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Universidad Autónoma De Yucatán

Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias

Licenciatura en Biología

“Efectos electrocinéticos”

Trabajo elaborado por:


Caamal Cobá Rebeca Aicela.
Contreras Nuñez Maria Andrea.
Covarrubias Cortés Jaret Aracely.
Fuentes Kú Maria Fernanda.
May Mutul Carla Gabriela.
Pérez Almeida Mitzi Miraldelly.
Soto David Mauricio.

Materia: Fisicoquímica

Profesor: Dr. Víctor M. Cobos Gasca

16/Octubre/2018

Mérida, Yucatán, México.


Electroforesis
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de
la técnica que se use.
Técnicas de electroforesis
● Electroforesis en papel.

Por las dificultades técnicas, los costos de aparatos y mucho tiempo que se
requeriría en la práctica de la electroforesis clásica de Tiselius, se ha puesto en
práctica un nuevo método, el de la electroforesis de papel o llamado también
microelectroforesis, que ha demostrado tener una adecuada precisión y las
siguientes importantes ventajas: aparatos de coste relativamente abordable, gasto
mínimo de suero, poder simultanear la prueba con distintos sueros, con el
considerable ahorro de tiempo y gastos y una corta duración operativa de solo
unas horas (de 3 a 6), en vez de 48 que requería el método clásico.
La electroforesis de papel no solo se utiliza para las proteínas de líquidos
orgánicos. Su campo de acción es ilimitado, los investigadores lo extienden para
estudios diferentes, como lípidos, glúcidos, bilirrubina, componentes de
hemoglobina y sustancias variadas.

Fundamento y técnica
La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una
disolución tampón, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel,
dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampón. Los extremos de la
tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolución tampón
y en los que se hallan colocados los electrodos.
Se conectan los electrodos a una fuente de tensión continua y se aplica una
diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente
directa, las moléculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de
polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigración de
una molécula, depende preferentemente de su carga. Completada la
electroforesis, se desconecta la fuente de tensión y se secan las tiras sobre una
superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc.).
El revelado se realiza empleando los mismos métodos que los utilizados en
cromatografía sobre papel, mediante la acción de los colorantes adecuados. La
electroforesis y la cromatografía en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo,
mientras que la electroforesis separa las moléculas fundamentalmente en función
de su carga, la cromatografía lo hace en base a una amplia gama de
características (ejemplos, solubilidad en la cromatografía de reparto, polaridad en
la de adsorción, carga en la de intercambio iónico, etc.).
La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separación de
sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos. La difusión que
se produce puede disminuirse aumentando la diferencia de potencial entre los
electrodos con lo que se reduce el tiempo de desarrollo. Este tipo de electroforesis
se denomina de “alto voltaje”. El revelador para localizar las sustancias sería la
ninhidrina en el caso de péptidos y aminoácidos.
Las electroforesis en papel también pueden hacerse en tiras de acetato de
celulosa, que son químicamente más homogéneas y tienen la ventaja de ser
transparentes, con lo que las sustancias a separar, una vez teñidas o reveladas,
pueden cuantificarse por densitometría. Es muy útil en los laboratorios clínicos por
su fácil manipulación y su rápido desarrollo. Las fracciones proteicas del suero que
se separan mediante este tipo de electroforesis son la albúmina y las globulinas
α1, α2, β1, β2 y γ. La localización de estas se hace visible después, mediante un
revelado y fijado, apareciendo en forma de manchas coloreadas, dispuestas en
serie, en el orden indicado y de extensión e intensidad de color diferente. El
gráfico obtenido se llama electroferograma y también, proteinograma y
cromatograma electroforético. Y el equipo se compone de dos aparatos, el
alimentador eléctrico y la cámara electroforética.
El acetato de celulosa se utiliza también para separar lipoproteínas. El resultado
obtenido se denomina lipidograma. Las fracciones lipoproteicas son denominadas
β, pre-β y γ. El tampón más usado es el veronal, a pH 8,6. La separación se
realiza de forma análoga a la de proteínas y se produce en unos 30 minutos. Las
lipoproteínas, una vez separadas, se localizan tiñéndolas con colorantes que se
unen a la fracción lipídica, como “Negro Sudán” o “Ciba 7B Fat Red”.
Electroforesis análogas a las de proteínas y lipoproteínas, utilizando como soporte
el acetato de celulosa, se han aplicado también para la separación de isoenzimas
del lactato deshidrogenasa y la creatín-quinasa.

● Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución cuyo objetivo es
la separación de mezclas de proteínas altamente complejas. La base de su
elevado poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad.
Esta es una combinación secuencial de: el enfoque isoeléctrico y la electroforesis
en gel de poliacrilamida con SDS. De este modo se es capaz de separar:
proteínas de masa molecular idéntica que difieren en su pI ó proteínas con
valores de pI similares pero con diferentes masas moleculares. Es la herramienta
más empleada para el análisis global y la separación de los componentes del
proteoma (conjunto de proteínas que se expresan a partir de un genoma en un
momento dado). Dicha técnica pasa por las siguientes etapas: 1. Preparación de
la muestra: En este paso se emplean agentes caotrópicos, surfactantes y agentes
reductores. Los agentes caotrópicos, como la urea, provocan la desnaturalización
de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno, dejando expuestos los
residuos hidrofóbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. Los
agentes reductores, como el DTT (Dithiothreitol, aunque también se emplean otros
reductores alternativos no cargados), completan la desnaturalización proteica por
ruptura de puentes disulfuro
Es una sucesión de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones)
realizadas sobre una misma muestra.
2. Separación en la 1ª dimensión (Isoelectroenfoque): Se separan los
componentes de la muestra según un criterio (carga, tamaño o pI).
3. Separación en la 2ª dimensión (SDS-PAGE): Las proteínas se separan en
función de su peso molecular. De esta manera, se combinan dos modos de
separación diferentes y se consigue el máximo de resolución posible mediante
técnicas electroforéticas.
4. Revelado: Los métodos más usados son la tinción con azul Coomassie -que se
fija a las proteínas pero no al gel-, la tinción fluorescente con Sypro Ruby y la
tinción con Plata. La tinción de azul Coomassie clásica puede detectar
normalmente bandas de proteína de 50 ng, mientras que la tinción con plata
incrementa este límite de sensibilidad en unas 50 veces.
La primera dimensión puede llevarse a cabo, por ejemplo, en condiciones no
desnaturalizantes y la segunda en condiciones desnaturalizantes; las proteínas
ribosomales se separan en un gel discontinuo en la primera dimensión, seguido
por otro continuo en la segunda, y ambos en presencia de urea; las histonas se
separan en geles con urea y ácido en la primera dimensión y utilizando
tritón/ácido/urea en la segunda.

Aplicaciones
La aplicación principal es la proteómica de expresión; con esta técnica se puede
comparar de forma cualitativa y cuantitativa la expresión de proteínas de dos
muestras. La electroforesis bidimensional puede considerarse como un criterio de
pureza positivo debido a su gran poder de resolución, aceptándose que la
aparición de una sola mancha indica una muestra homogénea.

● Electroforesis del Gel


La electroforesis del gel es una técnica utilizada en laboratorios de ciencias de la
vida para separar fragmentos de macromoléculas como ADN, ARN, y proteínas.
En esta técnica, se separan las moléculas por talla y carga eléctrica. La
electroforesis del gel se realiza generalmente en laboratorios para analizar ADN,
el ARN, o muestras de la proteína de diversas fuentes.
Principios de la electroforesis del gel

La técnica de la electroforesis del gel explota la diferencia de tamaño y la carga de


diversas moléculas en una muestra. La muestra de la DNA o de la proteína que se
separará se carga conectado a un gel poroso colocado en un ambiente iónico del
almacenador intermedio. En el uso de la carga eléctrica, cada molécula que tiene
diversas talla y carga se moverá a través del gel a diversas velocidades.

El gel poroso usado en esta técnica actúa como criba molecular que separa
moléculas más grandes de las más pequeñas. Las moléculas más pequeñas se
mueven más rápidamente a través del gel mientras que los más abultados se
dejan detrás. La movilidad de las partículas también es controlada por su carga
eléctrica individual. Dos electrodos opuesto cargados que son parte de las
moléculas del tirón del sistema hacía de ellas en base de su carga.

¿Cómo trabaja?

El gel usado en electroforesis del gel se hace generalmente de un material


llamado la agarosa (substancia gelatinosa extraída de alga marina). Este gel
poroso se podía utilizar para separar las macromoléculas de muchas diversas
tallas. El gel se sumerge en una solución amortiguadora de agua mezclada con
sales y se deja enfriar para conseguir un gel sólido y blando, posteriormente es
colocado en una cámara de la electroforesis. El Tris-borato-EDTA (TBE) es de uso
general como el almacenador intermedio. Su función principal es controlar el pH
del sistema. La cámara tiene dos electrodos - uno positivo y otra negativa - en sus
dos extremos.

Las muestras que necesitan ser analizadas entonces se cargan en pozos


minúsculos en el gel con la ayuda de una pipeta. Una vez que el cargar es
completo, una corriente eléctrica de 50-150 V es aplicada. Ahora, las moléculas
cargadas presentes en la muestra comienzan a emigrar a través del gel hacia los
electrodos. - Las moléculas cargadas se mueven hacia el electrodo positivo y
positivo - las moléculas cargadas emigran negativo hacia el electrodo negativo.

La velocidad a la cual cada molécula viaja a través del gel se llama su movilidad
electroforética y es determinada principal por su carga neta y talla. Las moléculas
fuertemente cargadas mueven más rápidamente que débil cargados. Moléculas
más pequeñas ejecutan más rápidamente irse detrás las más grandes. Así, carga
y tamaño pequeño fuertes aumentos la movilidad electroforética de una molécula,
mientras que carga débil y disminuciones de gran tamaño la movilidad de una
molécula. Cuando todas las moléculas en una muestra están del mismo tamaño,
la separación será basada solamente en su talla.

Una vez que la separación es completa, el gel se mancha con un tinte para revelar
las bandas de la separación. El bromuro de etidio es un tinte fluorescente de uso
general en electroforesis del gel. El gel se empapa en una solución diluida del
bromuro de etidio y después se coloca en un transilluminator ULTRAVIOLETA
para visualizar las bandas de la separación.

Las bandas se examinan o se fotografían inmediatamente para la referencia


futura, pues difundirán en el gel en un cierto plazo. El tinte se puede también
cargar en el pozo del gel por adelantado para rastrear la migración de las
moléculas mientras que suceso.

Usos de la electroforesis del gel

La electroforesis del gel es ampliamente utilizada en los laboratorios de la biología


molecular y de la bioquímica en áreas tales como ciencia forense, biología del
conservational, y remedio.

Algunos usos dominantes de la técnica son mencionados abajo:

● En la separación de fragmentos de la DNA para que huella dactilar genética


investigue escenas del crimen
● Para analizar resultados de la reacción en cadena de polimerasa
● Para analizar los genes asociados a una enfermedad determinada
● En la DNA que perfila para que estudios de la taxonomía distingan diversa
especie
● En la prueba de la paternidad usando la huella dactilar genética
● En el estudio de la estructura y de la función de proteínas
● En el análisis de la resistencia antibiótico
● En las técnicas que borran para el análisis de macromoléculas
● En el estudio de lazos evolutivos analizando semejanza genética entre
poblaciones o especie
Conclusión

De todas las técnicas propuestas la de electroforesis del gel es la más viable


teniendo en cuenta que es una metodología usada en laboratorios de alto nivel
profesional que ayuda a brindar resultados confiables y exactos con respecto al
análisis de ADN; ARN y muestras de proteínas que pueden derivar de diversas
fuentes.
Como se mencionó esta técnica permite conocer la diferencia de tamaño y carga
presentes en una muestra. Esto se logra a través del tipo de gel utilizado en el
proceso que es poroso que actúa como cribe molecular que permite la separación
de moléculas.
Algo que cabe destacar es que el gel es fácilmente manejable, no desnaturaliza
las muestras y estas también pueden recuperarse. Además se puede decir que
otras técnicas dependen de este procedimiento para la separación de ADN que
incluye la detección de características distintivas de ADN.
También cabe mencionar que la separación de moléculas permite la purificación
de tamaños específicos de ADNs después de la digestión de la enzima de
restricción.

Referencia:
Arroyo E. (S.F.) La electroforesis sobre papel y sus aplicaciones clínicas.
Recuperado de: file:///C:/Users/Mari/Downloads/Dialnet-
LaElectroforesisSobrePapelYSusAplicacionesClinicas-3665005.pdf [Último
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[Último acceso: 15 de octubre de 2018]
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Recuperado de: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
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Arizmendi, A.; Gribaudo, V.; Lonigro, M.; Loyola, A.; Polarolo, A.; Wingeyer, E.
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Virtual/BQblog/Electroforesis%202D%20%28IEF+SDS-PAGE%29.pdf [Último
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Khan Academy. (2018). Electroforesis en gel.
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-
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