NOMBRE DE ESCUELA; ESCUELA PREPARATORIA FEDERAL POR

COOPERACIÓN

“ANTONIO AUDIRAC”

NOMBRE DEL DOCENTE; MTS. JAVIER ANTONIO CABALLERO PATRICIO

NOMBRE DEL ALUMNO: SANTANDER GONZÁLEZ FERNANDO DANIEL

NOMBRE DE LA MATERIA: CAPACITACIÓN DE LABORATORIO QUIMICO III

NOMBRE DE LA PRÁCTICA; TÉCNICAS DE SIEMBRA CON ASA

NUMERO DE LA PRÁCTICA; PRACTICA NUMERO “5”

FECHA DE LA PRÁCTICA: 02/OCTUBRE/2018

FECHA DE ENTREGA DEL REPORTE DE PRÁCTICA: 12/OCTUBRE/2018

GRUPO: “F” GRADO: 5 SEMESTRE NL.: 39

 RESUENEN
1. TECNICAS DE SIEMBRA Los métodos de siembra se utilizan para inocular por
distintos métodos sobre un medio de cultivo apropiado una muestra que
contenga bacterias con el fin de reproducirlas para su estudio. Siembra por
aislamiento Siempre por estrías Por extensión
2. Siembra por aislamiento  Es la separación de un determinado microorganismo
del resto de microorganismos que le acompañan. El método más usual es la
siembra por estría sobre un medio de cultivo sólido adecuado dispuesto en
una placa de Petri.
3. Siembra por estría  Se inocula la muestra sobre un extremo de la placa con un
asa y se extiende formando estrías sobre la superficie en varios sentidos
cada célula aislada se multiplica formando una colonia
4. Por extensión  Se extiende el inoculo uniformemente con una varilla acodada
estéril por la superficie del medio de cultivo  Las células diseminadas sobre
la superficie forman colonias aisladas
5. Métodos para aislar cultivos puros  Técnica de siembra por estrías en placa  
Técnicas de siembra en placa 
6. Técnicas de siembra por estrías en placa  Con un asa bacteriológica, se pasa
una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base
de agar y se siembra en el medio por estrías en cuadrantes.
7. Técnicas de siembra en placa  Una porción de una colonia que se pase a un
medio de cultivo en tubo viene a ser un cultivo puro.  Después de una
incubación apropiada, el desarrollo de cada cultivo se observa al microscopio
o mediante cultivo para verificar que es puro.
8. 1-Siembra con rastrillo  2.Siembra con asa de cultivo  Diseminación de
superficie  Agotamiento en superficie  Tubos en superficie  Tubos en
profundidad o picada  3.Siembra con rotula
9. Siembra con rastrillo
10. Diseminación de superficie
11. Agotamiento en superficie
12. Tubos en superficie
13. Tubos en profundidad o picada

OBJETITO

2. Facilitar el crecimiento y el aislamiento de las bacterias presentes en una muestra

clínica.  Determinar qué bacterias entre las que se desarrollan tienen más
probabilidades de ser las causantes de la infección y cuáles son sus posibles
contaminantes o colonizadores.  Obtener un desarrollo suficiente de las
bacterias de importancia clínica para permitir su identificación y su
caracterización. CULTIVO PURO CULTIVO MIXTO CULTIVO
CONTAMINADO
3. DEFINICIÓN Sustrato sólido, líquido o semisólido que contiene todos los
nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo de los gérmenes.
Fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales.
pH Luz Temperatura Esterilidad absoluta (salvo excepciones) Recipientes
adecuados
4. Es importante destacar que la transición exitosa de un microorganismo invito a un
ambiente in vitro va a depender de: Disponibilidad de nutrientes esenciales
 Condiciones ambientales adecuadas pH Temperatura Oxígeno y CO 2 Presión
Luz
5. SÓLIDOS LÍQUIDOS SEMISÓLIDOS Clasificación de los medios de cultivo
según consistencia
6. semisólido
7. Caldo nutritivo Caldos de enriquecimiento Caldos revitalizadores
8. Enriquecimiento Nutritivo Selectivo y diferencial Clasificación de los medios de
cultivo según utilización
9. MEDIOS NUTRITIVOS Contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la
mayoría de losmicroorganismos sinrequerimientos especiales de cultivo. No
promueven el crecimiento de ningún agente en particular
10. MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
11. MEDIOS SELECTIVOS Contienen uno o más agentes que inhiben el
crecimiento de los microorganismos que no se quieren estudiar Agentes
inhibidores: colorantes, sales biliares, alcoholes, ácidos y antibióticos
12. MEDIOS DIFERENCIALES Contienen un factor o factores que permite que las
colonias de una especie o un tipo bacteriano exhiban ciertas características
metabólicas o de cultivo que puedan utilizarse para diferenciarlas de otras
bacterias que crecen en el mismo agar
13. MEDIOS ESPECIALES MEDIOS CROMÓGENOS MEDIOS DE TRANSPORTE
MEDIOS DE CONSERVACIÓN
14. Sustancias cromo génicas: - Son productos químicos de síntesis que son
incoloros cuando se unen a sustratos naturales por enlaces que son
hidrolizados por enzimas microbianas específicas. - Cuando la enzima
microbiana hidroliza el enlace, delibera el compuesto criogénico, que
adquiere un color intenso. - Ejemplo: Cromo agar (agentes uro patógenos),
supone en evidencia la actividad enzimática de la B-glucoronidasa o B-
galactosidasa de las bacterias formándose colonias de diferentes colonias
según la especie. - Identificación presuntiva, haciendo innecesaria la
realización de pruebas bioquímicas.
15. Medios para bacterias no exigentes - agar - extracto de carne - peptona - NACL -
leche descremada (congelar cepas) NORMATIVA ISP, entregar
16. CONTROL DE CALIDAD El Control de Calidad en la preparación y evaluación
delos medios de cultivo es considerado como una esencial buena práctica de
laboratorio, necesaria para mantener el nivel y la ejecución de cualquier
técnica microbiológica. Proceso continuo que se extiende desde las materias
primas; a través del productor hasta el producto final utilizado en los
diferentes departamentos de análisis y diagnóstico microbiológico.
17. ▪ Recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés
(Productividad) ▪ Inhibición o suspensión de los microorganismos no
deseados. (Selectividad) Propiedades bioquímicas (diferenciales y
diagnósticas) Propiedades físicas (por ejemplo, pH, Volumen) Sea estéril....
etc. El Jefe inmediato responsable del área * Deberá analizar
mensualmente los resultados de las pruebasrealizadas por el responsable del
departamento de control de calidad * Evaluará el cumplimiento de objetivos a
través de los resultados
18. CRITERIOS DE EVALUACIÓN DE LA CALIDADDE LOS MEDIOS DE
CULTIVOS PREPARADOS. Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio
respecto a: La recuperación o supervivencia de los microorganismos de
interés La inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene
que ser cuantitativa Los atributos ( por ejemplo: Propiedades físicas y
bioquímicas) Rajadura del plato o envase Variaciones en el volumen del
medio Hemólisis Cristales en el medio Presencia de burbujas
 Presencia de coágulos Cambio de color normal Contaminación Falla en
la inhibición de microorganismos saprofitos Esterilidad
19. PRUEBAS FUNCIONAMIENTO Para evaluar cada lote de medio de cultivo
que sea recibido en el laboratorio, se emplean cepas patrones (ATCC) de
varios géneros y especies de acuerdo al medio de cultivo a analizar. El
control del funcionamiento consistirá en comprobar:  capacidad del medio
de recuperar un bajo número de los microorganismos más sensibles para los
que ha sido preparado.  Capacidad de inhibir un alto número de los
microorganismos que deben ser inhibidos en caso de los medios selectivos y
diferenciar los microorganismos para los que ha sido diseñado en caso de
los medios diferenciales.
20. RECONSTRUCCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO DESHIDRATADO• Cumplir con
las instrucciones de preparación del medio de cultivo indicado en la etiqueta
del envase• Cumplir con los procedimientos técnicos de fórmulas enviadas
por el cliente• Utilizar agua destilada de calidad• Determinar el pH del M de
C• Esterilización del medio de cultivo• Procedimiento escrito• Control de
esterilidad del Medio de Cultivo
21. AGAR INFUSION DE CARNE
22. MEDIO DE LOWENSTEIN JENSEN
23. AGAR SANGRE
24. ERRORES EN LA PREPARACIÓN Apelmazamiento del producto deshidratado
DEFECTO  El envase no fue cerrado correctamente después de su uso. 
El envase permaneció abierto por largo rato. Apelmazamiento del  El
producto sobrepasó la fecha de vencimiento. Producto deshidratado El valor
de pH no coincide con el indicado • No fue empleada agua destilada • El
medio fue sobrecalentado durante su preparación • El PhD pH no coincide
El valor no fue determinado correctamente • El el indicado Con medio
estaba vencido.
25. Aparición de turbiedad o precipitados:  El medio preparado perdió agua por
evaporación El medio se calentó en exceso El medio no se calentó lo
suficiente. No fue empleada la cantidad del medio o suplemento
recomendada. El color del medio no coincide con el indicado:  El medio fue
sobrecalentado durante su preparación. El pH no fue ajustado
correctamente. El recipiente empleado estaba sucio. Los azúcares
contenidos en el medio se caramelizaron
26. El gel se obtiene más blando que lo característico para el medio:  No fue
garantizada la disolución total del agar durante la preparación del medio. No
fue empleada la cantidad de la media recomendada o se añadió agua en
exceso. El crecimiento de los microorganismos es pobre:  El medio fue
sobrecalentado El valor del pH no fue ajustado correctamente. La adición
de suplementos al medio se efectuó a excesiva temperatura. El medio no
fue mezclado correctamente.
27. El crecimiento de los microorganismos es atípico:  Quedaron residuos de
sustancias inhibidoras del crecimiento no deseables, en los recipientes donde
se preparó o distribuyó el medio. El medio de cultivo fue preparado de
manera incorrecta. El producto sobrepasa la fecha de vencimiento.
28. ES, POR LO TANTO, MUY IMPORTANTEQUE EL TECNÓLOGO MÉDICO SEA
QUIEN SUPERVISE Y CONTROLE TODOS LOS FACTORES NECESARIOS
EN LAPREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOSMEDIOS DE CULTIVO,
PARA ASÍ LOGRAR AISLAR E IDENTIFICAR CON EXCELENCIA LOS
DISTINTOS AGENTES MICROBIANOS.
29. Microbiología, Prescott
30. Microbiología, Prescott
31. Los métodos de siembra se utilizan para inocular por distintos métodos sobre un
medio de cultivo apropiado una muestra que contenga bacterias con el fin de
reproducirlas para aumentar el número de individuos de la población y formar
colonias en el caso de medios sólidos.
32. I. Siembra con rastrillo. Siembra con asa de cultivo- Diseminación en superficie-
Agotamiento en superficie- Tubos en superficie- Tubos en profundidad o
picadaIII. Siembra con rótula
33. Siembra con rastrillo Manual de microbiología 2011, U. Mayor
34. Siembra de diseminación ensuperficieManual de microbiología 2011, U Mayor
35. Siembra sema-cuantitativa de agotamiento en superficie. Manual de
microbiología 2011, U Mayor
36. Siembra de tubo en superficie. Manual de microbiología 2011, U Mayor
37. Siembra de tubo profundidad. Manual de microbiología 2011, U Mayor
38. Pared celular bacteria gran positiva y gran negativa Gram positiva Gram
negativa
39. Gram negativa de Braun
40. Gram positiva
41. 1 minuto De colorar 30con alcohol- 15segund segundo acetona os s
42. DIRECTOS Primera aproximación al posible diagnóstico Técnicas rápidas
ybaratasDiagnósticos rápidos certeros
43. EXAMEN AL FRESCO MATERIA GENITAL Secreción Semen, Orina de vaginal
y/o secreción primer uretral prostática chorro
44. LEVADURASBACTERIASCLUE CELLSLEUCOCITOSTRICHOMONAS

MARCO TEÓRICO

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de

éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de
microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste
contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o asténico,
cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo
mixto.

Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada

en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.

Un cultivo asténico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una

sola célula. Los cultivos asténicos son muy raros en la naturaleza. En los medios
naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos
mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.

Un cultivo asténico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener

un cultivo asténico se han de tomar precauciones especiales, ya que los
microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los
instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no
deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda
ser asténico. El segundo paso para obtener un cultivo asténico es inocular o
introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o líquido,
esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del
resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por
una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es
un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un
medio sólido. (KONEMAN, 2006)
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o
matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el
crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben
considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos
indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra
(inóculo) a sembrar.

Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena conciencia

de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el aíre y todas las
superficies estén densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la
transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben tener una
serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área
de trabajo, el lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios
de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona
estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. (HERNANDEZ,
2003)

Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se

le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita
accidentes tales como:

La contaminación y pérdida del cultivo en estudio.

La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la

contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto es
particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos
patógenos.

Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante

consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de
bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de
microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se
adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta

(para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar
protegida con filtro de algodón), pipeta Pasteur, cable de Colle o por tasa con
alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.
Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa
recta) o pipeta Pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando
se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se
agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean
para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de
microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno.

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aun

cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos
requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se
favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo.
Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las
condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de
los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están
relacionadas con la de su hábitat natural.

Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas

más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas
temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a
temperatura constante, en tanto que para los microorganismos que presentan su
crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta
o cajón del laboratorio, a temperatura ambiente. (Bock, 1998)

Técnicas de siembra:

Técnica de siembra en medios contenidos en tubos

Se tiene siembra en medios de cultivo contenido en tubos, ya sea caldo, caldo

nutritivo, agar inclinado, otros. Así se observará en las colonias su intensidad de
enturbiamiento, aparición de película o sedimento en el tubo, también poder
determinar un crecimiento móvil o no.

En esta siembra se debe tener mayor cuidado, puesto que un contaminante del aire
puede superar en crecimiento al microorganismo de estudio, por lo tanto, se deber
tomar las siguientes precauciones:

Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo

que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la
bica de este.

Los tapones se deben mantener en la mano contraria a aquella que contiene el

tubo, sosteniéndolos entre el dedo menique, el anular y el dedo del corazón. Nunca
deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar.

Flamear la boca de tubo antes de cerrarlo después de la siembra o inoculación.

Esterilizar el asa adecuadamente (toda porción que entra en contacto con el medio
de cultivo)
Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.

Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del

tubo.

Al sembrar trabajar en cámara de flujo laminar o en su defecto con mechero

Bunsen.

En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así como,
utilice asas totalmente rectas.

(HERNANDEZ, 2003)
Siembra en tubos por estrías simples

Se realiza en un tubo con medio solido inclinado (en

bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la
superficie expuesta del agar de manera que se
marque con movimiento en zigzag o surcos en la
superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va
avanzando hacia arriba por el área inclinada. Luego
incubar en estufa durante 28-48 horas a
temperatura más adecuada a 37ªC. (SWANSON
M. J. Katherine, 2001)
Siembra en tubos por picadura

Se realiza con asa recta en punta en tubos de

medios sólidos y semisólidos generalmente sin
inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con
el microorganismo al medio de cultivo por el centro
de superficie, llegando con el extremo del asa al
fondo del tubo y retirándolo posteriormente por la
misma trayectoria utilizada al realizar la picadura.
Una siembra con asa (de argolla) o con cierto
movimiento de vaivén podría originar un patrón de
crecimiento que se interpretaría erróneamente como
movilidad bacteriana. Por último, incubar durante 24-
48 horas a temperatura optima de crecimiento. (ROJAS, 2011)

Siembra en tubo en medio líquido (caldo líquido)

Transferir asépticamente con el asa

bacteriológica (de argolla), o en algunos
casos, pipetas estériles o hisopos. Si se usa
asas bacteriológicas, de una pequeña
muestra de microorganismos, se transfiere
desde el tubo que contiene el material
problema al tubo con medio de cultivo estéril, se inocula el microorganismo en el
medio líquido, sumergiendo el asa en el líquido y rotar el mango para desprender la
muestra. (MADIGAN, 2009)

Técnicas de aislamiento

Un modo de estudiar un ecosistema microbiano consiste en aislar de él los

microorganismos y estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. El
aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios experimentales
en el laboratorio y para las aplicaciones en los campos de la biotecnología y la
microbiología industrial y ambiental

A continuación, se mencionan tres de ellas:

Siembra en placas de Petri por rayado

Siembra en placa vertida

Diluciones en serie

La siembra en placas de Petri por rayado

Esta técnica se basa en la separación de los microorganismos al dispersar-por

rayado sobre agar- una muestra que los contiene. Para llevar a cabo la
disgregación, se recoge una porción de la muestra con un asa bacteriológica y se
raya sobre una sección de una placa Petri; luego, se repite el rayado en tres
secciones más de la placa. En cada rayado, se toma la muestra de la sección
anterior por lo que se logra una disminución gradual en la cantidad de
microorganismos.

Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el tiempo

recomendados; al crecer, formarán colonias separadas unas de otras en alguna de
las secciones del rayado.

Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y se repite

el procedimiento, con la finalidad de confirmar la presencia de un solo tipo de
microorganismos. (HERNANDEZ, 2003)
Técnicas de estriado:

estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma
la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del
mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja
a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a sembrar) y
con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y
con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas),
oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar;
mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.
estriado en cuadrantes: la mayor parte del inóculo e descarga en los cuadrantes 1y
2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra,
previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se
extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con medio, en forma de
estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el medio. Se flamea el asa,
se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de
nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite
sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas
siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre
en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de
una muestra que contenga un elevado número de bacterias. (Brock, 1998)

La siembra en placa vertida

En esta técnica se hacen crecer los microorganismos en tubos, cada uno con una
concentración diferente, y se evalúa el tubo en el que las colonias crecieron en
forma separada.

Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas diluciones

y se coloca cada una en un tubo con agar fundido, como se muestra en la figura 6,
a. Luego, se mezcla homogéneamente el contenido (el agar y el inóculo) de cada
tubo y se vierte (no se siembra por rayado) en una placa de Petri, según se muestra
en la figura 6, b.

Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona

la dilución en la que se haya obtenido mayor separación de las colonias.
Por último, de esta dilución, se toma una muestra de las colonias y se siembra en
una placa de Petri, por rayado, para confirmar si el cultivo está puro. La
conformación de pureza se puede realizar por observación a simple vista (colonias
de igual morfología), por observación microscópica o mediante pruebas
bioquímicas.

Diluciones en serie

Esta técnica se aplica cuando se conoce de antemano que el microorganismo de

interés se encuentra en mayor cantidad que los demás. Para llevarla a cabo, se
preparan varias diluciones de la muestra y se incuban en el medio de cultivo
adecuado para que crezca este microorganismo; así, se logra que en alguna de las
diluciones solo él aparezca. Es necesario reconfirmar su presencia, utilizando el
método de siembra en placa de Petri por rayado. (Brock, 1998)

Morfología de la colonia de bacterias

Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivos exhiben diferentes

tipos, formas macroscópicas en su crecimiento, estas diferencias llamadas
“características culturales”, son la base para la separación de ellas en grupos
taxonómicos. Estas son determinadas por el cultivo de microorganismos en agar
Nutritivo inclinado, en placas de Petri, en caldo nutritivo y otros.

La morfología colonial, es una característica indispensable a tener en cuenta en el

aislamiento primario de una bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la
elevación de la misma. Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y
textura de la masa celular, pues también son características distintivas. La
consistencia va desde viscosas que se pegan en el asa y se separan de la colonia
formando un hilo. Así como también la pigmentación de la colonia, las películas
continúas de crecimiento (bacterias móviles), colonias lisas (generalmente
virulentas) o colonias rugosas (generalmente avirulentas). (KONEMAN, 2006
Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio

Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para
crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, también es preciso aportar las condiciones
ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo
apropiado; con respecto al oxígeno, según el caso, será aportado o eliminado.

Temperatura
Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su
crecimiento óptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen más rápidamente cuando se
aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas. Así pues,
para favorecer un crecimiento rápido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta
a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli sp la bacteria que
más frecuentemente se utiliza en investigación, se encuentra en el intestino humano y de otros
mamíferos. Este microorganismo crece óptimamente a 37ºC, la temperatura del cuerpo
humano.

Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadores o en baños de agua, ambos

controlados termostáticamente. Los incubadores, o estufas, son cámaras con aire adecuados
para el crecimiento tanto de cultivos sólidos como líquidos, preparados en cualquier recipiente,
incluyendo placas Petri, tubos de ensayo, o matraces.

pH

El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de
pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la
neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.

Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento

microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente
algún componente ácido o básico del medio; o bien, porque algún producto de su metabolismo
es un ácido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen
utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales
naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces para valores neutros de
pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se añaden normalmente como nutrientes
(fuente de fósforo y calcio); pero si se desea que actúen como tampones se precisarán
cantidades mayores.

Oxígeno

La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento

bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden
vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados
anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico.
Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios Aero tolerantes,
pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos
utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin él. Los anaerobios Aero
tolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos
microaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como
las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo
que se vaya a cultivar, se tendrá que suministrar, restringir o eliminar el oxígeno. (Prescott,
1999)

Conservación de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder
trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo
resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro
también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos
que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos
de colección. Muchos laboratorios poseen una colección de cepas que se han aislado en el
mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son
organizaciones que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a
los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi
todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja
temperatura.

Los cultivos generalmente se desecan por liofilización (congelación y desecación). El método

consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se
añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en
hielo seco y se expone al vació para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante
el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al
sellado de los viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a
temperatura ambiente.

Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias

protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de
ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en un
ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas. (Ingraham, 1998)

La estimación por el método del Número Más Probable (NMP) es muy adecuado para
determinar bacterias anaerobias, porque permite mantener un ambiente anaerobio dentro de los
tubos, sin necesitar de sistemas anaerobios más complejos como cámaras o jarras anaerobias.

En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en

muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser
aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos
marinos y suelos contaminados.

El método consiste en la estimación del número de microorganismos viables a partir de

diluciones sucesivas (1/10) partiendo de 1 g de suelo o sedimento en base húmeda o 1 ml de
agua; posteriormente, de tres o más de las diluciones se inoculan tubos con medio de cultivo
con sustratos y aceptores de electrones específicos. En este método se asume que en las
series de diluciones los microorganismos se encuentran distribuidos al azar y que al menos un
microorganismo generará crecimiento, produciendo una respuesta positiva (turbidez, cambio de
color, producción de algún metabolito específico). Esta técnica se basa en la estimación de la
densidad bacteriana por el método estadístico de máxima probabilidad, utilizando la teoría de
diluciones.

Para realizar la estimación microbiana se utiliza un mínimo de tres diluciones y un intervalo de 3

a 10 réplicas (“n” tubos de medio para crecimiento) por dilución; el número de diluciones y
réplicas utilizadas estará en función de la precisión requerida.

5. ¿De qué manera se pueden preservar cepas puras por largos períodos?

Existen varios métodos para la conservación de los microorganismos-, todos buscan que las
células sufran el daño mínimo y se preserven por el máximo periodo posible. Los cuatro
procedimientos generales son:

La siembra o el subcultivo: Este método consiste en sembrar el microorganismo en determinado

medio de cultivo y, luego, conservarlo en refrigeración. El procedimiento se debe repetir cada
cierto tiempo. Se lleva a cabo en tubos de ensayo con agar inclinado, o en botellas especiales
que contienen un medio de cultivo sólido y estéril. Una de las desventajas del método es que los
tubos guardados en refrigeración se deshidratan y, entonces el microorganismo muere, por esta
razón, es necesario repetir el procedimiento periódicamente.

La desecación: El método consiste en remover el agua celular e impedir la rehidratación de las

células de los microorganismos. Para llevarlo a cabo se inocula una muestra de cultivo en tierra
húmeda estéril (material de soporte), se separa hasta que haya crecimiento (vatios días) y,
luego se seca con aire a vacío. Después, el cultivo se guarda en una atmósfera seca o en
refrigeración. Otros materiales de soporte pueden ser sílica gel, discos de gelatina y tiras de
papel.

La congelación: La congelación es, al igual que la liofilización, uno de los métodos de

mantenimiento más utilizados, porque se logran los periodos de conservación más largos
(superiores a veinte años, cuando se utiliza nitrógeno líquido).

En el proceso de congelación lo más importante es controlar la velocidad de disminución de la

temperatura, porque, si es muy lenta, los cristales que se forman a partir del líquido contenido
en las células serán muy grandes y pueden romper la membrana celular.

El proceso de congelación se puede clasificar, con base en la temperatura en la que se lleva a

cabo, en:

Congelación ordinaria: Se mantienen temperaturas de -5 a -20°C.

Congelación ultra fría: Se efectúa en congeladores mecánicos entre -50 y -80°C.

Congelación con nitrógeno líquido: Se logran temperaturas de -150 a -196°C.

La liofilización: Es la remoción de agua de las células congeladas (sólidas) a presión reducida
(sublimación). Para llevar a cabo este procedimiento, se toma una muestra de cultivo por
conservar y se suspende en algún medio con crioprotectores, como leche, suero o glutamato de
sodio. Se transfieren unas gotas de la muestra a una ampolla, se congela y se somete a alto
vacío hasta que el agua celular se sublima (pasa de estado sólido al gaseoso). Una vez
liofilizada la cepa, la ampolla que la contiene se sella para impedir que el microorganismo se
altere por el contacto con el medio ambiente.

MATERIALES Y REACTIVOS

1. Cajas Petrie
2. Incubadora De Bacterias
3. Pipetas De 1 Ml Y 10 Ml
4. matraz Erlenmeyer De 500 Ml
5. Espátula
6. Asa De Platino
7. Agua Destilada
8. Muestra A Analizar
9. Tubos De Ensayo De 10 Y 20 Ml
10. Mechero De Bunsen
11. Algodón Y Gasa
12. Mecheros de Alcohol
13. Balanza analítica
14. Tripee
15. Malla de asbesto
16. Mortero
17. Queso
18. Papel

PROCEDIMIENTO

 El primer paso fue descontaminar o desinfectar la mesa.

 El segundo paso fue lavar el material con agua y jabón y desinfectar las cajas con etanol.


El tercer paso fue calentar agua con el matraz de Erlenmeyer y después de 10 minutos vaciar el

agar.

 El cuarto paso fue Hacer girar el matraz con agar caliente para que se enfriara por
15 minutos
 El quinto paso vaciar el agar antes de que se cuajara a las cajas petrie.


 El sexto paso fue guardar las cajas petrie.

 Séptimo paso fue hacer moler el queso y vaciarlo ala tubo de ensayo.
  Octavo paso fue Después de 4 días se sacan las cajas petrie y aplicamos el paso

número “1”
 El noveno paso fue Con mecheros de alcohol esterilizamos el ambiente
 decimoprimero paso fue estriar los cultivos con el queso de los tubos de ensayo
esterilizando cada vez las bocas de los tubos de ensayo
 decimosegundo paso fue guardas las cajas petrie
 decimotercero paso fue esperar 4 días para ver los resultados

CONCLUSION


El desarrollo de microorganismos anaerobios facultativos en un medio líquido se manifiesta
a través de la turbidez.

 El crecimiento bacteriano realizado en la siembra en placas por estría no fue claramente

observable.

 El crecimiento microbiano obtenido en la siembra por punción manifiesta la existencia de

microorganismos aerobios.

 En la siembra por punción y estría se desarrolló un tipo de crecimiento filiforme.

 El desarrollo de colonias formadas a partir de las diluciones seriadas presentan

características que difieren en forma, borde, elevación, superficie y estructura interna, lo cual
es notablemente influenciado por las concentraciones de carga microbiana del medio en el
cual dichas colonias se desarrollan.
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