ESTUDO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Para o estudo da atividade e cinética de enzimas escolhemos como modelo a Fosfatase

Alcalina (ALP)

A fosfatase alcalina (E.C. 3.1.3.1 monoester ortofosfórico fosfohidrolase) é uma

hidrolase que cliva ésteres de ácido fosfórico. A atividade catalítica desta enzima pode ser
facilmente avaliada através da utilização de um substrato, o p-nitrofenilfosfato, incolor, que
após hidrólise (libertação do grupo fosfato) origina um produto corado, o p-nitrofenol que
absorve luz a 405 nm. Assim, o aumento da absorvância a 405 nm traduz, de acordo com
a lei de Beer, um aumento na concentração do produto formado e, a variação da
absorvância por minuto (ΔA/Δt) traduz a velocidade de reação enzimática.

pH alcalino

p-nitrofenol p-nitrofenol
(amarelo)
p-nitrofenilfosfato

I.- Quantificação da Enzima

As enzimas quantificam-se avaliando a sua atividade que pode ser determinada

experimentalmente quer por um método contínuo ou cinético, quer por um método
descontínuo ou de ponto final.

Neste caso vamos quantificar a fosfatase alcalina em solução, usando como substrato o
p-nitrofenilfosfato, a pH 8,5 e à temperatura ambiente. A actividade expressa-se em U.I. /L
de solução ou Katal/L de solução.

Método contínuo ou cinético

1- Pipetar para uma cuvete:

Tris-HCl 0,5 M pH 8,5 200 µl
p-nitrofenilfosfato 6 mM 400 µl
NaCl 0,9 % 1800 µl
2- Homogeneizar a solução e introduzir a cuvete no espectrofotómetro (λ = 405 nm).
Observe durante cerca de 1 minuto se o valor é estável.
 3- Adicionar 100 µl de solução de fosfatase alcalina homogeneizar e ler a absorvância
de 30 em 30 segundos durante 3,0 minutos.
4- Representar graficamente os resultados obtidos (absorvância em função do tempo de
reação). Determinar a variação da absorvância por minuto de reação.
Exprimir a atividade da fosfatase alcalina em U.I./L de solução e Katal/L de solução de
enzima.

Método descontínuo
1- Pipetar para tubos de ensaio:
E C
Tris-HCl 0,5 M pH 8,5 100 µl 100 µl
p-nitrofenilfosfato 6 mM 400 µl 400 µl
NaCl 0,9 % 400 µl 400 µl
Solução de enzima 100 µl __

2- Homogeneíze os tubos e deixe-os ficar 10 min à temperatura ambiente.

3- Após 10 min, pare a reação por adição de 5 ml de NaOH 0,02 M e adicione de
seguida 100 µl de solução de enzima ao tubo controlo.
4- Misture bem e leia a absorvância a 405 nm.
5- Exprima a atividade da fosfatase alcalina em U.I./L ou Katal/L de solução e compare
com o valor obtido pelo método cinético.

Nota: A absortividade molar do p-nitrofenol a 405 nm e pH alcalino é 18500 cm-1 M-1