VALIDACIÓN

DE

MÉTODOS ANALÍTICOS

CUALITATIVOS
 Desarrollo de un método analítico
Razones para desarrollar nuevos métodos de análisis

No hay un método apropiado para el analito en la matriz

Existen métodos pero no tienen la precisión y exactitud
necesarias
Los existentes no tienen la sensibilidad o selectividad apropiada
Evaluación de nuevas instrumentaciones y técnicas
Necesidad de disponer un método alternativo para confirmar los
datos obtenidos por otras metodologías.
 Objetivos que hay que cumplir para mejorar
un nuevo método analítico

 Mejora de la identificación del analito

 Poder realizar determinaciones, incluso al nivel de trazas, con

exactitud precisión y reproducibilidad en cualquier laboratorio.

 Fácil de usar, posibilidad de ser automatizado (poder analizar

alto numero de muestras)

 Pequeño costo por análisis

 Preparación de muestra que minimice tiempo, esfuerzo y

consumo de materiales así como disminuir el volumen de muestra
 SISTEMAS DE MEDIDA CUALITATIVOS

 La respuesta cualitativa suele ser binaria SI / NO

 Situaciones:

• Presencia / ausencia de un determinado analito en una muestra

• Presencia / ausencia por encima de un determinado nivel
(normalmente concentración)

Sistemas de screening
 > XSL
Hay analito por encima de un determinado valor, XSL ?
< XSL

Muestras

SISTEMA DE SI Análisis
SCREENING cuantitativo

NO

No se analiza
Tipos de sistemas de medida cualitativos

 Detección sensorial
o Color: cambio, aparición, etc.
o Olor
o ELISA

 Detección instrumental
o UV-Vis, Fluorescencia, Potenciometría, etc.
o Sensores: químicos, bioquímicos, etc.
o ELISA
 VALIDACIÓN

Validación es la confirmación mediante el

examen y la provisión de una evidencia
objetiva de que se han satisfecho unos
requisitos particulares para un uso
pretendido y específico

ISO 8402
 Expresión del resultado

Análisis cuantitativo Análisis cualitativo

SI / NO
VALOR ESTIMADO
 CON
INCERTIDUMBRE PROBABILIDAD DE
ERROR
 Requisitos analíticos
o
Parámetros de calidad
(performance characteristics)
Cuantitativo
• Sensibilidad, Especificidad
• Selectividad: interferencias
• Límite de detección
• Rango y linealidad
• Incertidumbre
• Exactitud: veracidad,
precisión
• Robustez
• ...
Cualitativo
• Probabilidad de falso positivo y
negativo
• Sensibilidad, Especificidad
• Selectividad: interferencias
• Límite de detección
• Límite de corte (cut off)
• Incertidumbre o región de error
• Robustez
• ...
 Respuesta teórica de un test kit

Rta

Respuesta Respuesta
negativa positiva

Concentración
Cut off

Punto de respuesta por debajo del cual un test cualitativo

resulta negativo y por encima, positivo
 Respuesta experimental de un test kit

Región de no fiabilidad o error

Rta

Zona de Zona de Zona de Zona de

correctos falsos falsos correctos
negativos positivos negativos positivos

Concentración
Cut off
 Límite de corte
 En el caso de un contaminante
Cut off ’ Cut off

Zona de Zona de Zona de

correctos falsos correctos
negativos positivos positivos

Región de no fiabilidad o error

Interesa no dar ningún falso negativo (decir que no hay analito cuando en
realidad si lo hay)
 Límite de corte

Definición (Test cualitativos)

Concentración del analito en la cual tras determinaciones sucesivas
de la misma muestra dan como resultado un test positivo en el 50 %
de las veces y negativo en el otro 50 %

Intervalo de referencia

Concentraciones por encima y por debajo del punto de corte que

por repetición de la misma muestra dan 95 % de los resultados
positivos o el 95 % negativos, respectivamente.
 Región de error

 Falsos negativos

Muestras que contienen uno o más analitos por encima del valor límite
permitido (límite legislativo) y que al aplicar el test de screening dan una
respuesta negativa

 Falsos positivos

Corresponden a aquellas muestras que realmente no contienen el analito por

encima del nivel máximo permitido y que sin embargo el test de screening
indica que están por encima de dicho nivel
 SENSIBILIDAD

Parámetros
relacionados con los
límites de la zona
de no fiabilidad

ESPECIFICIDAD

AMBOS SE EXPRESAN COMO PROBABILIDADES

 SENSIBILIDAD

cantidad VP detectados
S =
total de enfermos (VP+FN)

Proporción de pacientes con la enfermedad que tienen un

resultado positivo en el estudio = capacidad para detectar
enfermos.

Para que un estudio diagnóstico sea útil para descartar

enfermedad debe tener alta sensibilidad
 ESPECIFICIDAD

cantidad de resultados VN
E=
total de no enfermos (VN+FP)

Proporción de pacientes sin enfermedad que dan resultado

negativo en el estudio = capacidad para detectar sanos.

Para que un estudio diagnóstico sea útil para confirmar

una enfermedad debe tener alta especificidad
Valor predictivo positivo
VP
VPP =
VP + FP

Es la probabilidad de padecer la enfermedad dado un resultado

positivo en la prueba diagnóstica

Valor predictivo negativo

VN
VPN =
VN + FN

Es la probabilidad de no padecer la enfermedad (“estar sano”)

dado un resultado negativo en la prueba diagnóstica
 Valor Predictivo

Ventaja:
Enorme utilidad a la hora de tomar decisiones clínicas y
transmitir a los pacientes información sobre su diagnóstico
(definen probabilidad de enfermedad).

Desventaja:
Dependen en gran medida de la prevalencia de la enfermedad
a diagnosticar en la población de estudio:
prevalencia baja / resultado positivo: bajo valor predictivo(+).
Métodos para caracterizar un sistema de screening

 Tablas de contingencia

 Teorema de Bayes

 Curvas características de funcionamiento

 Test de hipótesis

 Curvas ROC
 Tabla de contingencia ( con 2 categorías )

o Tabla de comparación respecto al resultado obtenido mediante

un método de referencia o confirmatorio

o Las más sencillas son las que diferencian las muestras en dos
categorías

o A partir de la tabla se calculan los cuatro parámetros básicos:

FP, FN, S y E
 Tabla de contingencia ( con 2 categorías )

Muestra
Situación real (método cuantitativo)

Igual o Inferior Total

superior
Positivo tp fp tp + fp 1
Resultado
screening Negativo fn tn fn + tn 2
Total tp + fn fp + tn N

S = tp/ (tp + fn) E = tn / (tn + fp)

1) VPP = tp / (tp + fp)

2) VPN = tn / ( tn + fn)
 Tabla de contingencia

Ventaja:

 Fácil aplicación a múltiples tipos de bioensayos

Desventaja:

 Los parámetros dan una medida global de la capacidad del método

 Se supone que la muestra problema a examinar se comportará

estadísticamente de forma semejante a las ya analizadas

No se calcula probabilidad de error

 Teorema de Bayes

 Se basa en la teoría de probabilidades

 Se calcula la probabilidad de dar como válido (positivo o

negativo) un resultado cuando en realidad es válido

Probabilidad Condicional
 Teorema de Bayes

Desventaja:

 La terminología usada es compleja y presenta la dificultad del

cálculo de las distintas probabilidades intermedias

 Implica un número elevado de muestras para obtener una buena

estima de la incertidumbre o probabilidad de error
 Curvas características

 Consiste en representar la probabilidad de obtener resultados

positivos a distintos niveles de concentración

 Esta representación es sigmoidal, y la posición y amplitud de la

curva es característica de cada sistema de screening

 Desventaja
Elevada carga experimental (número elevado de análisis a
distintos niveles de concentración)
 Curvas características
Región de incertidumbre
100
100 - 
P 90
r 80
o N (x)
b 70
a Sensibilidad =P(x) =
60 1 – FN= 100 - 
b
i 50
l
40
i
d Especificidad = N (x) =
30
a FP =  P (x)
20
d
10

0
1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 Conc
Cut off
 Aplicación de los test de hipótesis

 Se establece el valor de respuesta instrumental al nivel de concen-

tración al que se quiere realizar el screening

 Se compara el valor de respuesta instrumental de la muestra

problema con el valor previamente establecido por el patrón para
decidir si es positiva o negativa

 Desventaja
No es directamente aplicable a los test kit no instrumental
 Curvas ROC

Enfermos

Sanos FVP = Sensibilidad

FFP = 1 - Especificidad
 Curvas ROC

• Se construyen graficando: Sensibilidad vs Inespecificidad

(VP vs FP) a distintos puntos de corte.

Sensibilidad
LR+ =
Inespecificidad

• Razón de verosimilitud
• Razón de probabilidad
• Cociente de probabilidades
 Likelihood Ratio

 LR refleja una relación de probabilidades: la p que un determinado

resultado ocurra en personas con enfermedad y la p que el mismo
resultado ocurra en individuos sin enfermedad

p ENFERMOS
LR =
p SANOS

S 1-S
LR (+) = LR (-) =
1-E E

 Es una característica intrínseca del estudio diagnóstico

 Curvas ROC
Área bajo la curva

 Permite cuantificar la capacidad discriminativa de un test en un

análisis ROC :
“ Cuanto más cerca de 1 mejor es el test ”

 Cuanto más arriba y a la izquierda más permite el test diferenciar

entre personas enfermas de sanas
 Curvas ROC
Punto de corte
Analisis ROC Estudio PRIDE (BNP)

Sensibilidad(S)
1

0.9 punto de máxima

 La intersección entre 0.8
discriminación

la bisectriz y la curva 0.7

determina el punto de 0.6

0.5
mayor poder 0.4
discriminativo 0.3

0.2

0.1

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

Inespecificidad (I)
 Protocolo para evaluar la “performance” de un
método cualitativo
1 ) Utili1idad clínica
Screenig, diagnóstico, confirmación o monitoreo
Determinado por la prevalencia de la enfermedad o condición a estudiar en
la población en estudio además de la S, E, valores predictivos y eficiencia

2 ) Evaluar los materiales

- Controles
- Recolección y manipuleo de muestras

3 ) Estudio de reproducibilidad
- Controles positivos y negativos
- Concentración del analito cerca del punto de corte

4 ) Comparación de métodos
- Método de referencia
- Método cuantitativo
- Diagnóstico clínico
Ejemplos
Objetivo:
Evaluar la performance diagnóstica de un test rápido de Hepatitis B Ag s/
Ag e (Binax Inc.)

 Materiales:
- 942 muestras totales
- 403 pacientes con Hepatitis B Crónica diagnosticada con biopsia, HBsAg
(AxSym) y HBV DNA (Amplicor)
- HBeAg fue detectado en 303 de 403 sueros
- 295 sueros de voluntarios de un trial de vacunación HBsAg y Hbe Ag
negativos
- 244 plasmas de donantes de sangre HBsAg y anto HBV core negativos
 Método de referencia:
Enzimainmunoensayo con micropartículas para HBsAg y HbeAg (AxSym)
Sensibilidad Analítica
 Materiales:
- 227 sueros de pacientes con sospecha clínica de SARS
- 385 y 1066 sueros de donantes de bancos de sangre de Hong Kong (HK)
y USA

 Métodos:
- IFI : Test de referencia
- ELISA
- Inmunocromatográfico ( test rapido – RT )
ELISA
 Bibliografía

• National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).

User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance;
Proposed Guideline. Document EP12-P; NCCLS, 1999.

• National Committee for Clinical Laboratory Standards

(NCCLS).Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests
Using Receiver Operating Characteristic (ROC) Plots; Approved
Guideline. Document GP10-A; NCCLS, 1995.

• Validation of qualitative analytical methods. Trullos E., Ruisánchez

I, Rius F. Trends in analytical Chemistry, Vol 23, Nº 2, 2004

• Curvas Roc. López de Ullibari Galparsoro I., Pita Fernández S. Cad

Aten Primaria 1998; 5 (4): 229-235