En general es muy utilizado el llamado cociente proteico que está dado por la relación

Albúmina/Globulinas:
Concentrac ión.de. Albúnina
C.P. 
Concentrac ión.de.Globulinas

Este cociente tiene importancia diagnóstica en situaciones patológicas.

4. Conclusiones

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41
 BIOENERGETICA

TEMARIO
1. Definición.

2. Principios de la Termodinámica. Primer principio de la termodinámica. Segundo principio de

la termodinámica.

3. Variación de energía libre. Sentido de los procesos. Energía libre y energía libre estándar.
Reacciones energéticamente acopladas. Reacciones sucesivas.

4. Compuestos de alta energía.

5. Carga energética de la célula.

42
1. DEFINICION

La bioenergética es el campo de la bioquímica que estudia la transformación y el uso de la

energía en los sistemas biológicos.
El sistema en estudio más el medio ambiente que lo rodea constituyen el universo. Un
sistema termodinámico puede ser una reacción química, una célula o un organismo completo.
Los sistemas pueden ser abiertos, cerrados o aislados, según intercambien materia y/o energía
con su medio ambiente. Los sistemas biológicos se consideran sistemas abiertos, o sea que
pueden intercambiar materia y energía con su medio ambiente.

2. PRINCIPIOS DE LA TERMODINAMICA

2.1. Primer Principio de la Termodinámica

Establece que la energía del universo permanece constante, por lo que la energía total de un
sistema más la de su medio ambiente es constante. Esto implica que la energía no se crea ni se
destruye, sino que se transforma. Es así como las represas hidroeléctricas transforman la energía
cinética del agua en energía eléctrica y ésta a su vez en energía lumínica en nuestros hogares. Del
mismo modo un animal transforma la energía química de los alimentos en energía mecánica de la
contracción muscular que conlleva a la energía cinética observada en su desplazamiento.
Es importante destacar que sólo una parte de la energía que se transforma es aprovechada, el
resto se pierde o sea que no puede ser utilizada para realizar trabajo útil. Por ejemplo sólo una parte
de la energía eléctrica es transformada en una lamparita en energía lumínica, el resto se disipa en
forma de calor. Del mismo modo sólo parte de la energía química será aprovechada en la
contracción muscular, el resto genera calor corporal.
También al producirse una reacción química suele haber un flujo de energía (en general
calórica) entre el sistema y el ambiente que debe ser acompañado por un cambio que lo compense
en el contenido energético del sistema o en el trabajo realizado por el sistema sobre dicho ambiente.

2.2. Segundo Principio de la Termodinámica

Establece que la entropía del universo va en aumento, por lo que la entropía del universo se
incrementa en cada proceso. Proporciona un criterio para predecir el sentido de cualquier proceso.
Establece que los procesos físicos y químicos se desarrollan en el sentido en que la entropía del
universo alcanza un máximo; en este punto tiene lugar el equilibrio. Un sistema está en equilibrio
con su medio ambiente cuando la entropía se incrementó a un máximo y no existe energía
disponible para manejar los procesos. Así, la tendencia a incrementar la entropía actúa como una
fuerza que maneja los sistemas hacia el equilibrio con su medio ambiente.
Es interesante destacar que cuando un sistema evoluciona hacia el equilibrio se puede
producir intercambio energético con el medio ambiente y por lo tanto realizar trabajo útil, pero al
llegar al equilibrio ya no. Es por ello que también se define a la entropía como la fracción de la
energía interna total del sistema que no puede ser utilizada para desarrollar trabajo útil. En las

43
reacciones químicas se produce intercambio energético con el medio ambiente mientras la misma
transcurre hacia el equilibrio, pero ya no al alcanzarlo.

3. VARIACION DE LA ENERGIA LIBRE

3.1. Sentido de los procesos

La variación de energía calórica interna total de un sistema o variación de entalpía (H) está
definida como la suma de la fracción de esa energía que puede ser aprovechada para realizar
trabajo útil (variación de energía libre, G) y la fracción que no es capaz de realizar trabajo útil
(variación de entropía, S), siendo T la temperatura absoluta:

H = G + T S

Por lo tanto, la energía libre de Gibbs (G) es una función termodinámica de estado que define la
condición de equilibrio en términos de la entalpía y entropía de un sistema a presión y temperatura
constantes:

G = H - T S

La habilidad de un sistema para realizar trabajo disminuye a medida que se aproxima al

equilibrio, y en el equilibrio no hay energía disponible para realizar trabajo. Si G es negativo el
proceso es espontáneo, si G es positivo el proceso no es espontáneo y si G es cero el sistema
está en equilibrio.
Los sistemas biológicos (por ej. células, organismos) son sistemas abiertos, o sea que
pueden intercambiar materia y energía con su medio ambiente; los cambios de energía y de
entropía serán de importancia para determinar la dirección de los procesos termodinámicamente
favorables. Las células vivas, son sistemas abiertos de evolución irreversible que se encuentran en
un estado estacionario dinámico. Un sistema abierto en el estado estacionario es capaz de realizar
trabajo, porque está alejado de su condición de equilibrio.

3.2. Energía libre y energía libre estándar

La energía libre de Gibbs (G) de una solución de una sustancia A está relacionada a su
energía libre de Gibbs estándar (Gº). La energía libre estándar de una sustancia A se define para
una solución 1 M a una presión de 1 atm, 25ºC (298ºK) y pH 0 en sistemas físico-químicos. En el
caso de los sistemas biológicos el pH es de 7 y la energía libre y la energía estándar se expresan
como G' y Gº', respectivamente:

G'A = G'A + RT ln [A]

Si se considera la reacción:

44
 aA +bB <–––––––––> cC + dD

La variación de energía libre (G') para la reacción es:

G' = (cG'C + dG'D) - (aG'A + bG'B)

Reemplazando la expresión para la energía libre estándar de cada componente de la reacción

anterior, se obtiene:

G' = (cG'C + dG'D - aG'A + bG'B) + RT ln [C]c ·[D]d

[A]a ·[B]b

El término entre paréntesis en la ecuación es la variación de energía libre estándar para la

reacción (G'), mientras que el segundo término dependerá de la relación X en un determinado
momento tal que:
X = [C]c [D]d
[A]a [B]b

De este modo se obtiene la ecuación (1) que determina los posibles valores de G':

G' = G' + RT ln [C]c ·[D]d

[A]a ·[B]b (1)

La variación de energía libre para una reacción química es la fracción de la energía total
del sistema que es capaz de realizar trabajo útil cuando el sistema evoluciona al equilibrio a
presión (1 atm), temperatura (25ºC ó 298ºK) y pH (7) constantes. Debido a que los metabolitos de
una reacción química difícilmente se encuentren en las células en concentraciones estándar, la
variación de la energía libre de una reacción química dependerá de las concentraciones iniciales de
reactivos y productos. De este modo la G' para una reacción puede tomar infinitos valores según
sean las concentraciones de los reactantes y de los productos. El criterio de espontaneidad para una
reacción está determinado por el valor de G', no de Gº'. Si el valor de G' es negativo la
reacción es espontánea, si es positivo es no espontánea y si es cero está en equilibrio.

Por otro lado, en el equilibrio el cambio de energía libre es cero y X es la constante de

equilibrio (Keq) para la reacción. Así a partir de la ecuación (1) obtenemos:

0 = G'+ RT ln {[C]c.[D]d}eq
{[A]a.[B]b} eq

G' = -RT ln Keq (2)

45
 La ecuación (2) establece la relación entre la variación de la energía libre estándar y la
constante de equilibrio de una reacción. El valor de G' es único dado que depende de la Keq que
es una constante. Cuando la Keq es > 1 la Gº' es negativa, significa que la reacción es exergónica
y por eso energéticamente favorable. Cuando la Keq es < 1 la Gº' es positiva, la reacción es
endergónica y no es energéticamente favorable.

En las células hay reacciones químicas que son termodinámicamente favorables

(exergónicas) y otras que no lo son (endergónicas). Sin embargo, es necesario que ambos tipos de
reacciones puedan llevarse a cabo en forma espontánea en las mismas. Para ello las células recurren
a dos tipos de estrategias, las reacciones energéticamente acopladas o las reacciones sucesivas.

3.3. Reacciones energéticamente acopladas

En este caso, a una reacción química endergónica se le acopla una reacción química
altamente exergónica que impulsa energéticamente a que la primera se produzca. El caso más
simple de acoplamiento de energía se produce cuando dos reacciones metabólicas comparten un
intermediario común:
Keq1
A + B <–––––––––> C G1' = +10 Kcal/mol
Keq2
C + D <–––––––––> E G2' = -30 Kcal/mol

La constante de equilibrio de la reacción final (Keq3) es igual al producto de las constantes

de equilibrio de las reacciones individuales:

Keq3
A + B + D <–––––––––> E Keq3 = Keq1 . Keq2

El cambio de energía libre estándar total (Gº´3) para una serie de reacciones químicamente
acopladas, es igual a la suma algebraica de la variación de energía libre estándar de las etapas
individuales:

G3'= G1' + G2' = [+10 + (-30)] Kcal/mol = -20 Kcal/mol

Si la reacción para la producción de C es endergónica (G1 > 0) y el equilibrio se desplaza

hacia la izquierda, la reacción neta puede todavía ser exergónica, resultando en la formación neta
de E. Esto ocurre si el cambio de energía libre estándar para la formación de E es lo
suficientemente exergónico como para sobrepasar el cambio de energía libre estándar para la
producción de C. Las dos reacciones están energéticamente acopladas y la segunda reacción provee
la fuerza termodinámica necesaria para impulsar la primera reacción.
El flujo de energía en el metabolismo celular se produce mediante reacciones
energéticamente acopladas en las cuales participa como intermediario el ATP. La mayoría de las
reacciones energéticamente acopladas en las que participa el ATP involucran la transferencia del

46
 grupo fosfato a partir del ATP a otras sustancias, o a partir de un metabolito rico en energía al ADP
formando ATP.
Así, la hidrólisis del fosfoenolpiruvato (PEP) que es altamente exergónica (G -14,8
Kcal/mol) es capaz de sintetizar ATP (proceso endergónico, G 7,3 Kcal/mol) en un proceso
termodinámicamente favorecido:

(1) Hidrólisis de
fosfoenolpiruvato (PEP) PEP + H2O –––––––> piruvato + Pi G10' = -14,8 Kcal/mol

(2) Fosforilación de ADP ADP + Pi –––––––––> ATP + H2O G20' = +7,3 Kcal/mol
______________________ ____________________________ _________________

(1) + (2): Fosforilación PEP + ADP –––––––––> piruvato + ATP GT0'= -7,5 Kcal/mol
acoplada de ADP por PEP

Del mismo modo, la hidrólisis del ATP (proceso exergónico, G -7,3 Kcal/mol) puede
ceder energía para el proceso endergónico de fosforilación de la glucosa (G 3,3 Kcal/mol):

(1) Hidrólisis de ATP ATP + H2O –––––––––> ADP + Pi G10' = -7,3 Kcal/mol

(2) Fosforilación de la glucosa G + Pi –––––––––> G 6-P + H2O G20' = +3,3 Kcal/mol

__________________________ __________________________ _________________

(1) + (2): Fosforilación acoplada ATP + G –––––––––> ADP + G 6-P GT0' = - 4,0 Kcal/mol
de glucosa por ATP

Esto explica el comportamiento del ATP como un agente de transferencia de fosfato

versátil a través de reacciones energéticamente acopladas.

3.4. Reacciones sucesivas

En otros casos, las células modifican las concentraciones de los reactantes y de los
productos haciendo que las reacciones endergónicas puedan realizarse igual en forma espontánea.
Si los productos están en baja concentración por estar siendo continuamente utilizados en
reacciones posteriores, el valor de G' puede ser negativo al transformarse el segundo término de la
ecuación (1) en un mayor valor absoluto y negativo tal que supere el valor positivo de G':

G' = G' + RT ln [C]c ·[D]d

[A]a ·[B]b (1)

En este caso, la concentración de los productos C y/o D baja al ser utilizados como
reactantes de una reacción sucesiva que los consuma. Este concepto es importante porque las
reacciones que no son termodinámicamente favorables basadas en su G (endergónicas) pueden
transformarse en espontáneas modificando las concentraciones de los reactantes y de los productos.

47
4. COMPUESTOS DE ALTA ENERGIA

Los compuestos de alta energía son sustancias que poseen altos valores de energía libre
estándar de hidrólisis (G > -5,0 Kcal/mol) y que por lo tanto son aptas para ser utilizados por las
células como dadores de energía para reacciones energéticamente acopladas, transporte activo a
través de membranas, procesos de contracción celular, etc. Existen principalmente dos tipos de
compuestos de alta energía, los compuestos con grupo fosfato y los tioésteres.
Entre los compuestos con grupo fosfato podemos nombrar al fosfoenolpiruvato (G -14,8
Kcal/mol), 1,3-bisfofoglicerato (G -11,8 Kcal/mol), fosfocreatina (G -10,3 Kcal/mol), ATP
(G -7,3 Kcal/mol), entre otros. El ATP es un compuesto relativamente inestable (carga -4) cuya
hidrólisis es termodinámicamente favorable al rendir como producto dos compuestas más estables,
el ADP (carga -3) y fosfato (estabilizado por resonancia).
Entre los tioésteres se encuentran el SuccinilCoA (G -10,2 Kcal/mol) y el AcetilCoA

(G -7,5 Kcal/mol). La hidrólisis del AcetilCoA es termodinámicamente favorable al producir
Acetato, compuesto que se estabiliza por resonancia.

5. CARGA ENERGETICA DE LA CELULA

La capacidad de una célula para llevar a cabo reacciones conducidas por el ATP depende de
las concentraciones relativas de ATP y de sus productos de hidrólisis. La suma de la concentración
de ATP y de sus productos de hidrólisis en las células se mantiene constante. Esto es lo que se
conoce como el sistema adenilato:

ATP + ADP + AMP = constante

Esta expresión significa que una forma química se transforma en otra según el nivel de
energía presente en la célula.
Debido a que la hidrólisis de ADP es también una reacción de alta energía (G -7,3
Kcal/mol), la cual puede ser usada en algunos procesos, el estado energético de la célula puede ser
mejor descripto por la relación llamada carga energética:

carga energética = [ATP] + 1/2 [ADP]

[ATP]+[ADP]+[AMP]

En el numerador están las concentraciones de las formas que pueden actuar como fuente
de energía libre, mientras que el denominador incluye tanto el ATP como todos sus productos de
degradación. El valor de la carga energética oscila entre 0 (todo está presente como AMP) y 1
(todo estaría presente como ATP). La mayoría de las células normales funcionan con valores de
carga energética de alrededor de 0,9.
Una forma práctica para expresar la carga energética de una célula es la relación
[ATP]/[ADP], así valores elevados significan que la célula posee alta carga energética y valores
bajos significa que tiene baja carga energética.

48
 ENZIMAS

TEMARIO

Enzimas como catalizadores biológicos. Clasificación. Especificidad. Sitio activo.

Complejo E-S. Cinética enzimática: Ecuación de Michaelis-Menten. Estado estacionario.
Significado de las constantes KM y Vmáx. Representación gráfica de dobles recíprocas.
Inhibidores reversibles: competitivos y no competitivos. Enzimas reguladoras: alostéricas y por
modificación covalente.
Estos conceptos deben ser conocidos por el alumno para poder comprender los siguientes
temas.

1. Aislamiento y purificación de enzimas. Medida de la velocidad. Medida de la actividad

enzimática. Aspectos técnicos del trabajo con enzimas. Extracción y purificación de enzimas.
Grado de pureza y rendimiento.

2. Determinación de la actividad de la lipasa pancreática. Introducción. Medición de la

actividad de la lipasa pancreática por aparición del producto: Fundamento.

3. Trabajo práctico experimental. Determinación de la actividad de la lipasa pancreática.

49
1. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE ENZIMAS

La propiedad característica de las enzimas es su capacidad de catalizar ciertas reacciones

químicas bien definidas. La presencia de una enzima se detecta, en general, por la reacción que
cataliza y la cantidad de la misma se estima a partir de la velocidad de reacción.

1.1. Medida de la velocidad

Es el paso esencial en la técnica de estudio de una enzima. La velocidad de una reacción
enzimática se determina midiendo el aumento de producto formado o la desaparición de sustrato
en función del tiempo.
S + Enz –––––––––> P + Enz S = sustrato
P = producto

Se observa que la velocidad disminuye con el tiempo. Las causas de este fenómeno
pueden ser varias:
a) El producto puede ser un inhibidor de la reacción.
b) Al aumentar [P] aumenta la velocidad de la reacción opuesta.
c) Al disminuir [S] decrece el grado de saturación de la enzima.
d) Desnaturalización de la enzima.
Uno o varios de estos factores pueden interactuar simultáneamente; para independizarse
de estos problemas entonces se recurre a la medición de la velocidad inicial. Sólo al comienzo de
la reacción, cuando los factores mencionados no han tenido tiempo de actuar, las condiciones se
conocen con precisión. Al trabajar con velocidades iniciales sólo una pequeña fracción del
sustrato se ha transformado en producto, si la [P] es pequeña la reacción opuesta es prácticamente
nula y tampoco puede actuar como inhibidor. La velocidad inicial se determina trazando la
tangente al tiempo cero (t).

50
 Los métodos usados para realizar las curvas de producto formado en función del tiempo
son de dos tipos:

a) En un caso se toman alícuotas de la mezcla de reacción a distintos tiempos y se determina la

formación de producto o desaparición de sustrato.

b) En casos en que la reacción se pueda llevar a cabo en la cubeta del espectrofotómetro, por
ejemplo:
LDH
Lactato + NAD –––––––––> Piruvato + NADH + H+
+

Se mide la aparición de NADH en base a su absorción a 346 nm, sin necesidad de tomar
alícuotas y la curva de producto formado en función del tiempo aparece directamente en la
pantalla del aparato.

1.2. Medida de la actividad enzimática

Las unidades enzimáticas (UE) o unidades internacionales (UI) se definen como la
"cantidad de enzima que cataliza la transformación de un mol de sustrato por minuto". Otra
posibilidad es definirla en relación con el método utilizado para su valoración. Así se puede
determinar, por ejemplo, la cantidad de enzima presente en un determinado volumen de muestra,
volumen de extracto, masa de tejido, número de células, etc.
La actividad específica (AE) es una medida de la pureza de la preparación enzimática y se
expresa como UE/mg de proteína. Durante el proceso de purificación de enzimas tanto las UE
como la AE de la preparación sufren variaciones.

1.3. Aspectos técnicos para el trabajo con enzimas

El éxito en el trabajo con enzimas depende del cuidado con que se eviten las condiciones
en las cuales son inestables. Estas condiciones varían con cada enzima, pero en general deben
evitarse las altas temperaturas y la acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento y
purificación se debe trabajar a 0°C (para que la enzima no pierda actividad) y evitar pH
superiores a 9 o inferiores a 5. Los solventes orgánicos inactivan muchas enzimas a temperatura
ambiente, de modo que los fraccionamientos con los mismos deben efectuarse a baja temperatura.
Por último las purificaciones deben llevarse a cabo sin pérdida de tiempo y en caso necesario los
extractos se deben guardar en congelador, siempre y cuando la enzima esté disuelta en un medio
adecuado para ello.
Para determinar la actividad enzimática se deben tener en cuenta las siguientes
precauciones:
a) La reacción que cataliza la enzima debe realizarse a la temperatura óptima para la misma.
b) Elegir un buffer adecuado para mantener estable el pH óptimo de la enzima.
c) Evitar la contaminación con detergentes u otras sustancias contaminantes.

51
1.4. Extracción y purificación de enzimas
El paso común para iniciar la extracción de una enzima, es la obtención de un
homogenato. La preparación de un homogenato de tejidos implica la destrucción o disgregación
mecánica de las células y por lo tanto, de la membrana celular, con lo cual se liberan las enzimas
que pasan a solución. Algunos de los métodos utilizados son:
a) Homogeneización mecánica: Puede utilizar un homogeneizador de vidrio, con pistón de
vidrio o teflón, un mortero, licuadora o aparatos similares. A veces se hace con la ayuda de
abrasivos tales como alúmina, bolitas de vidrio, etc.
b) Homogeneización sónica: La radiación sónica se utiliza en general para las bacterias y
levaduras (debido a la mayor resistencia que presentan sus membranas).
c) Desintegración térmica: El congelamiento y descongelamiento repetido permite la
desintegración de la membrana celular. Por congelamiento se forman cristales de hielo
destruyendo la estructura intracelular. Al descongelarse, las células son destruidas
osmóticamente debido a la presencia del agua, liberándose su contenido.
d) Desintegración química: Actúan agentes químicos destruyendo la pared celular. Los más
utilizados son el butanol, éter de petróleo, e isopentano.
Muchas veces, una vez obtenido el homogenato, es conveniente hacer una filtración a
través de gasa o lana de vidrio para separar tejidos conjuntivos y restos celulares. La suspensión
total obtenida por estos métodos es lo que se denomina homogenato o extracto crudo.

A partir del homogenato se puede detectar la actividad enzimática por la reacción que
cataliza la enzima en estudio, pero en general se procede a realizar el aislamiento de la enzima,
utilizando en primer lugar la centrifugación diferencial. En la centrifugación diferencial las
partículas que difieren en densidad y tamaño sedimentan a distintas velocidades por aplicación de
una fuerza centrífuga. Un esquema tipo es el siguiente.

52
 Dada la naturaleza proteica de las enzimas, los métodos de purificación utilizados son
los mismos que para proteínas (centrifugación en gradiente de densidad, cromatografía de
exclusión o de filtración por gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad,
fraccionamiento salino, etc.).

1.5. Grado de pureza y rendimiento

Durante la purificación de una enzima, en cada fracción obtenida luego de los distintos
pasos del proceso de purificación empleado, se determinarán las UE y proteínas totales. Con
estos datos se obtiene la AE = UE/mg proteínas que nos permite conocer si hubo purificación,
ya que a mayor AE tendremos menor cantidad de proteínas extrañas.

1.5.1. Grado de pureza

A la AE obtenida para el homogenato se le asigna el grado de pureza 1, conociendo la AE
de cada fracción, podemos calcular el grado de pureza de cada una de ellas, a mayor AE, mayor
purificación.

1.5.2. Rendimiento
Si al homogenato se le asigna el 100% de enzima presente, se puede calcular el
rendimiento de cada fracción en base a las UE calculadas para cada una de ellas.

El siguiente cuadro, sirve como ejemplo de una buena purificación acompañada de un

buen rendimiento.

PROT. TOT. AE REND.

FRACCIÓN UE/ml PURIFICACION
(mg/ml) (UE/mg) (%)

Homogenato crudo de hígado 100.000 10.000 10 100 1

Sobrenadante 105.000 g. 98.000 8.000 12,2 98 1,22

Precipitación con solución saturada

90.000 1.500 60 90 6
(NH4)2SO4; 20-35% de saturación

Precipitación con solución saturada

60.000 250 240 60 24
(NH4)2SO4; 40-50% de saturación

Resina de intercambio DEAE*:

58.000 29 2.000 58 200
50-100

*DEAE: dietilaminoetilcelulosa (resina de intercambio aniónico)

53
2. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA LIPASA
PANCREATICA

2.1. Introducción
Los animales superiores degradan los triacilglicéridos ingeridos mediante la acción de
enzimas hidrolíticas (lipasas) del jugo pancreático, en el intestino delgado. Para que la lipasa
pancreática actúe, es necesario que los triacilglicéridos estén solubilizados en el jugo intestinal.
En el organismo esto tiene lugar por la acción detergente de las sales biliares. La lipasa
pancreática cataliza la reacción:

Lipasa
pancreática

La hidrólisis completa de los triacilglicéridos produce glicerol y ácidos grasos. Sin

embargo se demostró que la lipasa pancreática es específica para la hidrólisis de las uniones éster
primarias y de hidrolizar la unión éster en la posición 2 del triacilglicérido lo haría en forma muy
lenta. Por lo dicho, debido a la dificultad de la hidrólisis de la unión éster secundaria en el
triacilglicérido, resulta que los 2-monoacilglicéridos y los ácidos grasos constituyen los
principales productos finales de la digestión de los triacilglicéridos.

2.2. Medición de la actividad de la lipasa pancreática por aparición del

producto: Fundamento
Para estudiar la actividad de la lipasa pancreática es necesario disponer del sustrato
adecuado: triacilglicéridos. Una fuente de triacilglicéridos de fácil acceso es la leche entera que
posee un 3% de sustancias grasas. Los triacilglicéridos presentes en la leche se hidrolizan en
presencia de la lipasa pancreática liberando ácidos grasos, por lo tanto se medirá la actividad de
la enzima por titulación de dichos ácidos grasos liberados (aparición de producto) con una base
de concentración conocida.

54
3. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA LIPASA PANCREATICA

1. Material biológico
Leche entera

2. Reactivos
a) Solución de rojo fenol (fenol sulfonftaleína)
(Vira del amarillo al rojo a pH 7,2)
Rojo fenol 0,1 g
Solución de NaOH 0,01 N 28,2 ml (0,04 g NaOH en 100ml de solución)
Agua destilada c.s.p. 250 ml
b) Extracto pancreático
c) Solución de NaOH 0,005 N
NaOH 0,2 g
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
d) Leche a pH 8,0
A 500 ml de leche entera se le agregan 50 gotas de solución de rojo fenol y tantos ml de
solución de NaOH 1 N como para obtener un color ligeramente rosado. Se prepararán 20 ml para
cada grupo de alumnos.

3. Material de laboratorio
1 tubo de ensayo
1 tapón para tubo de ensayo
1 pipeta de 0,2 ml
1 pipeta de 1 ml
1 pipeta de 5 ml
1 pipeta de 10 ml
1 bureta de 25 ml
1 vaso de precipitación de 50 ml
3 Erlenmeyers de 50 ml
1 embudo de plástico

4. Aparatos e instrumentos
Baño termostático a 37°C

5. Técnica

Colocar en 1 tubo de ensayo los reactivos que figuran en el siguiente cuadro.

55
 Extracto pancreático en solución (ml) 0,2

Leche con rojo fenol pH 8,0 (ml) 11,8

Tapar el tubo de ensayo y mezclar suavemente por inversión. Incubar a 37°C en un baño
termostático durante 30 minutos. Entre tanto preparar la bureta para titular los ácidos grasos
liberados, agregando NaOH 0,005 N mediante un embudo de plástico y enrasar a cero.
Colocar en el vaso de precipitación 3 ml de leche con rojo fenol (pH 8,0) y el volumen de
agua destilada necesario para usar como referencia de color rosado en la titulación.
A los 30 minutos tomar 3 ml del contenido del tubo de ensayo, colocarlos en un
erlenmeyer de 50 ml y titularlo con la solución de NaOH contenida en la bureta, agregando gota a
gota hasta obtener el color rosado de referencia.
Antes de realizar la titulación de los 30 minutos verificar que el color rosado inicial de
la leche a pH 8,0 haya virado al amarillo por la acción de los ácidos grasos liberados por la
lipasa; en caso contrario no se realizará la titulación y se dejará mayor tiempo de incubación
(observar a los 5 minutos y anotar el tiempo).
Repetir las titulaciones sacando muestras de 3 ml de leche a los 60 y 90 minutos de
incubación.
A partir de los volúmenes gastados de la solución de NaOH 0,005 N para titular cada una
de las muestras (30, 60 y 90 minutos), calcular el número de miliequivalentes de ácidos grasos
presentes en 3 ml de muestra y anotar los datos en la tabla correspondiente al informe del trabajo
práctico experimental.

4. Cálculo de la titulación

La titulación ácido base se fundamenta en que en el punto de equivalencia:

número de equivalentes de ácido = número de equivalentes de base

Siendo el número de equivalentes = Volumen x Normalidad (V x N). En este caso los

ácidos que se titulan son los ácidos grasos liberados a partir de los triacilglicéridos de la leche por
acción de la lipasa pancreática y la base utilizada es una solución 0,005 N de NaOH (0,005
mEq/ml).
número de equivalentes de ácido = V de base x N de base

Si el volumen de base gastado se mide en ml y la normalidad se expresa mEq/ml, la

cantidad de ácido graso titulada se expresará en mEq.
Construir en papel milimetrado un gráfico de miliequivalentes de ácido en función del
tiempo en minutos. Trazar la tangente al origen para determinar la velocidad inicial (Vo)
expresada mEq/min y calcular las UE/ml de extracto pancreático. Luego calcular la AE del
extracto pancreático (se suministrará como dato la concentración proteica del extracto
pancreático en mg/ml).

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Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA LIPASA
PANCREATICA
1. Objetivo

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2. Fundamento

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3. Resultados

Tiempo en
Volumen de NaOH (ml) mEq de ácido liberado
minutos
0,005N

30

60

90

57