Digestión Anaerobia PDF

http://librosagronomicos.blogspot.
com/
Digestión
Anaerobia
una aproximación
a la tecnología
http://librosagronomicos.blogspot.com/
Digestión
Ana_erobia
una ,aproximación,
a la tecnología
M A RíA (O N S U E 100 íA z -B Á EZ
SANDRA El lANA ESPillA VARGAS
FRANCISCO MaliNA IpÉREZ
UNIVERSIDAD
NACIONAL
DECOLOMBIA:
Instituto de Biotecn01ogia
Bogotá, junio de 2002
Este "bro fue pOSi~e graC.s al al"1O d~ Siguiente gNI" de lraba'"
Engie Carolina Plazas BacIIlrióloga¡

Asistente de Investlgacion
Insllulo de Biotecnolog~
Unhlersidad Nacional de Colombia
Mana. Sena. Gonzalez Bacteridoga

Facultad de Ingenieria
Universidad de AnuaqUla
Carolina Garda Microbióloga

Posgrado Irledawllades de MlCro~dOlla
Universidad NaCiOnal de Colombia'
cados JlJio CoIazos Ingemero sanitario M.se.

Facula:l de Ingenlena
~GESTIÚN ANAEROBIA
Universidad Nacional de Colombia
UNA APROXIMACION A LA TECNOLOGIA
© UNIVERSIDAONACJONAL
DECOLOMBIA
INSTITUTODEBI01ECNOLOGIA
MARIA CONSUELO DIAI·BAEZ

~ilIogo. M.5c.
Ingenieria Ambiental
Universidad Nacion~ de CoIomtHa
SANORA BIANA ESPilA VARGAS

Bacteridoga. M.SQ..
Instiulo de Biotecnologla
Universidad Nadonal de Colombia
FRANCISCOMOIINA PEREI
Ingeniero sanitario. M.se~
FacuJta:l de Ingeniena
Un'erS~ad de AntioqUIa
Pnmera edlCion 2002

ISBN 958· 70 1·1%-1
Esta Publlcacion ha sido posible gracias al patrocinio del

Instituto Colombiano para el Fomento de la Ciencia y la Tecnologia
"Francisco lose· de caJdas" COlCIENCIAS
Diseño y diagr amacion

ALEJANDROMlINA
Correccion de estilo
CAMILOB/l~EROC.
Preparación editOrial e Impresión

UNNfRS<OADf,I{IONALDECOlOMBIA
UNlBIBIOS
urifJItikl@.dnlc.unal.oou
C9
AGRADECIMIENTOS
Los autores queremos dar un reconocimiento especial al profesor Didier

A1azard,Microbiólogo Ph,Ode la ORSTOM,quienha sido uno de los pioneros
en la enseñanza y el estudio de la microbiología anaerobia en Colombia.
Además, los autores quieren expresar sus agradecimientos a:

Instituto de Biotecnologia de la UJ.1iversidadNacional de Colombia
Facultad de Ingeniería de la Universidad !Nacionalde Colombia
Facultad de Ingeniería de la Universidad de Antioquia
Finalmente, nuestros agradecimientos a Colciencias, Programa

de Biotecnología, por el apoyo financiero' brindado a los dos grupos de
trabajo, el cual nos permitió explorar este campo, así como contar con la
infraestructura necesaria para continuar en el estudio e investigación de
la digestión anaerobia.
CONTENlmo ~
PRÓLOGO
CAPITULO
RECURSOSHíDRIOOSy TRATAMIENTODE AGUAS RESIDUALES

Recursos hídricos
Opciones tecnológicas de tratamiento
Experiencias con digestión anaerobia en Colombia y América Latina
Problemas asociados con la digestión anaerobia
CAPiTULO
HISTORIADE LA DIGESTiÓNANAEROBIA
Microbiología
Desarrollo y apli:ación de la digestión anaerobia al tratamiento de residuos
CAPiTULO
MICROBIOLOGíADE LA DIGESTiÓNANAEROBIA
Interacciones microbianas
Degradación anaerobia de la materia orgánica
Bacterias involucradas en el proceso de digestión anaerobia
Metanogénesis
Bacterias sulfato-reductoras (BSR)
CAPiTULO
PUESTA EN MARCHAY OPERACiÓN DE REACTORESANAEROBIOS

Reactores anaerobios: ¿Caja negra o ecosistema microbiano?
Etapa de puesta en marcha o arranque del reacJor
Etapa de operación
CAPITULO
CARACTERIZACiÓNDE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES

Lodos anaerol)ios
Aguas residuales
ANEXOS
[9]
PRÓLOGO
AUNQUE COLOMBIA CUENTA CON GRAN CANTIDAD DE RECURSOS HíDRICOS E HIDROBIOLÓGICQS
CONTINENTALES (MÁS DE 2.6 MILLONES DE HECTÁREAS DE LAGOS, LAGUNAS, EMBALSES,
ciénagas y pantanos, y 720.000 cauées), fenómenos como la erosión, la destrucción

de formaGibnes vegetales y la contaminación de diversos oríg,enes, han llevado al
grave deterioro de tales recursos que vemos en la actualidad.
En términos generales, la contaminación de los recursos hídricos se debe a
la descarga de aguas residuales domésticas e industriales sin ningún tratamiento,
los derrames de hidrocarburos, la actividad agropecuaria y la minería. Es por eUo,
que gran parte de los esfuel2ios de las entidades gubernamentales encargadas de
la protección de estos recursos, está orientada tanto a la aplicación de la normatividad
existente en lo relativo al control de la calidad de los efluentes vertidos, así como a la
rehabilitación y recuperación de la base natural de los ecosistemas afectados. Como
resultado de estas medidas, en la actualidad muchas industrias cuentan con varia-
dos sistemas de tratamiento y a nivel municipal, algunos centros urbanos han abor-
dado el problema de tratamiento de sus aguas residuales.
Aunque el tratamiento de aguas residuales domésticas es un proceso co-
nocido y bien estudiado, la aplicación de los mismos sistemas al tratamiento de
residuos industriales y a la recuperación y rehabilitación de suelos, no siempre ha
tenido resultados exitosos. En muchos casos ha sido necesario, no solo conocer
en forma detallada los fenómenos que se llevan a cabo, sino que además para la
definición y análisis del problema, ha sido indispensable el trabajo coordinado e
interdiscipllnario de diferentes áreas del conocimiento como la biología, la química
y la ingeniería. Un ejemplo de la necesidad de este trabajo coordinado, es el trata-
miento anaerobio de aguas residuales utilizado exitosamente en diferentes países
(Europa, Japón, China, Brasil, México, etc.), mientras en otros, problemas como la
carencia de inóoulos, la puesta en marcha de los reactores, y la estabilidad del
proceso, han generado gran desconfianza de esta tecnología cuando, en muchos
de estos casos podrían haberse solucionado si se hubieran abordado con la cola-
boración de varias disciplinas.
Por esta razón, los autores concientes de las bondades de esta tecnolo-
gía, así como de su potencial para el tratamiento de aguas residuales, han que-
rido dar a los profesionales que trabajan en el área de tratamiento de aguas
residuales, un libro donde desde un punto de vista interdisciplinario, se consig-
nan los fundamentos teóricos y algunas de las experiencias prácticas logradas
en el manejo y aplicación- de la digestión anaerobia.
El presente documento se inicia con los conceptos básicos de microbiolo-
gía del proceso, continúa con aspectos relacionados con la puesta en marcha y
operación de reactores anaeroJoios, y finaliza con los protocolos recomendados
para la medición de parámetros de control y operación. Dado que no existe en el
mercado un texto donde se consignen todos estos elementos, esperamos que
este texto pueda ser una guía importante para los profesionales que abordan esta
tecnología, además de contribuir a una mejor aplicación de la misma en el país.
Crtp'tulo.
LJ n ú
RECURSOS I H~DRlaOS~ y
TRATAMIENTO DE
AGUAS RESIDUALES·
RECUI{SOS HíORICOS
EL AGUA ES UNA MOLÉCULA, ESENCiAl E INDISPENSABLE PARA LA VIDA; CUANTITATIVAMENTE, RE-
PRESENTA EL CONSTITUYENTE INORGÁNICO MÁS ABUNDANTE EN LA MATERIA VIVA. CERCA DE TRES
cuartas partes de la superficie terrestre están oubiertas por la hidrosfera; de

ésta, los océanos representan I el 97% de la masa total de agua presente y sólo un
3% corresponde a agua dulce. El 79% de esta ú~ima fracción se localiza en los
casquetes polares y en los glaciares, el 20% conforma las aguas subterráneas y
únicamente el 1% representa agua dulce superficial fácilmente accesible.
Por su localizadón geográfica, su historia geológica y la presencia de los An-
des, en Colombiase propició laformación de seis grandes unidades o regiones ¡natura-
les:Andina, Caribe,Orinoquía,Amazonía, losvalles Ilnterandinosy del Pacífico,lascuales
dan lugar a un país privilegiado en recursos hídricos, cuyo rendimiento por km2 es
aprol<imadamenteseis veces el planetario y tres veces el suramericano (Tabla 1.1). A la
retención que ocurre en la biosfera, producto de la diferencia entre la precipitación y la
evaporación, se le conoce como 'rendimiento hídrico'.
Tabla 1.1. Precipitación I y ¡rendimientos, hidricios,
Región Precipitación anual media (mm) Rendimiento(Vslkm')
Planeta Tierra 900 10
Sur América 1.600 21
Colombia 3.000 58
Fuente: Ministerio..•.del Medio Anlbiente. 1996
A pesar que 'el recurso hídrico en Colombia ,es abundante, su distriblilción

no es uniforme; por ejemplo, en la cuenca Magdalena-Cauca -donde se concentra
el 70 % de la población-, sólo se ouenta con el 10 % de la oferta hídrica. El 30%
de la población restante, se localiza en las cuencas del Orinooo, Amazonas, Pací-
fico, Sinú, Catatumbo y Sierra Nevada donde se encuentra el 90 % restante de la
oferta Ihídrica superficial..
[14] DIGESTiÓN ANAEROBIA
En la actualidad, del total de la oferta hídrica superfi~al, solamente se utiliza

entre el S y 6% en actividades relacionadas con: agricultura (63%), generación de
energía (31 %), consumo humano (S%)" y actividades industriales (1%). Algunas esti-
maciones indican que para un funcionamiento adecuado de los ecosistemas naturales
y el sostenimiento de la capacidad de autor regulación natural de estos cuerpos de
agua, será necesario reservar 80% de la oferta superfi~al, por lo que sólo un 20% de
la oferta hídricatotal podrá utilizarse (Ministerio del Medio Ambiente, 1996).
Sumado al problema de la distribución desigual, en las últimas décadas se
ha observado un creciente deterioro de la calidad de este recurso. La contamina-
ción de las aguas continentales y oceánicas es un problema vigente, y aunl cuando
los mecanismos y efectos de esta contaminación figuran entre Ilos más conocidos
de todos los problemas ambientales, la búsqueda de soluciones eficaces muchas
veces ha sido 'complicada y no siempre ha conducido a soluciones técnicas y
económicas exitosas.
En informes gubernamentales se establece que las principales causas de
este deterioro estriban en la modificación de la cobertura vegetal y en las explota-
I
ciones mineras, impactos ambientales que generan gran cantidad de sedimentos,

y el vertimiento de aguas residuales y residuos sólidms sin ningún tratamiento a
las corrientes y cuerpos de agua. En 1996, el Ministerio del Medio Ambiente re-
portó una descarga diaria de materia orgánica de origen doméstico a los ríos
colombianos de 1.800 toneladas, y una carga orgánica de SOOtoneladas de ori-
genl industrial (Mondragón, 1996). Por la misma época, sólo el 2% de la pobla-
ción urbana realizaba algún tratamiento de sus aguas residuales (Ministerio del
Medio Ambiente, 1996 y Mondragón, 1996).
Dos años más tarde, en el Inventario Nacional del Sector de Agua Potable
y Saneamiento Básico, realizado por el Ministerio de Desarrollo Económico (1998),
se reportó que de los 1.068 municipios colombianos, solamente 154 (14%) rea-
lizaban algún tipo de tratamiento de sus aguas residuales domésticas. De éstos,
133 correspondían a áreas urbanas con menos de 100.000 habitantes, y los
restantes 21 municipios tenían poblaciones mayores a 100.000 habitantes.
De forma similar, para la disposición de residuos sólidos sólo el 40% de la
población contaba con sistemas adecuados de disposición final, generalmente
RECURSOS HIDRlCOS y TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES [15]
rellenos sanitarios (Mondragón, 1996). De los 1.068 municipios existentes en

1996, solamente 940 contaban con servicio de aseo, 42 de ellos llevaban a cabo
la disposición final de las basuras directamente en los cuerpos de agua y 538 las
disponían en botaderos o mediante quema a cielo abierto (Ministerio de Desarro-
llo Económico, 1998).
A pesar de este grave panorama, las regulaciones y las actividades de
control de las agencias gubernamentales encargadas, así como los principios de
responsabilidad integral asumidos por la industria, han llevado a que en algunos
sectores agroindustriales e industriales se realicen esfuerzos en el tratamiento de
aguas residuales. No obstante estas iniciativas, la continua descarga de impor-
tantes volúmenes de aguas residuales hace que ríos como el Bogotá, el Medellín,
el Cauca, el Chicamocha y el Magdalena, presenten altos índices de contamina-
ción, y por lo tanto, deberán someterse prioritariamente a planes de saneamiento
y recuperación.
OPCIONES TECNOLÓGICAS
DE TRATAMIENTO
En términos generales, las opciones tecnológicas de tratamiento de aguas

residuales se pueden clasificar en dos clases: el tratamiento fisicoquímico y el
tratamiento biológico. Dadas las características de la gran mayoría de las aguas
residuales, los sistemas de tratamiento involucran una combinación de procesos
físicos, químicos y biológicos, los cuales se llevan a cabo en una secuencia de
etapas conocidas como tratamiento preliminar, tratamiento primario, tratamiento
secundario o Ibiológico y tratamiento terciario o avanzado (Figura 1.1).
Los tratamientos preliminares sirven para aumentar la efectividad de los
tratamientos subsiguientes; su papel se relaciona principalmente con la remoción de
sólidos de gran tamaño. Los tratamientos preliminares más usuales son: las rejillas,
los tamices, los desarenadores, los tanques de homogenización o neutralización.
!Lostratamientos primarios tienen como objetivo principal la remoción de
materiales que pueden sedimentar (llamados 'sólidos sedimentables') o flotar
[16] !DIGESTIÓN ANAEROBIA
(llamados 'sólidos suspendidos'). 1L0stratamientos más lutilizados son: la sedi-

mentación primaria, la precipitación química y la flotación.
Tralámiento preliminar Tratamiento ~ primario-
Agua
!rllliil:luaLJ • Desareñaélo~
Igual8ción
Tratamiento.~ terciario Tratamiento secundal"io',
Oxidación aerobia: Lodos activados

Agua Filtros
; tratada percoladores
Lagunas de
oxidación
Biodiscos
Digestión aerobia: UASB

RAP
Figura 1.1 Niveles de tratamiento de las aguas residuales.
El objetivo Iprincipal de Ilostratamientos secundarios es la remoción de la

materia orgánica soluble. Se llevan a cabo mediante procesos biológicos en los
cuales, los mioroorganismos utilizan aeróbica o anaeróbicamente el material
orgánico presente en el agua residual. Los tratamientos más comunes son: los
lodos activados, los filtros percoladores, las lagunas de estabilización, las zan-
jas de oxidación, los biodiscos y la digestión anaerobia. Esta !Últimapuede con-
siderarse, en algunos casos, como un tratamiento, intermedio ,entre los primarios
y los secundarios.
Los tratamientos terciarios están orientados a la remoción de elementos
como el nitrógeno, el fósforo, los metales pesados y/o algunos materiales tóxi-
cos. Los tratamientos avanzados que más se utilizan, son: la nitrificación-
desnitrificacilf>n, la adsorción en ,carbón activado, la oxidación química, el
intercambio iónico y Iladoración.
R E euRSoS H iD R I eos y T R A T A M I E N T o D E A G U A S R E S I D U A L E s [1 7]
EXPERIENCIÁS ' CON IOIGESTiÓN

ANAEROBIA EIN COL_OMBIA __ y
AMÉRICA ILATINA
La remoción de materia orgánica soluble puede ~Ievarse a cabo a través de proce-

sos Ibiológicos aerobios o anaerobios. En ambos casos, los microorganismos utili-
zan la materia orgánica como fuente de energía y carbono, y generalil nueva
Ibiomasa, además de productos de oxidación: CO'l!f HzO,para los aerobios ó CH4y
COz'para los anaerobios.
EnColombia, el 97% de las aguas residuales se vierten en los Iríossin ningún
tipo de tratamiento, razón Ipor la cual la contaminación por esta vía constituye uno de
los problemas ambientales de mayor impacto para la sooiedad colombiana. E11
sector
agroindustrial origina (sin incluir la caña de azúcar y el benefiCiode café) una carga
de 4.000 toneladas OSO/día; ¡le siguen los sectores pecuario, doméstico (1.200
toneladas OSO/día) e industrial (520' toneladas OSO/día).
Aunque en la mayoría de los países latinoamericanos solamente el 10% de
las aguas residuales domésticas son tratadas (Oficina de Análisis Económico, Mi-
nisterio del Medio Ambiente, 1997)1 esta tendencia ha venido cambiado en I10s
I
últimos años. La utilización de reactores anaerobios para el tratamiento de aguas

residuales ha crecidb desde 1982 orientándose principalmente al tratamiento de
aguas residuales agroindustriales. La importancia económica de este sector, la
susceptibilidad de estos ,efluentes al tratamiento anaerobio y las condiciones de
temperatura de los paises del trópico han favorecido la operación de este tipo de
reactores (Sorzaccolili et al., 1996). En la Figura 1.2 se presenta el número, de
I
reactores instalados entre 1982 y 1'993 en América Latina; de ellos, 82% corres-
ponde a reactores tipo UASS, 14% a filtros anaerobios y los señalados como 'otros'
representan generalmente sistemas híbridos.
I
En 1994 existían en América Latina aproximadamente . 396 reactores

anaerobios los cuales trataban un volumen aproximado de 394.421 m3. El 43%
(182.286m3) eran utilizados en el tratamiento de aguas residuales industriales y
[18] [10 I G E S T I 6 N A N A E R O B I A
agroindustriales, y el 57% restante, para domésticas, o se utilizaban en 11a,diges-

tión final de lodos provenientes de plantas de tratami.ento aerobias. La mayoría de
los reactores que trataban I efluentes agroindustriales (11 5), se localizan en Bra-
sil, yen menor propor~óm en México (22) y Cdlombia (10) Yel resto en otros
países. Básicamente, los efluentes tratados provenían de la industria cervecera
(40%), malterías (21 %), destilerías de caña de azúcar (5%), yel 34% de la indus-
tria de levaduras (Borzacconi ,et al., 1996).
80
o
13
!~!:~60
.:1.,
~ .. 40
:z
20
Tiempo (años)
QOlros llFA UASB
Figura 1.2. Reactores anaerobios. utilizados en el tralBmienlo de' efluenlBs'

agroindustriales en América Latina. ,(1982-1993).,
Se calcula que en Colombia existen más de 80 reactores anaerobios los

cuales tratan un caudal aproximado de 855 J/seg. Estas instalaciones se utilizan
para el tratamiento de efluentes de procesos industriales, agroindustriales yaguas
residuales domésticas. En la Figura 1.3 se presenta la distribución porcentuall por
volumen y caudal tratado. Los biorreactores tratan efluentes de las industrias
cervecera, de levaduras, de gaseosas y refrescos, papeleras y de lavado de lana,
con eficiencias que oscilan entre 40 y 70% (Duque, 1996).
[18] IoIGESTiÓN ANAEROBIA
agroindustriales, y el 57% restante, para domésticas, o se utilizaban en la diges-

tión final de lodos provenientes de plantas de tratamiento aerobias. La mayoría de
los reactores que tratabalil efluentes agroindustriales (11 5), se localizan en Bra-
sil, yen menor proporción en México (22) y Colombia (10) Yel resto en otros
países. Básicamente, los efluentes tratados provenían ,de la industria cervecera
(40%), malterías (21 %), destilerías de caña de azúcar (5%) yel 34% de la indus-
tria de Ilevaduras (Borzacconi el al., 1996).
120
100
•• 8'0
Oí
1) ••
,1
• ""60
..( ~
211.1-
'S
z 40
20
1982 1983 1'984 1985 1l)86 19S7 19S8 1981) 19l)O 1991 1992 1993
Tiempo (años)
o Otros miFA UASB
Figura 1.2. !Reactores anaerobios utilizados en el tratamiento de efluentes

agroindilstriales en América !Latina (1982-1993).
Se calcula que en Colombia existen más de 80 reactores anaerobios los

cuales tratan un ,caudal aproximado de 855 I/seg. Estas instalaciones se utilizan
para el tratamiento de efluentes de procesos industriales, agroindustriales yaguas
residuales domésticas. En la Figura 1.3 se presenta la distribución porcentual por
volumen y caudal tratado. Los biorreactores tratan efluentes de las industrias
cervecera, de levaduras, de gaseosas y refrescos, papeleras y de lavado de lana,
con eficiencias que oscilan ,entre 40 y 70% (Duque, 1996).
RECURSOS HiDRICOS y TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES [19]
Agua residual industrial

268 Vsegl
Agua residual 31%
dOlOéslica
567 VsegL
66%
Agua residual
agrolndustrial
27 Vsegl
3%
Figura 1.3,. Distribución ¡porcentual del volumen y el caudal que tratan los reactores'
anaerobios instaladds en Colombia (Duque, 1996).
Para las aguas residuales domésticas, de los 154 municipios Cdlombianos

donde se reporta tratamiento de aguas servidas, las lagunas de estabilización
constituyen 'el mayor número, seguidas por sistemas de aireación extendida y reac-
tores anaerobios tipo UASB (Tabla 1.2).
Tabla 1.2. Sistemas de tratamiento, de aguas residuales en los municipios

colombianos, en 1996
Tipo J:1B,gJ,a"Wa, .da tratamiento No. de Municipios
Plantas compactas aerobias 6
Lodos activados 17
Filtros lpercoladores
Lagunas de estabilización 96
Filtros biológicos 18
Aireación extendida 26
Reaelores anaerobios UAS8 17
Otros 16
Número de Municipios que tratan sus aguas servidas: 1541 TOtal de Municipios: 1068
Fuente: Ministerio de Desarrollo. 1998.
[20] o I G E S T IÓN A N A E R O B I A
PROBLEMAS ASOCI~DOS CON LA

DIGESTiÓN ANAERO_BIA
Puesta enl marcha de los réélctares
Una característica particular de los microorganismos anaerobios es su baja tasa

de crecimiento; por lo tanto, al iniciar el proceso se requiere un período de
tiempo que puede oscilar entre 30 y 180 días dependiendo de la calidad y
cantidad del inóculo utilizado (Weiland y Rozzi, 1991). Sin embargo, en los ca-
sos en los que no se cuenta con inóculos adecuados esta etapa se puede pro-
longar, incluso hasta condicii:mes críticas en las que nunca se alcanza la
estabilidad. Por 'ello la optimización de la puesta ,en marcha requiere contar con
las herramientas apropiadas para la evaluación de los inóculos; además, en
muchos casos es necesario desarrollar costosos procesos para la obtención de
semillas o inóculos más eficientes.
Postratamiento
Por lo general, con la digestión anaerobia no se logra la misma remoción de

materia orgánica que con los procesos aerobios. La presencia de concentracio-
nes importantes de sólidos suspendidos, nutrientes y organismos patógenos en
el efluente de los sistemas, hace necesario complementan el proceso con
postratamiento. Los recursos tecnológicos más utilizados incluyen procesos bio-
lógicos como los filtros percoladores, las lagunas de oxidación, los humedales y
estanques con plantas acuáticas; también se usan procesos físicos, químicos o
fisicoquímicos como lafiltración en arena, la desinfección con cloro o lafloculación
y coagulación (Van Haandel y ILettinga, 1994).
R E e u R S o S H io R I e o s y T R A T A M I E N T o o E A G U A S R E S I o U A L E s [21 ]
Producción de olores,
Uno de los mayores problemas aso~ados con la tecnología anaerol:lia es la libera-

ción de' malos olores atribuida a la produccWn de compuestos azufrados como el
ácido sulfhídrico (H2S) en el biogás. Estos compuestos tienen un olor muy ofensivo
que se ha convertido en la principal causa de conflictos con las comunidades
aledañas a las plantas de tratamiento de agl!Jasresiduales. Un caso muy conocido
es el de la planta El Vivero Municipal de {ali, Ilacual tuvo que cerrarse entre 1991
y 1994 por este problema (Mora, 1996; Sterling y Mora, 1998). lEn este campo,
existen múltiples necesidades de investigación, por lo que diferentes grupos estánI
desarrolldndo varios proyectos orientados a la remoción de estos gases (Gómez y
Figueroa, 1998; Martínez et al., 1998; Sterling y IMora, 1998) en ellpaís.
R E eu R S o S H í D R I eos y T R A T A M I E N T o D E A G U A S R E S I D U A L E s [21 ]
¡Producción de olores
Uno de los mayores problemas asociados con Ilatecnologia anaerobia es la libera-

ción de malos 'Olores atribuida a la producción de compwestos azufrados como el
áddo sulfhídrico- (HzS) en el biogás. Estos compuestos tienen un ol'or muy ofensiyo
que se ¡ha convertido en la principal causa de conflictos con las comunidades
aledañas a las plantas de tratamiento' de aguas residuales. Un caso muy CQnoGi~o
'
es el 'de la planta El Vivero Munic;:jpalde Cali, la cual tuvo que cerrarse entre 1991
y 1994 por este problema (Mora, 1996;, Sterlimg y Mora, 1998). lEn este campo,
existen múltipl~s necesidades de investigación,I por lo ,que diferentes grupos están
desarrollandol varios proyectos orientados a la remoción de estos gases (Gómez y
lFigueroa, 1998; Martínez et al., 1998; Sterling y Mora, 1998) en el país.
R E eu R S o S H í D R I eos y T R A T A M I E N T o D E A G U A S R E S I D U A L E s [21 ]
Producción I de olor~s
Uno de los mayores problemas asociados con la tecnología anaerobia es la libera-

ción de' malos olores atribuida a la ¡producción de compuestos azufrados como el
ácido sulfhídtico' (HzS) en el biogás. Estos 'compuestos tienen un olor muy ofensivo,
que se ha convertido en la principal 'causa de conflictos con las comunidades
aledañas a las plantas de tratamiento de aguas residuales. Un caso muy conocido
es el de la planta 61Vivero Municipall de Cali, la cualltuvo que cerrarse, entre 1991
y 1994 por este promlema {Mora, 1996; Sterling y Mora, 1998).1 En este campo,
existen múltiples necesidades de investigación, por lo que diferentes grlilpos están
desarrollandol varios proyectos orientados a la remoción de estos gases (Gómez y
Figueroa, 1998; Martínez el aI., 1998; Sterling y Mora, 1998) en el país.
[22] o I G E S T ION A N A E R O B I A
BORZACCONI,L, López, ~.yViñas, M. (1995). "Application 01Anaerobic Digestion to the Treatment
01 Agricultural Effluents in Latin America". Water Science Techno/r/gI¡, 32: 105-111.
DUQUE,A. (1996). "Desarrollo de reactores anaeróbicos en Colombia". En: Cuarto seminario
taller latinoamericano sobre tratamiento anaerobio de aguas residuales. Red Colombiana
de Biotecnología Ambiental y Universídad Industrial de Santander. Bucaramanga

(Colombía).
GáMEZ, G. y Figueroa, C. (1998). "Eliminacíón de contaminantes del aire y gases por procesos
biotecnológipos". En: Segundo simposio colombiano sobre biotecnología ambiental.. Red
Colombianade BiotechologíaAmbientaly FundaciónUniversitariade Boyacá.Tunja (Colombia).
LEITINGA¡ G. (1995). "Anaerobie Digestion and Wastewater Treatment System". Antonie Van
Leewenhoek, 66: 271-294.
MARTíNEZ,A., Támara, W., Vela, G. y Vargas, C. (1998). "Diseño y construcción de un bioliltro la
escala piloto para el tratamiento de olores y VOC's". En: Segundo simposio colombiano
sobre biotecnGlogía ambiental.. Red Colombiana de BiotecnGlogía Ambiental y Fundación

Universitaria de Boyacá. Tunja (Colombia).
Ministerio' del Medio Ambiente (1996). "Lineamientos de política para el manejo integral del
agua". Revista ACOOAL 169, 20. trimestre: 10-30.
Ministerio de Desarrollo Económico (1998). Inventario nacional del sector de agua potable y
saneamiento. Bogotá (Colombia).
MONDRAGÓN,L (1996). "Políticas nacionales relacionadas con el mejoramiento de la calidad
del agua". En: Conlerencia internacional de mejoramiento de la calídad del agua.

Universidad del Valle. Cali (Colombia).
MORA,L (1996). "Control de olores en la planta de tratamiento de aguas residuales UASBVivero,
MuniGipalde EMCALJI".En: Primer simposio colombiano sobre biotecnología ambiental..
RedColombianade Biotecnología Ambiental y Universidad de Antioquia. Medellín (Colombia).
RECURSOS HfDRICOS y TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES [23]
Ministerio del Medio Ambiente, Oficina de Análisis Económico (1997). "Aguas limpias para Colombia
al menor costo. Implementación de Ilas tasas retributivas por contaminación hídrica".
Revista Palmas, 18 (3)! 69-79..
STERLlNG,C. y Mora, L. (1998). "Resultados de una planta depuradora tipo UASB, IEIVivero
Municipal de EMCAU". En: Segundo simposio colombiano sobre biotecnología
ambiental., Red Colombiana de IBiotecnología Ambiental y IFundación Universitaria de
Boyacá. Tunja (Colombia).
VAN HMNOEU, A. y Lettinga, G. (1994). Tratamento anaerobio de esgotos em regioes de clima
quente. Editorial IEpgraf, Campina Grande (Brasil).
W61LANOyRozzi. (1991). "The start up operation an monit0fing of high rate anaerobic treatment
systems". Water Seienee Teeho/lgy, 24 (8): 257-277. ,
capítulo
d o s
HlrSTORIA lOE
ILA DIG~ESTiÓN
ANAEROBIA
COMO SE MENCIONA EN DIFERENTES IREVISIONES (BARKER, 1956; IEI:lNDER, 1978) LA PRIMERA
DESCRIPCiÓN SOBRE LA PRODUCCiÓN DE METANO EN LA NATURALEZA. FUE HECHA POR VOliTA EN
1776, quien lo definió como el 'gas de los pantanos'. IUnsiglo después, se demostró la
producción de este gas en el intestino grueso de los reos recién ejecutados, asícomo en
el estómago de Ilos rumiantes. En 1868, Béchamp realiza experimentos en los que
observa la producción de metano al inocular un medio de etanol con heces de conejo;
este resultado perm~e confirmar las observaciones realizadas por Reíseten 1858 en las
pilas de estiércol almacenadas (McCarty, 1982).
MICROBIOLOGíA I
A finales del siglo XIX, Popoff, Van Senus y Omelianski ¡realizan estudios detallados
sobre Ila producción microbiológica de metano (McCarty, 1982). Estos investiga-
dores establecen que la metanogénesis es un proceso, derivado· del rompimiento
de materiales poliméricos como la celulosa, dependiente de Ila temperatura. Sin
embargo, hasta ese momento no era claro si las bacterias productoras de metano
eran capaces de utilizar los polímeros directamente, o si la generacióR de este
gas era el producto de la utilizacióm de moléculas más simples produGidas por el
rompimiento de los polímeros por otros microorganismos, En sus estudios,.
Omelianski demostró que durante la fermentacié>n metánica de la celulosa se pro-
duce hidrógeno, ácido acético, y ácido butírico, [para finalmente formar metano de
acuerdo· con la siguiente reacción:
Las observaciones de IBéchamp, y los Iresultados obtenidos por OmeJianski,

permiten a Sohngen llevar a cabo una serie de experimentos en los cuales
estudió la producción de metano a partin de sustratos puros como el formato, ,el

acetato, el butirato, el etanol y una mezcla de H/COzl similar a la obtenida durante
la descomposición anaerobia de la celulosa (McCarty, 1982). Los resultados per-
mitieron concluir que estos sustratos son compuestos intermediarios generados
durante la fermentación metánica de la celulosa. Aunque se hicieron ,observacio-
nes microscópicas de algunas especies de microorganismos que actualmente se
Ireconocen como metanogénicas, los investigadores nunca lograron aislarlas y
oultivarlas ,enforma pura en elllaboratorio.
lEn 1936, Barker anuncia el primer aislamiento en cultivo puro de un
metanógeno al que denomina Melhanobac1llus omelianskll" y muestra los resulta-
dos de los primeros estudios bioquímicos con este microorganismo. Señala Ila
capacidad de esta bacteria para oxidar el ,etanol a aoetato, y basado en la teoría
de Ilareducción del dióxido de carbono desarrollada por Van Niel en 1934 (Barker,
1956), plantea que los electrones generados durante la oxidación son utililados
para reducir los iones bicarbonato los cuales actúan como aceptores finales de
electrones de la siguiente forma:
Oxidación: ClfjCOOH + 2Hp =>- 2COz + 8H+

Reducción: 8H+ + COz CH4 + 2Hp
Reacaión neta:
Posteriormente en 1948, Buswell y Sollo, utilizando C14como trazador,

demostraron que la formacióll de metano a partir de acetato no ocurre por reduc-
Ción del dióxido de carbono, sino por la descarboxilación de este compuesto: Este
hecho posteriormente es verificado, por Stadman y Barker (1949), YPiney Barker
(1956), confirmandb la hipótesis formulada por Sohngen.
Con el desarrollo de nuevos procedimientos para el cultivo de microorga-
nismos anaerobios estrictos (Hungate, 1969) se iniDiauna nueva era en las investi-
gaciones sobre metanogénesis. La introducción de la técnica del tubo rodado (roll
lube), así como el uso de las nuevas'cámarasde anaerobiosis, permite el aislamiento
de numerosas especies metanogénicas en cultivo puro. Mediante el uso de estos
nuevos Iprocedimientos,Bryant el al. (1967) iniOianel estudio sobre la metabolizaclión
H 1ST O R I A O E L A O I G E S T ION A N A E R O B I A [29]
del etanol por un cultivo de M. omelianskll. los ¡investigadores ,encontraron que para
poder llevar a cabo la fermentaciónl metánica, ,este microorganismo (denominado
posteriormente oomo Methanobaden:um bryantli), requería de la asociación con otro
microorganismo que los autores denominaron "Organismo No Metanogénico 'Sil. De
esta forma, para lograr el proceso metanogénico completo, era necesario contar con
un Organismo No Metanogénico S el cual oxida el etanol a acetato e hidrógeno,
mientras que el M. bryantii cepa MoH reduce el bicarbonato presente en el medio oon
el hidrógeno ,generado por el organismo S. Termodinámicamente, las reacciones
fueron descritas de la siguiente forma:
Microorganismos L1Ca' (kJ)
Microorganismo S:
2C2HpH + 2Hp 2CHPOO- + 4H2 + H+ + 19.2
M. bryantii:
4H2 + HC03• + H+ CH4 + 3Hp -135.6
Reacción neta:
-116.4
La remooión de'l hidrógeno por el M. bryantli' permitía mantener la presión

parcial de este gas por debajo de 10 3 atmósferas, lo cual favorecía termodinámica-
mente la primera reacción y perm~íael crecimiento del Organismo INolMetanogénico
S. Este descubrimiento mostró la importancia del hidrógeno como intermediarío en
los habitats anaerobios (Hungate, 1967) y permitió la formulación de una nueva
relación biológica interespecíficaconocida como 'asociación sintrófica' o "transferencia
interespecíficade hidrógeno', que aclara una de las relaciones más importantes en la
ecología microbiana de los ambientes metanogénicos.
La subsecuente caracterización de las vías metabólícas típicas de las
bacterias metanogénicas, así como la de los cofactores involucrados en el
[30] o I G lE S T IÓN A N A E R O 8 I A
proceso de generación de metano, llevó al cuestionamiento de las relaciones

filógenéticas con otras bacterias¡ al ligual que su papel en la evolución de la
Vida sobre 'el planeta. Mediante el examen de los patrones de secuencia de
Ilos oligonucleótidos ' de la fracción ribosomal 165, fue posibl'e demostrar que
este grupo es filogenéticamente diferente de otros procariótidos y de las cé-
luías eucariótidas (Figura 2.1). Como también se observó, una alta diversi,-
dad dentro del grupo sugirió la existencia de una divergencia evolutiva que
IpUdo haber dado lugar a la aparicióm de las tres l.íneas ancestrales que origi--
naron los reinos actualmente conocidos_ como Eucariota, Eubacteria y
Archaebacteria (Balch el al.., 1977).
ARQUEOBACTERIAS :
METÁGENOS
\ H~S 1ERMÓFILOS EXTREMOS
=
""~ EUCARI0TES
,~ .__ ----.J
1I I
Bacteria
Cianobaclerias verdes no
Flavobaclecias azufradas
Thermologa
Figura 2.1. Árbol filoge:nético universal."
DESA~ROt!.LO y APUCACiÓN PE
LA DIGESTiÓNI AN~EROBIA AL
TRATAMIENTO IDE IRESIDUO_S
!La primera aplicación documentada del tratamiento anaerolilio de aguas

residuales domésticas fue descrita ¡por Mouras al final del siglb, XIXen Fran __
cia. El tratamiento se llevaba a cabo en una cámara cerrada hermética-
mente, en ¡la cual los sólidos sedimentados· se degradaban
anaéróbicamente, (McCarty, 1982).
HISTORIA DE LA DIGESTiÓN ANAEROBIA [3
En la última década del siglo XIX y comienzos del siglo XX, en Inglate-
rra, Alemania, India y Estados Unidos se desarr011aron varios sistemas muy
conocidos: el tanque séptico inventado en Inglaterra ¡por (ameran y el tanque
Imhoff en Alemania. En ambos casos los sólidos presentes decantan para ser
degradados aneróbicamente en el fondo del reactor. Este tratamiento ¡prima-
rio de los sólidos fue ampliamente aplicado entre las dos guerras mundiales;
en Alemania se utilizó el tanq~e Imhoff para una población de doce millones
de habitantes (Van Haandel y Lettinga, 1994).
Debido a la baja remoción de materia orgánica, así como a los largos
períodos de tiempo que requieren los sistemas anaerobios, a partir de 1945,
empieza la utilización masiva de sistemas aerobios especialmente, Ilodos activa-
dos y filtros percalladores. La alta ,eficiencia de estos sistemas ,en cuanto la
remoción de la materia orgánica expresada en términos de OSO (90-95%),
comparada con la obtenida con los procesos anaerobios (30-50%) hacían a
'estos !Últimos poco competitivos. En la actualidad, se reconoce que la baja efi-
Ciencia de estos sistemas se relaciona con un pobre contacto entre la masa
bacteriana presente y el material suspendidb y disuelto del agua residual (Van
Haandel y Lettinga, 1994). Por 'esa razón, gran parte del material disuelto o
hidrolizado no IPodía ser utilizado y era descargadb en el efluente del sistema.
A Ipartir de la década de los años 70 fue plenamente reconocida la impor-
tancia del contacto entre el lodo y el sustrato, lo cual permitió el desarrollo de
nuevas configuraciones de reactores y demostró que estos procesos pueden al-
canzar eficiencias de remoción de materia orgánica comparables con las de los
procesos de depuración aerobios.
En términos generales, se Iregistran tres generaciones de reactores
anaerobios, las cuales se caracterizan IPorque en cada generación se reduce el
tiempo de retención hidráulico y mejora el contacto entre el lodo y el sustrato, lo
cual significa menores volúmenes de reactor, costos más bajos, sistemas más
estab'les y de más fádil operación.
Aunque podría pensarse que en la actualidad los reactores de la primera
generación han dejado de utilizarse, en muchos países se continúan usando,
'especiialmente en dos campos:
HISTORIA DE LA DIGESTiÓN ANAEROBIA [31]
En la última década del siglo XIX y comienzos del siglo XX, en Inglate-
rra, Alemania, India y Estados Unidos se desarrollaron varios sistemas muy
conocidos: el tanque séptico inventado en Inglaterra- por (am~ran Y el tanque
Imhoff en Alemania. En ambos casos los sólidos presentes decantan para ser
degradados aneróbicamente en el fondb del ¡reactor. Este tratamiento prima-
rio de los sólid'os fue ampliamente~aplicado entre las dos guerras mundiales;
en Alemania se utilizó el tanque Imhoff para una población de doce ¡mi,Uones
de habitantes (Van Haandel y Lettinga, 1994).
Debido a Ila Ibaja remoción de materia orgánica, así como a los largos
períodos de tiempo que requieren los sistemas anaerobios, a partir de 1945
empieza Ilautilización masiva de sistemas aerobios especialmente, lodos activa-
dos y filtros Ipercoladores. La alta eficiencia de estos sistemas en cua,nto la
remoción de la materia orgánica expresada en términos de OSO (90~95%),
comparada con la obtenida con los procesos anaerobios (30~50%) hacían a
estos últimos poco 'competitivos. En la actualidad, se reconoce que Ila baja efi-
cienGia de estos sistemas se relaciona con un pobre contacto entre la masa
bacteriana ¡presente y el material suspendido y disuelto del agua residual (Van
Haandel y Lettinga, 1994). Por esa ¡razón, gran parte del material disuelto o
hidroliZado no ¡podíaser utilizado y era descargado en el efluente del sistema.
A partir de la década de los años 70 fue plenamente reconocida la impor-
tancia del contacto entre el lodo y el sustrato" lo cual permitió el desarrollo de
nuevas configuraciones de reactores y demostró que estos procesos pueden al-
canzar eficiencias de remoción de materia orgánica comparables con las de Ilos
procesos de depuración aerobios.
En términos generales, se registran tres generaciones de reactores
anaerobios, las ouales se caracterizan porque en cada generación se reduce ,el
tiempo de retención hidráulico y mejora el contacto entre el lodo y el sustrato, lo
cual significa menores volúmenes de ¡reactor, costos más bajos, sistemas más
estables y de más fácil operación.
Aunque podría pensarse que en la actualidad los reactores de ilª primera
generación han dejado de utilizarse, 'en muchos países se continúan usando,
especialmernte,en dos campos:
• En la digestión de los sólidos sedimentados en reactores tipos tanque séptico

o tanque Imhoff yen lagunas anaerobias. En estos casos, los lodos sedimenta-
dos en el fondo del reactor son degradados por procesos anaerobios.
• En la digestión anaerobia de los lodos resultantes del tratamiento aerobio (Iodos
activados, filtros percoladores), para lo cual se utilizan reactores donde el tiem-
po de retención celular es igual al tiempo de retención hidráulico, por lo que se
trabaja con tiempos de retención hidráulicos muy altos (mayores de 30 días).
Como se mencionó anteriormente, los largos tiempos de retención requeri-
dos, así como un contacto inadecuado entre la biomasa y el material orgánico, ha-
cían que estos reactores fueran poco competitivos, en especial para el tratamiento
de grandes volúmenes de aguas residuales. Con el fin de resolver estos problemas,
algunos grupos de investigadores de diferentes países abordaron el diseño de una
nueva generación de reactores (segunda generación), en los cuales se independiza
el tiempo de retención celular del tiempo de retención hidráulico y se incorporan
elementos para mejorar el contacto entre la materia orgánica y la biomasa anaerobia
presente en el reactor. A fin de evitar la pérdida de biomasa en los reactores se han
probado varias estrategias (Lettinga el al. 1999; Van Den Berg, L., 1984):
• Aumentar la concentración de biomasa en el reactor mediante la recirculación
de los lodos separados en el sedimentador secundario. Este proceso que dio
origen a un sistema denominado 'reactor de contacto anaerobio' que es similar
a los lodos activados (Figura 2.2A) pero bajo condiciones anaerobias. Ha sido
utilizado en Suiza, Francia, Canadá y Estados Unidos principalmente para tra-
tar aguas residuales con materia orgánica fácilmente degradable, como el al-
midón. Sin embargo, la adherencia de las burbujas de gas a los lodos genera
problemas en la sedimentación del lodo y la clarificación del agua residual
tratada. Para mejorar la separación del lodo se han utilizado diversos métodos
como la adición de polímeros orgánicos y floculantes inorgánicos, la gasificación
y la centrifugación, pero sus resultados no han sido satisfactorios.
• Con base en la estrategia de fijar la biomasa a un soporte de material inerte, se
desarrollaron los filtros anaerobios de flujo ascendente, similares
conceptualmente a los filtros percoladores (Figura 2.2B) Estos reactores
fueron propuestos por Young y McCarthy (1969), Y en ellos se utiliza un
medio de soporte (carbón, grava, plástico, etc.) con una gran área superficial
para el desarrollo de una biopelícula anaerobia. Se han utilizado en el trata-
miento de aguas residuales con bajas cargas orgánicas y material suspendido
fácilmente biodegradable. Sin embargo, el principal inconveniente de este siste-
ma ha sido el frecuente taponamiento de los reactores, ya sea por los sólidos
presentes en el agua residual o por materiales como el carbonato de calcio o la
biomasa no adherida al soporte.
• Desarrollar un gránulo cuyas características de sedimentación y actividad
metanogénica, permitieran el desarrollo de todos los grupos bacterianos
involucrados en el proceso de degradación anaerobia de la materia orgánica.
Lodos con estas características facilitarían la segregación de las fases gaseosa,
sólida y líquida, y evitarían la pérdida de la biomasa del reactor. Como producto
de esta estrategia se presentó el reactor anaerobio de manto de lodos de flujo
ascendente,comúnmente conocido como reactor Up Row Anaerobic Sludge Blanket
(UASB) (Figura 2.2C), sistema desarrollado en Holanda por el grupo de Lettinga
et al. (1980). En la actualidad, existen más de 1.000 reactores que tratan
exitosamente diferentes tipos de aguas residuales agroindustriales, domésticas e
industriales en Holanda, Bélgica, Estados Unidos, Brasil y Cuba.
r; Mezclador Gas Gas
- --J 1
Alimentación
~. e,"," digerido Área de
Colector sedimentación
de gas
Tanque de
sedimentación
Digestor Manto
;etorno I de lodo
de lodo
-.J
-+ LIquido digerido
t
Alimentación Alimentación
(A) (B) (e)
Figura 2.2 Diversos esquemas de reactores anaerobios:

(A) Contacto anaerobio, (B) Filtro anaerobio y (C) Reactor UASB.
[34] D lúE S T ION A N A E R O B I A
Con aparición de la tercera generación de reactores anaerobios, se

optimizaron algunas variables del proceso, las cuales que se citan a continuación:
A fin de mejorar el contacto entre el sustrato y la biomasa, ésta se adherió con
partículas inertes de arena (diámetro: O.1-o.3mm), alúmina o plástico, las
cuales se expanden ante el flujo rápido del agua residual. Estos reactores se
denominaron de 'lecho fluidizado' o 'expandido', y se han utilizado en el trata-
miento de aguas residuales con alta carga orgánica (Figura 2.3A).
También, para mejorar el contacto entre la biomasa y el sustrato, y evitar los
problemas de taponamiento de los filtros anaerobios, se desarrollo el 'reactor.
de película fija y flujo descendente', en el cual la biomasa se adhiere a una
superficie tubular (Figura 2.3B). La cantidad de biomasa dependerá del área
superficial del soporte, el grosor de la película será controlado por el flujo del
agua descendente y la mezcla del residuo se logra por el flujo de gas ascen-
dente. Los sólidos suspendidos son eliminados con el efluent~ evitando así los
problemas de taponamiento. Este sistema ha sido utilizado en el tratamiento
de aguas residuales con baja y alta carga orgánica en países como Canadá y
Puerto Rico.
Gas
t
•. Alimentación
Liquido
digerido
Trampa de
soporte Material de
Lecho soporte
fluid izado
Bomba de
recirculación
Alimentación
•
Liquido digerido
(A) (B)
Figura 2.3 Reactores de lecho fluidizado (A) y de lecho fijo con flujo descendente (B).
La separación de la fase metanogénica de las fases de hidrólisis y acidificación

permite un manejo por aparte de los principales grupos microbianos
involucrados. Este sistema se denomina 'reactor de fases separadas' y logra
disminuir el tiempo de retención hidráulico, lo cual facilita la operación del
sistema y confiere una mayor estabilidad al proceso (Figura 2.4). La separa-
ción ha sido exitosa principalmente con aguas residuales parcialmente
acidificadas que se operan a bajas temperaturas.
Mezclador
11 -Gas
Líquido
digerido
Alimentación
Separador
gas. líquido. sólido
Manto
de
lodos
Acidificación Metanogenización
Figura 2.4 Reactores de fases separadas
[36] D I G E S T ION A N A E R O B I A
BIBLIOGRAFíA
BALCH,W E., Fox, G.E., Magrum, L.J.,Woese, eR. yWolfe, R.5. (1979). "Methanogens: Revaluation
of Unique Biological Group". Microbi%gica/ Reviews, 43: 260-296.
BARKER, HA (1936). "Studies upon the methane-producing bacteria". Archiv fur Mlkrobi%gy,
7: 420-438.
BARKER, HA (1956). Bacterial Fermentations. New York: John Wiley & Sons, p. 1-27.
BRYANT,M.P.,Wolin, EA y Wolfe, R.5. (1967). "Methanobaal/us ome/ianskll, a symbiotic association
of two species of bacteria". Archiv fur Mikrobi%gie, 59: 20-31'.
BUSWEL, A.N. y Sollo, F.W (1948). "The mechanism of the methane fermentation". American
Chemica/ Society Journa/, 70: 1778.
HUNGATE, R.E. (1967). "Hydrogen as an intermediate in the rumen fermentation". Archiv für
Microbi%gie, 59: 158-164.
HUNGATE,R.E. (1969) "A roll tube method for cultivation of strict anaerobes". Methods Microbio/,
3B:117-132.
LETIINGA, G., Van Velsen, A.F.M., Hobma, S.w., de Zeeuw, W. y Klapwijk, A. (1980). "Use of the
Upflow Sludge Blanket (USB) reactor concept for biological wastewater treatment,
especially for anaerobic tretament". Biotechn%gy & Bioengineering, 22: 699-734.

LETIINGA, G., Hulshoff, Poi, L.W y Zeeman, G. (1999). Lecture notes: Biological Wastewater
Treatment. Part 1: Anaerobic Wastewater Treatment. Wageningen University The
Notherlands. December 1999.
McCARTY.L. (1982). "One hundred years of anaerobic treatment". Proceedings of the Second
International Symposium on Anaerbic Digestion, Federal Republic of Germany. Sept. 6-
11, 1981. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam.
PINE, M.J Y Barker, HA (1956). "Studies on the methane fermentation. XII. The pathway of
hydrogen in the acetate fermentation". Journa/ol Baderi%gy, 71: 644.
H 1ST o R I A DEL A DI G E ST I 6 N A N A E RO B I A [37]
STADMAN, R.e. y Barker, HA (1949). "Studies on the methane lermentation. VII. Traeer Experiments
on the Meehanism 01 Melhane Formalion". Archives of Biochemistry, 21: 256.
VAN DEN BERG, L. (1984). "Development in Methanogenesis lrom Industrial Waste Water". Journal
of Microbiology, 30: 975-990.
VAN HMNDEL, A. Y Lettinga, G. (1994). Tratamenlo anaerobio de esgotos em regioes de clima
quente. Editorial Epgral. Campina Grande, Brasil.
YOUNG, J.e. y MeCarty, L. (1969). "The Anaerobie Filler lor Wasle Treatment". j Water Pollution
Control Federation, 41: R- 160.
capítulo
t r e s
MICROBIOLOGíA DE
LA DIGESTiÓN
ANAEROBIA
SE DENOMINA DIGESTiÓN ANAEROBIA AL PROCESO EN VIRTUD DEL CUAL LA MATERIA ORGÁNICA
ES CONVERTIDA EN METANO, DiÓXIDO DE CARBONO E HIDRÓGENO, EN AUSENCIA DE OXíGENO
Y a causa de la acción combinada de diferentes poblaciones bacterianas. La

formación de metano y dióxido de carbono corresponde a la última etapa de
una serie de reacciones en las cuales los compuestos orgánicos son
degradados completamente.
La digestión anaerobia es un proceso que se produce en ambientes natu-
rales como los pantanos, en zonas anegadas para el cultivo del arroz, en los
sedimentos de lagos y mares, en las zonas anóxicas del suelo, en fuentes de aguas
termales sulfurosas y en el tracto digestivo de los rumiantes. Bajo condiciones
anaerobias, los diferentes grupos bacterianos interactúan unos con otros y cons-
tituyen una comunidad microbiana, la cual tiene una estructura definida y a la que
contribuye cada población para su mantenimiento.
INTERACCIONES MICROBIANAS
En una comunidad, las diferentes poblaciones pueden desarrollar interacciones

positivas y negativas, las cuales surgen en una sola población o entre las diferen-
tes poblaciones que la conforman. Estas interacciones permiten que las poblacio-
nes alcancen un tamaño óptimo con los recursos disponibles del habitar,' en su
conjunto, las interacciones mantienen el balance ecológico de la comunidad
De acuerdo al principio de AIIee, las interacciones positivas y negativas
que ocurren en una población, dependen de la densidad. Cuando se presenta
una relación positiva, la tasa de crecimiento aumenta y cuando es negativa, se
presenta el efecto inverso. En general, las interacciones positivas (cooperación)
se presentan en poblaciones con baja densidad, mientras que las interacciones
negativas (competencia) se presentan cuando existe una alta densidad
poblacional. Como resultado, el máximo crecimiento se logra cuando se alcanza

la densidad poblacional óptima.
Cuando dos poblaciones diferentes interactúan, una o ambas podrán be-
neficiarse o afectarse negativamente de esta relación. Para categorizar estas re-
laciones se utiliza un sistema de clasificación conceptual en el cual se describe
cada una de ellas (Tabla 3.1). En general, en comunidades simples sólo se pre-
sentan una o más de estas interacciones; sin embargo, en comunidades comple-
jas probablemente se presentan todas las interacciones posibles.
Tabla 3.1. Tipos de interacciones entre poblaciones microbianas
Efecto de la interacción
Interacción Población A Población B
Neutralismo o o
Comensalismo o +
Sinergismo + +
Mutualismo + +
Competencia
Amensalismo O/ +
Predación +
Parasitismo +
O = Sin efecto.
+ = Efecto positivo.
- = Efecto negativo.
Fuente: Atlas y Bartha, 1993.
Con el desarrollo de interacciones positivas en una comunidad, los

microorganismos utilizan los recursos disponibles en un determinado habitat de manera
eficiente,combinando sus capacidadesfísicasy metabólicas,lo cual permite que lastasas
de crecimientoy/o supervivenciaaumenten. Las interacciones negativas actúan como un
mecanismode retro-alimentación que limita la densidad poblacional;no obstante, a largo
plazo son un mecanismo de auto regulación que beneficia las especies porque evita la
sobrepoblación, la destrucción del habitat y la extinción.
MICROBIOLOGIA DE LA DIGESTiÓN ANAEROBIA [43]
DEGRADACiÓN ANAEROBIA DE LA
MATERIA ORGÁNICA
Enel proceso de degradación anaerobia de la materia orgánica intervienen

diversos grupos de bacterias anaerobias facultativas y anaerobias estrictas las
cuales utilizan en forma secuencial los productos metabólicos generados por cada
grupo, según se esquematiza en la Figura 3.1. El flujo de carbones y electrones
generado durante la degradación anaerobia de los compuestos orgánicos involucra
tres grandes grupos tróficos:
• Grupo 1: bacterias hidrolíticas y fermentativas.
• Grupo 11: bacterias acetogénicas.
• Grupo 111:bacterias metanogénicas.
El proceso se inicia con la hidrólisis de polisácaridos, proteínas y lípidos
por la acción de enzimas extracelulares producidas por las bacterias del Grupo
1.Los productos de esta reacción son moléculas de bajo peso molecular como
los azúcares, los aminoácidos, los ácidos grasos y los alcoholes, los cuales son
transportados a través de la membrana celular; posteriormente son fermenta-
dos a ácidos grasos con bajo número de carbonos como los ácidos acético,
fórmico, propiónico y butírico, así como compuestos reducidos como el etanol,
además de Hz y COz. Los productos de fermentación son convertidos a acetato,
hidrógeno y dióxido de carbono por la acción de las bacterias del Grupo 11,las
cuales son conocidas como 'bacterias acetogénicas productoras de hidrógeno'
(Figura 3.1).
Finalmente, las bacterias del Grupo III o metanogénicas convierten el
acetato a metano y dióxido carbono, o reducen el dióxido de carbono a metano.
Estas transformaciones involucran dos grupos metanogénicos que son los en-
cargados de llevar a cabo las transformaciones mencionadas anteriormente.
En menor proporción, compuestos como el metanol, las metilaminas y el ácido
fórmico pueden también ser usados como sustratos de el grupo metanogénico
(Figura 3.1).
pOLíMEROS COMPLEJOS
B. celuloHticas O
Polisacáridos (celulosa),
hidroliticas
Lípidos, Proteínas
HIDRÓLISIS Grupo I
MONÓMEROS
B. fermentativas Azúcares, Aminoácidos,
Ácidos grasos
FERMENTACiÓN
[ 1
PROPIONATO
H, + CO, ACETATO
BUTIRATO
Bacterias B. acetogénicas
homoacetogenicas ACETOGENÉSIS productoras
deH
HOMOACETOGÉNESIS
• 1 Grupo 11
ACETATO 1
H, + CO, ACETATO
•
B. metanogénicas B. metanogenicas Grupo 111
acetoclasticas hidrogenofilicas
METANO
Fuente: Madigan. Martinko y Parker. 1997.
Figura 3.1. Principales etapas de la digestión anaerobia y grupos
bacterianos involucrados.
En la Tabla 3.2 se consignan las principales reacciones bioquímicas que se

llevan a cabo en el proceso de digestión anaerobia con los correspondientes
cambios de energía libre.
MICROBIOLOGíA DE LA DIGESTiÓN ANAEROBIA [45]
Tabla 3.2. Principales reacciones químicas que ocurren en la digestión anaerobia

de la materia orgánica
Tipo de Reacción Ecuación LlGO· 1 LlGo.2
(KJ/reacción) (KJ/reacción)
Fermentaciónde Glucosa + 4H20 -+ CH3COO-+ 4H+ + 4H2 - 207 -319

glucosa a acetato
Fermentaciónde la Giucosa + 2H20 -+ C,H¡02 + 2HC03- + 3H+ + 2H2 . -135 -284

glucosa a bulirato
Fermentación del Butirato + 2H20 + 48.2 -17.6

bulirato a acetato e H2
Fermentacióndel + 76.2 - 5.5

propionato a acetato
Acetogénesis a -105 - 7.1

partir del H2y CO2
Metanogénesis a partir -136 -3.2

del CO2y H2
Metanogénesis a -31 - 24.7

partir del acetato
1 Condiciones estándar: solutos 1 molar. gases 1 atmósfera.
2Condiciones típicas en un reactor anaerobio: AGV = 1mM, HC03 = 20mM, Glucosa= 1OmM, CH,
=0.6mM, H2 =10 ..• mM.
Fuente: lindero 1984.
BACTERIAS INVOLUCRADAS EN EL
PROCESO DE DIGESTiÓN ANAEROBIA
Grupo 1: Bacterias fermentativas - hidroliticas
La utilización microbiana de polímeros complejos requiere que los microorganismos

involucrados en su degradación sean capaces de hidrolizar o romper las moléculas
de polisacáridos, proteínas y grasas e hidrolizarlas a compuestos simples como
azúcares, aminoácidos y ácidos grasos. Las bacterias que llevan a cabo estas reac-
ciones son anaerobias facultativas y los géneros más frecuentes que llevan a cabo
esta reacción son los miembros de la familia Enterobacteriaceae, además de
[46] D I G E S T IÓN A N A E R O B I A
los géneros: Baci//us, Peptostreptoeoeeus, Propionibaeterium, Baetero/des,

Microeoeeus y [fostndium.
DIGESTiÓN ANAEROBIA DE POLISACÁRIDOS
En aguas residuales, los polisacáridos más comunes son la celulosa, la hemicelulosa,

el almidón y la pectina; normalmente están presentes en materiales como el papel, la
madera o la paja, los cereales y tubérculos comestibles, así como en los productos
del procesamiento del café y la fabricación de cerveza.
POLlSACÁRIDOS
AZÚCARES
1
2H PIRUVATO I 2H
H, 2H OXALACETATO
I
~ CO, +
LACTATO
CO, 1 L- SUCCINATO
ACETILCoA ACRIDILCoA
4H
rACE~ATol 4H 2H
ETANOL BUTIRATO PROPIONATO
Fuente: Bryant • 1979.
Figura 3.2. Principales vías metabólicas de la degradación anaerobia de polisacáridos.
Los polisacáridos son carbohidratos de alto peso molecular constituidos

por un gran número de unidades monoméricas unidas una a otra por enlaces
covalentes conocidos como enlaces glucosídicos. Estos enlaces pueden tener orien-
tación a o ¡3, por lo que algunos polisacáridos con las mismas unidades
monoméricas (por ejemplo, la glucosa), tienen propiedades funcionales diferentes
debido a las diferentes configuraciones (a y ¡3) de los enlaces glucosídicos. Es
M I e R o B I o LaG IA o E L A DI G E ST I 6 N A N A E RO B I A [47]
común encontrar dos tipos importantes de polisacáridos: aquellos como la celulo-

sa y la hemicelulosa con enlaces 13-1-4, y los polisacáridos como la pectina y el
almidón, con enlaces a-1-4. En la Figura 3.2 se presentan las principales vías
metabólicas utilizadas en la degradación de polisacáridos.
El rompimiento de los enlaces 13-1-4 presentes en la celulosa se lleva a
cabo mediante la acción de enzimas extracelulares, las cuales rompen el enlace
introduciendo una molécula de agua. Las enzimas involucradas en la hidrólisis de la
celulosa se conocen como 'celulasas'. El rompimiento de los enlaces a-1-4, comu-
nes en el almidón y la pectina, son hidrolizados por la acción de amilasas y pectinasas
las cuales son enzimas constitutivas de la gran mayoría de los organismos.
DIGESTiÓN ANAEROBIA DE PROTEíNAS
Las proteínas se encuentran comúnmente en aguas residuales y están constitui-

das por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Las proteínas son solu-
bles en agua y su hidrólisis se lleva a cabo por acción de proteasas; los productos
son generalmente péptidos de cadena corta y aminoácidos. Estos productos son
rápidamente fermentados a ácidos orgánicos, amonio y COz' Las bacterias con
actividad proteólitica son en su mayoría especies de los géneros C/ostridium,
Peptococcus, Bifidobacteriumy Staphy/ococcus. Las vías metabólicas utilizadas en
la degradación de proteínas se presentan en la Figura 3.3.
PROTEiNAS
¡
POLlPÉPTIDOS
!
Péptldos de
Aminoácidos + + NH, + CO,
cadena corta
Acetato, Isobutirato ]
Crecimiento
microbiano
Metilbutirato f--------
Isovaleriato
NH, + CO, ------+, Aminoácidos
Fuente: Mclnerney. 1988.
Figura 3.3. Degradación de proteínas y metabolismo del nitrógeno.
[48] o I G E S T I 6 N A N A E R O B I A
DIGESTiÓN ANAEROBIA DE LíPIDOS
Estasmoléculasestán constituidas por ácidos grasos unidos por un enlace éster a una
moléculade glicerol, y se denominan triglicéridos cuando tres ácidos grasos se unen al
glicerol. La hidrólisis dependerá de la solubilidad del ácido, la cual a su vez es función
del pH. Por tanto, a altos valores de pH la solubilidad aumenta y a bajos valores dismi-
nuirá, por lo que la hidrólisis tendrá un compo tamiento similar.
En ambientes anaerobios, los ésteres del glicerol son hidrolizados libe-
rando los ácidos grasos. El glicerol, la galactosa, la colina y otros componentes
también son liberados durante la hidrólisis y posteriormente fermentados a áci-
dos grasos volátiles por la acción de las bacterias fermentativas. Sin embargo,
los ácidos grasos libres no son fermentados por las bacterias fermentativas, y
solamente en algunos casos los ácidos grasos insaturados pueden ser
hidrogenados. En los digestores anaerobios y sedimentos acuáticos, donde el
tiempo de retención es suficientemente largo, los ácidos grasos (de cadenas
larga y corta) son oxidados por las bacterias sintróficas productoras de Hz a
acetato mediante la vía de la B-oxidación. En ambientes ricos en sulfatos como
los sedimentos marinos, la degradación se lleva a cabo por las bacterias sulfato
reductoras. Bacterias como Anaerovibrio lipolytica con actividad lipolítica han
sido aisladas del rumen; esta bacteria fermenta el glicerol, la ribosa y la fructosa
a acetato, propionato y succinato; sin embargo, no puede hidrolizar galacto-
Jípidos a menos que los residuos de galactosa sean removidos. Igualmente, la
Butyrov/brio ftbrisolvens hidroliza fosfo-Jípidos cuando crece con azúcares
fermentables como fuente de carbono.
Grupo 11:Bacterias acetogénicas
Para que tenga lugar una eficiente metanogénesis, los productos de fermentación
como el propionato y el butirato deben ser oxidados a acetato, COz'e Hz.Esta oxida-
ción es llevada a cabo por un grupo denominado organismos acetógenos productores
obligados de hidrógeno (OHPA, Obligate Hydrogen Producing Acetogens), mediante
un proceso conocido como 'acetogénesis'.
Aunque la mayoría de este tipo de reacciones consumen energía, el aco-

piamiento de la actividad de las bacterias OHPAcon la de las bacterias consu-
midoras de Hz (metanógenos hidrogenofílicos), mediante la 'transferencia
interespecífica de hidrógeno', permiten un balance energético favorable. Esto
significa que en ambientes donde la energía disponible para los
microorganismos es baja, como ocurre en reactores anaerobios, las relacio-
nes de cooperación entre los dos grupos microbianos permiten el máximo
aprovechamiento de la energía. Así, si una célula requiere un mínimo de + 70kJ
para la síntesis de 1 mol de ATP, las relaciones de cooperación entre los
microorganismos, permitirán mantener sus actividades metabólicas con sólo
-20kJ (Schink, 1997).
TRAN5FERENCIA INTER-E5PECíFICA DE HIDRÓGENO
Durante la acetogénesis el hidrógeno es un factor de regulación de la degrada-

ción anaerobia de compuestos orgánicos. La producción de hidrógeno en esta
fase proviene de la oxidación del NADPH(nicotin-adenin-difosfo-nucleótido) cuyo
potencial redox a pH 7 es -0.32 V (Wo/in, !976). Sistemas con bajos potenciales
redox (Eh)' como el que se obtiene durante la acetogénesis del piruvato, se ven
poco afectados por la presión parcial de hidrógeno y las reacciones están favore-
cidas, por lo cual no pueden ser controladas. Reacciones en sistemas con altos
potenciales redox (Eh)' como los que se presentan en la producción de Hza partir
del NADPH,o en la acetogénesis a partir del propionato o butirato, sólo estarán
favorecidas a bajas presiones parciales de hidrógeno, condición facilitada por la
interrelación entre las bacterias OHPA y las bacterias metanogénicas
hidrogenofílicas. Este último grupo, consume el hidrógeno generado por las OHPA
manteniendo una presión parcial de Hza un nivel adecuado para que termodiná-
micamente pueda darse la conversión de los AGV a acetato e hidrógeno. Esta
asociación se conoce como 'relación sintrófica' o 'transferencia interespecífica
de hidrógeno'.
El sistema sintrófico mejor estudiado en el metabolismo fermentativo,
es la fermentación del etanol a acetato y metano por un agente oxidante
anaerobio y un metanógeno.
fermentación del etanol:
2CH3CHpH + 2Hp -+ 4Hz + 2CH3COO- + 2H+

Etanol Acetato
LiGo = + 41.9 KJ/reacción
Metanogénesis:
4Hz + COz -+ CH4 + 2Hp

LiGo = -142.5 KJ!reacción
Reacción acoplada:
2CH3CHpH + COz --+ CH4 + 2CH3COO- + 2H+

LiGo = -100.6 KJ /reacción
En este sistema, los fermentadores del etanol producen hidrógeno y acetato

en una reacción con un balance energético desfavorable. Sin embargo, el hidrógeno
generado por las bacterias fermentativas es consumido por un metanógeno en una
reacción energéticamente favorable. Cuando el cambio en energía libre de estas dos
reacciones se suma la reacción total será energéticamente favorable.
Solamente un limitado número de especies del grupo OHPA han sido aisla-
das; probablemente existen más, pero aún no son conocidas. Dentro de las espe-
cies aisladas capaces de degradar ácidos grasos se pueden mencionar:
• Syntrophomonas sapovorans (Roy et a/., 1986): oxida ácidos grasos de 4 a 8
carbonos y algunos ácidos grasos insaturados produciendo acetato, COze Hz,
• Syntrophobacter wo/inii (Boone y Bryant, 1980): oxida propionato generan-
do acetato, COze Hz,
(OHPAj
-+ CH3COO- +H+ + 2Hz

LiGo = + .76 KJ/reacción
Reacción acopLada con la bacteria metanogénica:
4CH3CHzCOO- + 3Hp -+ 4CH3COO- + 3CH4+H++HC03-

LiGo = -102.4 KJ/reacción
MICROBIOLOGíA DE LA DIGESTIÓN ANAEROBIA [51]
• 5yntromonas wo/fei (Mclnerney et al., 1981). Oxida ácidos monocarboxilicos

saturados de 4 a 8 carbonos a acetato e hidrógeno.
• 5yntrophospara bryantti' (Stieb y Schink, 1985; Zhao et al., 1990) : oxida
ácidos grasos de cuatro a once carbonos.
• 5yntrophus buswe/Ití' (Mountfort, 1984): oxida el benzoato.
Todas las bacterias OHPA aisladas crecen lentamente y sus tiempos de
generación son muy largos. El estudio de 5yntrophobacter wohi7lí'(Boone y Bryant,
1980) mostró que en sintrofía con Methanospiri//um hungateitiene un tiempo de
generación de 161 horas. Este hecho junto con las necesidades de aislarlas en
co-cultivo ha limitado su estudio fisiólogico. Sin embargo en 1987, Kaspar y su
grupo de trabajo lograron desacoplar la oxidación del butirato y la utilización del
hidrógeno, sustituyendo la bacteria hidrogenofilica por una oleofina en presencia
de catalizadores. De esta forma, se logró el cultivo puro de la bacteria OHPA
abriendo así, nuevas perspectivas para futuros trabajos.
Los rendimientos energéticos (ÓGO) de todas las conversiones realiza-
das por el grupo OHPAa condiciones estándar (solutos 1M; gases 1 atm) son
positivos, por lo que se piensa que la oxidación de los ácidos grasos a hidróge-
no deberá estar acoplada a la producción de ATP.Esto significa que la presencia
o ausencia de Hz afectará el rendimiento energético de la reacción. Como la
concentración tanto del reactante como la del producto afecta el cambio en
energía libre de la reacción (ÓGO), .el rendimiento energético en situaciones
reales puede diferir del rendimiento obtenido a condiciones estándar. Así, cuan-
do el Hz es un producto, las bacterias consumidoras de hidrógeno pueden man-
tener la concentración de Hz tan baja que el rendimiento energético estará
afectado significativamente. Por ello, durante la fermentación del etanol a acetato
e Hz el ÓGo' (a 1 atm) es de + 9.63 kJ, sin embargo a 10 atm. el cambio en
energía libre es de -36.03 kJ.
Teniendo en cuenta lo anterior, en una digestión anaerobia estable, las
condiciones de las reacciones estarán controladas por la concentración de
propionato, acetato e hidrógeno libre, donde las concentraciones de acetato y
propionato oscilarán entre 10-4 Y 10-5 molar y las presiones parciales de
hidrógeno serán inferiores a 10-4 atmósferas (Figura 3.4). A presiones parcia-
[52] D I G E S T IÓN A N A E RO B I A
les de Hz mayores a 10-1 para el etanol, 10-3 para el propionato, y 10-4 para el
butirato, la transferencia de hidrógeno no ocurre. A estos valores se produce una
inhibición de las bacterias hidrogenofilicas, lo cual genera una sobreproducción de
Hz cuya acumulación inhibirá el proceso. También es necesario tener en cuenta que
a nivel de la primera etapa las bacterias fermentativas transfieren los electrones vía
Hz a las bacterias hidrogenofilicas, haciendo que las primeras produzcan una mayor
cantidad de acetato y por tanto una mayor cantidad de energía. Cuando la transfe-
rencia de hidrógeno no ocurre, el metabolismo de las bacterias fermentativas se
desplazará hacia una mayor producción de compuestos reducidos como el etanol, el
lactato, el propianato, el butirato, etc.
-10
-8 , V, CH3CH,OH + 1/2H,O - V, CH3COOH + H,
--6 H, + 1/4CO,- V, CH, + '/, H,O

....-
--4 1/2CH3COOH _o. 1/2CH. + V, CO,

.
...-
1/3CH3CH,COOH + 213H,O - Región para la oxidación
1/3CH3COOH + 1/3CO, j- H,
2
Región para la oxidación del
propionato a metano
L del etanol a metano
-8 -7 -6 -5 --4 -3 -2 -1 O
Figura 3.4. Efecto de la presión parcial de hidrógeno sobre la energia libre durante la
conversión del etanol, el propionato, el acetato y el hidrógeno durante la
digestión anaerobia.
Las relaciones dependientes de la transferencia interespecífica de hidró-

geno se pueden presentar en los siguientes casos:
M I e RO B I o LO G ¡A o E L A DI G E S TI 6 N A N A E R o B I A [53]
1. En bacterias involucradas en el catabolismo de alcoholes o lactato. Estos

microorganismos pueden crecer con otros sustratos sin necesidad de una transfe-
rencia de hidrógeno, pero sólo pueden degradar alcoholes o lactato cuando el
hidrógeno es removido por asociacióncon bacterias consumidoras de hidrógeno o
cuando hay un aceptor de hidrógeno inorgánico (sulfato) u orgánico (fumarato).
2. En bacterias que degradan carbohidratos simples y complejos. Crecen bien sin
que se produzca la remoción de hidrógeno, sin embargo cuando están en
presencia de bacterias consumidoras de hidrógeno incrementan la producción
de hidrógeno y acetato, disminuyendo la concentración de propionato, butirato,
lactato y etanol.
3. En bacterias que producen hidrógeno de forma obligatoria, por lo que deben
mantener una relación sintrófica obligada con bacterias consumidoras de hi-
drógeno las cuales reducen las concentraciones de hidrógeno en el medio
(Ramírez, 1997).
Aunque la transferencia interespecífica se asocia fundamentalmente al hi-
drógeno, se ha podido establecer que el formato y el acetato también pueden ser
transferidos. La difusión de estos compuestos de un organismo a otro, es un
fenómeno regulado por factores como la relación área superficial/volumen de las
bacterias, la constante de difusión del compuesto, el gradiente de concentración y
la distancia entre los dos organismos (Schir'iky Thauer, 1988).
La distancia entre organismos productores y consumidores es un factor crí-
tico para la difusión del H2 y dependerá de la forma en que este estructurada la
biomasa. Célulasagrupadas en lodos granulares presentan alta densidad celular lo
cual favorece la transferencia interespecífica de electrones, por lo que con estos
\
lodos se obtiene una alta actividad metanogénica con sustratos como propionato y
butirato (Grotenhuis eta!., 1991).
Estudios orientados a determinar la importancia relativa de otros sustratos
en la transferencia de electrones en cultivos sintróficos, no han mostrado resultados
concluyentes a este respecto. En el caso del formato, las bajas concentraciones, la
poca capacidad de las poblaciones acetogénicas para formar este sustrato, así
como la baja capacidad de los metanógenos y sulfato reductoras para utilizarlo,
son algunos de los factores que han dificultado establecer con claridad el papel
[54] D I G E S T I 6 N A N A E R O B I A
de este compuesto en la transferencia interespecífica de electrones (Grotenhuis

et al., 1991; Stams, 1994).
BACTERIAS HOMO-ACETOGÉNICAS
Dentro del grupo de acetógenos existe un grupo de bacterias conocidas como 'bac-
terias homo-acetogénicas' las cuales son anaerobias obligadas y utilizan el COz'
como aceptor final de electrones, produciendo acetato como producto único de la
fermentación anaeróbica. Los electrones para la reducción del COzprovienen del Hz
y de una variedad de compuestos como azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes,
aminoácidos y ciertas bases nitrogenadas.
Auque este grupo no es un grupo taxonómico definido, en él se incluyen una
amplia variedad de bacterias Gram (+) y Gram(-) formadoras de esporas tales
como Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticumy Acetobacterium wooddi
(Balch et al.., 1977).
Las especies Clostridiumy Acetobacterium wood//pueden utilizar compues-
tos orgánicos o inorgánicos mediante la fermentación homoacética de azúcares o
la reducción del COz'de la siguiente forma:
C6H¡P6 --+ 3CHjCOOH

2COz + 4Hz --+ CHjCOOH + 2Hp
Las bacterias homo-acetogénicas fermentan la glucosa mediante la vía

glucolítica produciendo dos moléculas de piruvato y dos moléculas de NADH.Ade-
más del acetato producido a partir de las dos moléculas de piruvato, una tercera
molécula de acetato se genera por la reducción del COzproducido en la reacción,
utilizando los 4 electrones generados en la glucólisis más los 4 electrones produ-
cidos en la oxidación del piruvato. Por tanto, la producción total a partir del piruvato
son tres moléculas de acetato.
La mayoría de los homoacetógenos convierten el COzen acetato por la vía
de la acetil-CoA. La reacción de homoacetogénesis es:
4Hz + H+ + 2HCOj- --+ CHjCOO- + 4Hp

.dGo = -113.2 KJ/reacción
M le RO B I o L o G í A o E L A DI G E S TI 6N A N A E R o B I A [55]
En la Figura 3.5. se presentan las reacciones seguidas por las bacterias

homoacetogénicas, sulfato reductoras y metanogénicos para la síntesis de acetato.
El grupo metilo del acetato se origina en una serie de reacciones enzimáticas en las
cuales el COzse reduce para formar el grupo metilo del acetato, y otra molécula de
COzse incorpora para formar el grupo carboxilo. La vía Acetil-CoA requiere Hzcomo
donador de electrones, y una enzima clave es la carboxil-monoxido-dehidrogenasa
que contiene como cofactores los metales Ni, Zn, y hiero. La importancia de esta
enzima es que cataliza la reducción del dióxido de carbono a monóxido de carbono,
el cual termina en la posición carbonil del acetato. Inicialmente el COzse reduce a
formato por la acción de la enzima formiato-dehidrogenasa, y posteriormente se
convierte en formil-tetrahidrofolíato. El grupo metilo es entonces transferido a una
enzima que tiene vitamina B1Z como cofactor. En la fase final de la síntesis del
acetato, el grupo metilo se combina con el COen la monóxido dehidrogenasa. La
adición de la coenzima A se produce en este punto, y la CO-dehidrogenasa cataliza
la formación del acetil-CoA como producto final.
ca, 2H,
•..--------------------. •
"-... "-... B"

"-.... CH,-B,
/" ) CHa-THF • CH,-THF
l
~::~:~~~~~~:ro
ATP THF Formil Metil Metil-B"
L ~~:~~_~:~:::~~:~::
ca, ca ca ------------:
H, "-... • I I ¡
Fe ------------'-+ Fe ¡
/"
Fe
I
~-Ni
I
tiI-Ni
......•..
ca dehidrogenasa
~.
1-
.-Ni-
CoA
CH.
•
N'
F~erza
Proton
Motriz
CH,-caaH .•••••••
/~- CH,-Ca-SCoA
¡
Acetato ATP Acetil CoA ATP
Neto: 4H2 + 2C02
Figura 3.5. Vía del Acetil-CoA, mecanismo autotrófico de las bacterias homo-génicas,
sulfato reductoras y metanogénicas. (Tomado de Brock, 1997)
Grupo 111:Bacterias metanogénicas
Las bacterias metanogénicas pertenecen al grupo actualmente conocido como

Archeaea, cuyos miembros presentan características diferentes a las encontradas
en Bacteria. Estas características están relacionadas fundamentalmente con la
composición química de algunas estructuras celulares.
Aunque la estructura de la membrana celular es una bicapa de
fosfolípidos, en lugar de los enlaces éster presentes en la unión entre el
glicerol y los ácidos grasos, los lípidos del grupo Archaea son químicamente
únicos, debido a que la unión del glicerol a las cadenas laterales hidrofóbicas
se hacen mediante enlaces éter, además los Iípidos carecen de ácidos grasos
y en su lugar presentan cadenas laterales constituidas por unidades del hi-
drocarburo isopreno. Los di-éteres de glicerol y los tetra-éteres de glicerol
son las principales clases de lípidos presentes en las especies del grupo
Arquea, e:los forman una monocapa lipídica, en lugar de un arreglo de bicapa.
Estas monocapas son muy resistentes y se encuentran ampliamente distri-
buidas en bacterias hipertermófilas.
En forma similar, las paredes de algunos metanógenos están constituidas
de un polisacárido similar al péptido-glucano, el cual se ha denominado
pseudopéptido-glucano y está compuesto de unidades alternadas de N-acetil-
glucosamina y ácido N-acetiltalosaminurónico. Los enlaces glucosídicos son 1-3
en lugar de los 1-4 encontrados en el péptidoglucano. Las paredes celulares de
otros Archaea están constituidas de polisacáridos, glicoproteínas, o proteínas.
Especies de Methanosarcina presentan paredes gruesas de polisacáridos consti-
tuidos de glucosa, ácido glucorónico, galactosamina, y acetato.
Las bacterias metanogénicas son anaerobias estrictas y producen metano
como principal producto del metabolismo energético. A pesar de los requerimien-
tos estrictos de anaerobiosis obligada y el metabolismo especializado de este
grupo, estas bacterias se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza.
La actividad metanogénica es mucho mayor en ecosistemas de agua dulce y te-
rrestres, la menor actividad detectada en océanos, se debe a la alta concentra-
Grupo 111:Bacterias metanogénicas
Las bacterias metanogénicas pertenecen al grupo actualmente conocido como

Archeaea, cuyos miembros presentan características diferentes a las encontradas
en Bacteria. Estas características están relacionadas fundamentalmente con la
composición química de algunas estructuras celulares.
Aunque la estructura de la membrana celular es una bicapa de
fosfolípidos, en lugar de los enlaces éster presentes en la unión entre el
glicerol y los ácidos grasos, los lípidos del grupo Archaea son químicamente
únicos, debido a que la unión del glicerol a las cadenas laterales hidrofóbicas
se hacen mediante enlaces éter, además los lípidos carecen de ácidos grasos
y en su lugar presentan cadenas laterales constituidas por unidades del hi-
drocarburo isopreno. Los di-éteres de glicerol y los tetra-éteres de glicerol
son las principales clases de lípidos presentes en las especies del grupo
Arquea, e:los forman una monocapa lipídica, en lugar de un arreglo de bicapa.
Estas monocapas son muy resistentes y se encuentran ampliamente distri-
buidas en bacterias hipertermófilas.
En forma similar, las paredes de algunos metanógenos están constituidas
de un polisacárido similar al péptido-glucano, el cual se ha denominado
pseudopéptido-glucano y está compuesto de unidades alternadas de N-acetil-
glucosamina y ácido N-acetiltalosaminurónico. Los enlaces glucosídicos son 1-3
en lugar de los 1-4 encontrados en el péptidoglucano. Las paredes celulares de
otros Archaea están constituidas de polisacáridos, glicoproteínas, o proteínas.
Especiesde Methanosarcina presentan paredes gruesas de polisacáridos consti-
tuidos de glucosa, ácido glucorónico, galactosamina, y acetato.
Las bacterias metanogénicas son anaerobias estrictas y producen metano
como principal producto del metabolismo energético. A pesar de los requerimien-
tos estrictos de anaerobiosis obligada y el metabolismo especializado de este
grupo, estas bacterias se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza.
La actividad metanogénica es mucho mayor en ecosistemas de agua dulce y te-
rrestres, la menor actividad detectada en océanos, se debe a la alta concentra-
M I e RO B I o LO G f A oE L A DI G E S T IÓN A N A E R o B I A [57]
ción de sulfatos, condición que favorece la sulfato reducción en sedimentos mari-

nos (Whitman et al., 1992; Zinder, 1998).
Lasbacteriasmetanogénicaspueden llevar a cabo una seriede reaccionespor la
presenciade ciertas coenzimas,las cualesno se encuentran en otros géneros de bacte-
rias,y se clasificande la siguientemanera: coenzimastransportadoras de CI : coenzima
M, metanofurano y metanopterina, y coenzimas involucradas en reacciones Redox:
coenzimaF4Z0 y H5-HTP (fosfato de 7-mercaptoheptanoiltreonina ).
o Coenzima F4Z0: actua como donador de electrones en la reducción del COzen la
metanogénesis hidrogenofílica. Esta coenzima en estado oxidado absorbe luz
a 420nm y presenta fluorescencia azul verdosa, esta fluorescencia constituye
una herramienta útil para la identificación preliminar de las bacterias
metanogénicas (Whitman et al., 1992).
o Coenzima F430: actúa en el paso final de la metanogénesis como parte del
sistema metil reductasa. Absorbe luz a 430 nm pero a diferencia del factor F4Z0
no fluoresce.
o Metanofurano: está involucrado en el primer paso de la formación de metano a
partir del COz.
o Metanopterina: fluoresce a 342nm emitiendo un color azul brillante, es similar
al ácido fólico, y actúa como transportador de compuestos monocarbonados
durante la reducción del COza metano. La forma activa de la coenzima "in
vivo" es la forma reducida, la tetrahidrometanopterina (THMP).
o Coenzima M: transporta los grupos metílicos y se reduce por el complejo
enzimático metil-reductasa-F 430 al final de la formación de metano.
CH]-S-CoM+2H+ -+ HS-CoM+ CH4
Un potente inhibidor de la coenzima M es el ácido bromo-etano-sulfónico,

este compuesto a una concentración de 106M causa una inhibición del 50% de la
actividad de la metil-reductasa, así como el crecimiento de las bacterias
metanogénicas.
o La HS-HTP: (fosfato de 7 mercapto-heptanoil-treonina), al igual que la
coenzima M, este cofactor está involucrado en la fase final de la formación
de metano catalizada por el sistema metil-reductasa. Su estructura es simi-

lar al ácido pantoténico, y actúa como donador de electrones en el sistema
metil-reductasa.
Este grupo requiere amonio como fuente de nitrógeno, además de azufre, y
micronutrientes como cobalto, níquel y hierro. El tungsteno, selenio, molibdeno y
ciertas vitaminas como biotina, ácido p-a¡ninobenzoico y riboflavina son
estimuladores del crecimiento (Jamel y Kalmokoff, 1987). Utilizan un limitado
numero de sustratos para la generación de metano, los principales sustratos son: Hz
+ COz'formato y acetato. Adicionalmente otros compuestos de C,' pueden ser
utilizados como son: metanol, trimetilamina, y algunos alcoholes como isopropanol,
isobutanol, ciclopentano y etanol.
Con base en el tipo de sustrato utilizado, los bacterias metanogénicas se
subdividen en tres grupos (Whitman el a/., 1992):
Grupo 1: Utiliza como fuente de energía Hz,formato y ciertos alcoholes, el caz es el
aceptor final de electrones el cual es reducido a metano. La reducción de COzes
importante para mantener una baja concentración de Hz y formato, condición indis-
pensable para los procesos de transferencia interespecifica de electrones.
Reacciones
( KJ /moL de metano)
4Hz + COz -+ CH. + 2HzÜ -135.6
----=------ ---
4 Fonllalo -+ CH. + 3eOz + 2HzO -130.1
-----'=---------------
Grupo l/.' Utilizauna ampliavariedad de compuestos que tienen el grupo metilo durante
el metabolismo energético. Algunas de moléculas son oxidadas a COz'el cual actúa
como aceptor final de electrones y se reduce directamente a CH4•
}<"/I. ,'irilll's
( KJ/lllo/ de metano)
-------_.
4 ,\ J ,'1 i/alll~/(1 + H zO -+ CH--'4_+_C_O....;z=--...+_4_N_H_4:.-....... -_7_5 _
2 Dillldilalllilla + 2 HzO -+ 3CH4 + COz + 2NH4 -73.2
Aunque el metanol y Hz-COz, pueden ser metabolizados simultáneamente,

el metanol es consumido más rápidamente. El metabolismo de la aminas metiladas
a CH4, conlleva a la producción de amonio, el cual es utilizado como fuente de
nitrógeno (Jarrrel y Kalmokoff, (987).
Grupo II/.· aunque la mayor parte del metano que se genera en la naturaleza
proviene del rompimiento del acetato, la habilidad de catabolizar este sustrato esta
limitada a los géneros: Methanosarcinay Methanosaeta (Methanothrix). Elcarbono
metilado del acetato es reducido directamente a metano y el grupo carboxilo es
oxidado a COz' El acetato es utilizado como fuente de carbono y de energía, sin
embargo, la energía que se obtiene a partir del acetato es pobre.
CH3COO- + Hp -. CH.¡ + HC03-

Ll ca' =- 31 kJ /moL de metano
Género Methanosarcina: Se asocian formando pseudosarcinas y tienen

baja afinidad por el acetato. La constante de afinidad por este sustrato (Km) es
del orden de 5mM y el tiempo de generación pueden llegar a 30 horas cuando se
cultivan con este sustrato. Además del acetato, este género puede utilizar metil-
aminas, metanol y algunas especies pueden actuar hidrogenofílicamente. Las
especies más representativas son: Methanosarcina barker~ Methanosarcina mazei
y Methanosarcina thermophila.
Género Methanosaeta (antes llamado MethanothriX¡: Este grupo tienen un
Km para el acetato entre 0.7- 1.2 mM y tiempos de generación entre 65 y 70 horas.
Aunque las especies de este grupo no utilizan ni el hidrógeno, ni el metanol, ni las
metilaminas, no son inhibidas por el hidrógeno o el formato. Dada la gran afinidad
por el acetato, es recomendable mantener en los digestores anaerobios un alto
contenido en este grupo de bacterias. Por lo general , es frecuente encontrar en
lodos granulares un alto contenido de Methanosaeta. (Whitman et a/., 1992).
Es frecuente encontrar en reactores anaerobios, una competencia por el
acetato entre las especies de los géneros Methanosaeta y Methanosarcina, sin
embargo, las bajas concentraciones de acetato que usualmente predominan al
interior de los reactores favorece el crecimiento del género Methanosaeta. Por
otra parte, también existen diferencias en los requerimientos de pH entre los do~
géneros, Methanosaetatrabaja a pH 7.0, mientras MethanosarctÍ7ageneralmentl
se presenta a valores inferiores a 7.0. Otra característica diferente se relaciona COI
la predominancia del género Methanosaeta en lodos con altas concentraciones dI

propionato, lo cual señala su mejor adaptación a este sustrato. En el caso dI
MethanosarctÍ7a hay una mejor adaptación al etanol, fenómeno asociado con lo:
cambios del pH, producidos cuando la oxidacion del etanol no está acoplada con lé
conversión del acetato. Cuando esto ocurre, el pH disminuye y las concentracione~
de acetato se incrementan, lo cual favorece el desarrollo de la población dI
MethanosarctÍ7a (GrotenhU/; et a/., 1991).
METANOGÉN ESIS
La producción de metano es la principal forma por medio de la cual las bacteria~

metanogénicas obtienen la energía necesaria para el crecimiento. Desde un punto dE
vista metabólico, la formación de metano es un tipo de respiración anaerobia en lé
cual, el dióxido de carbono actúa como aceptor de electrones y el hidrógeno es utiliza-
do para reducirlo. Los estudios bioquímicos indican que el sistema de transporte dE
electrones no es igual al encontrado en organismos aerobios, no hay citocromos ni
quinonas,y existe un sistema de transportadores en los cualesalgunas de las coenzimas
mencionadas permiten la reducción secuencial de los intermediarios monocarbonados.
Metanogénesis hidrogenofil ica
La reducción de COza metano es un proceso Hz dependiente aunque compuestos

como el formato, el monóxido de carbono, y aún el hierro elemental (FeO)pueden
actuar como donadores de electrones en este proceso (Vogels et a/., 1982).
La reducción de COza CH4 se efectúa mediante la utilización de varios
intermediarios y los principales pasos se pueden resumir de la siguiente
manera (Figura 3.6):
MICROBIOLOGfA DE LA DIGESTiÓN ANAEROBIA [61]
1. activación del COzmediante su unión al metanofurano, y la posterior reducción

del grupo formilo
2. transferencia del grupo formilo del metanofurano a la tetrahidrometanopterina,
y la posterior deshidratación y reducción en dos etapas separadas a nivel de
los grupos metileno y metilo.
3. transferencia del grupo metilo de la metanopterina a la coenzima M.
4. reducción del metil-coenzima M a metano mediante la acción del sistema metil-
reductasa en el cual participan el F430 y el HS-HTP.El donador de electrones para
esta reacción es el HS-HTP y el producto de la reacción además del CH4• es un
disulfuro de la CoM y del HTP (CoM-S-S-HTP). Por reducción con Hzse regene-
ran CoM y HS-HTP en libre.
Falo de microscopía electrónica
Figura 3.6. Methanobacterium formicicum
Metanogénesis acetoclástica
Las reacciones de la vía acetil-CoA explicadas anteriormente están relacionadas con la

producciónde metano a partir de compuestos metmcosy del acetato.Compuestosmetílicos
como el metanol son catabolizados mediante la donación de los grupos metílicos a una
proteína corrinoide para formar un complejo CH3-Corrinoide. Los corrinoides son estructu-
ras parentales como la vitamina B1Z' El complejo Corrinoide-CH3 dona el grupo metílico
a la CoM para formar el complejo CoM-eH3 a partir del cual se obtiene el metano por
reducción con 105 electrones obtenidos en la oxidación de otras moléculas de metanol a
COZ'En el metabolismo energético, el acetato es activado a Acetif-CoA, el cual interactúa
con el monóxido de carbono deshidrogenasa, para transferir el grupo metnico a la enzima
corrinoide de la vía acetif-CoA. A partir de este punto, el grupo metilo es transferido a la
tetrahidro-metano-pterina y a la coenzima M para formar el complejo CoMf-CH3. Poste-
riormente, es reducido a metano con 105 electr nes generados en la oxidación del CO a
COzpor la acción de la COdehidrogenasa (Figura 3.8).
CO,
r-----· MF - -- 2H Hp
,.. __.. _.. _.... _ MF - CHO

Formilo
MP
MP-CHO
<
F42o-red¡
H,O -- ---.J Hidrogenasa
F420-oxi ,
H,
MP > CH,
Melileno
2H
MP-CH, MF: Metanofurano,

Metilo MP Tetrahidrometanopterina
r................... CoM-SH - -- Bomba de Na'
CoM-S-CH,
:-2H
¡- -............ HS-HTP-- Complejo F",,-metil· Bomba
reductasa protónica
¡
L.. _ CoM-S-S-HTP
~
CH,
¡
ATP
Fuente: Madigan, Martinko y Parker, t997.
Figura 3.7. Metanogénesis hidrogenofilica a partir de la reducción del CO"
CH,- COOH
ATP
CH, CO S- CoA Biosíntesis
CO Dehidrogenasa
CODH- Monóxido CH, CO-CODH

de Carbono
Dehidrogenasa
CO-CODH CH, - Corrinoide
Fuente: Madigan. Martinko y Parker. 1997
Figura 3.8. Utilización de las reacciones de la via acetil-CoA durante el crecimiento con acetato.
BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS (BSR)
Las bacterias sulfato reductoras son anaerobios estrictos, ampliamente distribui-

das en ambientes acuáticos y terrestres donde se lleva a cabo los procesos de
degradación de la materia orgánica. Utilizan el sulfato como aceptar de electrones
durante la oxidación anaerobia de compuestos orgánicos, aunque pueden utilizar
también, compuestos como el tiosulfato, el tetrationato y el azufre elemental. Los
donadores de electrones más utilizados por las BSRson Hz, lactato, piruvato aun-
que existen otros tipos fisiológicos más restringidos.
2CH 2 O + SO 42- H 2S + 2 HCO-3
[64] D I G E S T ION A N A E R O B I A
El grupo de las B5R es diverso morfológicamente pero fisiológicamente

unificado, taxonómicamente se reconocen 18 géneros capaces de llevar a cabo la
sulfato reducción desasimilativa, los cuales se agrupan en dos subgrupos fisioló-
gicos:
Grupo 1: bacterias no oxidantes del acetato
Los miembros de este grupo utilizan el lactato, el piruvato. el etanol o ciertos
ácidos grasos como fuente de carbono y energía. y reducen el sulfato a sulfuro de
hidrógeno. Los géneros representativos son:
Desu/fovibrio Desu/fobacu/a
Desu/fomicrobium Archaeog/obus
Desu/fobotu/us Desu/fobu/bus
Desu/fotomacu/um Thermodesu/fobacterium
Desu/fomoni/e
Grupo 11:bacterias oxidantes del acetato
Las bacterias de este grupo se especializan en la oxidación de ácidos grasos parti-
cularmente el acetato y reducen el sulfato a sulfuro. Los géneros más representati-
vos son:
Desu/fobacter Desu/foarcu/us
Desu/fobacterium Desu/fadnum
Desu/fococcus Desu/forhabdus
Desu/fonema Thermodesu/forhabdus
Desu/fosardna
Sulfato reducción
Para la reducción del sulfato a sulfuro de hidrógeno es necesario una reducción de

ocho electrones, y se lleva a cabo a través de una serie de etapas. Comoel ión sulfato
es muy estable, para su utilización es necesario una activación previa mediante el ATP
La enzima ATP-sulfurilasacataliza la unión del sulfato a uno de los fosfatos del ATP
formando el adenosin-fosfo-sulfato (AP5). En la sulfato reducción desasimilativa, el
complejo AP5 se reduce directamente a sulfito 503 2 con la liberación de AMP.En la
reducción asimilativa, un nuevo fosfato se une al AP5 para formar el fosfo-fadenosín-
fosfo-sulfato (PAPS) y solo entonces reduce el sulfato (Figura 3.9). En ambas reaccio-
nes, el primer producto de la sulfato reducción es el sulfito, a partir de este momento
las subsecuentes reducciones ocurren rápidamente. En la sulfato reducción asimilativa
el H2Sformado es convertido en azufre orgánico en la forma de aminoácidos, mientras
en la sulfato reducción desasimilativa el HzS es excretado.
ATP PP ATP ADP
so,'
U
ATP-Sulfurilasa
APS
U
APS- quinasa
PAPS
2e-
~ AMP
NADPH
2e-
-. PAP
NADP·
SO," SO,'
6e
.. 6e-
·1
I
•
1
H,s H,S
Excreción Compuestos orgánicos azufrados:

cisteína, metionina, etc
REDUCCiÓN DESASIMILATIVA REDUCCiÓN ASIMILATIVA
Fuente: Madigan, Marlinko y Parker, 1997.
Figura 3.9. Sulfato Reducción Desasimilativa y Asimilativa de las Bacterias Sulfato Reductoras
Interrelación de las B5R durante la degradación de

la materia orgánica
Una característica de los medios donde las BSR desarrollan una alta actividad
metabólica, es la presencia de olores desagradables producidos por el H2S, asi
[66 J D I G E S T IÓN A N A E R O B I A
como un color negro en las aguas y los sedimentos, debido a la formación de

sulfuros que precipitan al reaccionar con diferentes metales. Las BSRcumplen un
importante papel en las etapas finales de la degradación de la materia orgánica,
especialmente en la remoción de los sulfatos presentes en el afluente. Las bacte-
rias BSR pueden crecer en presencia o ausencia de sulfatos, utilizando dos vías
metabólicas diferentes; una fermentativa y la otra oxidativa. La Figura 3.10. pre-
senta las interrelaciones de las BSRdurante la utilización de la vía fermentativa en
la cual, crecen sintróficamente con las bacterias metanogénicas, sin embargo, en
la presencia de sustratos como lactato y etanol compiten con las poblaciones
fermentativas por sustratos comunes (Gibson, 1990). La siguientes reacciones
ilustran la capacidad fermentativa de las BSR.
3 Lactato --+ Acetato +2 Propionato + HCOj- + H+

Etanol + H CO + H 2 --+ Propionato
j-
3 Etanol + 2 HCO Acetato + 2 Propionato + H+ + 3H20

j-
Acetato + HCO + H+ +3H2

j- Propionato + 3 H20
En presencia de sulfatos, las BSRson capaces de acoplar la oxidación de

compuestos orgánicos e hidrógeno a la sulfato reducción, compitiendo con las
bacterias metanogénicas por sustratos comunes, generando la inhibición de las
bacterias acetoclásticas por la producción de HzS. Los ácidos grasos como el
propionato, y el butirato son oxidados completamente hasta COzpor las BSR, o
parcialmente hasta acetato. Compuestos como el etanol, otros alcoholes, lactato,
malato y compuestos aromáticos pueden ser degradados completa o parcialmen-
te. La siguientes reacciones ilustran la capacidad de las BSRde acoplar la oxida-
ción de ciertos sustratos a la sulfato reducción (Oude Elferink et a/. 1994; Gibson,
1990; Widdel and Hansen, 1992).
4H 2 + SO 4-2 + H+--+HS- + 4H 2 °
4Formato + H+ + S04-2 --+ 4HCO + HS- j
-
Acetato-+ S04-2 2 HCO + HS- j

-
Propionato- + %S04- 2 Acetato- + HCO- + j

%HS- + 1/¡H+
+ 1/2S04-z
Blltirato- 2 Acetato- + 112 HS- + 1/2H+
Lactato- + 112 S04- -. Acetato- + HC03- + 'l? H - + 'l? H+
Z
Etanol + 112 S04-Z -. Acetato- + 112 H S- + 112 H + + H zO

Glucosa + S04-z H + 2Acetato + 2COz + HS- + 4HzÜ
Moléculas Poliméricas
Proteínas, carbohidratos, Iípidos, ácidos nucleicos
Hidrólisis
Productos de bajo peso molecular
so; Amino ácidos, azucares, ácidos grasos, etc
j
s' Intermediarios de fermentación
Alcoholes, lactato, piruvato, succinato
SO; ~ BSR
S' --1 Fermentación
Acidos grasos volátiles
Acetato, propionato, butirato CO, H,
Acetogénesis
so;~ BSR
S'
o.' =iAcetato BM
Metanogénesis
BM BSR BSR
~ S'
CH, CO, CH,
Fuente: Gibson. 1990
Figura 3.10. Interrelaciones entre las B5R durante la degradación de la materia orgánica.
De acuerdo con Dude Elferink et a/. (1994), durante el tratamiento

anaerobio de aguas residuales, la sulfato reducción puede interferir con la
metanogénesis, generando en los reactores problemas como:
1. Competencia por sustratos comunes y la consecuente disminución en la pro-
ducción de metano, entre BSRy bacterias metanogénicas.
2. Inhibición de varios grupos bacterianos por la presencia de H2S.
3. Toxicidad generada por el H2S, malos olores, corrosión en las calderas y los
motores operados con biogas
La forma tóxica del H2S es la forma no disociada lo que facilita su paso a
través de la membrana celular. Pequeñas variaciones de pH en los digestores,
pueden causar inhibición del proceso. Se ha recomendado para disminuir la toxi-
cidad generada por el H2S las siguientes estrategias (Tanaka y Lee, 1997; Hulshoff
Pol,1996):
• Diluir el afluente con aguas residuales que no contengan sulfato.
• Adicionar metales como el hierro para remover el H2S por precipitación.
• Implementar sistemas de fases separadas de manera que la sulfato reducción
se limite al reactor acidogénico.
• Incrementar el pH para obtener una forma menos tóxica del H2S.
• Oxidar biológicamente el H2S hasta sulfuro elemental.
H+ + H --H2S atar pH < 7.0

H2S HS- + H+ inodoropH > 8. O
A pesar de los problemas que ocasiona la sulfato reducción al interior de

los reactores, esta reacción puede presentar algunas ventajas (Dude Elferink et
al., 1994; Dvorak et al., 1992):
1. Contribuye a mantener un bajo potencial de óxido-reducción al interior de los
reactores.
2. Constituye un método biotecnológico para la remoción de sulfato.
3. Los complejos Metal-S 2 tienen baja solubilidad, propiedad que puede ser uti-
lizada para la precipitación de metales pesados como Co, Ni, Pb Y Zn.
M I e Ro BID LO G f A oE L A o I G E ST I 6 N A N A E R o B I A [6S
Interrelación entre las B5R - bacterias acetogénicas

(BA) y las bacterias metanogénicas (BM)
EN PRESENCIA DE SULFATO
Las bacterias sulfato reductoras compiten con las bacterias metanogénicas

(BM) por sustratos comunes como; formato e hidrógeno, con las bacterias
acetogénicas -(BA) por componentes como propionato y butirato (Lovley, et
a/. 1982). Esto no significa que la metanogénesis y la sulfato reducción sean
excluyentes, pues pueden ocurrir simultáneamente cuando el metano se ge-
nera a partir del metanol y/o aminas metiladas, sustratos por los cuales las
BSR tienen poca afinidad.
La relación DQO/sulfato en las aguas residuales es un indicador de la
cantidad de materia orgánica que puede ser degradada vía sulfato reduc-
ción. En teoría todo el material orgánico puede ser degradado vía sulfato
reducción, si la relación DQO/sulfato es menor de 0.66. Si por lo contrario, la
relación DQO/sulfato es mayor de este valor, las BSR compiten con las bacte-
rias metanogénicas y acetogénicas por los sustratos disponibles, además de
otras sulfato reductoras por el sulfato disponible. Se ha estimado que la con-
centración de H2S al interior del reactor, no debe exceder de 150mg/L, para
que el proceso metanogénico sea eficiente (Harada et al., 1994; Oude Elferink
etal.,1994).
En general, los reactores anaerobios operan a valores umbrales para el
consumo de hidrógeno por la población metanogénica. Sin embargo, el valor umbral
de las BSRes más bajo, por lo que en presencia de sulfato el hidrógeno es consumi-
do principalmente por las BSR. Esta población tiene ventajas cinéticas frente a las
BM que favorecen su proliferación al interior de los reactores (Lovley et al., 1982).
Tabla 3.3. Parámetros cinéticos de crecimiento entre las bacterias metanogénicas y sulfato
reductoras consumidoras de hidrógeno en presencia de sulfato.
Microorganismo Ks V Rendimiento Km V••••

"'"
(días·' ) (¡!M)
(¡!M) (g/mol H,) (¡!mollmin.g)
Desulfovibrio desulfuricans 2.4 -4.2 1.2-1.6 1.4 -2.0 1.1

cepa Gll
Melhanospirillum hungatei 5.8 - 7.3 1.2 -1.8 0.3 - 0.5 5.0
Tomado de Harada el al, 1994
La población de bacterias metanogénicas acetoclásticas (BMA), predomi-

nan en reactores anaerobios cuando la concentración de sulfato es baja al interior
del reactor debido a que las BSRacetoclásticas compiten con las otras BSRpor el
sulfato disponible y con las BM acetoclásticas por el acetato, Por otra parte, el
acetato es el sustrato menos utilizado por las BSRcomparado con el propionato,
butirato y el hidrógeno. Sin embargo, factores como tiempos de retención celular
cortos favorecen el crecimiento de la población BSRacetoclástica ya que la velo-
cidad de crecimiento es mucho más alta. Para Desu/fotomacu/um acetoxidans se
ha reportado f...lmax entre 0.65 y 1.39 días-l , mientras para Methanosaeta
soehngenii las tasas de crecimiento oscilan entre 0.08 y 0.29 días-l. Otros
parámetros como afinidad por el sustrato, la capacidad de utilizar otros sustratos
y la temperatura también influyen en la competencia entre BSRAy BMAen presen-
cia de sulfato (Jetten et a/., 1992; Visser et a/., 1993).
En reactores anaerobios con alta concentración de sulfato, las bacterias
sulfato reductoras también compiten con las bacterias acetogénicas (BA) por
sustratos como propionato y butirato, por lo que la relación sintrófica entre las BM
y BA para la oxidación de estos compuestos, son superadas por las BSR.
EN AUSENCIA DE SULFATO
En ausencia de sulfato, las BSR puede constituir el 15% del total de la biomasa
presente en el reactor, Bajo estas condiciones fermentan sustratos como: piruvato,
lactato, etanol, fructosa, propanol y acetato entre otros, y crecen como organis-
mos acetogenicos. Se ha reportado la degradación del formato mediante la rela-
ción sintrófica de Desu/fovibrio vulgaris y Methanobacterium bryantti: Las BSR
M I e RO B I oLo G lA DEL A DI G E S T IÓN A NA ER o BIA [71]
mantienen una presión parcial de hidrógeno (1-2 Pa) por debajo de la requerida
para que se de la transferencia interespecífica de electrones con la población
metanogénica (3-10 Palo Esta diferencia, podría estar mostrando que la veloci-
dad de crecimiento de las BA dependerá del organismo consumidor de hidrógeno.
Es por ello, que en algunos estudios se reportan tasas de crecimiento máximo
para las BA consumidoras del propionato y butirato en co-cultivo con BM de 0.10
Y 0.19 días-I, mientras en co-cultivo con BSR es de 0.19 y 0.31 dias-1 • Esto
estaría sugiriendo que la utilización del propionato y butirato por las BSR, está
más relacionada con la presión parcial de hidrógeno, que con la capacidad de
esta población para utilizar estos sustratos. El crecimiento de BSRcon butirato en
ausencia de sulfato, no ha sido demostrado. Sin embargo Desu/fovibrio sp ha sido
aislado en reactores con altas concentraciones de butirato y en ausencia de sulfato
(Mclnerney eta!., 1981; Bryant eta!., 1977; Stams, 1994).
BIBLIOGRAFíA
ATLAS, R. Y Bartha, R. (1993). Microbial ecology: Fundamental and application. The Benjamin/
Cummings Publicing Company Inc. Menlo Park, California.
BALCH, WE., Schoberth, S., Tanner, R.E. y Wolfe, R.5. (1977). "Acetobacterium a new genus 01
hydrogen- oxidizing, carbon dioxide- reducing anaerobic bacteria". Insto Jouma/Systerr.

Bacteri%gy, 27: 355-386.
BRYANT, M.P, Campbell, L.L., Reddy, CA y Crabill, M.R. (1977). "Growth of Desu/fovibrio in
lactate or ethanol media low in sulfate in association with Hz- utilizing methanogenic
bacteria". App/ied Enviromenta/ Microbi%gy, 33: 1162-1169.
BRYANT,M.P (1979). "Microbial methane production- theoretical aspects". Jouma/Anima/Science,
48: 193-201.
BOONE, O.R.y Bryant, M.P (1980). "Propionate- degrading bacterium Syntrophobacter wo/imi'sp. nov.
gen. nov., from methanogenic ecosystem". App/ied Enviromenta/ Microbi%gy, 40: 626-632.
OVORAK,O.H, Hedin, R.5, Edenborn, H.M. y Mcintire, PE. (1992). "Treatment of metal contaminated
water using bacterial sulfate reduction: results from pilot-scale reactors". Biotechn%g}
&: Bioengineering, 40: 609-616.
GIBSON, G.R. (1990). "Physiological and ecology of the sulfate-reducing bacteria". A review.
Jouma/ App/ied Bacteri%gy, 69: 769-797.
GROTENHUIS, ne., Smit, M., Plugge, M., Yuansheng, X., Van Lammeren, A.A.M., Stams, A.J.M.y Zehnder,
A.J.B. (1991). "Bacteriological Composition and Structure of Granular Sludge Adapted te
Oifferent Substrates". App/ied Environmenta/ Microbi%gy July 1991: 1942-1949.
HARADA, H., Uemura, S. y Monomoi, K. (1994). "Interaction between sulfate reducing bacterié
and methane- producing bacteria in UASB reactor s fed with low strengh wastes containin~
different levels of sulfate". Water Research, 28: 355-367.
HULSHOFF-POL L. (1996). Perspective for anaerobic treatment of sulfate rich wastewater
Memorias IV Seminario Taller Latinoamericano sobre tratamiento anaerobio de agua~
residuales. Bucaramanga, Colombia: 383-396.
M I C R O B I O L O G fA DEL A D I G EST I 6 N A NA ERO B IA [73]
JARREL, K.F. Y Kalmokoff, M. (1987). "Nutritional requimerents 01 the Methanogenic

Archeobacteria". Canada ¡oumal Microbiology, 34: 557-576.
JETTEN M.s., Stams AJ y Zehnder AJ (1992) "Methanogenesis lrom acetate: a comparison 01 the
acatate metabolism in Methanothn'x soehngenii and Methanosarcina sPP'. fEMs Microbiology,
88: 181- 198. En Stams, A.J. (1994). Metabolic interactions between anaerobic bacteria in
methanogenic enviroments. Antonie van Leeuwenhoek, 66: 271-294.
KASPAR H.F., Holland A.J. y Mountlort D.O (1987). "Simultaneous butyrate oxydation by
syntrophomonas wollei and catalitic oleolin reduction in absence 01 interspecies
hydrogen transler". Arch. Microbiology, Volumen? 1029-1039.
LOVLEY, D.R., Dwyer, DJ y Klug, M.J. (1982). "Kinetic analysis 01 competition between sullate
reducers and methanogens lor hydrogen in sediments". Applied Enviromental

Microbiology, 43: 1373-1379.
MADIGAN, M.T., Mertinko, J.M. y Parker, J. (1997). 8i%gy of microorganisms. Eighth Edition.
Prentice Hall. New Jersey (USA).
McCARTY,L. (1982). "One hundred years 01 anaerobic treatment". En: Anaerobic Digestion
(1982). Proceedings 01 the Second International Symposium on Anaerbic Digestion,
Federal Republic 01 Germany on Sep!. 6-11. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam.
MclNERNEY, MJ, Bryant, M.P, Hespell, R.B. y Costerton, J.w. (1981). "syntrophomonas wolfei
gen. nov. sp. nov., an anaerobic, syntrophic, latty acid- oxidizing bacterium". Applied
Enviromental Microbiology, 41: 1029-1039.
MclNERNEY,MJ (1988). "Anaerobic hydrolysis and lermentation 01 lat and protein". En: Zendher
AJB (Ed.) Biology 01 anaerobic microorganisms. John Wiley & Sons, Ine., publication.
New York, p. 373-415.
MOUNTFORT, D.O., Brulla, WJ, Krumholz, L.R. y Bryant, M.P (1984). "syntrophus buswel/i gen.
nov. sp. nov., a benzoate catabolizer Irom methanogenic ecosystems". Int. J. sys.
8acteri%gy, 34: 216-217.
OUDE ELFERINK, SJ, Visser, A., Hulshoff-Pol, L. y Stams, AJ (1994). "Sullate reduction in
methanogenic bioreactors". fEMs Microbiology Review, 15: 119-136.

RAMíREZ, L. (1996) "Evaluación de potenciales semillas para la inoculación de reactores
anaerobios". En: IV Seminario Taller latinoamericano sobre Tratamiento Anaerobio de
Aguas Residuales. Bucaramanga (Colombia).
ROY,F., Samain, E., Dubourguier, H.e y Albagnac, G. (1986). "5yntrophomonas sapovorans sp.
nov., a new obligately proton reducing anaerobic oxidizing saturated and unsaturated
long chain latty acids". Archi Microbiology, 145: 142-147.

SCHINK, B. (1997). "Energetics 01 syntrophic cooperation in methanogenic degradation".
Microbiology Molecular Biology Review, 61: 262-280.

SCHINK, B. y Thauer, R.K. (1988). "Energetics 01 syntrophic methane lormation and the inlluence
01 aggregation". En Stams, A.J. 1994. Metabolic interactions between anaerobic bacteria
in methanogenic enviroment. Antonie van Leeuwenhoek, 66: 271-294.

STAMS, A.J. (1994). "Metabolic interaction in methanogenic bioreactors". Antonie van
Leeuwenhoek, 66: 271-294.
STIEB M. Y Schink B. (1985). "Anaerobic oxidation 01 latty acid by Oostridium bryantiisp. nov. a
spore lorming obligately syntrophic bacterium". Archives Microbiology, 140: 387-390.

TANAKA, K. (1992). "Anaerobic oxidation 01 1,5- pentanediol, 2- butanol and 2- propanol by a
newly isolated sullate- reducer". Journalol Fermentation & Bioengineering, 72: 362-365.
VISSER, A., Beekman, l., Van der lee, A., Stams, A.J y Lettinga, G. (1993). "Anaerobic degradation
01 volatile latty acids at different sullate concentrations". Applied Microbilogy &
Biotechnology, 40: 549-556.

VOGELS,G.D., Keltjens,1J. Hullen, J.T.y Van der Drift, e (1982). "Coenzyme Methanogenic Bacteria".
Zbl. Backt. Hyg. 1.Abt. Orig. e 3: 258-264.

WHITMAN, WB, Bowen, U., Boone, D.R. (1992). "The Methanogenic Bacteria". In: Prokaryotes
2nd edn. (Balows A, Truper, Dworkin M, Harder W, Schleiler K-H, Eds.) 719-767. Springer
Ver lag. New York.
WOLlN, M. J (1976). Interactions between Hz- producing and methane- producing species. En:
Microbial Formation and utllization 01gases (H? CH" CO). Schlegel, H.G., Gottschalk, G.
y Plenning, N. (Ed.) E. Goltze, K.G. Germany.
llNDER, S.H. Y Koch, M. (1984). "Non-acetoclastic methanogenesis lrom acetate: acetate oxidation
by a thermophilic syntrophic ca culture". Arch. Microbiology, 138: 263-272.

lINDER, S.H. (1998). Chapter 5. Methanogens. En: Burlage, R.S. et al., Techniques in Microbial
Ecology. Oxford University Press. New York. 113-135.
lHAO, H., Yang, D., Woese, eR. y Bryant, M.P (1990). "Assignment 01 Oostridium bryantii to
syntrophospora bryantli' gen. nov., combo Nov. on the basis 01 165 rRNA sequence
analysis". Int Joumal5ystem baderiology, 43: 278-286.
capítulo
cuatro
PUESTA EN MARCHA Y
OPERACiÓN DE
REACTORES
ANAEROBIOS
REACTORES ANAEROBIOS: ¿CAJA
NEGRA O ECOSISTEMA MICROBIANO?
Los INGENIEROS GENERALMENTE UTILIZAN EL PROCESO DE DIGESTIQN ANAEROBIA PARTIENDO DE
PRINCIPIOS BÁSICOS, CONTROLANDO Y OPERANDO EL PROCESO EN LA PRÁCTICA COMO UNA CAJA
negra, en la cual se conocen las entradas: el caudal de agua residual y su carga

'orgánica, así como la existencia o no de sustancias tóxicas en concentraciones apre-
ciables. El seguimiento de las salidas del sistema de tratamiento se desarrolla a
través del monitoreo de la calidad del efluente líquido y de la cantidad y calidad del
efluente gaseoso. No obstante, al no disponer de un conocimiento detallado de
los procesos biológicos que ocurren dentro de los reactores, los ingenieros se
guían fundamentalmente por el principio experimental de ensayo y error. En este
campo existen numerosos trabajos que presentan metodologías para el arranque
y operación de los sistemas anaerobios, las cuales se basan fundamentalmente en
el seguimiento de los parámetros de operación y en el aumento paulatino de la
carga, dependiendo de la "salud" del sistema.
De otro lado, microbiólogos y biólogos se centran en el estudio de las
poblaciones microbiológicas existentes y en el tipo de relaciones que se estable-
cen entre ellas, aislándolas y clasificándolas con procedimientos que suelen de-
morar días y aún meses. Se estudian así mismo, los fenómenos de competencia
por el sustrato, los procesos bioquímicos y en general se realiza la evaluación
cuidadosa de las principales relaciones y sucesos que ocurren dentro del proceso
de la digestión anaerobia.
Ambos enfoques, el de la ingeniería de orden eminentemente pragmático
y práctico, y el microbiológico poseedor de una mirada más científica y analítica,
deben complementarse procurando un entendimiento integral del proceso. El
trabajo mancomunado debería centrarse en la búsqueda de soluciones para los
principales problemas de la tecnología anaerobia, como son: el control de olores,
la optimización de la etapa de arranque, la identificación y manejo de sobrecar-
gas, el arrastre de sólidos y la valorización de subproductos. Se pone entonces, al
[78] o I G E S T IÓN A N A E R O 8 I A
orden del día, la conformación de grupos interdisciplinarios que estudien y expe-

rimenten con la tecnología anaerobia, avanzando de una manera más integral en
el conocimiento teórico y práctico de la misma, y en su aplicación a nuestra reali-
dad, mediante un enfoque interdisciplinario (Figura 4.1).
Afluente Efluente
enfoque ingenierif I enfoque microbiológico
? /
mmm
Figura 4.1. Integración de los enfoques ingenieril y microbiológico en los

reactores anaerobios.
Reconociendo los vacíos que existen actualmente en Colombia respecto a las

metodologíaspara el estudiode ladigestiónanaerobia,en este capítulose consideraránlos
aspectoscríticosen la implementaciónde estatecnología,buscandouna mayor integración
entre los saberes microbiológicoe ingenieril.
El uso de la tecnología implica dos etapas fundamentales: el arranque o
puesta en marcha del sistema y la operación del mismo (Tabla 4.1). En ambas
etapas la microbiología juega un papel fundamental, aportando elementos que
permiten explicar las respuestas del sistema, evaluar la salud del reactor, planifi-
car el esquema de trabajo y, en general, obtener información de los fenómenos
microbiológicos que ocurren en el sistema.
PU EST A EN M A R e H A Y o PERA eI6 N oE REA eTo RES A NA ER o B I os [79]
Tabla 4.1. Caracterización del residuo y de los lodos anaerobios desde el diseño del
reactor hasta la fase de estudios de mejoramiento de lodos
Fase
DISEÑO ARRANQUE OPERACiÓN MEJORAMIENTO

Componente
• Contenido • Remoción de DaD • Remoción de DaD

RESIDUO de nutrientes
• AGV efluente • AGV efluente
• DaD
• Alcalinidad y pH • Alcalinidad y pH
• Biodegradabilidad efluente efluente
• Toxicidad • Producción de • Producción de

biogas biogas
• Drigen del lodo • Actividad • Actividad • Actividad

INÓCULO O
metanogénica metanogénica metanogénica
LODO • Actividad
metanogénica • Sedimentabilidad • Sedimentabilidad • Sedimentabilidad
• Sedimentabilidad • Relación SSV/SST • Relación SSV/SST • Relación SSV/SST
• Relación SSV/SST • Composición • Composición • Composición

bacterial (NMP)
• Composición bacterial (NMP) bacterial (NMP)
bacterial (NMP) • Aislamiento
• Indice de
diversidad de
especies.
Lo anterior se logra estudiando y caracterizando el lodo en las dife-

rentes etapas: antes del arranque como inóculo potencial, durante el proceso
de arranque para evaluar la evolución del lodo y durante la etapa de opera-
ción para realizar el seguimiento de la calidad de éste. Es obvio qu·e la infor-
mación sobre las características microbiológicas del lodo es de gran ayuda
para el ingeniero en la toma de decisiones frente a las dos variables de ope-
ración como la carga hidráulica y la carga orgánica.
ETAPA DE PUESTA EN MARCHA O

ARRANQUE DEL REACTOR
Es el período de tiempo durante el cual la biomasa anaerobia se adapta a la

cantidad y calidad de las aguas residuales que debe tratar; en dicho período
generalmente el sistema de tratamiento se alimenta con caudales menores al de
diseño y la eficiencia de remoción de materia orgánica aumenta lentamente hasta
alcanzar los valores proyectados. Por lo tanto, es una etapa inestable y crítica
cuya duración puede oscilar entre un mes y un año o más, dependiendo del inóculo,
las características del agua residual y de la estrategia de arranque utilizada. La
duración de la etapa de arranque está definida, según Van Haandel y Lettinga
(1994), por el período de tiempo necesario para obtener una calidad constante
del efluente y una masa de lodo que no varía cualitativamente con el tiempo.
La mayoría de los autores identifican el final del proceso de arranque en lo
que respecta a la biomasa,con la aparición del fenómeno de granulación y/o la forma-
ción de una biopelícula o floc estable (Weiminel al., 1986; Lane, 1986; Francese y
Siñeriz, 1990, 1994; Camposy Anderson, 1991; Weilandy Rozzi, 1991).
Se han podido definir tres etapas en el proceso de arranque de las unida-
des anaerobias (Lettinga el al., 1980):
Adaptación primaria y crecimiento de bacterias degradadoras de los ácidos
acético y propiónico.
Formación de una biomasa anaerobia metanogénica activa.
Formación de un lodo granular, si las condiciones del sustrato lo permiten.
Enfoques utilizados en la etapa de arranque
AUMENTO LENTO DE LA CARGA ORGÁNICA
El enfoque tradicional de arranque de los reactores anaerobios se fundamenta en

una estrategia de aumento lento de la carga orgánica, siempre y cuando la 'salud'
del reactor lo permita; se inicia el arranque con cargas orgánicas bajas, las cuales
P U E S T A E N M A R e H A Y o P E R A eI6N D E R E A eT o R E S A N A E R o B lOS [81]
se incrementan cuando se alcanzan eficiencias de remoción de la materia orgá-

nica entre 60 y 80% Y el reactor presenta estabilidad en dichas remociones.
Este enfoque produce generalmente períodos de arranque largos, del orden de
varios meses; con el fin de reducirlos, se han desarrollado otros enfoques los
cuales se presentan a continuación.
ALTA PRESiÓN SELECTIVA
Se utiliza fundamentalmente para reactores de flujo ascendente y manto de lodos

(UASB). La velocidad ascensional conseguida funciona como factor de selección
del lodo: inicialmente se presenta el lavado del lodo floculento y disperso con
bajas actividades metanogénicas y, por lo tanto, en virtud de este fenómeno de
selección, suele aparecer el lodo granular (Hulshoff-Pol, 1989). La velocidad
ascensional está controlada por dos parámetros de operación: la carga hidráuli-
ca, relacionada directamente con la velocidad ascensional del líquido, y la carga
orgánica que regula la producción de biogas; al ascender, el gas aumenta la tur-
bulencia y, por lo tanto, la presión selectiva sobre las partículas de lodo.
ADICiÓN DE ELEMENTOS Y SUSTANCIAS QUE AUMENTAN
LA ADHESiÓN BACTERIAL
Esta estrategia consiste en agregar al reactor, a través del sustrato, elementos y sus-
tancias que incrementen la adhesión bacteria!.Se ha probado, entre otros compuestos,
la adición de Ca++ y de polielectrolitos; se reportan valores de Ca++ de 100 mg/I-l con
un efecto positivo sobre la adherencia (Mahoney, 1987; Hulshoff-Pol, 1989).
Por su parte, el uso de polielectrolitos mejora las condiciones de forma-
ción de gránulos, incrementando su tamaño (Cail y Barford, 1985). Los
polielectrolitos pueden ser útiles cuando el arranque se realiza con lodos pobre-
mente aclimatados o para residuos concentrados que dificultan la utilización de
cargas hidráulicas altas buscando la granulación; la adición de polímeros catiónicos
en presencia de carbón activado, como soporte inicial del gránulo, se ha reporta-
do como una combinación exitosa para conseguir la granulación (Wirtz y Dague,
1996). También se ha reportado la adición de sucrosa en proporción de 0.1 %
(masa/volumen) como estímulo para la formación de gránulos (Tay y Van, 1996).
[82] o I G E S T IÓN A N A E RO 8 I A
FENÓMENO DE GRANULACiÓN
El fenómeno de formación de biomasa con buenas características de sedimenta-

ción, preferiblemente bajo la forma de agregados en granos, se denomina 'granu-
lación' y es resultado de varios procesos físicos, químicos y biológicos. El tiempo
necesario para que el fenómeno de granulación tenga lugar dependerá, entre
otras cosas, del tipo de agua residual, del lodo utilizado como semilla, la disponi-
bilidad de nutrientes esenciales y las condiciones de operación del sistema.
El conocimiento de la composición microbiológica del lodo y el papel de las
especies en la adhesión ha sido de gran utilidad para el cabal entendimiento de la
manera como los consorcios microbiológicos trabajan, así como de los factores
que contribuyen a la formación del gránulo (Wu et a/., 1992; Dolfing, 1985;
Grotenhuis et a/., 1991).
El proceso de granulación se inicia cuando las bacterias se adhieren a los
precipitados inorgánicos o a las matrices formadas por las bacterias filamentosas.
En ambos casos los polímeros extracelulares excretados por los microorganismos
contribuyen a dar firmeza a la adherencia. Los conglomerados que se forman son
de tres tipos (Tay y Yan, 1996; Wentzel y Moosbrugger, 1995):
• Flocs: conglomerados con estructura suelta.
• Pellets: conglomerados con estructuras bien definidas que sedimentan rá-
pidamente. '.
• Gránulos: son pellets con apariencia granular y alta sedimentación.
Los principales factores que influyen en la granulación del lodo son
(Weigant et a/., 1986; Hulshoff-Pol, 1989): el tipo y concentración del lodo semilla;
las concentraciones de cationes bivalentes; la producción de sustancias poliméricas
extracelulares; el efecto hidráulico denominado 'presión selectiva'; la concentra-
ción del sustrato.
La formación de agregados celulares tiene las siguientes ventajas (Hulshoff-
Poi et a/., 1986):
a. Conduce al ordenamiento de poblaciones heterogéneas de microorganismos
sintróficos en forma de asociaciones multicelulares, bajo condiciones fisiológi-
cas favorables.
[84] o I G E S T IÓN A N A E R O 8 I A
CAPA CENTRAL
• BACTERIAS METANOGÉNICA
Methanosaeta sp.
CAPA EXTERNA
ACIDÓGENOS y BACTERIAS
CONSUMIDORAS DE HIDRÓGENO
CAPA MEDIA
BACTERIAS ACIDOGÉNICAS
BACTERIAS METANOGÉNICAS
Tomado de Fang, 1995.
Figura 4.2. Estructura y composición bacterial de los gránulos que tratan

carbohidratos solubles.
ETAPA DE OPERACiÓN
La operación rutinaria del sistema se inicia una vez superada la etapa de arran-
que, cuando se alcanzan las condiciones de diseño de carga orgánica e hidráulica
y la eficiencia de remoción de materia orgánica proyectada. En esta etapa se
espera que el reactor funcione en condiciones de estado estacionario o estable,
en el cual las variables de salida del sistema se mantienen relativamente constan-
tes a pesar de las variaciones temporales en cantidad y calidad del afluente.
La carga hidráulica aplicada sobre un sistema de tratamiento de aguas
residuales se define como la relación entre el caudal del afluente y el volumen útil
del sistema; por lo tanto, la carga hidráulica es igual al inverso del tiempo de
retención hidráulico.
El tiempo de retención hidráulico es el tiempo promedio de permanencia
del líquido en el reactor, el cual se define mediante la sigiente relación:
P U E S T A E N M A R e H A Y o P E R A CiÓ N oE R E A eT o R E S A N A E R o B lOS [85]
Lh = Qa/Vr = l/Trh (1)

Donde,
Lh = Carga hidráulica
Qa = Caudal del afluente
Vr = Volumen útil del reactor
Trh = Tiempo de retención hidráulico.
Por carga orgánica volumétrica se entiende la relación entre la masa de

material orgánico aplicada por unidad de tiempo y por unidad de volumen del
reactor, y se define así:
Lo = (Qa .•.Ca)/Vr = Ca/Trh (2)

Donde,
Lo = Carga orgánica
Ca = Concentración de DQO del afluente.
De otro lado, se define también la carga orgánica másica como la relación

entre la masa de material orgánico aplicada por unidad de biomasa presente en el
reactor y por unidad de tiempo:
Lm = (Qa .•.Ca)/Mvl (3)

Donde,
Lm = Carga orgánica másica
Mvl = Biomasa presente en el reactor.
Factores que influyen el arranque y la operación

de los reactores anaerobios
El arranque y operación de un reactor son procesos complejos que involucran

simultáneamente los siguientes factores relacionados (Figura 4.3):
Factores relacionados con el diseño y operación del reactor.

Factores ambientales (temperatura, pH, nutrientes).
Factores relacionados con la calidad y cantidad de la biomasa.
Factores relacionados con las características del residuo.
[86] D,GEST'ÓN ANAEROBIA
RESIDUO
Compoalclón
eonc ••.•lnlclón
OegrlldM>lllded
REACTOR
Geomeln.
T.m.ño
Figura 4.3. Factores que afectan el arranque y la operación de los

reactores anaerobios.
FACTORES RELACIONADOS CON EL DISEÑO Y LA OPERACiÓN
El diseño y operación de un reactor anaerobio debe asegurar las siguientes con-

diciones (Monroy, 1997):
• Retención de lodos viables dentro del reactor. Mientras mayor sea la concen-
tración de células activas retenidas (sedimentadas o adheridas), mayor será la
carga orgánica que podrá tratar. La capacidad que puede tener un reactor
para retener biomasa bajo diversas condiciones y el sistema de separación
gas-sólido-Iíquido son los factores claves en el diseño y operación de reacto-
res anaerobios.
• Contacto entre el lodo y el sustrato. El tiempo de retención hidráulica (TRH) debe
ser suficiente para permitir un estrecho contacto entre los reactantes. Si se tiene
en cuenta la baja velocidad de crecimiento de las bacterias metanogénicas, y
además que el 90% de la energía que utiliza esta población es para la produc-
ción de metano y sólo el1 0% para síntesis celular, el tiempo que se requiere para
PUESTA EN MARCHA Y OPERACiÓN DE REACTORES ANAEROBIOS [8~
formar una biomasa activa implica que el tiempo de residencia del lodo con el
agua se debe incrementar. El contacto lodo-agua residual es efectivo solamente
si el lodo está localizado en la parte principal del reactor.
Un problema común es que algunos lodos pueden flotar en la superficie del
reactor; entonces, el lodo que flota no se pone en contacto con el agua resi-
dual y hay una alta posibilidad que el lodo que flota saldrá del reactor. Varias
condiciones pueden asociarse con la flotación de la biomasa: presencia de
biomasa ligeramente filamentosa (que puede entrapar el biogas); presencia
de sustancias grasas en el lodo las cuales absorben el biogas; presencia de
proteínas en el agua residual; contacto inadecuado entre la biomasa y el agua
residual debido a deficiencias en el sistema de alimentación.
o Velocidades de reacción. Es decir que los productos puedan salir fácilmente del
agregado, que los subproductos puedan transferirse inmediatamente entre las
especies bacterianas y que los sustratos se encuentren a concentraciones ade-
cuadas frente a dichas especies. La difusión del sustrato hacia el microambiente
que rodea las bacterias está limitada por la velocidad de difusión del sustrato en
el manto de lodo y en el lodo granular (Field, 1987) (Figura 4.4).
+ + + + +
••••
•••••
••••••
Difusión en el gránulo
•••••
Difusión en el menlo de lodo
Figura 4.4. Difusión de las partículas de lodo.
o Transferencia de masa. El tamaño de las biopartículas o biopelículas debe per-

mitir el fácil acceso de los organismos al sustrato.
o Tiempo de retención de sólidos. Un tiempo de retención de los sólidos alto en
el reactor contribuirá a una mayor adaptación de los lodos al afluente, lo que
favorece la estabilidad de la biomasa.
FACTORES AMBI ENTALES
Entre los factores ambientales que afecta la operación de un biorreactor anaerol

se encuentran el tipo de sustrato, la temperatura de operación, los nutrient
disponibles, el pH, la relación alcalinidad/ácidos grasos volátiles (AGV) y
toxicidad anaerobia.
Tipo DE SUSTRATO. El tipo de sustrato determina la comunidad trófi,
que se desarrolla. En ecosistemas complejos como el de un digestor anaerobio,
tamaño de cada grupo de organismos deberá ser proporcional al flujo de ~
correspondiente sustrato en el sistema y la prevalencia de una u otra rul
metabólica está determinada por el acoplamiento entre la velocidad de produ(
ción y la capacidad de asimilación del mismo. Si las diferencias entre el contenid
de DQO y DBOs son grandes, indica que existe una alta proporción de componer
tes no biodegradables. Cuando la DQOBD está compuesta por sustratos fácilment
biodegradables, tales como azúcar o aminoácidos, la etapa limitante en la diges
tión anaerobia es la metanogénesis, porque las bacterias fermentativas tienen le
capacidad de acidificar el sustrato a una velocidad ocho veces más rápida compa·
rada con la velocidad con que las bacterias metanogénicas consumen los ácido~'
grasos volátiles (AGV) productos de la fermentación; como resultado, la capaci-
dad de utilización de DQO BDtotal de la población metanogénica en el reactor
determina la máxima carga de DQO BDque puede aplicarse. Si la velocidad de
carga excede la capacidad metanogénica se producirá una acumulación de AGV
en el reactor y el pH disminuirá (Zegers, 1987).
Cuandoocurren sobrecargas en el reactor puede darse lugar a dos situaciones:
• Las bacterias acetogénicas crecen rápidamente y producen grandes cantida-
des de ácido acético. Esto ocasiona una baja del pH y la liberación de hidróge-
no; sin embargo el aumento en la concentración de hidrógeno en el reactor
estimula una disminución en la producción de ácido acético, lo cual permite
que el reactor se recupere y que el metabolismo se desplace hacia la forma-
ción de ácido butírico, lo que reduce la carga sobre el sistema.
• Cuando la sobrecarga es muy alta, la concentración de hidrógeno induce la
formación de grandes cantidades de ácido propiónico y, paralelamente, el me-
P U E ST A EN M A R e H A Y o PERA eI6 N DE REA eTo RES A NA ER o B 105 [89]
tabolismo y crecimiento de las bacterias acetogénicas cesa por el hidrógeno

acumulado en el sistema. Esta situación se conoce como 'sobrecarga por ácido
propiónico' y constituye un grave problema ya que su recuperación es incierta
y muy lenta (Zegers, 1987).
Por otra parte es importante conocer la composición promedia del agua
residual con respecto a:
• La presencia de compuestos tóxicos.
• La cantidad de nutrientes.
• La disponibilidad de trazas de elementos como Fe, Co y Ni.
TEMPERATURA. La mayoría de los digestores anaerobios operan entre 30-35°C,
por que la formación de metano a 20°C es baja. En reactores operados a 35°C se ha
observado un descenso del 50% en la actividad y crecimiento de las bacterias cuando
la temperatura disminuye en 10°C. Por el contrario, el aumento en la temperatura
permite incrementar la producción de metano. Comparativamente, los reactores que
son operados en el intervalo termofílico (55-60°C) muestran el doble de la producción
de metano que a 35°C, lo cual disminuye el tiempo de residencia y volumen del reactor,
en contraprestación de la energía que se requiere para mantener el reactor a esta
temperatura (Varel el al., 1977).
NUTRIENTES. Los nutrientes necesarios para el crecimiento de las bacterias
al interior del reactor dependen de la concentración de DQOBD del agua residual.
Aunque los requerimientos nutricionales de las bacterias durante el proceso de
degradación anaerobia son bajos, y la mayoría de las aguas residuales no presen-
tan tal deficiencia, los efluentes producidos en la fabricación de papel, almidón y
alcohol pueden ser deficientes en los micronutrientes esenciales. La adición de
nitrógeno y fósforo incrementa la eficiencia del proceso. Sin embargo, es necesa-
rio controlar la concentración de amonio en el afluente del reactor, pues aunque
éste es utilizable por las bacterias para su crecimiento, su exceso puede causar
toxicidad e inhibición de la población metanogénica (Field, 1987; Zegers, 1987).
PH. El reactor debe operar en un intervalo de pH entre 6.8 y 7.5, porque la
actividad de la población metanogénica es altamente vulnerable a los cambios de
pH comparada con las demás poblaciones presentes en el lodo. Los AGV son
tóxicos para la metanoqénesis, solamente en la forma no ionizada. A DH neutro.
los ácidos orgánicos están mayoritariamente (>99%) en la forma ionizada (no

tóxica). No obstante, cuando el pH disminuye, los AGV están menos disociados
(tóxicos), incluso a pH 5.0, los AGVestán disociados en un 50% aproximadamente
(Zegers, 1987).
RELACIÓN ALCALINIDAD/ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES. La relación AGV/aicalinidad es
un parámetro de utilidad para controlar la acumulación de AGV en los reactores
anaerobios: un valor de 0.2 indica una excelente capacidad buffer del sistema,
con un máximo valor de 0.4; sin embargo, en los reactores UASB,un valor de 0.35
indica acidificación. Así, esta relación es utilizada como un indicador temprano de
acidificación, comparado con los datos de pH y alcalinidad que se alteran en esta-
dos avanzados y de difícil recuperación (Rojas, 1987).
TOXICIDAD ANAEROBIA. El consorcio de microorganismos involucrados en el
proceso de digestión anaerobia de la materia orgánica, como cualquier organis-
mo vivo, no esta exento de ser inhibido por alguno de los compuestos presentes
en el agua residual. Sin embargo, dado el hecho de que las bacterias metanógenas
tienen tiempos de generación muy prolongados, la consecuencia de la introduc-
ción de sustancias tóxicas es mayor en un sistema anaerobio que en uno aerobio.
Es por esta razón que se debe conceder una especial atención a la operación de
este tipo de reactores para evitar que las sustancias tóxicas entren a los sistemas
anaerobios, por lo menos en concentraciones inhibitorias. Para tal fin es necesa-
rio conocer y entender a fondo el fenómeno de toxicidad.
El término toxicidad se refiere normalmente a la perturbación originada
por una sustancia sobre un proceso metabólico o sobre la viabilidad del organis-
mo en cuestión. En la práctica, durante el tratamiento anaerobio del agua resi-
dual, la toxicidad se observa como una reducción en la producción de metano a
consecuencia de un compuesto o una mezcla de compuestos. Cabe considerar
que la inhibición causada por determinadas sustancias puede ocurrir en cualquie-
ra de las poblaciones del consorcio bacteriano, lo que implicaría un desbalance
poblacional y, por consiguiente, una síntesis disminuida del producto final: el me-
tano. Esto implica que el efecto de un compuesto tóxico es muy complejo y no
puede asumirse solamente como la inhibición de las bacterias metanogénicas,
pues ellas dependen del metabolismo de las demás bacterias allí presentes; por
P U E S T A E N M A R e H A Y o P E R A eI6 N oE R E A eTo R E S A N A E R o B lOS [9
otra parte, la magnitud de la toxicidad es función de varios factores entre los que
se encuentran la concentración, la formación de complejos y la aclimatación,
entre otros.
De acuerdo con Lettinga (1999), se pueden distinguir tres tipos de toxicidad:
a. Toxicidad metabólica: Se refiere a la inhibición competitiva de un proceso
metabólico; al retirar la sustancia tóxica, la toxicidad es completamente reversible.
b. ToxicIdad fisiológica: Es la inhibición que resulta del daño sobre componentes
subcelulares; al retirar el compuesto tóxico ocurre la recuperación, aunque de
manera tardía. Esta demora se debe al tiempo requerido para reparar los
daños ocurridos.
c. ToxiCIdadbadericida: Se aplica a sustancias tóxicas que causan la muerte celu-
lar; luego de su remoción, la producción de metano puede que se reanude
luego de mucho tiempo, pues se requiere que surja una nueva generación a
partir de las células viables, lo cual se ve muy limitado por los largos tiempos
de generación de las bacterias involucradas.
Existe una gran variedad de compuestos reportados como tóxicos; Lettinga
(1999) propone la siguiente clasificación en cinco clases principales:
1. Inhibldores típicos. Dentro de este grupo se encuentran aquellos compuestos
que son causa frecuente de toxicidad en la mayoría de las plantas de tratamiento
de aguas residuales. Tal es el caso de los ácidos grasos volátiles, sustratos típi-
cos de las aguas residuales, o del amonio y el sulfuro de hidrógeno, productos
finales de la digestión anaerobia que resultan de la degradación de proteínas y
de la reducción del sulfato. Estos compuestos tienen en común que su toxicidad
es dependiente del pH; esto se debe a que las especies no ionizadas de dichos
compuestos, al tener un carácter apolar, son absorbidas por la membrana celular
y alteran las funciones celulares, siendo entonces las responsables de la toxici-
dad. En la medida en que esta disociación está en función del pH, es posible
controlar hasta cierto punto el efecto de estos compuestos; así, a pH menores de
6, la fracción de ácido acético no ionizado es muy significativa, mientras que a pH 8
es sólo una traza. Por lo tanto, durante la operación del reactor es necesario man-
tener el pH en un intervalo ligeramente alcalino (7,5 - 8) de manera que no se
exceda la capacidad de carga orgánica particular del reactor.
En el caso del sulfuro, su toxicidad se debe a la forma no ionizada del sulfuro

de hidrógeno; como esta especie se incrementa a pH ácido, se estima que una
concentración de 250 mg/L causa la inhibición del 50% de la actividad
metanogénica. Para estimar la concentración de esta especie en el reactor se
debe tener en cuenta: la cantidad de sulfuro que se llega a producir por reduc-
ción del sulfato, la producción de biogas, pues junto con el metano también se
escapa una fracción de HzS,y finalmente, la ionización del sulfuro. Por su par-
te, el amonio es una fuente importante de toxicidad en aguas residuales ricas
en nitrógeno orgánico; el amoniaco, la base no ionizada del amonio, es consi-
derado como el responsable de la toxicidad, pues su concentración aumenta a
pH alcalino mientras en condiciones neutras disminuye significativamente.
2. Sales. El agua residual de algunas industrias suele contener altas concentra-
ciones de sal. Los problemas más comunes de toxicidad se relacionan con Na+,
K+, Ca+zy Mg+z.
3. Compuestos naturales. En este grupo se encuentran aquellas sustancias natu-
rales que tienen efectos inhibitorios sobre las células bacterianas. Este tipo de
compuestos es común encontrarlos en los efluentes de plantas de procesa-
miento de alimentos.
4. Contaminantes industriales. Dentro de esta clase se agrupan los compuesto~
xenobióticos que tienen generalmente un origen industrial, en algunas ocasio-
nes con una contraparte natural, pero cuya concentración en el ambiente e~
muy baja. Usualmente son muy tóxicos y ejercen fuertes efectos inhibitorios é
muy bajas concentraciones; entre éstos se incluyen sustancias como solven·

tes, pesticidas, surfactantes, colorantes, organohalogenados y metales pesa·
dos, entre otros.
Los metales pesados pueden estar presentes en concentraciones considera
bies en las aguas residuales que provienen de industrias, fuentes doméstica:
y comerciales (Hickey et al., 1989; Bhattacharya et al., 1995). Una concen
tración alta de estos metales en los lodos puede conducir a la perturbaciór
del proceso de estabilización del lodo y, por lo tanto, puede llegar a limitar su:
opciones de disposición. La digestión anaerobia es, por lo general, el prime
proceso que sufre un deterioro en su funcionamiento debido a estos compues
PUESTA EN MARCHA Y OPERACiÓN DE REACTORES ANAEROBIOS [93]
tos. Swandick (1969), citado por Battacharya, afirma que la inhibición por meta-
les pesados es la segunda causa, después del diseño y operación inadecuada,
relacionada con el bajo rendimiento de la digestión anaerobia y las consecuentes
fallas del proceso. Una de las principales características que distingue a los meta-
les pesados de otros compuestos tóxicos es que no son biodegradables y, por lo
tanto, se acumulanen el lodo hasta alcanzar concentraciones tóxicas (Bhattacharya
el al., 1995). La especiación y partición de los metales es el factor que más
influyeen su potencial de toxicidad. Las investigaciones de Gouldy Genetelli (1978),
citados por Hickey el al. (1989), muestran que los organismos vivos son más
sensibles a los metales iónicos libres en solución que aquellas especies del metal
unido a complejos o precipitados.
La toxicidad relacionada con los metales pesados ocurre debido a la alteración
de la estructura y las funciones de las enzimas, pues éstos se unen con de-
terminados grupos de la proteína o reemplazan los metales que ocupan nor-
malmente el grupo prostético Hickey el al. (1989). En consecuencia, cualquiera
de las poblaciones del consorcio bacteriano son sensibles a estos elementos;
se ha reportado que los metales más tóxicos para las bacterias metanogénicas
son el cromo, el cadmio, el plomo, el zinc, el cobre y el níquel.
Los compuestos aromáticos están presentes en el ambiente en forma de deri-
vados de la lignina, los taninos, los aminoácidos fenólicos y otros componentes
aromáticos de las plantas. Así mismo, muchas actividades humanas contribu-
yen a la presencia en el medio de estos compuestos; dentro de las principales
fuentes de contaminación se encuentra la incineración de desechos, la minería
y la descarga a los cuerpos de agua de los desechos provenientes de las
industrias petroquímica, farmacéutica y productora de papel. Algunos de estos
compuestos son xenobióticos y tienden a bioacumularse resultando tóxicos
para los microorganismos (Reyes el al., 1991). Según Reyes y Lettinga, los
bencenos monosustituidos que presentan mayor toxicidad para las bacterias
metanogénicas acetoclásticas son el clorobenceno, el metoxibenceno y el
benzaldehido; concluyen también que la toxicidad de los compuestos aromáti-
cos se incrementa al aumentar la longitud de las cadenas alifáticas sustituyentes,
al igual que el número de grupos alquil y cloro. Así mismo, estos autores repor-
tan que existe una correlación positiva entre la hidrofobicidad del compuesto y
la inhibición de la actividad metanogénica.
5. Otras sustancias: Se han realizado otra serie de investigaciones en donde se
busca analizar el efecto de determinados compuestos que suelen entrar en
contacto con las bacterias encargadas de la degradación anaerobia, depen-
diendo de los procesos que se lleven a cabo en cada industria en particular. Es
así como se encontró que las resinas ácidas, presentes en el agua residual de
las industrias productoras de papel, resultan tóxicas para las bacterias
anaerobias (McCarthy el a/., 1990). Otro ejemplo corresponde al caso del
formaldehído, un compuesto ampliamente usado en las industrias química, tex-
til y maderera, para el cual los investigadores encontraron que causa una
fuerte inhibición de la biomasa responsable de la digestión (Lu el a/., 1998).
Los compuestos citados se incluyen dentro de las sustancias xenobióticas cau-
santes de toxicidad en los sistemas anaerobios, junto con el formaldehído,
algunos antibióticos, hidrocarburos c1orados y algunos aromáticos. El efecto
de estos detergentes o surfactantes sobre los sistemas de tratamiento de aguas
se ha venido apreciando en varios casos; Austermann el a/. (1998), repor-
tan que durante la recuperación de la planta de tratamiento de aguas de una
cervecería alemana se hizo necesario sustituir algunos de los desinfectantes y
de los lubricantes de cadenas utilizados, así como la reducción en el uso de
agentes desinfectantes como el ácido etilendiamino triacético (EDTA),con el fin
de mejorar el nivel de tratamiento. García el a/. (2000) estudiaron el efecto
de varios surfactantes catiónicos comerciales (sales de amonio cuarternario)
sobre la degradación anaerobia y encontraron que uno de los tres compues-
tos evaluados (compuestos con dos grupos metilo sustituidos y unidos di-
rectamente al átomo de nitrógeno) resultaba tóxico para las bacterias en
concentraciones superiores a 64 mg/g de lodo; los demás surfactantes, en
los cuales los grupos hidrofóbicos estaban unidos al nitrógeno por enlaces
éster, eran tomados como nutrientes por parte de las bacterias. Wagener el
a/. (1987) reportan porcentajes de inhibición del 80% de la actividad
metanogénica con surfactantes aniónicos del tipo alquil-benceno-sulfonatos,
y del 20% para surfactantes no iónicos como los alquil-fenol-etoxilatos.
PUESTA EN MARCHA Y OPERACiÓN DE REACTORES ANAEROBIOS [95]
Factores relativos a la calidad del lodo

TIPO DE INÓCULO
El tiempo para el arranque del reactor será corto si el lodo utilizado como inóculo
tiene una alta actividad metanogénica y está adaptado a los sustratos presentes
en el agua residual. En países donde la tecnología anaerobia es ampliamente
utilizada (Europa, USA,China), la consecución de lodos como inóculos para las
plantas de tratamiento normalmente se realiza a partir de otros reactores o éstos
son suministrados por compañías privadas; sin embargo, en los países de Améri-
ca Latina que han venido utilizando esta tecnología, la consecución de lodos como
inóculos no es una labor fácil, ya que no existen suficientes reactores anaerobios
que suministren inóculos de calidad.
Frente a esta dificultad se viene trabajando en el acondicionamiento de
inóculos a partir de fuentes diferentes a los reactores anaerobios; por ejemplo, se
han explorado inóculos provenientes de lodos activados, lagunas de estabiliza-
ción, tanques de sedimentación y tanques sépticos, requiriéndose por lo tanto, la
adaptación de dichos inóculos al sustrato que se va a utilizar.
En este proceso de búsqueda de inóculos alternativos, la caracteriza-
ción microbiológica de los lodos se ha constituido en una herramienta funda-
mental de trabajo, toda vez que permite identificar y seleccionar potenciales
inóculos para reactores anaerobios. En la Tabla 4.2 se reportan las posibles
fuentes de inóculos de los reactores, así como los valores de actividad
metanogénica y el contenido de sólidos suspendidos volátiles (SSV) (Guyot,
1993; Ramírez, 1996).
En general, se recomienda una concentración mínima de 1OKgSSV/m3 y
un volumen no mayor del 60% del volumen total del reactor. Por otra parte, es
importante evitar el arrastre de las bacterias durante la fase de arranque y
controlar parámetros como la carga orgánica volumétrica, el tiempo de reten-
ción hidráulica (TRH) Y la concentración de AGV en el efluente del reactor
(Hulshoff-Pol,1987).
Tabla 4.2. Diferentes fuentes de inóculos para reactores anaerobios
Tipo de inóculo Actividad metanogénica Concentración típica de

específica SSV en el lodo
gCH.-DaO/g SSV.d gIl
Lodo granular 0.5 -1.5 70 -120
Biopelicula 0.4·1.2 ND
Lodos domésticos digeridos 0.02 - 0.2 15·40
Estiércol digerido 0.02·0.08 20 - 80
Lodo de fosa séptica 0.01·0.07 10·50
Laguna anaerobia 0.03 30
Estiércol fresco 0.001 - 0.002 30 -140
Sedimento laguna 0.002 - 0.005 20·50
Fuenle: Fiekl. 1987
Los procesos anaerobios de segunda y tercera generación requieren d~

biomasa con alta actividad metanogénica y que se mantenga en el reactor, ya seé
por adherencia a un soporte como en el caso de los filtros anaerobios o los reacto·
res de lecho fluidizado, o por formación de gránulos como ocurre en los reactore~
UASBde alta tasa. En la Tabla 4.3 se consigna un resumen de las principales carac-
terísticas de los lodos granulares presentes en reactores UASBde alta carga.
Tabla 4.3. Propiedades del lodo granular
Característica Intervalo
Densidad ( kg/m 3) 1028 a 1082

I
Relación SSV/SST 0.45 a 0.90
Velocidad media sedimentación (mlh) 53 a 100
Diámetro medio de gránulos (mm) 0.8 a 2.2
Actividad metanogénica (gDOO-CH'/gSSV/d) 0.2 a 1.9
Fuente: Hulshoff- Poi. 1989.
P U E S T A E N M A Re H A Y o P E R A CiÓ N D E R E A e T o R E S A N A E R o B lOS [97]
BIBLIOGRAFíA
AUSTERMANN, u.; Lange, R. y Seyfried, C. (1998). "Upgrading an Anaerobic/Aerobic Wastewater
Treatment Plant". Water 5cíence Techn%gy, 37: 243-250.
BHAnACHARYA, 5.; Madura, R. y Uberoi, V (1995). "Toxic Effects 01 Cadmium on Methanogenic
Systems". Water Research, 29: 2239-2345.
CAIL, R.G y Barford, J.P. (1985). "The development 01 granulation in an upllow Iloc digester
and an upllow anaerobic blanket digester treating cane juice stillage". Biotechn%gy
Letters, 7: 493-498.
CAMPOS, C.M y Anderson, G.K. (1991). "The effect 01 the liquid upllow velocity and the substrate
concentration on the star-up and the steady state periods 01 lab-scale UASB reactors".
In: 6° International Symposion on Anaerobic Oigestion. Sao Paulo, Brasil.
OOLFING, J. (1985). "Chemical and bacteriological co~position 01 granular methanogenic sludge".

Canada. ¡ouma/ of Microbi%gy. 31: 744-750.
OOLFING J. Y Bloemen, W. (1985). "Activity measurements as a tool to characterize the microbial
composition 01 methanogenic environments". ¡ouma/of Microbia/ Methods, 4: 1 - 12
FANG, H., Chui, H.K. y Li, Y. (1995). "Microbial structure and activity 01 UASB granules treating
different wastewater". Water 5cíence Techn%gy 30(12): 86-96.
FIELD,J.(1987) "Medición de parámetros". En: Curso de arranque y operación de reactores anaerobios
con flujo ascendente y manto de lodos (UASB). Universidad del Valle, Cali. (Colombia).
FRANCESE, A. y Siñeriz, F. (1990). "Puesta en marcha de reactores anaerobicos tipo UASB".
Memorias del XXII Congreso de AIOIS, San Juan de Puerto Rico.
FRANCESE, A. y Siñeriz, F. (1994). "Puesta en marcha de reactores UASB". Memorias del 111
Taller y Seminario Latinoamericano 'Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales'.
Montevideo, (Uruguay).
GARcíA,M., Campos, E., Sanchez, J. y Ribosa 1. (2000). "Anaerobic Oegradation and toxicity 01 Comercial
Cationic Surfactants in Anaerobic Screening Tests". Chemosphere. 41: 705-710.
GROTENHUISJ.T.,Smith" M. y Plugee, C.M. (1991). "Bacteriological composition and structure of
granular sludge adapted to different substrates". Applied and Enviromental Microbiology,

57(7): 1942-1949.
GUIOT, R.5., Pauus A. y Costerton J,W (1992). "A structural model of the anaerobic granule
consortium". Water 5cíence Technology, 25(7): 1-10.
GUYOT,J.P (1993). "Anaerobic microbial counts of different potential anaerobic inocule". Applied
Microbiology, 40: 139-142.
HICKEY,R., Vanderwielen, J. y Switzenbaum, M. (1989). "The effect of Heavy Metals on Methane
Production and Hydrogen and Carbon Monoxide Levels Ouring Batch Anaerobic Sludge
Oigestion". Water Research, 23:207-218.
HULSHOFF-POL, L., Worp, L.W. y Lettinga, G. (1986). "Physical characterization of anaerobic
granular sludge". Proc(. NVA/ EWPCA, Water Treat. Conf. Anaerobic Treatment: A grow-
up technology, Amsterdam, (The Netherlands). Sept. 1986: 89-101.
HULSHOFF-POL, L. (1987). "Arranque y operación de reactores UASB. Arranque y operación de
sistemas de flujo ascendente con manto de lodo UASB. Manual del curso. Universidad
del Valle. Corporación Autónoma Regional del Cauca y Universidad Agrícola de
Wageníngen. Santiago de Calí (Colombia). Noviembre. E-1 - E-11.
HULSHOFF-POL, L. (1989). "The phenomenon of granulation of anaerobic sludge". Tesis doctoral.
Universidad Agrícola de Wageningen, (Holanda).
LANE, A.G. (1986) "Star-up, operating requeriments and granule formatíon during upflow sludge bed
treatment of a strong food processing effluent". Environmental Technology Letters, Vol. 7.

LEnlNGA G. (1980) "Use of the upflow sludge blanket (USB) reactor concept for biological
wastewater treatment". Biotechnology & Bioengineering, 22: 699-734.
LETIINGA G., Hulshoff-Pol L. y Zeeman G. (1999). Lecture notes: "Biological wastewater treatment.
Part One: Anaerobic Wastewater Treatment". Wageningen University (The Netherlands),
Oecember, 1999.
LU, Z. y Hegemann, W. (1998). "Anaerobic Toxicity and Biodegradation of Formaldehyde in Batch
Cultures". Water Research, 32: 209-215.
MAHONEY, E.M. (1987). "The effect of calcium on microbial aggregation during UASB reactor
star-up". Water 5cíence Technology, 19: 249-260.
McCARTHY,P, Kennedy, K. y Oraste, R. (1990). "Role of Resin Acids ín the Anaerobic Toxicity of
Chemythermomechanical Pulp Wastewater". Water Research. 24, 1401-1405.
P U E S T A E N M A R e H A Y o P E R A eI6 N o E R E A eT o R E S A N A E R o B I os [99]
MOLlNA, F.(1997). "Influencia de la carga hidraúlica y la concentración del sustrato en el arranque
de reactores UASB". Tesis de Maestría. Universidad del Valle, (Colombia)
MONROY, O. (1997). "Sistema de Rectores Anaerobios". Memorias. VIII Curso Avanzado sobre
Procesos Biotecnolágicos "BiotecnologíaAmbiental". Junio 30-Julio 11. Cuernavaca, (México).
RAMIREZ, L., Molina F., Rojas O. y Alazard O. (1996). "Evaluación de potenciales semillas para la
inoculación de reactores anaerobios". En: IV Seminario Taller Latinoamericano sobre
Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales. Bucaramanga, (Colombia).
REYES,S. y Lettinga, G. (1991). "The Effect 01 Aromatic Structure on the Inhibition 01 Acetoclastic
Methanogenesis in Granular Sludge". Applied Microbiology & Biothechnology, 34: 544-550.
ROJAS, O. (1987). "Relación Alcalinidad - Acidos grasos volátiles. Arranque y operación de
sistemas de Ilujo ascendente con manto de lodo". UASB. Manual de curso. Universidad
del Valle. Corporación Autónoma Regional del Cauca y Universidad Agrícola de
Wageningen. Santiago de Cali (Colombia). Noviembre. 0-1-0-31.
TAY,J.YVan, y. (1996). "Influence 01 substrate concentration on microbial selection and granulation
during star-up 01 upllow anaerobic sludge blanket reactors". WaterEnvironment Research,

68(7): 1140-1150.
VAN HAANOEL, A. y Lettinga, G. (1994). Tratamento anaerobio de esgotos em regioes de clima
quente. Editora EPGRAF.Campina Grande, Brasil
VAREL IJ.H.,Isasscson, Bryant, M.P. (1977). "Thermophilic methane production Irom cattle waste".
App/ied Environtal Microbiology; 33: 298-307.
WAGENER, S. y Schink, B. (1987). "Anaerobic degradation 01 nonionic and anionic surfactans in

enrichment cultures and lixed-bed reactors". Water Research, 21 :615-622.
WEIGANT, M. y Oe Man, A.w (1986). "Granulation 01 biomass in thermophilic upllow anaerobic
sludge blanket reactors treating acidilied wastewater". Biotechnology & Bioengineering,

28: 718-727.
WEILANO, P. y Rozzi, A. (1991). "The star-up operation and monitoring 01 high-rate anaerobic
treatment systems. Oiscessers reports". Water Sdence Technology, 24 (8): 257-277.
WENTlEL, M.C y Moosbrugger, R.E. (1995). "Tentative guidelines lor waste selection, process
desing, operation and control 01 upllow anaerobic sludge bed reactors". Water Sdence
Technology; 30(12): 31-42.
WEIMIN, w., Jiwi, H. y Xiasheng, G. (1986). "Effect 01 granulation 01 sludges in the upllow reactor
in solid-liquid separation". Uanjing Kexue Xuebae, 6 (1): 86-95.
[100] D,GESTiÓN ANAEROBIA
WIRTZ, R. Y Dague, R. (1996). "Enchancement 01 granulation and star-up in the anaerobic

sequencing batch reactor". Water Environment Research, 68(5): 883-892.
WU,W.M.,Jain, M.K., Macario, E.C., Thiele, J.Hy Zeikus, G. (1992). "Microbial composition and
characterisation of prevalent methanogens and acetogens isolated Irom syntrophic
methanogenic granules". App/ied Microbi%gy & Biotechn%gy. 38: 282-290.
ZEGERS,F. (1987). Microbiología, arranque y operación de sistemas de flujo ascendente con
manto de lodo. UASB. Manual de curso. Universidad del Valle. Corporación Autónoma
Regional del Cauca y Universidad Agrícola de Wageningen. Santiago de Calí. Colombia.
Noviembre. A-1-A-14.
ZEHNDER,A. (1988). Biology of Anaerobic Microorganisms. John Wiley and SonsoInc.
capítulo
c i n c o
CARACTERIZACIÓN DE
LODOS ANAEROBIOS Y
AGUAS RESIDUALES
EL ÉXITO O FRACASO DE UN SISTEMA ANAEROBIO DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES
DEPENDE FUNDAMENTALMENTE DE LA CALIDAD DE LA BIOMASA CONTENIDA EN EL REACTOR; POR
lo tanto, la caracterización de la biomasa permite entender el funcionamiento del

sistema, proyectar su desempeño futuro y definir la potencialidad de la biomasa
como fuente de inóculo para otros reactores.
LODOS ANAEROBIOS
Caracterización Fisicoquimica
MUESTREO
La toma de una muestra de lodo en reactores de lecho suspendido, por ejemplo

reactores UASB,se realiza extrayendo la cantidad de lodo necesaria mediante las
válvulas de drenaje del sistema. En los reactores de lecho fijo, por ejemplo los
filtros anaerobios, la toma de la muestra se lleva a cabo extrayendo una cantidad
suficiente del medio de soporte y raspando posteriormente la biomasa adherida.
La muestra de lodo se toma en recipientes limpios; dependiendo del objetivo
del estudio, se pueden tomar muestras puntuales de una o varias capas de lodos o
del medio de soporte. La otra alternativa consiste en tomar muestras compuestas a
partir de muestras individuales tomadas a diferentes alturas o alícuotas del manto
de lodo o del medio de soporte. Es importante tener en cuenta, que para obtener
una muestra representativa, debe descartarse el lodo almacenado en la válvula,
para lo cual se descarta el volumen inicial colectado. Generalmente se toma de uno
a dos litros de muestra y se recomienda llenar el recipiente hasta el borde superior
para minimizar la exposición al oxígeno (Wills et al., 2000).
Al tomar la muestra, se debe registrar información básica como el tipo de
reactor evaluado, los parámetros de operación y las características del afluente y
el efluente del reactor. La muestra se debe transportar refrigerada, y una vez

ingresa al laboratorio, se recomienda gasear la muestra con Nz por 10 a 15 minu-
tos y luego refrigerar a 4°C hasta el momento de ser procesada.
SÓLIDOS
FUNDAMENTO TEÓRICO. El material suspendido o disuelto presente en el agua resi-

dual se denomina 'sólidos', y en él se pueden distinguir tres categorías: sólidos
totales, sólidos suspendidos totales y sólidos disueltos totales. En cada una de
estas tres categorías también se hace diferencia entre los sólidos fijos y los sóli-
dos volátiles: los primeros son los sólidos que permanecen después de incinerar
la muestra, mientras que los segundos son los sólidos oxidados o volatilizados al
incinerar la muestra.
Cuando los lodos anaerobios presentan características sólidas o semi-só-
lidas, la masa de los sólidos disueltos es despreciable comparada con la fracción
de sólidos suspendidos, por lo cual no es necesario filtrar los lodos, evitando así
las dificultades inherentes a filtrar al vacío una cantidad apreciable de lodo.
En caso de que el contenido líquido del lodo sea importante, debe realizar-
se el filtrado de los lodos para separar la fracción suspendida de la disuelta; para
este caso se utilizó el método consignado en los métodos normalizados para el
análisis de aguas potables y residuales (APHA, 1998).
MATERIALES y EQUIPOS.
o Cápsulas de porcelana
o Balanza analítica
o Probeta
o Baño María
o Estufa
• Mufla
• Pipetas
• Pinzas para mufla
PROCEDIMIENTO. Se recomienda trabajar por triplicado, así:
• Colocar 30 mililitros de lodo en una cápsula de porcelana previamente incine-
rada y pesada, (PJ
CARACTERIZACiÓN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [105]
• Evaporar al baño María la humedad del Iodo.

• Secar en estufa a una temperatura entre 103°( Y 105°( durante 24 horas.
• Transferir las cápsulas al desecador hasta que se enfríen y pesarlas, (Pzl.
• Incinerar la muestra en la mufla a 550 0
( ± 50 0
( durante una hora.
• Transferir las cápsulas a la estufa durante 15 minutos.
• Posteriormente, colocar las cápsulas en el desecador y permitir que se enfríen.
• Pesar las cápsulas, (PJ
CÁLCULOS.
• Sólidos Suspendidos Volátiles (SSV):
SST (mg/l) = (PrP)"'1.OOO/(30/1.000)
• Sólidos Suspendidos Totales (SST):
s V (mg/l) = (PrP)+1.OOO/(30/1.000)
íNDICE VOLUMÉTRICO DE LODOS Y VELOCIDAD DE SEDIMENTACiÓN
FUNDAMENTO TEÓRIco' Los sistemas de tratamiento de aguas residuales por proce-

sos biológicos anaerobios se basan en la retención de grandes cantidades de
lodo en el sistema; con ello se logra que el tiempo de retención de lodos sea
mucho mayor que el tiempo de retención hidráulico; por lo tanto la velocidad de
sedimentación (VS) es una variable importante para mantener la biomasa dentro
del sistema. La velocidad de sedimentación indica la rapidez con la que sedimenta
el lodo y se expresa en m/h.
El índice Volumétrico de Lodos (IVL) es una prueba que evalúa la capaci-
dad de sedimentación y compactación de un lodo; se define como el volumen que
ocupa un gramo de lodo, después de sedimentar durante 30 minutos, sus unida-
des son ml/g.
• Probeta de vidrio de 1.000 mi

• (ronómetro
• Regla
• 200 mi de lodo sedimentado
[106] D,GESTiÓN ANAEROBIA
PROCEDIMIENTO.
• Colocar los 200 mi de lodo sedimentado en la probeta y aforar a 1.000 mi con

efluente clarificado del propio reactor anaerobio o con agua destilada.
• Tapar la probeta con parafilm, homogenizar el lodo y el agua invirtiendo la
probeta tres veces.
• Colocar la probeta en una superficie plana y registrar el volumen de lodo sedi-
mentado por unidad de tiempo; generalmente se registra el volumen sedimen-
tado cada 30 segundos para los primeros 5 minutos y, posteriormente, cada 3
minutos hasta completar 30 minutos.
CÁLCULOS.
• Seconvierte el volumensedimentadoa altura equivalenteutilizandola siguienteecua-

ción h¡= (1.000 - V) * L /1.000, donde hies la altura (cm) del borde superior de la
probeta al volumende lodo sedimentado para un tiempo ~,Vies el volumen sedimen-
tado (mi) en un tiempo Ti y L es la altura (cm) de la probeta entre O y 1.000 mI.
• Se construye una gráfica de Ti(abcisas) contra h¡ (ordenadas), uniendo los pun-
tos manualmente, luego se traza una tangente a la zona de la curva con mayor
pendiente. La pendiente de esta recta corresponde a la velocidad máxima de
sedimentación (cm/min); utilizando el factor de conversión se calcula la velocidad
de sedimentación en m/h.
• El IVL se calcula aplicando la siguiente ecuación:
lVL = VJOmi.",,j(SST*F)
donde V30 mlnu

. t es el volumen en mi, ocupado por el lodo a los 30 minutos de
os
iniciado el ensayo, los SSTson los sólidos suspendidos totales del lodo en gIL y F
es el factor de dilución, que para este caso es 200/1.000=0.20 .
PERFIL DE LODOS
FUNDAMENTO TEÓRICO. La concentración del lodo dentro del manto de lodo no es

uniforme, pues generalmente la concentración disminuye desde el fondo a la su-
perficie del reactor. La evaluación de esta variación se realiza determinando la
concentración del lodo a diferentes alturas, procedimiento denominado 'perfil de
lodos', el cual permite estimar la cantidad de lodo existente en el reactor. Cono-

ciendo la biomasa presente y la actividad metanogénica del lodo, se puede prede-
cir la máxima carga orgánica que puede soportar el sistema.
El contenido y la actividad del lodo varían con el tiempo; se estima que el
reactor alcanza la estabilidad, la actividad metanogénica del lodo permanece cons-
tante y la cantidad del lodo aumenta a una tasa constante.
o Recipientes para toma de muestras.

o Materiales y equipos necesarios para determinar sólidos.
PROCEDIMIENTO.
o Tomar aproximadamente 100 mi de lodo en cada punto de muestreo.

o Determinar los SSTy SSVen cada muestra de acuerdo con el método determi-
nación de sólidos.
CALCULOS.
o Convertir la altura de toma de muestra a volumen de reactor utilizando la geo-

metría y dimensiones del reactor
o Construir sendas gráficas de las concentraciones de SSTo SSV(abscisas) con-
tra el volumen correspondiente de reactor (ordenadas): el área bajo las cur-
vas resultantes son las masas de SSTy SSVcontenidas en el reactor. El contenido
total de SSTy SSVse calcula descomponiendo el área bajo la curva en figuras
geométricas, calculando el área para cada una de estas figuras y realizando la
suma de las áreas individuales.
GRANULDMETRíA
FUNDAMENTO TEÓRICO. El tratamiento anaerobio de residuos líquidos en reactores

de lecho suspendido, tiene como fundamento el lograr la formación de gránulos
que tengan velocidad de sedimentación alta y actividad metanogénica notable.
Los gránulos evolucionan con el tiempo y dependen de la operación del reactor y
del estado en que se encuentre el mismo, es decir en la fase de arranque o en la
estable. La determinación del tamaño de los gránulos permite establecer sus cam-
bios durante un proceso de granulación y además, permite identificar la homoge-
neidad o heterogeneidad de los gránulos del lodo con respecto a su tamaño.
• Agar bacteriológico o gelatina sin sabor.

• Cajas de Petri.
• Microscopio óptico con ocular de Whipple.
PROCEDIMIENTO.
• Preparar agar bacteriológico como lo recomienda la casa comercial; no

requiere su esterilización. Como alternativa se puede utilizar gelatina sin sal
• En 5 cajas de Petri, colocar 1mi de lodo en el centro.
• Enseguida verter el agar aún tibio, procurando formar una película lo rr
delgada posible.
• Distribuir la muestra en el agar de manera uniforme, con movimientos circ
lares de la caja de Petri hacia la derecha y los mismos hacia la izquierc
formando ochos.
• Esperar a que se solidifique el agar.
• Observar en el microscopio óptico empleando un ocular de Whipple previamen
calibrado, determinando el tamaño de cada cuadrado del micrómetro ocular.
Para su lectura se debe tener en cuenta:
• Presencia de gránulos bien definidos y compactos.
• El valor del diámetro promedio se debe realizar sobre una muestra al azar (
mínimo 100 gránulos.
• Para granos no esféricos se debe medir el diámetro mayor.
CALCULOS. Con los datos obtenidos de las mediciones de los gránulos se determin
la valor promedio de los gránulos.
ACTIVIDAD METANOGÉNICA ESPECíFICA
Para evaluar la actividad metenogénica específica (AME) del lodo, se determina I

capacidad del consorcio microbiano para generar metano, lo cual se mide baj
condiciones controladas de temperatura. Se puede utilizar diferentes sustratos e
forma individual o mezclados, lo cual permitirá establecer la presencia y la activi
dad de los diferentes grupos metanogénicos.
FUNDAMENTO TEÓRICO. La actividad metanogénica es una característica que indica 1;
capacidad de la biomasa para transformar la materia orgánica en metano; SI
define como la masa de sustrato en forma de DQOque es convertida a metano por

unidad de masa de biomasa y por unidad de tiempo, lo cual se expresa con las
siguientes unidades: gDQO-CHigSSV día.
La actividad metanogénica se mide bajo condiciones de saturación de sustrato;
por lo tanto, la concentración de ácidos grasos volátiles (AGV) deberá ser suficiente
para que su difusión en el lecho del lodo no constituya una limitante. Así por ejemplo,
en ensayos estáticos con frecuencia el lodo sedimenta y forma una capa que limita la
difusión del sustrato. Tambiénse debe adicionar macro y micronutrientes, una solución
buffer para mantener el pH cercano a 7, mientras su incubación puede hacerse con o
sin agitación, a una temperatura entre 30°C y 35°C. En estas condiciones ambientales
los microorganismos presentes en el lodo podrán llevar a cabo la transformación del
sustrato. Comoresultado,podrá calcularselatasa máximade producción de metano para
el lodo bajoestudio (Field, 1987). Enreactores a escalareal, o en la naturaleza, latasa de
conversión de sustrato a metano es menor debido a que existen limitacionesen la canti-
dad de sustrato, en la cantidad de nutrientes y en las condiciones ambientales.
Para determinar la cantidad de lodo y de sustrato que se deben adicionar
en la prueba, se han hecho algunas recomendaciones (Field, 1987) las cuales se
consignan en la Tabla 5.1.
Tabla 5.1. Relaciones SSV/AGV
Sistema lodo SSV (gil) AGV' (gil) DaD
Agitado 2.0 a 5.0 2.0 a 4.0
No agitado . 1.0 a 1.5 3.5 a 4.5
'Los KN del sustrato deben ser neutralizados a pH 7 usando NaOH; de lo contrario. la baja de pH y la alta fracción de KN no ionizados
causarán inhibkión severa de la metanogénesis.
Los sustratos más utilizados para este ensayo son una mezcla de Hz-eOz
(80%-20%), ácidos grasos neutralizados solos o en mezclas, específicamente
los ácidos fórmico, acético, propiónico y butírico; también se utilizan alcoholes,
metanol, etanol y carbohidratos (glucosa).
La actividad metanogénica del lodo puede verse afectada por el tiempo
que el lodo requiere para adaptarse al sustrato, este período se denomina 'fase
de adaptación' o 'fase lag'. Por esta razón, previamente a su determinación, se

hace una primera alimentación con el sustrato, de forma que la actividad se mide
durante la segunda alimentación.
METODOLOGíAS.
Existen diferentes metodologías para realizar el ensayo de activi-
dad metanogénica, las cuales se diferencian en la forma como se mide la cantidad
de CH4 producido y en la manera como se realiza la adición del sustrato.
Las metodologías básicas de medición de la producción de metano son
las siguientes:
• Medición de CH4 por desplazamiento de líquido, para lo cual se utilizan reci-
pientes de 0.5 litros o mayores y un sistema de desplazamiento de líquido
(Figura 5.1). El biogas producido se burbujea en una solución alcalina (gene-
ralmente de NaOH o KOH) con pH mayor que 12 en la cual el COzes adsorbido
y el volumen de gas metano desplazará un volumen igual de la solución alcalina;
esta metodología exige un montaje y seguimiento muy cuidadoso. El volumen
de líquido desplazado fuera de la botella de solución será equivalente al volu-
men de biogas generado por el sistema.
Solución
de NaOH
Siegas
----.
Figura 5.1.
Reactor Válvula
Medición de la actividad metanogénica por desplazamiento.

Cilindro
graduado
• Medicióndel volumen de metano mediante la determinación de la concentración de

CH4 por cromatografía de gases en un sistema cerrado (Figura 5.2), mediante el
CARACTERIZACiÓN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [111 ]
uso de botellas serológicas de 60 o 120 mi, en las cuales la fase gaseosa corres-
ponde a 2/3 del volumen de la botella donde podrá acumularse el metano produ-
cido. Tanto en la preparación del medio de cultivo, como en la inoculación se debe
seguir los procedimientos recomendados para el manejo de microorganismos
anaerobios (evitar contaminación con oxígeno y mantener condiciones reductoras).
Aunque en este método la manipulación de las botellas es mucho más simple, los
requerimientos de equipos de cromatografía de gases limitan su uso.
Para la adición del sustrato se pueden utilizar dos métodos:
o Realizar dos alimentaciones, iniciando la segunda alimentación cuando se ha
logrado la conversión a metano de por lo menos el 80% del sustrato adiciona-
do en la primera alimentación.
o Realizar una activación inicial del lodo mediante la adición de 0.1-0.3 mi de
sustrato; al cabo de 12 horas se retira de la botella de ensayo todo el metano
producido durante este lapso de tiempo. En ese momento, se adiciona una
cantidad de sustrato tal, que se cumpla la relación SSV/AGVseleccionada y se
inicia la medición de metano a diferentes intervalos de tiempo hasta el momen-
to en que se alcanza la máxima producción (generalmente, 72 horas).
MEDICiÓN DE METANO POR DESPLAZAMIENTO DE LíQUIDO
Ver Figura 5.1.

o Botellas de suero de 500 mI.

o Sistema de mangueras y agujas para comunicar la botella utilizada como reac-
tor con la botella utilizada para medir la producción de metano por desplaza-
miento de líquido.
o Cuarto caliente o baño María.
o Solución de NaOH con fenoftaleina como indicador de pH.
o Medio de cultivo (ver Anexo 1).
o Solución de nutrientes (ver Anexo 1).
PROCEDIMIENTO.
o Adicionar 250 mi de agua destilada hervida así como los volúmenes de AGV y
de lodo. El volumen dependerá de si el sistema es estático o agitado.
• Cuando se sospecha una limitación de nutrientes y elementos traza se adiciona

la solución de nutrientes en una relación de 1mi /L. El extracto de levadura se
adicionan en una concentración de 0.2g/L.
• La temperatura de incubación es de 30°C a 35°C de acuerdo con las condicio-
nes que se fijen para el ensayo.
• En otra botella de suero se colocan 500ml de la solución de NaOH, se sella con
tapón de caucho el cual se perfora con dos agujas de jeringa. La botella con
NaOH se coloca boca abajo, y se conecta a la botella con el lodo (Figura 5.1).
La "T" de la manguera de conexión funciona como trampa para NaOH, e impi-
de la entrada de NaOH a la botella de lodo. La segunda aguja en el frasco con
NaOH permite la salida del líquido y medir el volumen de gas producido, el cual
es equivalente al volumen de NaOH desplazado y recogido en el cilindro gra-
duado.
• Determinar la producción diaria de metano a intervalos regulares de tiempo
para determinar el periodo de tiempo en el cual se obtiene la mayor produc-
ción de metano. Es importante agitar la botella que contiene el lodo antes de
realizar la lectura para liberar el gas del lodo y conseguir mayor contacto
entre el sustrato yellodo.
• Cada muestra se realiza por duplicado. Para cada serie de ensayos se incluye
un blanco que contiene agua destilada y un control al que no se le agrega
sustrato, a fin de corregir la producción endógena de gas, así como el volumen
desplazado por cambios de temperatura y presión atmosférica.
Medición de metano por cromatografía
Ver Figura 5.2.

• Botellas serológicas de 60 mi, con tapón de caucho y sello de aluminio

• Cilindro de CH4 puro para elaborar curva de calibración
• Cromatógrafo de gases configurado para cuantificaciónde concentraciones de CH4•
• Cuarto caliente o baño María.
• Medio de cultivo, ver Anexo 1.
Figura 5.2. Cromatógrafo de gases para medición de metano.
PROCEDIMIENTO.
• Por cromatografía de gases no sólo se puede determinar la producción de

metano sino las de alcoholes y ácidos grasos volátiles.
• Previa a la determinación de la actividad metanogénica es necesario contar
con una curva de calibración para cuantificar el volumen de metano producido
por cada muestra.
CURVA DE CALIBRACIÓN.
• La curva de calibración se construye rea-
lizando mediciones en 6 botellas
serológicas de 60 mi, a las cuales se les
agrega 20 mi de agua destilada. Las bo-
tellas se tapan y se sellan con sello de alu-
minio. Utilizando jeringa se inyectan los
----+--_ Aire + CH,
siguientes volúmenes de metano puro: 0.5,
1, 5, 10,20 Y 30 mililitros (Figura 5.3).
_-1-_-+ Agua
destilada • La curva de calibración se construye
graficando el volumen de metano inyec-
Figura 5.3. Preparación de la curva
de calibración tado versus el área del cromatográma ob-
tenido en el cromatógrafo de gases. La ecuación de la regresión lineal de lo~

datos corresponde a la relación de calibración.
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD METANOGÉNICA
• Se colocan 13 mi de medio de cultivo en botellas serológicas de 60 mi, 0.2 mi

de la solución de vitaminas diluida y 0.2 mi de la solución de NazS.En la cámara
anaerobia o bajo flujo continuo de nitrógeno se adiciona el volumen de lodo
requerido para mantener la relación DQO/SSV seleccionada. Posteriormente,
se adiciona el volumen de sustrato requerido (generalmente se preparan solu-
ciones a una concentración suficiente para adicionar entre 1 a 2 mi) y se com-
pleta a un volumen total de 20 mi con el medio de cultivo.
• Adicionalmente, se debe preparar una botella sin sustrato con la cual, se eva-
luará la producción de metano residual del Iodo. Se recomienda hacer el ensa-
yo por triplicado para cada sustrato. La adición de las soluciones estériles
(vitamina y agente reductor) se lleva a cabo con jeringa estéril, purgadas con
Nz (filtro estéril de algodón en rama para el flujo de Nz), y se debe flamear el
tapón al realizar este procedimiento. La inoculación del lodo se puede realizar
con pipeta o con jeringa sin aguja, el lodo a utilizar debe en lo posible estar
estabilizado para eliminar la interferencia por producción de metano por sustrato
residual presente en ellodo.
• Para la preparación de la solución de sustrato se pueden utilizar los datos
para ácidos grasos volátiles que se presentan en la Tabla 5.2. La cantidad de
sustrato y de lodo a agregar se calculan utilizando las relaciones consignadas
en la misma Tabla 5.1.
• Para la incubación se colocan las botellas en posición invertida, lo cual contribuye
a crear un sello hidráulico. Las lecturas se realizarán a diferentes intervalos de
tiempo hasta cuando la producción de metano sea constante a través del tiempo
o hasta que el 80% del sustrato haya sido utilizado. Cuando se realiza una se-
gunda alimentación, se adiciona la misma concentración de AGVque la utilizada
en la primera alimentación, el control de la producción de metano se lleva a cabo
hasta que el 80% del sustrato haya sido consumido (Field, 1987).
CARACTERIZACiÓN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [11
Tabla 5.2. Datos básicos de 105 ácidos grasos volátiles (AGV)
Formula Peso molecular Densidad DaD Produccion

del teorica (g CH,
Acido Acido Sal ACldo Sal hquido(*) DaD/ g teorica(mol
(g/mi) acido) CH, / mol
acido)
Fórmico CH¿02 CHO,Na 460 6801 1.22 0348 0.25
Acetlco C2H,02 C2H30¿Na3H2 ° 6107 13608 105 1067 100
Proplómco C3H602 C3H502Na 74.08 9606 0.99 1514 175
8utJnco C4Hs02 C,H¡02Na 88.11 1101 0.96 1.818 250
\ •I Dependede lacalidaddelreactivo.
CALCULOS.
Se construye una gráfica colocando el volumen acumulado de metano en el ej~

Y,y el tiempo acumulado en horas en el eje X. Se selecciona la región de mayor
pendiente de la curva, y se calcula el valor numérico de dicha pendiente, la cual
estará expresada en mililitros de CH/hora. El período de tiempo utilizado para
determinar la tasa de producción de metano, debe cubrir por lo menos el re-
querido para la utilización del 50% de los AGV.La actividad metanogénica es-
pecífica (AME) se calcula mediante la siguiente ecuación:
.1M 1:' = (P·24) /(FC·I'·SSI')
Donde,
P= Pendiente de la gráfica en mi/hora,
FC = Factor de conversión de DQO a CH4, en mi CH4/g DQO (este valor depen-
de de la temperatura y la presión, En la Tabla 5.3 se consigna este factor para
diferentes temperaturas).
V= Volumen de lodo utilizado en el ensayo en litros.
SSV = Concentración de SSV en el Iodo.
Tabla 5.3. Factores de conversión de llramos de DQOa mililitros de CH, bajo

diferentes temperaturas y a una presión de 1 atmósfera"
Temperatura (OC)
I mi CH, seco! 9 de Daa
I mi CH, húmedo! 9 de Daa
10 363 367
15 369 376
20 376 385
25 382 394
30 388 405
35 395 418
40 401 433
45 408 450
50 I 414 471
• Si la determinación de la actividad melanogénica se realiza en mayores akiludes sobre el nivel del mar. se puede corregir el factor de
conversión reporlado para la presión atmosférica. así:
Factorde conversión x 760 I presión atmosférica del lugar (mm de mercurio).
Caracterización microbiológica
RELACIONES DE LOS MICROORGANISMOS CON EL 'OXíGENO
En la naturaleza no existe una línea rígida de demarcación entre los organismos

aerobios y anaerobios, por lo que los microorganismos pueden ser divididos en
varios grupos de acuerdo con su relación con este parámetro; la Figura 5.4 ilustra
dicha situación. Tomado como criterio la relación de las bacterias con el oxígeno,
éstas se puden clasificar como aerobios obligados, anaerobios obligados,
anaerobio aerotolerante, anaerobio facultativo y microaerófilo.
I ANAEROBIOS
•Aerotolerantes
• Obligados
Fillura 5.4. Relación de los microorllanismos con el oxilleno.
• Aerobios obligados. Son bacterias capaces de crecer con las concentraciones

de oxígeno presentes en el aire (21 %) Y muchos pueden tolerar altas concen-
traciones (hiperbáricos).
• Anaerobios obligados. Son microorganismos que carecen del sistema respira-
torio y no pueden utilizar el oxígeno como aceptar final de electrones. Estos
mueren en presencia de oxígeno, probablemente por su incapacidad para
detoxificar algunos de los productos del oxígeno. Cuando el oxígeno se reduce,
algunos productos tóxicos como el peróxido de hidrógeno (HzOz)'el superóxido
(Oz ), y el radical hidroxilo (OH') se producen. Muchos de los anaerobios obli-
gados son ricos en enzimas flavínicas las cuales reaccionan espontáneamente
con el 0z generando los productos tóxicos. Obtienen energía mediante las vías
fermentativas, en las que compuestos orgánicos como ácidos, alcoholes y otros
productos sirven como aceptares de electrones.
• Anaerobios aerotolerantes. Son bacterias que pueden tolerar el 0z y crecer en
su presencia aún cuando no lo utilizan.
• Anaerobios facultativos. Son bacterias que crecen bajo condiciones anaerobias
o aerobias determinadas. Usan el oxígeno como aceptor de electrones termi-
nal, con menos eficiencia; en condiciones anaerobias, tienen metabolismo
fermentativo produciendo Hzy COzY pueden crecer aeróbicamente por respi-
ración produciendo sólo COz.Si el 0z está presente, produce mayor cantidad
de ATP y mayor crecimiento de biomasa celular; pero si no hay 0z' y está
disponible una fuente de energía fermentable como la glucosa, se lleva a cabo
la fermentación, que produce menos crecimiento de la biomasa y elimna Hzy
COz.(Madigan et a/., 1997).
• Microaerofílicos. En contraste a los anteriores existen algunos microorganismos
aerobios que utilizan el oxígeno solo cuando esta presente en niveles muy
bajos, usualmente por su limitada capacidad para respirar o porque contienen
alguna molécula o enzima sensible al oxígeno.
FORMAS TÓXICAS DEL OXíGENO
Como se mencionó anteriormente, el oxígeno es un fuerte oxidante y un excelente

aceptor de electrones en la respiración. La presencia de oxígeno atmosférico in-
duce reacciones en la célula que conllevan a la producción del radical superóxido

de carga negativa (O-z)' peróxido de hidrógeno (HPz) y otros productos de
oxidoreducción tóxicos. Los dos primeros pueden reaccionar y producir radicales
hidroxilo (OH-) libres que constituyen los oxidantes biológicos más poderosos
conocidos. La enzima superóxido-dismutasa cataliza la conversión de radicales
superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular, mientras la catalasa
convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
TÉCNICAS PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS
Considerando las limitaciones y restricciones de crecimiento de los

microorganismos anaerobios, su aislamiento y cultivo requirió del desarrollo de
metodologías especiales, que sólo hasta hace menos de cuatro décadas fueron
incorporadas para su estudio. Los desarrollos de Hungate (1969), Wolfe (1976),
Bryant (1967) Y Mah (1980), permitieron avances significativos en el uso de
técnicas específicas para el estudio de bacterias anaerobias estrictas. Además,
estos avances permitieron conocer y entender la complejidad de las interacciones
microbiológicas y bioquímicas que ocurren durante la digestión anáerobia de la
materia orgánica.
JARRA DE ANAEROB/OS/S. Son recipientes sellados de policarbonato, en las cuales el
aire es reemplazado por una mezcla de Hz y COz'y con la presencia de un catali-
zador químico se remueven las trazas de Oz presentes en el vaso o en el medio de
cultivo; de esta forma es posible obtener las condiciones anóxicas requeridas
(Figura 5.5). En estos sistemas también se puede crear las condiciones anaerobias
mediante el uso de klrspara generar hidrógeno y dióxido de carbono (Gas PaK®,
Gas Pack Plus®). Cuando se utilizan generadores de Hz y COz'el sobre del gene-
rador se abre y se coloca en la jarra, se adiciona 10 mi de agua destilada o
desionizada para permitir la generación de hidrógeno y dióxido de carbono e
inmediatamente se cierra la jarra. En el sistema Gas Pack Plus®, el hidrógeno se
genera a 'partir de las tabletas de borohidruro; una vez que se adiciona agua, el
hidrógeno que se genera se combina con el oxígeno presente en la jarra en pre-
sencia del catalizador de paladio para formar agua. El COzse genera a partir del
bicarbonato de sodio más la tableta de ácido cítrico. Con este sistema después de
CARACTERIZACiÓN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [1
30 minutos de incubación se observa la formación de gotas de condensación al

interior de la superficie de la cámara. Dentro de las dos horas siguientes a 35°C,
la concentración de COz suele superar el 4%, pero menor al 10%. Después de la
incubación, aire la jarra por 15 segundos, antes de retirar las cajas (Catálogo No.
4371040. Becton Dickinson®).
Figura 5.5. Jarras de anaerobiosis.
Elcatalizador que se utiliza está compuesto de bolitas de alúmina recubiertas

de paladio, que actúa removiendo las trazas de oxígeno y generando vapor de agua,
el cual puede ser inactivado por exposición a humedad y al HzSu otros productos
volátiles de la bacteria. Las bolitas de alúmina pueden ser rejuvenecidas o restitui-
das a su total actividad mediante calentamiento en horno seco a 160-170 oCduran-
te 2 horas. Luego se guardan a temperatura ambiente en un recipiente limpio y
seco, preferiblemente en un desecador, hasta el momento de ser usadas. Es impor-
tante cada vez que se usen las jarras, es preciso utilizar un catalizador activo e
indicador de la anaerobiosis. Las jarras de anaerobiosis no son utilizadas para el
aislamiento de bacterias anaerobias obligadas, por que la exposición al oxígeno no
puede ser evitada durante en la manipulación de los cultivos.
En el sistema evacuación-reemplazo el aire del frasco es extraído y reem-
plazado por una mezcla de 85% de Nz' 10% de Hz y 5% de COz;este sistema es
más económico que el generador de gas y permite que las condiciones anaerobias
se establezcan rápidamente (Holdeman et al., 1977).
(AMARA DE ANAEROB/OSIS. Sistema anaeróbico autoabastecido que permite la mani-

pulación de bacterias por medio de dos guantes fijados herméticamente y propor-
ciona una atmósfera de gases controlada con 85% de Nz' 10% de Hz y 5% de COz
(Figura 5.6). El material se introduce o se retira de la cámara mediante un dispo-
sitivo de intercambio de gases que, por lo general, es un compartimiento anexo a
la cámara, de material rígido, con una puerta interior que comunica a la cámara y
una exterior. Las cámaras de anaerobiosis pueden contar con incubadora,
indicadores de potencial redox (azul de metileno, usualmente) y esterilizador de
asas por electricidad (ver Anexo 4).
Figura 5.6. Cámara de anaerobiosis.
GASES LIBRES DE OXIGENO
En los laboratorios de microbiología anaerobia se utiliza gases de alta pureza como:

Nz' Hz, COz' mezclas Nz-COz (80-20%) y Hz-COz (80 -20%). El sistema de distribu-
ción utilizado, que se ilustra en la Figura 5.7, es el 'manifold' descrito por Ba/ch el al.
(1979). Los gases pueden contener algunas trazas de oxígeno las cuales pueden
ser removidas haciendo fluir el gas por una columna de vidrio empacada con cobre
la cual es calentada a 3500( con electricidad, las trazas de oxígeno se combina con
el cobre y este es oxidado tomando una coloración negra. El cobre puede ser rege-
nerado haciendo pasar hidrógeno por unos pocos minutos (3% de Hz, y 97% de
COz)a través de la columna de cobre calentada (Holdeman el al., 1977).
Figura 5.7. Sistema de distribución de gases.
AGENTES REDUCTORES
Las bacterias anaerobias estrictas, grupo al que pertenecen las bacterias

metanogénicas, requieren de un ambiente totalmente exento de oxígeno puesto
que el este gas actúa como un tóxico o como un inhibidor del crecimiento del
grupo de bacterias anaerobias estrictas; de otro lado las bacterias metanogénicas
exigen también condiciones reductoras en el medio( ~330 mv).
Estos requerimientos obligaron a desarrollar técnicas especiales (Hungate,
1969; Wolfe, 1976; Balch y otros, 1979). dichas técnicas se apoyan en la aplica-
ción de dos principios fundamentales:
1. Exclusión total de trazas de oxígeno en la preparación y almacenamiento de los
medios de cultivo.
2. Mantenimiento de condiciones reductoras estrictas en dichos medios de cultivo.
El método más simple para evitar la contaminación con oxígeno del me

de cultivo, consiste en hervir y enfriar el medio bajo un flujo de gas inerte como
o una mezcla Nz/COz;posteriormente se distribuye el medio en los viales, así m
mo en presencia de dichos gases. Una vez distribuido el medio se realiza el ca
bio de la fase gaseosa para asegurar que cualquier traza de oxígeno presente
la misma desaparezca; por último, la manipulación de los medios se realiza dent
de la cámara anaerobia o utilizando jeringas y agujas hipodérmicas previamen
purgadas con Nz.
La sola remoción de las trazas de oxígeno del medio de cultivo r
asegura las condiciones reductoras necesarias, por lo que se requiere ad
cionar al medio uno o varios compuestos reductores que permitan manten{
un potencial redox adecuado para el crecimiento de las poblaciones anaerobia
(Tabla 5.4).
Generalmentese utilizan dos agentes reductores: la cisteína-HCI,que se agre
ga al preparar el medio, y el sulfuro de sodio, que se agrega a cada tubo o botell¡
antes de inocular para garantizar las condiciones de anaerobiosis adecuadas.
Tabla 5.4. Características de algunos compuestos reductores
Compuesto Potencial redox estándar (mV)
Thioglicolato de sodio -100 005

----------------''--------------'
Cisteína-HCI I
-210 0.05
Dithiothreitol i -330 0.05
Titanio 111citrato -480 0.5 a 2.0
-571 0.05
INDICADORES DE ANAEROBIOSIS
Las condiciones de anaerobiosis se controlan mediante un agente indicador de

oxido-reducción. Para este propósito, se dispone en el comercio de tiras de
azul de metileno o también se puede preparar una mezcla de azul de metileno-
glucosa (Anexo 4); el azul de metileno (AM) es azul cuando está oxidado e
incoloro cuando está reducido. Cuando el azul de metileno es incoloro el poten-
cial redoxen este punto es cercano a -230m\'. A pH alcalino y a una temperatu-

ra mayor de 3]OC, la glucosa reduce el azul de metileno a una forma transpa-
rente. (Holdeman el al., 1977)
Azul de melileno + Glucosa Azul de melileno + Ácido glucorónico

oxidado CALOR reducido
(azul) (reductora) (incoloro)
Los indicadores generalmente se mantienen incoloros en condiciones

reductoras y se colorean en condiciones oxidantes. Otro indicador de uso general
en la preparación de medios de cultivos prereducidos es la resarzurina, la cual
presenta un color rosado a un Eh cercano de -SOmV y es incolora a -10m\'.
Resarzurina Reducción Resorufin Reducción Oihidroresorulin

(azul/morado) (rosado) (transparente)
Oxidación
Al igual que los agentes reductores, los indicadores redox pueden ser tóxi-
cos para algunas bacterias; por lo tanto, debe ser utilizado en concentraciones
muy bajas en los medios. La resarzurina se utiliza a una concentración aproxima-
da de 1mg/L .
MATERIAL DE VIDRIO
La vidriería utilizada en microbiología anaerobia se ilustra en la Figura 5.S;

incluye botellas de suero de diferente volumen, tubos de alta presión y tubos
Hungate, los cuales tienen tapa rosca y un septo de caucho. El material de
vidrio se tapa con tapón de caucho de butyl y sello metálicos, de 20 mm de
diámetro; se utiliza la agrafadora y la desagrafadora para colocar y retirar los
sellos metálicos respectivamente.
Figura 5.8. Material de vidrio: agrafador, desagrafador, tapones, agrapes y

viales de cultivo.
INOCULACiÓN y TRANSFERENCIA DE SOLUCIONES
Los tubos y botellas utilizados en la manipulación de bacterias anaerobias se

sellan con tapones de caucho, lo cual asegura las condiciones de anaerobiosis
y permite agregar soluciones e inocular utilizando jeringas estériles gaseadas
con Nz. Para realizar la inoculación o transferencias de soluciones se utilizan
generalmente jeringas de 1 mi tipo 'tuberculina'; antes de tomar cualquier líqui-
do, el aire contenido en la jeringa se debe purgar con Nz' para lo cual se intro-
duce la aguja de la jeringa dentro de otra aguja de diámetro mayor, previamente
esterilizada, realizando varias succiones de Nz para desalojar el aire; posterior-
mente, se toma la solución deseada. Al inocular o transferir soluciones se tienen
los cuidados normales para evitar la contaminación de estos medios (flamear
los tapones, agujas y trabajar cerca de la llama); la Figura 5.9 ilustra el proce-
dimiento de inoculación y transferencia de soluciones.
N2
Purgar la jeringa
con N2
cerca de la llama
Flamear el tapón. Agua

Inocular destilada
con jeringa
cerca de la llama.
Tomado de Alazard el al., 1997
Figura 5.9. Inoculación y transferencia de soluciones.
TRANSfERENCIA DE COLONIAS. El aislamiento de bacterias anaerobias estrictas re-

quiere de un manejo especial para evitar el contacto con el oxígeno; a tal fin se
realizan pases consecutivos de medio sólido a medio líquido hasta obtener un
cultivo puro.
Para la inoculación en medio sólido se utiliza la técnica del ro//-tube
(tubo rodado). Los viales que contienen el medio sólido se llevan a un baño
serológico a SOO( para evitar que se solidifiquen; con ayuda de una jeringa
hipodérmica y su aguja, se inocula O.S mi de la dilución seleccionada del re-
cuento realizado inicialmente; es necesario evitar la formación de burbujas.Luego
el tubo es rodado lentamente hasta obtener una capa uniforme del medio sólido
sobre las paredes del tubo. Los tubos rodados son incubados en posición inver-
tida para que el agua de condensación pueda ser removida posteriormente.
Para la transferencia de las colonias, se seleccionan aquellas bien desa-
rrolladas sobre la superficie del medio en el ro//-tube, y son transferidas al
medio líquido con la mínima cantidad de agar alrededor de la colonia. Para ello,
y bajo condiciones asépticas, se remueve el agrafe y el tapón, se flamea la boca
Purgar la jeringa
con N2
cerca de la llama
Flamear el tapón. Agua

Inocular destilada
con jeringa
cerca de la llama.
~
Tomado de AJazard el al, 1997

B
Figura 5.9. Inoculación y transferencia de soluciones.
TRANSFERENCIA DE COLON/AS. El aislamiento de bacterias anaerobias estrictas re-

quiere de un manejo especial para evitar el contacto con el oxígeno; a tal fin se
realizan pases consecutivos de medio sólido a medio líquido hasta obtener un
cultivo puro.
Para la inoculación en medio sólido se utiliza la técnica del ro//-tube
(tubo rodado). Los viales que contienen el medio sólido se llevan a un baño
serológico a 50 0
( para evitar que se solidifiquen; con ayuda de una jeringa
hipodérmica y su aguja, se inocula 0.5 mi de la dilución seleccionada del re-
cuento realizado inicialmente; es necesario evitar la formación de burbujas.Luego
el tubo es rodado lentamente hasta obtener una capa uniforme del medio sólido
sobre las paredes del tubo. Los tubos rodados son incubados en posición inver-
tida para que el agua de condensación pueda ser removida posteriormente.
Para la transferencia de las colonias, se seleccionan aquellas bien desa-
rrolladas sobre la superficie del medio en el ro//-tube, y son transferidas al
medio líquido con la mínima cantidad de agar alrededor de la colonia. Para ello,
" h"i" rnnriirinnpc; rlséoticas. se remueve el agrafe y el tapón, se flamea la boca
del vial e inmediatamente se inserta una aguja a través de la cual fluye el nitró-
geno; la aguja debe estar adaptada a una jeringa empacada con fibra de vidrio
estéril (Figura 5.10).
FIBRA DE VIDRIO
Figura 5.10. Jeringa empacada con fibra de vidrio para el saseo de los viales.
Usando una pipeta de Pasteur estéril, con su punta doblada y preferible-

mente gaseada con nitrógeno, y valiéndose de la ayuda de'una chupeta, se toma
la colonia marcada sobre la superficie del vial y se transfiere a un vial con medio
líquido el cual ha sido conectado al sistema de gaseo con nitrógeno; inmediata-
mente después se tapa y agrafa, procedimiento que ilustra la Figura 5.11.
(Holdeman et al., 1977).
o O O
O
'-- __ O-----J ~
Tomado de Esp~ia. 1999.
Figura 5.11. Transferencias de colonias a medio liquido.
CARACTERIZACiÓN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [12j
COMPOSICiÓN MICROBIOLÓGICA
Existen varios métodos para realizar la caracterización y la cuantificación de la

composición microbiológica de los lodos. Los métodos convencionales para la ca-
racterización del lodo se basan en el crecimiento de las diferentes poblaciones en
medios selectivos. En primer lugar está la técnica del Número Más Probable (NMP),
en la cual diluciones seriadas del lodo son inoculadas en medios selectivos; con este
método se maneja un intervalo de confianza del 95% y brinda información de la
proporción de cada población bacteriana presente en el lodo (Beliaeff y Mary, 1993).
Elanálisisde microscopíadirecta ha sido utilizado durante la caracterización de
lodos, para determinar la estructura de los gránulos y las biopelículas.Algunas técnicas
permiten realizar la visualización directa, otras requieren de la fijación y teñido del lodo
previa al examen. Esta técnica presenta el inconveniente de basarse solamente en la
morfología, lo cual no siempre permite identificar las bacterias con exactitud. La
epifluorescencia permite identificar las bacterias metanogénicas gracias a la fluores-
cencia producida por el factor 420; sin embargo, tiene el inconveniente de que algunos
microorganismos metanógenos no exhiben fluorescencia (Doddema y Vogels, 1978).
Otro método es la determinación de la velocidad de conversión de sustratos
a metano (AME) el cual es frecuentemente utilizado para la caracterización de la
biomasa del lodo, ya que proporciona información sobre la máxima actividad
metabólica posible de los diferentes grupos microbianos presentes en el lodo; sin
embargo no ha sido utilizada para la identificación y cuantificación de los
microorganismos.
A pesar de las limitaciones de las técnicas convencionales descritas ante-
riormente, estas han sido utilizadas con éxito para la caracterización de las comu-
nidades microbianas de los lodos, han permitido un mayor entendimiento de las
diferentes reacciones metabólicas que se llevan a cabo entre las poblaciones den-
tro del reactor y, por lo tanto, contribuyen a mejorar el dominio de esta tecnología
(Zinder, 1998; Oude Elferink, 1994).
Los avances en las técnicas de caracterización microbiológica han permi-
tido disponer de diversos métodos como la inmunodetección (ELlSA), los
biomarcadores (RNA ribosomal; amplificación de secuencias de la fracción 165 del
rRNA mediante reacción en cadena de la polimerasa, PCR) y los análisis de

composición lipídica de las membranas, para llevar a cabo una identificación
recta de los microorganismos en los lodos (Oude Elferink, 1994). Cabe mencior
que, si bien estas técnicas permiten una rápida identificación de los representé
tes de las poblaciones microbianas presentes en el lodo, no evalúa la capacid
de estas poblaciones para producir metano a partir de diferentes sustratos. En
Tabla 5.5 se especifican las principales poblaciones microbianas que son cuant
cadas en los estudios de caracterización micr.obiológica de los lodos.
A través de los recuentos microbiológicos se realiza la estimación del to
de las poblaciones presentes y del número de representantes para cada pob
ción. Para ello se utilizan las siguientes técnicas:
• Recuento total de bacterias con naranja de acridina.
• Estimacióndel número más probable (NMP) de representantes de cada poblacic
• Recuento total de la población metanogénica por epifluorescencia (factor 42(
RECUENTO MICROBIOLÓGICO TOTAL
La metodología utilizada es la
descrita en el Standar Methods
(1992). La población total se es-
tima a través de la extrapolación
del promedio de varios conteos
directos, realizados por mi-
croscopía de epifluorescencia
sobre unfiltro de nucleopore (0.2
~m), en el cual previamente se
filtran la dilución del lodo selec-
cionada y se colorea con naranja
de acridina (ver Anexo 2).
Figura 5.12. Microscopio de

epifluorescencia.
Tabla 5.5. Caracterización microbiológica de lodos utilizados en el tratamiento de

diferentes tipos de agua residual por la técnica del NMP
Grupos Doméstica Matadero Vinaza Refineria de Reflneria de Procesadora Palma Cerveceria

microbianos (Ramírezet (Ramirezel (Ramirezet azúcar azúcar de papa africana (Wuelal.
al. 1996)" al. 1996)" al. 1996)" (Grotenhuis (Ooflingel (Wuelal. (Espitia el 1993)"""
elal. al. 1985)"" 1993)""" al. 1998)"
1991)""
8acterias
fermentativas
(Glucosa) 2 x lO' 3 X lO" 3 x 10' 2.1 x 10" lO" 2.7 x 10' 5x 10' 1.9 X lO"
(Lactosa) 2x lO' 5 x 10' 4 x 10' 5.6 x 10' 11 x 10' 1.2 x lO"
Bacterias
sulfato
reductoras
(Acetato) 1 x 10' 1 x 10' 2 x 10' 2 x 10' 3.4 X lO"
(Lactato) 1xl0' 3 x 10' 4 x 10' x 10' 6.8x lO"
Bacterias
acetogénicas
Propionato 2 x 10' 4 x 10' 2.4 x 10' lO' 6.6x lO" 5 x 10'
Butirato 4 x lO' 2 x 10' lO' 4.2 X lO" x 10'
Etanol 1.5 x 10'
Bacterias
metanogénicas
Acetato 2 x lO' 1 x 10' 2 x 10' 2.4 x 10' 10' 1.3 x 10" 3 x lO' 6.6 X lO"
Hidrógeno 8 x 10' 2 x 10' 2 x 10' 9.0 x 10' 10' 3.5 x 10" 5 X lO' 1.3 x 10"
Formato 2.0 x 10' 2.0 x 10" 4.7 x 10"
Metanol 4.3 x 10' 3.1 x lO"
No.de baderiasl 9 SSV • • No.de baderiasl mi ••• No.de baderiasl 9 SS
El microscopio está dotado de un ocular micrométrico de 100 divisiones,

sobre el cual las bacterias coloreadas por el naranja de acridina toman una tona-
lidad verde-amarilla que presenta fluorescencia; se realizan varios conteos, cuyo
promedio se extrapola al área del filtro, dividiendo dicho resultado por la biomasa
filtrada; así, se obtiene el número total de bacterias por gramo de SSVde lodo.
ESTIMACiÓN DEL NÚMERO DE REPRESENTANTES DE CADA POBLACiÓN
Se realiza mediante la técnica del número más probable (NMP), descrita en el

5tandar Methodsdiferenciando los siguientes grupos según los medios de cultivo
utilizados para cada población:
Bacterias fermentativas (BF).
Bacterias sulfatoreductoras (BSR).
Bacterias sintróficas (BS).
Bacterias metanogénicas (BM).
A su vez, para cada póblación se cuantifican el número de representantes

con diferentes sustratos. La Tabla 5.6 resume los sustratos utilizados para cada
población, el periodo de incubación y los parámetros para detectar la positividad
de los tubos sembrados.
Se realizan diluciones seriadas del lodo en el medio correspondiente. La
dilución 10-1 de la muestra de lodo previamente mezclada y homogenizada (me-
diante un homogenizador de tejidos) se realiza en la cámara de anaerobiosis o
bajo una fuente de nitrógeno. Las demás diluciones se realizan fuera de la cámara
con jeringas gaseadas con nitrógeno. Se inoculan tres o cinco tubos por cada
dilución, adicionalmente se incuban para cada población tubos sin inóculo como
control del medio (ver Anexo 3).
Las concentraciones de sustratos recomendadas para las bacterias
metanogénicas fueron: formato de sodio 4g/L y metanol 4 ml/L para las bacterias
acetogénicas; etanoI20-30mM/L para las sulfato reductoras; propionato 1 mi de una
solución de ácido propiónico neutralizado, butirato, 1 mi de una solución neutralizada
de ácido butírico, el metanol y etanol 1 mi de una solución stock de 6M y 1M respecti-
vamente (Whitman, 1992; Widdel, 1992; Hickey 1991).
Tabla 5.6. Principales caracteristicas de la determinación del NMP de acuerdo con el

metabolismo bacterial de los grupos relacionados con la digestión anaerobia
Grupo Sustrato Periodo de Incubación Detección tubos positivos

35'C (dias)
Bacterias fermentativas de la glucosa (BFG) y Glucosa 5a8 Acidificación dei medio. cambio de
Lactosa (BFG) color verde a amarillo
Bacterias fermentativas del lactato (BFL) Lactosa 5a8 Acidificación del medio. cambio de
color verde a amarillo
8acterias sulfatoreductoras del lactato (BSRL) Lactato 7 a 15 Producción de feS, coloración negra
Bacterias sulfatoreductoras del acetato (BSRA) Acetato 7 a 15 Producción de FeS, coloración negra
Bacterias sintróficas del propionato (BSP) Propionato 30 a 60 Detección de metano por

cromatografía
Bacterias sintróficas del butirato (BSB) Butirato 30 a 60 Detección de metano por

cromatografía
Bacterias metanogénicas hidrogenofílicas (BMH) H/eD, 15 a 45 Detección de metano por

cromatografia
Bacterias metanogénicas acetoclásticas (BMA) Acetato 30 a 60 Detección de metano por

cromatografía
Para la estimación de la población metanogénica del Hz-e0z' se realiza el

intercambio de gases con esta mezcla (80%-20%). Cada tres días se gasean los
tubos inoculados. Para la población fermentativa, sintrófica y metanogénica,
acetoclástica y sulfatorreductora, el intercambio de fase se realiza con mezcla
Nz-COz (80%-20%).
Para el aislamiento de bacterias de las diferentes poblaciones cuantifica-
das por la técnica del NMp, a partir de la última dilución donde todos los tubos
fueron positivos, se toma 0.2-0.5 mi y se inoculan medios de cultivo sólidos (agar-
agar 2% para bacterias mesofílicas o 3% para bacterias termofílicas) para cada
población y se aplica la técnica del tubo rodado, de tal forma que las colonias
crecen sobre el agar en las paredes del tubo.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS METANOGÉNICAS
Para la inoculación de los medios sólidos se deben mantener a 50°C en un baño

serológico. A esta temperatura
, adicionar las vitaminas, agente reductor e inoculo
en condiciones de esterilidad con jeringas gaseadas con nitrógeno. Se homogeniza
suavemente y se rodan bajo un chorro de agua fría. Se incuban en posición inver-
tida por el tiempo necesario para obtener colonias, el agua de condensación es
retirada con una aguja gaseada con nitrógeno. Las colonias posteriormente son
transferidas, dentro de la cámara de anaerobiosis o bajo una fuente de nitrógeno
con pipetas de Pasteur estériles dobladas en la punta, a medios de cultivo líquidos
(el mismo medio que se utilizó para el aislamiento). Fuera de la cámara se realiza
intercambio de fase con jeringas empacadas con fibra de vidrio y estériles para
evitar una posible contaminación. El aislamiento de las colonias se obtiene me-
diante repiques sucesivos.
La pureza de los cultivos es confirmada inoculando el aislado en medio
sólido donde se deben obtener colonias de un solo tipo, también se chequea la
ausencia de contaminantes aerobios u otro tipo de anaerobios inoculándolo en un
caldo nutritivo donde se inhiba el crecimiento de las bacterias en estudio y se
favorezca el crecimiento de los posibles contaminantes.
Para el aislamiento de bacterias metanogénicas es necesario utilizar me-
dios selectivos que proporcionen las fuentes de carbono y energía que requiere la
Para la estimación de la población metanogénica del H2-C02, se realiza el

intercambio de gases con esta mezcla (80%-20%). Cada tres días se gasean los
tubos inoculados. Para la población fermentativa, sintrófica y metanogénica,
acetoclástica y sulfatorreductora, el intercambio de fase se realiza con mezcla
N2-C02 (80%-20%).
Para el aislamiento de bacterias de las diferentes poblaciones cuantifica-
das por la técnica del NMp, a partir de la última dilución donde todos los tubos
fueron positivos, se toma 0.2-0.5 mi y se inoculan medios de cultivo sólidos (agar-
agar 2% para bacterias mesofílicas o 3% para bacterias termofílicas) para cada
población y se aplica la técnica del tubo rodado, de tal forma que las colonias
crecen sobre el agar en las paredes del tubo.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS METANOGÉNICAS
Para la inoculación de los medios sólidos se deben mantener a 50°C en un baño

serológico. A esta temperatura adicionar las vitaminas, agente reductor e inoculo
,
en condiciones de esterilidad con jeringas gaseadas con nitrógeno. Se homogeniza
suavemente y se rodan bajo un chorro de agua fría. Se incuban en posición inver-
tida por el tiempo necesario para obtener colonias, el agua de condensación es
retirada con una aguja gaseada con nitrógeno. Las colonias posteriormente son
transferidas, dentro de la cámara de anaerobiosis o bajo una fuente de nitrógeno
con pipetas de Pasteur estériles dobladas en la punta, a medios de cultivo líquidos
(el mismo medio que se utilizó para el aislamiento). Fuera de la cámara se realiza
intercambio de fase con jeringas empacadas con fibra de vidrio y estériles para
evitar una posible contaminación. El aislamiento de las colonias se obtiene me-
diante repiques sucesivos.
La pureza de los cultivos es confirmada inoculando el aislado en medio
sólido donde se deben obtener colonias de un solo tipo, también se chequea la
ausencia de contaminantes aerobios u otro tipo de anaerobios inoculándolo en un
caldo nutritivo donde se inhiba el crecimiento de las bacterias en estudio y se
favorezca el crecimiento de los posibles contaminantes.
Para el aislamiento de bacterias metanogénicas es necesario utilizar me-
dios selectivos que proporcionen las fuentes de carbono y energía que requiere la
bacteria que se desea aislar; así, cuando se quiere aislar bacterias metanogénic.
hidrogenofílicas, se utiliza Hz/COzcomo fuente de carbono. Durante la incubació
el espacio de cabeza es analizado para determinar la producción de metano pi
cromatografía de gases. Cuando se obtiene un resultado positivo se examina
cultivo por epifluorescencia; si se observa una fluorescencia azul-verdosa, el
indica la presencia de bacterias metanogénicas (BM), pero es necesario tener e
cuenta que no todas las BM muestran esta fluorescencia. El uso de antibiótico
como kanamicina y vancomicina, entre otros, ayuda a reducir la contaminació
con bacterias no metanogénicas durante el aislamiento.
AGUAS RESIDUALES
Muestreo
,
La toma de muestras del residuo debe enmarcarse en la metodología de carac-
terización de aguas residuales; ésta consta generalmente de cinco etapas (es-
tablecimiento de objetivos, información básica, selección de sitios de aforo y
muestreo, programa de aforo y muestro, registro e interpretación de resulta-
dos), las cuales se especifican a continuación.
Objetivo de la caracterización. En este caso, el objetivo de la caracteriza-
ción responde a obtener las características fundamentales del residuo antes y
después del sistema anaerobio de tratamiento biológico. De esta manera se pue-
de evaluar la eficiencia del sistema y realizar los balances básicos de materia
orgánica, sólidos y nutrientes. Debe incluirse la medición y caracterización del
biogas generado en el proceso.
Información básica para la caracterización. La información básica esta rela-
cionada con las características del sistema de tratamiento, tales como: tipo de siste-
ma, cargas hidráulica y orgánica, volumen y tiempo de retención hidráulico, origen
del residuo, procesos preliminares (rejas, desarenado, sedimentación primaria).
Selección de sitios de aforo y muestreo. Con el fin de evaluar la eficiencia
del sistema de tratamiento, los sitios de aforo y muestreo se localizan al ingreso
del sistema y a la salida del mismo. Normalmente se cuenta con algún dispositivo
de aforo que permite determinar el caudal afluente y efluente del sistema. De
otro lado, en sistemas anaerobios de tratamiento de aguas residuales, la medi-
ción y caracterización del biogas generado en el proceso es fundamental para
realizar los balances de materia orgánica e identificar la eficiencia en su remo-
ción; por lo tanto, se debe prever dicha medición en el programa de caracteri-
zación del residuo.
Elaboración del programa de aforo y muestreo. En la etapa de planifica-
ción del muestreo se debe definir si se toman muestras puntuales o una mues-
tra compuesta; por lo general, cuando se quiere evaluar la calidad del residuo y
la eficiencia del sistema, se trabaja con muestras compuestas; esta muestra se
compone a partir de muestra puntuales, mezclándolas en forma proporcional al
flujo o al tiempo. La muestra debe tomarse en recipientes limpios y refrigerarse
a 4°C hasta su análisis, los parámetros más importantes a analizar son la De-
manda Química de Oxígeno (DQO), la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) y
los Sólidos Suspendidos (SST y SSV). La medición de biogas generalmente se
realiza con medidores continuos tipo gasómetro seco, como los utilizados en
las redes de gas natural.
Registro e interpretación de resultados. La calidad con que se realice todo
el proceso de caracterización del residuo influye directamente en los resultados
del mismo; así, los aspectos más sobresalientes para tener en cuenta son:
representatividad de la muestra, técnicas de muestreo apropiadas, adecuado
manejo y preservación de muestras y análisis de datos desde los aspectos más
relevantes. Generalmente, el análisis se fundamenta en determinar las cargas hi-
dráulica, orgánica y de sólidos que ingresan al sistema, así como en evaluar la
eficiencia del sistema para remover materia orgánica y sólidos. Otro aspecto im-
portante en el análisis es la estabilidad del pH en el sistema, así como la evolución
de los ácidos grasos volátiles (AGV). Dichos parámetros influyen directamente en
el desempeño del proceso de digestión anaerobia: la tasa de degradación
anaerobia es máxima en la faja neutra, cerca del pH = 7, pero si el pH toma
valores menores de 6.3 o mayores de 7.8, la tasa de metanogénesis disminuye
drásticamente (Van Handel v I pttinn~ 1 qqL1\
Demanda Química de Oxígeno
La determinación de la DQO,tanto en el afluente como en el efluente del sistem¡

permite evaluar la tasa de remoción de la materia orgánica. Para completar el CUé
dro de transformación de la materia orgánica en un reactor anaerobio, se requier
cuantificar y caracterizar el biogas generado en el proceso. Según las característiCé
del residuo y el proceso de tratamiento, la DQOpuede presentarse de varias man(
ras: soluble, insoluble, biodegradable y resistente. En el proceso de degradación,
DQO biodegradable está constituida por las fracciones acidificada, celular
metanogenizada. La suma de la DQOresistente y la acidificada en el efluente, repn
senta la DQO no removida; mientras que la sumatoria de la DQO celular y
metanogenizada conforma la DQOremovida. La Figura 5.1 3 representa esquemál
camente el balance de DQOen el proceso de degradación anaerobia.
DQOCH. -DQO
Figura 5.13. Balance de DQO en el proceso de degradación anaerobia.
FUNDAMENTO TEÓRICO
La metodología para la determinación de la demanda de oxígeno se fundamen

en una oxidación de la materia orgánica presente en la muestra en medio ácid
para lo cual se utiliza una mezcla de dicromato de potasio en exceso y ácic
sulfúrico, en presencia de un catalizador y alta temperatura. Luego de la dige
tión, se valora el exceso de dicromato de potasio y por lo tanto se determina
cantidad de materia orgánica oxidada en términos de equivalentes de oxígeno.
METODOLOGíAS
Con respecto a la forma en que se realiza la digestión y oxidación de la materia

orgánica, los métodos de determinación se clasifican en aquellos de reflujo abierto y
los de reflujo cerrado. Los primeros, referenciados bajo el método 5220B en los
Métodos normalizados para el análisis de aguas potables y residuales (APHA, 1998),
requieren de uná cantidad importante de muestra y de los compuestos químicos
utilizados en la determinación; además, para concentraciones bajas de DQO, no
presentan buena exactitud. El otro método es el de reflujo cerrado, más económico
en el uso de reactivos y con buena exactitud para concentraciones bajas de DQO,
siempre y cuando dichas concentraciones estén por encima de 50 mg/1.
Con relación al método de valoración del dicromato de potasio en exceso
se dispone de dos métodos: el titulométrico y el colorimétrico. El primero,
referenciado como el método 5220C en los Métodos Normalizados para el análisis
de aguas potables y residuales (APHA, 1998), consiste en una titulación del
dicromato de potasio en exceso en presencia de indicador de ferroína, utilizando
una solución valorada de sulfato ferroso amoniacal; por su parte, el método
colorimétrico, referenciado como 5220D en el mismo manual de referencia, re-
quiere cantidades pequeñas de muestra y de reactivos, y para su implementación
debe usarse un espectrofotómetro y una curva de calibración que se obtiene a
partir de una solución estándar de ftalato hidrógeno de potasio.
Ácidos grasos volátiles

MÉTODO 1. ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES POR TITULACiÓN
La medición de los AGVtambién puede ser realizada por titulación, método por el
cual se determina el bicarbonato y los ácidos grasos volátiles en soluciones acuo-
sas. La muestra centrifugada o filtrada se lleva a pH 3.0 con HCI0.1 N; a este pH,
el bicarbonato será convertido en COzy los AGVestarán presentes en solución en
la forma no ionizada. Después de ebullir la solución bajo condensador, para remo-
ver el COz' la solución se titula con NaOH 0.1 N hasta pH 6.5. Los AGV (y quizás
algunos otros ácidos orgánicos) serán convertidos ahora a su forma disociada.
Los equivalentes de bicarbonato y AGVse pueden calcular a partir de los volúme-

nes de ácido y base utilizados en la titulación. (Rojas, 1988).
Las aguas residuales que contienen compuestos oscuros coloreados necesitan
ser evaluadas para corregir la acidez preexistente debida a ácidos orgánicos que no
son volátiles, generalmente ácidos húmicos y compuestos acaramelados. Una vez co-
nocida esta acidez, la concentración verdadera de AGVpuede ser calculada:
ACV verdaderos(meq/I) = ACV (meq/I) - Acidez preexistente (meq/t)
El procedimiento se realiza de la siguiente manera: la muestra se centrifuga

por cinco minutos a 5000 rpm o se filtra a través de papel filtro, se deja decantar
y el sobrenadante se lleva a un recipiente graduado. Posteriormente, se agrega
agua destilada hasta un volumen de 100 mi, cuando el pH es mayor de 6.5 se
añade ácido hasta lograr un pH de 6.5, enseguida se titula con ácido clorhídrico
0.1 N hasta pH 3.0 (el consumo se registra como A).
Posteriormente la muestra se coloca en un balón de digestión con co-
nexiones de vidrio esmerilado, se añaden algunas perlas de vidrio de ebullición y
se conecta el balón al condensado. De esta forma se elimina por calentamiento el
bicarbonato como COz' mientras que se preservan los AGV que han sido
volatilizados por condensación. Se calienta el balón hasta que el líquido empieza a
ebullir y se deja así tres (3) minutos. Se interrumpe el calentamiento y se espera
dos (2) minutos, entonces se titula inmediatamente hasta lograr un pH 6.5 con
NaOH0.1 N (este consumo se registra como B). No es necesario enfriar el líquido
(Field, 1987). Los meq/I de AGVse calculan de la siguiente, manera:
Voltlmende base gastada (B) x O.lmeq = meq ACV

meq ACV / Volumen de muestra V(mt) x 1000 = meq/I ACV
Volttmellde ácido gastado (A) x O.1meq = meq de Acidez total
meq de Acidez total/Volumen de muestt'a V(ml) x 1000 = meq/I Acidez total
meq/I Acidez total - meq/I ACV = meq/I bicarbonato.
CARACTERIZACiÓN DE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES [13'
MÉTODO 2. ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES POR CROMATOGRAFfA
Para la determinación de ácidos grasos volátiles, la muestra se toma asépticamente

del cultivo, se acidifica y extrae con éter; el extracto de éter es utilizado para la
lectura por cromatografía.
La sal a partir del ácido es soluble en agua pero no en éter. A bajo pH (por
ejemplo, pH 2.0) los ácidos se encuentran en la forma de ácido libre, la cual es
soluble en agua y éter. Por esta razón las muestras para el análisis cromatográfico
son acidificadas a pH 2.0 o menor con una solución acuosa de H2SO4 al 50%
previamente a la extracción.
Para su análisis la muestra (1 mi) se mezcla con 0.2 mi de H2S04 al 50%,
O.4g de NaO y 1 mi de etil éter, mezclar, centrifugar y retirar la capa de éter, a esta
adicionar CaCL2para remover agua disuelta en el éter. Inyectar en el cromatografo el
extracto de éter para su análisis. Se utiliza un cromatógrafo de gases, equipado con
detector de conductividad térmica, columna de aluminio o acero inoxidable de 6 1/
4
de pulgada, empacada con Supelco 1OOO®,o 5% de FFAPsobre Chromosorb-G® y

como gas de arrastre se utiliza helio.
La solución estándar de los ácidos grasos volátiles se prepara: 1meq de
Ca/1 OOmlde solución acuosa: ácido fórmico: 0.037ml, acético 0.057ml, propiónico
0.075mL y butírico 0.091 mi (Holdeman et a/., 1977).
Biodegradabilidad del residuo

FUNDAMENTO TEÓRICO
Existen dos tipos de procesos para el tratamiento de aguas residuales: los

fisicoquímicos y los biológicos. Los primeros son aplicados a aguas con contami-
nantes inorgánicos o con materia orgánica no biodegradable. Los procesos bioló-
gicos aerobios y anaerobios son utilizados cuando los principales contaminantes
son biodegradables.
La prueba de biodegradabilidad anaerobia permite evaluar el potencial de
degradación de la materia contaminante en un agua residual hasta metano (CH4)
y dióxido de carbono (C02). Con esta prueba se puede determinar:
• La velocidad de reacción (tasa de biodegradabilidad).

• Porcentaje máximo de biodegradabilidad.
• El efecto de la carga orgánica.
• Detectar efectos inhibitorios.
El método se basa en medir a lo largo del tiempo (30-45 días) la produc-
ción de metano generado dentro de un reactor batch con medio mineral, lodo
metanogénico activo y la muestra problema. En esta prueba se puede determinar
si los microorganismos son capaces de llevar a cabo la degradación de la materia
orgánica, lo cual permite hacer una aproximación al comportamiento y la veloci-
dad de reacción de las bacterias en un tratamiento continuo.
MATERIALES y EQUIPOS
• Botellas serológicas de 160ml con tapones de hule y sellos de aluminio.

• Lodo metanogénico activo.
• Cromatografía de gases equipado con columna para la determinación de metano.
• Análisis de OQO (ver sección respectiva).
• Análisis de ácidos grasos volátiles (ver sección respectiva).
• Análisis de sólidos suspendidos volátiles (ver sección respectiva).
• Incubadora a 35°C.
• Medio mineral de Batch (Anexo 1).
REACTORES
Las pruebas de biodegradabilidad se realizan en botellas serológicas de 160 mi con

un volumen de fase gaseosa del 30% del volumen total. El medio mineral se adiciona
para asegurar que no se presente limitación por nutrientes, las botellas con el medio
se esterilizan previo a la adición del lodo y del agua residual de prueba.
INÓCULO y ARRANQUE
El agua residual a estudiar se debe caracterizar mediante la determinación de

sólidos totales, volátiles y fijos; en sus formas totales (ST), suspendidos (SS) y
disueltos (SO), Demanda Química de Oxígeno (DQO) total y soluble. Cuando el
agua residual tiene un pH ácido se debe neutralizar.
Aliado metanogénico activo que se va a utilizar como inóculo se le determi-

nan los sólidos suspendidos volátiles. Estos datos, junto con la DQO del agua, son
necesarios para calcular las cargas orgánicas de prueba. Durante el ensayo se debe
montar una botella testigo (Iodo y medio mineral únicamente) para corregir la pro-
ducción de gas generada por el lodo solo y obtener la producción neta de metano.
PROCEDIMIENTO
Aunque depende de la actividad metanogénica del lodo y del volumen total de la

fase líquida en el vial de ensayo, la mayoría de los autores recomiendan utilizar una
concentración de lodo suficientemente alta para mantener un exceso (5 gSSV/1),
pero suficientemente baja para que el lodo no contribuya con más del 20% de la
DQO.Si el lodo tiene una alta actividad metanogénica (> 0.2 gDQO-CH/g SSV día)
se puede usar menor cantidad de lodo, pero no menos de 1.5 gSSV/L. La concentra-
ción de DQOdel agua residual debe ser suficientemente alta que permita medir el
metano y los AGV en forma precisa. Generalmente se recomienda, utilizar agua
residual con una concentración de 5 gDQO/L (Field, 1987).
Luego de la inoculación los reactores son incubados a 35°C, el ensayo se
debe realizar por triplicado, ya que al tiempo cero se sacrifica una botella por cada
carga que se va a evaluar para verificar pH y determinar DQO total y soluble y
ácidos grasos volátiles. Durante la prueba se debe medir la producción de metano
acumulada, la presión de la botella con un transductor de presión, la concentra-
ción de AGV y la DQO filtrada, tanto del lodo control como del tratamiento en
intervalos de tiempo de tres a cuatro días.
El volumen de medio mineral de Balch en las botellas, puede variar, depen-
diendo del agua residual. Aguas residuales con una baja DQO son poco adecua-
das para el tratamiento anaerobio, el volumen de medio mineral adicionado a
cada vial puede introducir una importante dilución del agua residual a probar,
dando resultados poco confiables
El periodo de tiempo requerido para el ensayo depende del tiempo permi-
tido para que ocurra la digestión y por lo tanto siempre se debe informar el núme-
ro de días en que se llevó a cabo el experimento para obtener resultados de
DQOBD(Díaz-Baez, 1994; Field, 1987).
La prueba de biodegradabilidad se da por terminada cuando deja de au-

mentar la presión interna de la botella y la producción de metano se hace nula;
cuando esto sucede, se procede a abrir las botellas para determinar la DQO total
y soluble final, así como el pH y los SSV (Díaz-Báez, 1994).
CÁLCULOS
A manera de ejemplo se realizará el cálculo del volumen de agua residual y de lodo a

utilizar en un ensayo de biodegradación. En el caso que se quiera evaluar una relación
de 1 gDQO/gSSVcon un agua residual y un lodo con las siguientes características:
Agua residual Lodo de inóculo

Q0Total = 81369 mg/I SST = 46850 mg/I
QOSolllblr = 77260 mg/I SSV = 32740 mg/I
Para los cálculos se debe trabajar en mg/ml, por lo que los anteriores valores
serían:
Agua residual Lodo de inóculo

DQ0Total = 81,369 mg/ml SSV = 46,850 mg/ml
El volumen de lodo adicionar a la botella de ensayo, teniendo en cuenta una con-

centración mínima de lodo 1.5 9 SSV/I (1.5mg/ml) y un volumen total de la fase
líquida del ensayo (por ejemplo 13 mi) será;
1.5 mg ,.. 13 mi
x = 1 mi
x = 19.5 mg
Como la concentración de sólidos del lodo es: 32.740 mg/ml,

1 mi
x 19.5mg ,..-----
32. 740mg
x = 0.6 mi de lodo
Para el cálculo del agua residual, por ejemplo para una carga de 1mg DQO/
mgSSV,será:
1mgDQO/mgSS V 32. 740mgSSV/ml
O.6ml x
x= 19.6 mg DQO
La DQOTotal
del agua residual es de 81.369mg/ml:
1mI • _1_9_. 6_m....::og~D....:Q::....O

__
x =
81.369 mgDQO
x = O.24 mI de residuo.
Cuando el agua residual tenga más del 80% de la DQOtotal como DQOsoluble, se
tomará en cuenta la DQOsoluble para los cálculos, de lo contrario la DQO soluble
e insoluble( o DQO filtrada y DQOss) deberán ser separadas y estudiar la
biodegradabilidad para cada fracción (Field, 1987).
Con los datos experimentales obtenidos en la prueba de biodegradación
se realizan los siguientes cálculos:
CÁLCULO DE fA DQO SOLUBLE DEL AGUA RESIDUAL. La primera etapa del cálculo es con-
vertir los datos de la producción acumulada de CH4 a mg de DQO-CH4/L (DQO
convertida a metano), como sigue (Field, 1987):
1000 X (SCH4/FC)/V
Donde,
S CH4: Producción acumulada de CH4 (mi) producido después de un tiempo de
digestión.
FC: Factor de Conversión (mi de CH4/ gDQO). (ver Tabla 5.3.).
V: Volumen efectivo (litros) del recipiente de digestión.
/000 = mg/g
El factor también puede ser calculado con base en la masa de metano
producida expresada como DQO, dividida sobre la masa de DQO removida. Si el
cálculo se hace sobre la fracción soluble, la producción que se considera es la
neta de metano; si es sobre la DQOtotal, se utiliza la producción bruta de metano.
Para el primer caso, es necesario lavar el lodo antes de inocular las botellas para
eliminar el sustrato soluble que pueda contener el inóculo.
MCHrDQO(g)
y
MCHrDQO(g) = nCH4 tletas (máximo) (16) (4) = gCHrDQO

MCH4-DQO removida(g) = (DQOi - DQOj) (VoLumenfase Líquida)
Los valores de concentración de los ácidos grasos volátiles deberán ser

convertidos a mg DQO/L, en el caso que estén expresados meq/L. Los factores de
conversión son: para el ácido acético 64, para el propiónico 112 y para el butírico
160. Sin embargo, es necesario conocer la relación (2:(3:(4 para poder calcular
el factor de conversión correcto. Estos pueden ser cuantificados por cromatografía
de gases.
(on los datos en mg DQO/L, es necesario corregir los datos de cada trata-
miento, restándoles los valores obtenidos para el control. Los datos corregidos
se dividen por la concentración corregida de la DQO del agua residual al tiempo
cero (Field, 1987).
Para obtener los porcentajes de metanogénesis, el porcentaje de AGVpre-
sentes, el porcentaje de acidificación, y el porcentaje de DQO filtrada remanente,
se utilizan las siguientes ecuaciones:
% Metanogénesis: DQO- CH 4/ DQOt =0 x 100

% Acidificación: DQO- acid / DQOt=O x 100
% ACV presentes: DQO - A.C. V / DQOt=O x 100
% DQO fiLtrada ¡'emanente: DQO -fiLtr / DQOt = Ox 100
Después se calcula la DQOfiltrada removida (% DQOfi,trada

removida) o % R
de la siguiente forma:
% R = 100 - % DQO ji/llotlo
Los porcentajes de biodegradación del agua residual (% DQOBDo % BD) Y

las células producidas como una fracción de la DQOdel agua residual (% DQOcelo
% células) se calcula como sigue:
% BD = % R + % ACV
% éLuLas= % BD - % A o % CéLtdas = % R - % M
El coeficiente de rendimiento celular (Y): 9 DQOcélu,as

/ 9 DQOBD
y = % células / % BD
CALCULO DE LA MM/MA TASA DE B/ODEGRADAB/L/DAD. Indica la velocidad de utilización

del sustrato por los microorganismos, se calcula a través de la medición de
metano obtenida por unidad de SSVy por unidad de tiempo. Para ello se gráfica
las moles netas de metano producidas en función del tiempo, y se calcula la
pendiente máxima de producción de metano. El dato de la pendiente máxima de
la curva, se divide entre los SSV inoculados en la botella. Las moles de metano
expresadas en masa de DQO (g CH4-DQO), se obtienen multiplicando por el
peso molecular del metano (16g) por los gramos de Oz requeridos para oxidar
1 9 de CH4 a COzy HzÜ (4g). Las unidades obtenidas son 9 CH4-DQO/gSSV días
(Díaz-Báez, 1994).
La tasa máxima de biodegradabilidad será:
Pendiente máxima nCH 4 "<las X 16 x 4 x 1000

-----------.:......:....------- = mgCHPQO/mgSSVd
SSV*
*La concentración mg/mJ x volumen de lodo inoculado
Toxicidad anaerobia
FUNDAMENTO TEÓRICO
En el tratamiento de aguas residuales, la toxicidad es observada cuando se pro-

duce una reducción en la producción de metano como consecuencia de la presen-
cia de uno o varios compuestos tóxicos. El ensayo de toxicidad se basa en comparar
la reducción en la tasa de producción de metano de un lodo expuesto a una sus-
tancia tóxica frente a un control que no tiene dicha sustancia (Figura 5.14).
Generalmente la toxicidad es el resultado de la inhibición de bacterias
metanogénicas y/o acetogénicas, sin embargo se puede presentar inhibición de las
enzimas extracelulares producidas por las bacterias responsables de la hidrólisis de
polisacáridos, proteínas y grasas.
CONTROL
M
E
T
A MÁS COMPUESTO TÓXICO
N
O
TIEMPO
Figura 5.14. Producción de metano en un ensayo de toxicidad.
MATERIALES y EQUIPOS
• Botellas serológicas de 120ml, con tapón de caucho y sello de aluminio.

• Cilindro de CH4 puro para elaborar curva de calibración.
• Cromatógrafo de gases configurado para cuantificación de CH4
• Cuarto caliente o baño María.
• Medio de cultivo (ver Anexo 1).
PROCEDIMIENTO
El ensayo de toxicidad se realiza igual a una Actividad Metanogénica Específica,

AME (ver sección correspondiente) con la activación previa del lodo y la
cuantificación de la producción de metano mediante cromatografía de gases.
La prueba se hace por triplicado, debe incluir un control positivo con una
sustancia de referencia de toxicidad conocida, y un control negativo en el cual no se
le ha adicionado lasustanciao el agua residual potencialmentetóxica (Iodo + sustrato).
Se deben probar además diferentes concentraciones del tóxico o del agua residual
que se va a evaluar.
Luego de la activación del lodo, se adiciona el sustrato para control nega-
tivo, para cada uno de los tratamientos se adiciona el sustrato junto con el tóxico
o dilución a evaluar. Se incuban las botellas a 35°C, y se realiza la medición de la
producción de metano cada tres horas durante las primeras 24 horas del ensayo.
Posterior a este tiempo, se hacen mediciones dos veces al día durante los si-
guientes 5 días de exposición. Previo a iniciar el ensayo de toxicidad se establece

la tasa de producción de metano propia del lodo mediante un ensayo de actividad
metanogénica específica.
CÁLCULOS
Con los datos obtenidos, se construye una gráfica de volumen de metano produ-
cido en función del tiempo de prueba. Se calcula la pendiente obtenida para el
control negativo, el control positivo, y para cada uno de los tratamientos utiliza-
dos. Con los valores obtenidos, se calcula la actividad metanogénica de cada uno
de los tratamientos.
La inhibición de la actividad metanogénica para cada uno de los tratamien-
tos se calcula comparando el valor obtenido respecto al valor obtenido para el
control negativo. El porcentaje de actividad metanogénica (% ACT) comparada
con la del control será:
El porcentaje de inhibición (% 1)para cada tratamiento o concentración será:
%1 = 100 - %ACT
El valor de la concentración a la que un compuesto o mezcla de compues-

tos (agua residual) produce una inhibición de la actividad en un 50%, se determi-
na graficando los % ACT obtenidos para cada tratamiento en función de la
concentración o dilución del tratamiento. La concentración a la cual se obtiene
una inhibición del 50%, corresponderá a la CEsode la muestra.
BIBLIOGRAFíA
ALAZARD, D. Y Molina, F. (1997). Microbiología de la digestion anaerobia y caraderización de

lodos anaerobios. Universidad de Antioquia, Medellín, (Colombia).
APHA (American Public Health Association) (1998). Standar Methods for the Examination of
th
Water and Wastewater. 20 edition. Washington.
BALCH, W.E.; Fox, G.E.; Magrum, L.J.; Woese, C.R y Wolfe, R.5. (1979). "Methanogens: Revaluation
of unique biological group". Microbio!. Rev. 43: 260-296.

BELlAEFF, B. Y Mary, J.Y. (1993). "The Most Probable Number Estimate and its confidence limits".
Water Res. 5: 799 - 805.

BROCK, l y Madigan, M. (1984). Biology of Microorganisms. Fifth Edition. Prentice Hall. New
Jersey (EUA).
BRYANT, M.P.;Wolin, EA y Wolfe, R.S. (1967). "MethanobaClllus omelianskii, a symbiotic association
of two species of bacteria". Archiv fur Mikrobiologie 59,20- 31

Catálogo No. 43710401993. U.S. Patent No 4,976,931. BBL Gas Generator Envelopes of
Anaerobic Atmosphere. Gas Pak Plus 1M Disposable Hydrogen + Carbono Becton Dickinson
and Company.
DíAZ-BÁEZ, M.e. (1994). "Manual de ensayos de caracterización de lodos y reactores anaerobios".
Corporación para el fomento de la investigación y el desarrollo tecnológico de la Facultad
de Ingeniería de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá (Colombia).
DODDEMA, H.J. y Vogels, G.D. (1978). "Improved Identification of Methanogenic Bacteria by
f1uorescence microscopy". App!. Environ. Microbio!. 36: 752-754.

DOLFING, J.; Griffioen A; Van Neervan, A. y Zevenhuizen, L.( 1985). "Chemical and bacteriological
composition of granular methanogenic sludge". Can. j Microbio!. 31: 744-750.

E.P.A. 1986. "Operation of Wastewater Treatment Plants". Volumen 11.En: Romero, J. (1989).
Acuianálisis. Escuela Colombiana de Ingeniería. Bogotá (Colombia).
ESPillA, S. (1999). "Caracterización microbiológica de lodos provenientes de plantas de tratamiento
anaerobio". Tesis de maestría. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá (Colombia).
FIELD, J. (1987). "Parámetros operativos del manto de lodos anaerobios de flujos ascendente.
Arranque y operación de sistemas de flujo ascendente con manto de lodo UASB". Manual
del curso. Universidad del Valle. Corporación Autónoma Regional del Cauca y Universídad
Agrícola de Wageningen. Santiago de Cali (Colombia). Noviembre. B-1 - B-35.
GROTENHUIS,J.T; Smith, M. y Plugee, C.M. (1991 ). "Bacteriological composition and structure of
granular sludge adapted to different substrates". App/ied and Enviromenta/ Microbi%gy.
57(7): 1942 - 1949.
HICKEY,R.F.;Wu,W y Zeikus, G. (1991). "Characterisation of metabolic performance of methanogenic
granules treating brewery wastewater: role of Sulfate-reducing bacteria". App/ied
Enviromenta/ Microbi%gy.5 7 ( 12): 3438- 3449.
HOLDEMAN, L.V; Cato, E. y Moore, W.E.C.(1977). "Anaerobe Laboratory Manual. Culture Methods.
Use of Prereduced Media". 4th Edition. Virginia Polytecnhnic Institute and State University.
Blacksburg, Virginia (EUA), p. 117-121.
HUNGATE, R.E (1967). "Hydrogen as an intermediate in the rumen fermentation". Archiv fur
Microbi%gie 59: 158-164.
MAH, R.A. (1980). "Isolation and characterization of Methanococcus mazael'. Current Microbi%gy
3: 321-326.
OUDE, E.; Visser A.; Hulshoff L.W y Stams A.J. (1994) "Sulfate reduction in methanogenic
bioreactors". FEM5 Microbi%gy Rev. 15: 119 - 136.
RAMíREZ, F.; Molina, F.; Rojas, O. y Alazard, D. (1996). "Evaluación de potenciales semillas para
la inoculación de reactores anaerobios". Memorias IV Seminario Taller Latinoamericano
sobre tratamiento de aguas residuales. Bucaramanga (Colombia) p. 33-44.
ROJAS, O. (1988). "La alcalinidad como parámetro de control de ácidos grasos volátiles en
digestión anaerobia". En: Manual del curso Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales
Microbiología y Bioquímica. Universidad de Antioquia, Medellín (Colombia).
VAN HAANDEL, A. Y Lettinga, G. (1994). Tratamento anaerobio de esgotos em regioes de clima
quente. Editora EPGRAF.Campina Grande (Brasil).
WIDDEL, F. y Hansen, lA. (1992). "The dissimilatory sulfate and sulfur-reducing bacteria". In:
The Prokaryotes, 2nd ed. (Balows A., Dworkin M., Harder W, Schleifer K.H, Eds.), p. 719-
767. Springer Verlag. New York (EUA).
WILDSCHUT, L. (1987). "Medición de parámetros. Arranque y operación de sistemas de f1L
ascendente con manto de lodo UASB". Manual del curso. Universidad del Vall
Corporación Autónoma Regional del Cauca y Universidad Agrícola de Wageninge
Santiago de Cali (Colombia). noviembre. J 1-J17.
WHITMAN, W.B., Bowen, IL. y Boone, D.R. (1992). "The Methanogenic Bacteria". En: Th
Prokariotes 2nd edn. (Balows, A., Truper, Dworkin, M., Harder, W., Schleifer, K.H, Eds;
Springer Verlag. New York (EUA), p. 719-167.
WILLS, B. el a/(2000). "Informe final de la investigación: Optimización de la etapa de arranqu(
de reactores anaerobios, mediante el mejoramiento de la calidad de diferentes semilla~
en condiciones dinámicas de operación". Colciencias, contrato 178-96. Universidad de
Antioquia, Facultad de Ingeniería, Medellín (Colombia).
WOLFE, R.S. y Higgins, !.J. (1979). "Microbial biochemistry of methane: a study in contrats". /nt.
Rev. Biochem. 21: 267-350.
WU, W.M.; Thiele, J.H.; Jain, M.K.; Pankralz, H.5. y Hickey, R.F. (1993). "Comparison of Rod -
versus Filament type methanogenic granules: Microbial population and reactor

performance". App!. Microbio!. Biotechno!. 39: 795-80l
ZINDER, S.H. (1998). "Methanogens", capítulo 5. En: Techniques in Microbial Ecology (Burlage,
R.5 el al, eds. ) Oxford University Press. New York (EUA), p. 113-135.
ANEXOS
ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO y SOLUCIONES
ANAEROBIAS
A. MEDIOS DE CULTIVO
ACTIVIDAD METANOGÉNlCA
Para 1000 mi
Solución mineral de Balch sin sulfatos 50 mi

Solución oligoelementos sin sulfatos 10 mi
KzHP04 0.3g
Solución de resarzurina (0.1%) 1.0 mi
Extracto de levadura 0.1g
Bio-tripcase (Peptona trípsica de caseína) 0.1g
Se completa volumen a 11,se ajusta pH a 7.0 con NaOH 1N, agregar 10% en
volumen de agua destilada adicional, hervir hasta llegar al volumen de 1 litro y enfriar bajo
atmósfera de Nz.
Cuandoesté a temperatura ambiente agregar:
NaHC03 2.0g
Cisteína 0.5g
Dosificar bajo corriente de nitrógeno. Se gasea el frasco donde se va a servir con Nz

y se agrega el medio. Servir 13 mL en botellas de 60 mL, hacer intercambio de fase Nz - COz
(80% - 20%) por un minuto, se debe retirar primero la aguja con la cual se está gaseando
para que no haya una sobre presión y luego la aguja de desalojo, llevar a autoclave durante
15 minutos (121°C - 15 psi), antes de utilizarlo agregar:
NazS(2.0%) 0.2 mL
Solucióndiluida de vitaminas de Balch 0.2 mL
Nota. Elmedio para la realización de la prueba de Biodegradabilidad es este mismo suprimien(

el extracto de levadura y Bio-tripticasa, estos compuestos aumentan la concentración de DQOf
un bajo porcentaje y finalmente la concentración real no es la misma que se va a evaluar.
RECUENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS ESTRICTAS (BAS)

Volumen 1 litro:
Solución mineral de Ba/ch sin sulfatos 50ml

KzHP04 0.30g
Fe(SOJ7HzO (0.2%) 1.0ml
Solución de oligoelementos sin sulfatos 10.0ml
NiClz·6HzO (O.5g/L) 0.5ml
Azul de bromotimol (1.0%) 1.0ml
Bio trypcase (Peptona trípsica de caseína) 2.0g
Glucosa 10.0g
Se completa con agua destilada a 1OOOmL,se ajusta pH con NaOH 1N, agregar 1O~
en volumen de agua destilada, hervir hasta llegar al volumen de 1 litro y enfriar bajo atmósfl
ra de nitrógeno (NJ
Cuando esté a temperatura ambiente agregar

NaHC03 5.0g
Cisteína 0.5g
Servir 5mL en tubos Hungate, hacer cambio de fase N/COz (80%, 20%) durante u
minuto, llevar a autoclave durante 15 minutos (121°C - 15 psi). Antes de utilizarlo agregal
NazS.9HzO (2.0%) 0.05ml/5ml
Vitaminas diluidas de Balch 0.05ml/5ml
Después del autoclave el pH debe ser 7.1
ANEXOS [153]
RECUENTO BACTERIAS FERMENTADORAS DEL LACTATO Y DE LA GLUCOSA (BFG Y BFL)

Volumen 1 litro:
Solución mineral de Balch sin sulfatos 50ml

Oligoelementosde Balch sin sulfato 10ml
KzHP04 0.30g
Fe(SOJ7HzO (0.2%) 1.0m\
NiClz.6 HzO(O.5g/L) 1.0ml
Azul de bromotimol (1.0%) 1.0ml
BIOtrypcase (Peptona trípsica de caseína) 2.0g
Selenito de sodio (1.73g/L) 1.0ml
Para las BFGtomar 500mL del medio anterior y agregar 5g de glucosa. Ajustar pH a
7.1. Despuésde hervir enfriar bajo atmósfera de N/COz y agregar:
Cisteína- HCI 0.25g
NaHCO¡ (10%) 2.5g
Para las BFLtomar los 500 mL de medio restantes y agregar 3.6 mL de lactato de
sodio (60% en peso) ó 2.8 mL de ácido láctico. Ajustar el pH a 7.25. Después de hervir,
enfriar bajo atmósfera de NzlCOz.
Cuandoestá a temperatura ambiente agregar:

Cisteína- HCI 0.25g
NaHCO¡ (10%) 2.5g
Servir 5mL en tubos Hungate, bajo atmósfera de nitrógeno. hao"r cambio de

fase Nz/COz(80% / 20%) durante un minuto. Llevar al autoclave durante 15 minutos
(121°C - 15 psi).
Antes de utilizarlo agregar:
NazS.9HzO (2.0%) 0.05ml/5ml
[154] D,GeST'ÓN ANAeROBIA
RECUENTO DE BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS DEL ACETATO Y LACTATO (85RLAc y 85!

Volumen 1 litro:
KHlo4 0.2g
NH4CI 0.5g
Na2S04 3.0g
NaCl 1.2g
FeCI2AH20 0.36g
MgCl2·6H20 OAg
CaCl2·2H20 0.15g
Oligoelementos P.w.sin sulfato 1.0ml
Solución de resarzurina (0.1 %) 1.0ml
Para las bacterias sulfato reductoras del acetato se toman 500mL del medio
y agregar 1. 5g de acetato de sodio. 3Hp Ajustar pH a 6.7.
Después de hervir, enfriar bajo atmósfera de N2/C02 y agregar antes de ser
NaHC03
Para las bacterias reductoras del lactato tomar los 500mL de medio re~
agregar 4.25ml de lactato de sodio (60%). Ajustar el pH a 6.8. Después de herv
bajo atmósfera de N/C02.
Cuando está a temperatura ambiente agregar antes de servir 2.5g
NaHC03
Servir 5mLen tubos Hungate,bajo atmósfera de nitrógeno, hacercambiode fa
(80% / 20%) durante un minuto, llevar al autoclave durante 15 minutos (121°C, 15 P
Cisteína HCI (2.5%) 0.1 ml/5ml
Vitaminas P.W.diluidas 0.05ml/5ml
RECUENTO DE BACTERIAS METANOGÉNlCAS HIDROGENOFÍllCAS. (BMH)

Volumen 1 litro:

Solución oligoelementos de Balch sin sulfatos 10ml
ANEXOS [155]
K2HP04 0.30g
NiCI2. 6Hp (O.5g/L) O.5ml
Selenita de sodio (1.73g/L) 1.0ml
FeCI2.4H20 (0.2%) 1.0ml
Resarzurina (0.1 %) 1.0ml
El medio no contiene SO4 con el fin de evitar el crecimiento de bacterias autotróficas,

cuando se requiere el medio para aislar bacterias hidrogenofilicas, con el fin de evitar la
contaminación del cultivo, no se agregan vitaminas, extracto de levadura, Bio-trypcase , ni
jugo de rumen.
Cuandose requiere el medio para identificar crecimiento de bacterias hidrogenofílicas

se agregan:
Bio- trypcase 0.1g
Ajustar el pH a 7.2 - 7.4 con NaOH 1M, agregar 10% en volumen y hervir hasta
evaporar el exceso, enfriar bajo corriente de nitrógeno, cuando esté a temperatura am-
biente agregar:
Cisteína - HCI O.5g
NaHCOJ (10%) 5.Og
Servir 5mL en tubos Hungate,bajo atmósfera de nitrógeno,hacer cambiode fase H)C02

(80% /20%) durante un minuto, llevar al autoclave durante 15 minutos (121 °C_15 psi).
Renovar el cambio de fase H)C02 cada 2 ó 3 dias después de inocular.
Na2S. 9H20 (2.0%) 0.05ml/5ml
RECUENTO DE BACTERIAS METANOGÉNlCAS ACETOCI..ÁSTlCAS (BMA)

Volumen 1 litro:

K2HP04 0.30g
[156] DIGE:ST/ÓN ANAE:RDBIA
Soluciónoligoelementosde Balchsin sulfatos 10.0ml

FeS04' 7HzO(0.2%) 1.0ml
Selenitode sodio (1.75g/L) 1.0ml
Extracto de levadura O.5g
Bio - tripcase 0.19
Resarzurina (0.1%) 1.0ml
Acetato de sodio 8.0g
Para el aislamiento de bacterias metanogénicas del metanol, se utiliza este medio

adicionando 0.63mL de metanol a cambio del acetato.
Ajustar el pH a 7.1-7.2. Agregar 10% del volumen final de agua destilada, enfriar
bajo atmósfera de N/COz (80% - 20%), cuando esté a temperatura ambiente agregar:
Cisteina- HCI O.5g
Na HC03 (10%) 5.0g
Servir 5mL en tubos Hungate, bajo atmósfera de nitrógeno, hacer cambio de fase N/
COz(80% - 20%) durante un minuto, llevar al autoclave durante 15 minutos (121°C - 15 psi).
NazS.9H20 (2.0%) 0.05ml/5ml
Vitaminasdiluidas de Balch 0.05ml/5ml
RECUENTO DE BACTERIAS slNTRÓFlCAS DEL PROPIONATO / BUTlRATO (BsP y BsB)

Volumen 1 litro:
Soluciónmineral de Balch sin sulfatos 50ml

Soluciónoligoelementos de Balch sin sulfatos 10ml
KzHP04 0.3g
Fe S04' 7HzO(0.2%) 1.0ml
Selenito de sodio (1.75g/L) 1.0ml
NiClz(0.05%) O.5ml
Extracto de levadura 0.19
Bio - tripcase 0.19
Resarzurina(0.1%) 1.0ml
ANEXOS [157]
Setoman 500ml para preparar el medio de bacterias sintróficas del propionato, agre-
gando 0.5g de propionato de sodio (C3HsOzNa)
Los 500ml restantes se utilizan para el medio de bacterias sintróficas del butirato, se
agregan O.5g de butirato de sodio (C4H70zNa) o 4.5ml de ácido butírico 1M.
Agregar 10% en volumen de agua destiladaen exceso,enfriar bajo atmósfera de N/COz

(80% - 20%) ,cuando esté a temperatura ambiente agregar:
Cisteína - HCI 0.5g
NaHC03 (10%) 5.0g
Servir 5mL en tubos de Hungate, bajo atmósfera de nitrógeno, hacer cambio de fase Ni
COz(80% - 20%) durante un minuto, llevar al autoclave durante 15 minutos (121°C - 15 psi).

NazS.9Hp (2.0%) 0.05ml/5ml
B. PREPARACiÓN DE SOLUCIONES
SOLUCIÓN MINERAL DE BALCH
Con sulfatos Sin suIfatos *

KHl04 6.0g 6.0 9
(NH4)zS04 6.0g
NH4C1 5.0 9
MgClz·6Hp 2.1 9
MgS04·7HzO 2.6g
CaClz·2HzO 0.16g 0.16 9
NaCl 12.0 9 12.0 9
* Para evitar inhibición por la presencia de bacterias sulfato-reductoras.
Diluir en 1litro de agua destilada., preparara en aerobiosis, almacenar en refrigera-
dor a 4°(,
[158] D,GéSTIÓN ANAéROBIA
SOLUaÓN OLlGOELEMENTOS SIN SULFATOS

Con sulfatos Sin sulfatos*
Ácido nitrilotriacético** 1.5g 1.5 9
MgS04· 7HzO 3.0g
MgClz·6Hp 2.5 9
MnS04·HzO 0.5g
MnClz.4HzO 0.6 9
NaCl 1.0g 1.0 9
FeS04·7HzO 0.1g
FeClz.4HzO 0.1g
CoClz·6HzO 0.1g
CoS04·6HzO 0.1g
CaClz·2HzO 0.1g 0.1g
ZnClz 0.1g
ZnS04 0.1g
CuS04.5 Hp 0.01g
CuCV HzO 0.01g
ALK(S04)z 0.01g
ALCIJ 0.01g
HJBOJ 0.01g 0.01 9
NaMo04.2 Hp 0.01g 0.01 9
* Para evitar inhibición por la presencia de bacterias sulfato reductoras.

**Se disuelven 1.5g de ácido nitrilotriacético con KOH 10N ó 1N hasta pH 6.5.
La solución se prepara en aerobiosis. Después de adicionar todo, ajustar el pH a

con KOH 1N, almacenar en el refrigerador a 4°(,
SOLUaÓN DILUIDA DE VITAMINAS DE BALCH

Volumen 1 litro:
Biotina (vitamina H) 2mg

Ácido p-aminobenzóico (PABA) 5mg
Cianocobalamina (vitamina B12) 0.1mg
ANEXOS [159]
Tiamina HCI(vitamina B1) 5.0mg

D.L.Pantotenato de Ca 5.0mg
Ácido nicotínico 5.0mg
Piridoxina - HCI (vitamina B6) 10.0mg
Acido fólico 2.0mg
Riboflavina (vitamina B2) 5.0mg
Ácido lipoico (thioico) 5.0mg
Esterilizar por filtración en membranas de 0.22mm en anaerobiosis

Almacenar protegido de la luz en refrigerador a 4°(,
Se preparan en frascos de 60mL con cambio de fase de N/COz y estériles.
SOLUCIÓN MINERAL DE PEENNlG ET W/DDEL (SIN SULFATO)

Volumen 1 litro:
KHl04 0.2g
NH4CL O.5g
NaCl 1.2g
MgClz·6HzO OAg
CaClz·2HzO 0.15g
KCI O.5g
SOLUCIÓN DE OUGOELEMENTOS DE PFENNlG y W/DDEL

(MODIFICADO)
Volumen 1 litro:
HCLa 25% (6.75N)* 10ml

* Acidificar el hierro antes de disolverlo en el agua, los oligoelementos se disuelven en el
siguiente orden:
FeClzAHzO 1.5g
H3B03 60mg
MnClzAHp 100mg
CoClz·6Hp 120mg
ZnClz·anhidro 70mg
NiCI2·6H20 25mg
CuCl2·2H20 15mg
AICI] anhidro 50mg
Na2Mo04·2H20 25mg
Na2SeO] 3mg
SOLUCIÓN DE VITAMINAS DE PFENNlG y WlDDEL

Volumen 1 litro:
Biotina (vitamina H) 1mg

Acido para-Amino benzoico (PABA) 5mg
Cyanocobalamina (vitamina B12) 5mg
Thiamina, HCI 10mg
DL panthotenato de Ca 5mg
Acido nicotínico 5mg
Pyridoxamina (Pyridoxina HCI) 10mg
Nota: Esterilizar por filtración, en anaerobiosis. Almacenar a 4 oCy protegido de la IL
SOLUCIÓN DE RESARZURINA (0.1%)

Volumen 50 mi:
Resarzurina 0.05g
Se disuelven en 50 mL de agua destilada
Almacenar a temperatura ambiente, proteger de la luz con papel aluminio
SOLUCIÓN DE SULFITO DE SODIO (2.0%)

Volumen 20ml:
Na2S. 9 Hp O.4g
Se disuelven en 20mL de agua anóxica
Realizar el cambio de fase N/C02 y después esterilizar
Se almacena a temperatura ambiente
SOLUCIÓN DE AZUL DE BROMor/MOL (1.0%)

Volumen 100ml:
Azul de bromotimol 1.0g
NaOH 1N 100ml
Se utiliza 1mi/litro de medio
SOLUCIÓN DE AGUA REDUCIDA

Volumen 1litro:
K2HP04 0.3g
Solución mineral de Balch sin sulfato 50ml
Resarzurina 1ml
Se completa el volumen a un litro y agregar el 10% adicional de agua destila,

hervir hasta llegar al volumen de 1 litro y enfriar bajo atmósfera de nitrógeno.
Cuandoesté a temperatura ambiente agregar:
NaHCO¡ 5g
Cisteína. HCI 0.5g
Servir según necesidad 4.5ml , 9.0ml ó 13.5ml en tubos Hungate, hacer cambio de fase I
C02 (80%- 20%) por un minuto, llevar a autoclave durante 15 minutos (121°C, 15lb/pulg
Antes de usar agregar:

Na2S.9H20 (2%) 0.05ml/5ml
ANEXOS [163]
ANEXO 2
RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS
A. PRINCIPIO DEL MÉTODO
Se filtra la dilución del lodo seleccionada en un filtro nucleopore de O.2Ilm, las bacterias son
retenidas por el filtro y son teñidas con una solución de naranja de acridina, con la luz de
epifluorescencia se realiza el conteo directo del número de bacterias por retícula en un campo
visual, este procedimiento se repite al menos tres veces, luego se promedia el resultado y
extrapolando el promedio al área total del filtro.
B. REACTIVOS y EQuIPOS
• Solución de Naranja de Acridina

Se prepara la solución A y B de la siguiente manera:
Solución A, disolver 2.76g de NaHl04.HzO en 1OOmlde agua destilada
Solución B, disolver 3.56g de NazHP04.HzOen 1OOmlde agua destilada
Se disuelven 100mg de Naranja de Acridina en 28.25ml de la solución A y 21. 75ml de la
solución B, completando el volumen de esta mezcla a 100ml.
• Filtros
Se requiere de filtros Millipore de 0.451lm para filtrar el agua de preparación de la Na-
ranja de Acridina y el agua de lavado, la filtración de la muestra se realiza sobre un filtro
Nucleopore de O.2Ilm; para realizar ambos procesos se utilizan soportes de filtración
que se unen a un erlenmeyer donde se aplica vacío.
Microscopio con luz de epifluorescencia
C. PROCEDIMIENTO
• Filtrar el agua de lavado en filtro Millipore de 0.451lm

• Coloración de las bacterias con Naranja de Acridina
- Colocar el filtro sobre la filtra del portafiltro con el lado brillante hacia arriba, arman-
do el equipo de filtración.
Tomar con jeringa 5ml de la dilución en estudio (generalmente 10 Jo 10-4'

la jeringa con Nz y agitando muy bien el tubo antes de tomar la muestra
Agregar los 5ml de muestra por las paredes del tubo de carga del sisterr
ción, filtrar en presencia de vacío.
Detener el vacío y agregar 1mi de la solución de Naranja de Acridina, dej,
colorante durante 15 minutos en la oscuridad.
Eliminar el colorante lavando profusamente en presencia de vacío.
Retirar el filtro y colocarlo en una caja de petri, cubriéndola con papel alL
protegerla de la luz.
Conteo
Dividir el filtro en cuatro partes iguales, montar un cuarto de filtrc
portaobjetos, agregando una gota de aceite de inmersión y colocando el CL
La lectura se realiza con el objetivo 100X.
Se enciende la lampara de epifluorescencia.
Secuentan las bacterias presentes en la retícula, las bacterias se identifican pe
un color verde fluorescente, se repite el conteo en varios campos visuales y e
El cálculo se realiza con la siguiente ecuación, teniendo en cuenta que la
microscopio tiene un área de 0.0064mmZy el área del filtro es de 227mr
N. Bact./gSSV = 35469 x (Promedio de Losconteos/DiLución)/(5mL x SS)
ANEXOS [165]
ANEXO 3
RECUENTO DE LOS GRUPOS TRÓFICOS
POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS
PROBABLE (NMP)
A. PRINCIPIO DEL MÉTODO
Se realizan diluciones seriadas del lodo en estudio, con las diluciones seleccionadas se inocu-
lan cinco tubos Hungate por dilución; se identifican los tubos positivos de acuerdo con las
características de cada grupo bacterial (Tabla 5.6) realizando los cálculos del número más
probable con base en la tabla 6.1
B. REACTIVOS y EQUIPOS
Medios de cultivo yagua reducida, según especificaciones del Anexo 1.

o Tubos Hungate
Cámara de anaerobiosis para realizar la primera dilución
Incubadora a 35°C.
Cromatógrafo de gases para la detección de metano
C. PROCEDIMIENTO
La muestra de lodo se introduce en la cámara de anaerobiosis para realizar la primera

dilución, la muestra se homogeneiza utilizando un homogeneizador de tejidos estéril: se
diluye 1mi de lodo homogeneizado en 9ml de agua reducida.
Las diluciones seriadas se realizan fuera de la cámara de anaerobiosis, agregando 1mi
de la dilución anterior a 9ml de agua reducida utilizando una jeringa purgada con nitróge-
no previamente y trabajando con las normas de asepsia para evitar la contaminación de
las diluciones.
La inoculación de los tubos se realiza con jeringas, bajo flujo de nitrógeno, con los cuidados
necesarios, para evitar la contaminación de los medios flamear tapones y trabajar cerca de
la llama, los medios se inoculan con O.2ml por tubo de la dilución correspondiente, se inocu-
lan cinco tubos por dilución, exceptuando los grupos de las bacterias sintróficas para
cuales se inoculan tres tubos y dos controles (sin sustrato) por dilución.
La incubación se realiza a 35°( durante el periodo recomendado para cada grupo tról
(Tabla 5.6)
El Número más Probable se calcula utilizando la siguiente ecuación:
MP/gSSV= o. Bacterias (tabla 6.1) x máxima diluciónpositiva x 5000 / gSSV
Cálculo del NMP según Mac Grady para 5 tubos por dilución
Combinación de Número de Combinación de Número de

Combinación de Número de
bacterias tubos positivos bacterias tubos positivos bacterias
tubos positivos
para tres para tres para tres
diluciones diluciones
diluciones
consecutivas consecutivas
consecutivas
0.0 231 1.4 451 5

000
0.2 240 1.4 500 2.5
001
0.4 300 0.8 501 3
002
0.2 301 1.1 502 4
010
0.4 302 1.4 503 6
011
0.6 310 1.1 504 7.5
012
0.4 311 1.4 510 3.5
020
0.6 312 1.7 511 4.5
021
0.6 313 2 513 8.5
030
0.2 320 1.4 520 5
100
0.4 321 1.7 521 7
101
0.6 322 2 522 9.5
102
0.8 330 1.7 523 12
103
0.4 331 2 524 15
110
0.6 340 2 525 17.5
111
0.8 341 2.5 530 8
112
0.6 400 1.3 531 11
120
0.8 401 1.7 532 14
121
1 402 2 533 17.5
122
0.8 403 2.5 534 20
130
1 410 1.7 535 25
131
1.1 411 2 540 13
140
0.5 412 2.5 541 17
200
0.7 420 2 542 25
201
1.2 421 2.5 543 30
203
0.7 422 23 544 35
210
0.9 430 2.5 545 45
211
1.2 431 3 550 25
212
0.9 432 4 551 35
220
1.2 440 3.5 552 60
221
1.4 441 4 553 90
222
1.2 450 4 554 160
230
ANEXOS [167]
ANEXO 4
PREPARACiÓN AZUL DE METILENO
COMPOSICiÓN:
A. Tris (tris-(hydroxymethyl)-amonimethane), 60% en agua hervida (para mantener la

alcalinidad del indicador)
B. Glucosa(agenteque se reduce) 4% en agua
C. Azul de metileno, 0.02% en agua.
Se mezcla partes iguales de A, B Y e a temperatura ambiente, el pH de la solución

indicadora es de 12. El indicador debe ser protegido de la luz y almacenado en refrigeración
Holdeman., et al., 1977. La solución es utilizable por dos semanas (Catálogo Cabina de
Anaerobiosis 1025 Forma Scientic).
Este libro se terminó de imprimir
en el mes de agosto de 2002
Universidad Nacional de Colombia

UNIBIBLOS
unibiblo@dnic.unal.edu.co
Bogotá, Colombia

Digestión Anaerobia PDF

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Digestión Anaerobia PDF

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

http://librosagronomicos.blogspot.

SANDRA El lANA ESPillA VARGAS

FRANCISCO MaliNA IpÉREZ

Bogotá, junio de 2002

Engie Carolina Plazas BacIIlrióloga¡

Mana. Sena. Gonzalez Bacteridoga

Carolina Garda Microbióloga

cados JlJio CoIazos Ingemero sanitario M.se.

MARIA CONSUELO DIAI·BAEZ

SANORA BIANA ESPilA VARGAS

Pnmera edlCion 2002

Esta Publlcacion ha sido posible gracias al patrocinio del

Diseño y diagr amacion

Preparación editOrial e Impresión

Los autores queremos dar un reconocimiento especial al profesor Didier

Además, los autores quieren expresar sus agradecimientos a:

Finalmente, nuestros agradecimientos a Colciencias, Programa

RECURSOSHíDRIOOSy TRATAMIENTODE AGUAS RESIDUALES

PUESTA EN MARCHAY OPERACiÓN DE REACTORESANAEROBIOS

CARACTERIZACiÓNDE LODOS ANAEROBIOS Y AGUAS RESIDUALES

AUNQUE COLOMBIA CUENTA CON GRAN CANTIDAD DE RECURSOS HíDRICOS E HIDROBIOLÓGICQS

CONTINENTALES (MÁS DE 2.6 MILLONES DE HECTÁREAS DE LAGOS, LAGUNAS, EMBALSES,

ciénagas y pantanos, y 720.000 cauées), fenómenos como la erosión, la destrucción

EL AGUA ES UNA MOLÉCULA, ESENCiAl E INDISPENSABLE PARA LA VIDA; CUANTITATIVAMENTE, RE-

PRESENTA EL CONSTITUYENTE INORGÁNICO MÁS ABUNDANTE EN LA MATERIA VIVA. CERCA DE TRES

cuartas partes de la superficie terrestre están oubiertas por la hidrosfera; de

Tabla 1.1. Precipitación I y ¡rendimientos, hidricios,

Región Precipitación anual media (mm) Rendimiento(Vslkm')

Planeta Tierra 900 10

Sur América 1.600 21

Fuente: Ministerio..•.del Medio Anlbiente. 1996

A pesar que 'el recurso hídrico en Colombia ,es abundante, su distriblilción

En la actualidad, del total de la oferta hídrica superfi~al, solamente se utiliza

ciones mineras, impactos ambientales que generan gran cantidad de sedimentos,

rellenos sanitarios (Mondragón, 1996). De los 1.068 municipios existentes en

En términos generales, las opciones tecnológicas de tratamiento de aguas

(llamados 'sólidos suspendidos'). 1L0stratamientos más lutilizados son: la sedi-

Tratamiento.~ terciario Tratamiento secundal"io',

Oxidación aerobia: Lodos activados

Digestión aerobia: UASB

Figura 1.1 Niveles de tratamiento de las aguas residuales.

El objetivo Iprincipal de Ilostratamientos secundarios es la remoción de la

EXPERIENCIÁS ' CON IOIGESTiÓN

La remoción de materia orgánica soluble puede ~Ievarse a cabo a través de proce-

últimos años. La utilización de reactores anaerobios para el tratamiento de aguas

En 1994 existían en América Latina aproximadamente . 396 reactores

agroindustriales, y el 57% restante, para domésticas, o se utilizaban en 11a,diges-

Figura 1.2. Reactores anaerobios. utilizados en el tralBmienlo de' efluenlBs'

Se calcula que en Colombia existen más de 80 reactores anaerobios los

agroindustriales, y el 57% restante, para domésticas, o se utilizaban en la diges-

Figura 1.2. !Reactores anaerobios utilizados en el tratamiento de efluentes

Se calcula que en Colombia existen más de 80 reactores anaerobios los

Agua residual industrial

Para las aguas residuales domésticas, de los 154 municipios Cdlombianos

Tabla 1.2. Sistemas de tratamiento, de aguas residuales en los municipios

Tipo J:1B,gJ,a"Wa, .da tratamiento No. de Municipios

Plantas compactas aerobias 6

Reaelores anaerobios UAS8 17

Fuente: Ministerio de Desarrollo. 1998.

PROBLEMAS ASOCI~DOS CON LA

Puesta enl marcha de los réélctares

Una característica particular de los microorganismos anaerobios es su baja tasa

Por lo general, con la digestión anaerobia no se logra la misma remoción de