“AÑO DE LAS CUMBRES MUNDIALES EN EL PERU”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL

ESCUELA PROFESIONAL DE
AGROINDUSTRIAS

TEMA: Enzimas Inmovilizadas

CURSO: Biotecnologia.

PROFESOR: Cesar Torres Diaz

 Introducción

Enzimas en disolución
Excelentes métodos (selectivos y sensibles) para la determinación
de sustratos, activadores, inhibidores.

 Las enzimas son solubles en medio acuoso y no pueden reutilizarse

 Estabilidad limitada. Preparación de disoluciones con frecuencia

Costes elevados

Inmovilización de enzimas
Proceso por el que se confina la enzima en un soporte adecuado para
obtener una forma insoluble de la misma que retiene su actividad catalítica

 Posibilidad de reutilizar la enzima

 Aumento de la estabilidad del preparado
 Introducción

Aplicaciones Analíticas:
Diseño de biosensores
Reactores enzimáticos

Enzimas inmovilizados

Aplicaciones Médicas Aplicaciones

Tratamiento con
enzimas inmovilizados Industriales
Industria farmacéutica
Industria alimentaria
Industria química
 Métodos de Inmovilización

Retención física Inmovilización química

Sin formación de enlaces covalentes Con formación de enlaces covalentes

Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
 Métodos de Inmovilización

Inmovilización por Adsorción

Interacción física, no específica (puentes de hidrógeno
interacciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones
de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.

 El método más sencillo

 De aplicación general
 Coste moderado

Uniones
Reversibles  Estabilidad limitada, se requiere un control
No covalentes
riguroso de las condiciones de trabajo para
evitar pérdidas de enzima por desorción.

Alumina, carbón activo, vidrio

Resinas cambiadoras
 Métodos de Inmovilización

Retención física Inmovilización química

Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
 Métodos de Inmovilización

Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa

Formación de un polímero altamente entrecruzado

en presencia de la enzima. Esta queda atrapada en
los poros de la matriz polimérica formada.

 Se requiere controlar las condiciones de

polimerización para que no se produzcan
alteraciones en la molécula enzimática

 Se puede perder proteína lentamente

 Se pueden obtener membranas con

enzimas inmovilizadas
Gel de poliacrilamida
 De aplicación general Polímeros conductores
 Métodos de Inmovilización

Atrapamiento por microencapsulación

Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-100 µm diámetro) dentro de

membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de
sustratos y productos pero no de la proteína.

 Se requieren elevadas
concentraciones de proteína
en disolución acuosa (10 mg/L)

Membrana polimérica obtenida

en un proceso de polimerización
en la interfase disolución orgánica-
acuosa
 Métodos de Inmovilización

Retención física Inmovilización química

Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
 Métodos de Inmovilización

Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente

Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soporte
pero no entre las moléculas de enzima.
El tipo de soporte determina la química de la inmovilización

Soporte Enzima
Activación para obtener grupos funcionales reactivos
Grupo funcional Soporte Unión a través de las cadenas laterales
-CONH2 Poliacrilamida de los aminoácidos de la secuencia
polipeptidica de la proteína
-COOH Carboxymetilcelulosa
-NH2 Lisina -SH Cisteina
-NH2 Poliestireno, nylon
-OH-Ph Tirosina -OH Serina
-OH Celulosa, agarosa, sephadex -COOH Aspartato -Nimidazol Histidina
-Si(OH)3 Vidrio poroso Glutamato

Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivos

empleados en el proceso de inmovilización.
Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidor
competitivo durante el proceso de inmovilización.
 Métodos de Inmovilización – Unión Covalente

1. Método de la acyl-azida para unión a soporte con grupos ácido

Activación de soporte para obtener un grupo acil-azida

CH3OH NH2NH2
OCH2COOH OCH2COOCH3 OCH2CONHNH2
HCl

NaNO2
OCH2CONHNH2 OCH2CON3
HCl

Ataque nucleófilo a la acil-azida para dar lugar a un enlace amida

OCH2CON3 + NH2-ENZIMA OCH2CONH-ENZIMA

Son más reactivas las aminas primarias (lisina), aunque también

reaccionan residuos de cisteina, serina y tirosina.
 Métodos de Inmovilización – Unión Covalente

2. Método de la carbodiimida para unión a soporte con grupos ácido

R´ R
N NH
Activación del soporte para dar
COOH + C COOC un derivado acilisourea por reacción
N NH con carbodiimida
R R

Reacción con la enzima

R
NH NHR
COOC + NH2-ENZIMA CONH-ENZIMA + O C + H
NH NHR
R

Reaccionan lisina, tirosina, cisteina, serina y metionina

La selectividad de la reacción mejora si se añade un derivado de

N-hidroxisuccinimida durante la etapa de activación del soporte.
Se forma un ester de N-hidroxisuccinimida que forma selectivamente
enlace amida con residuos de Lisina
 Métodos de Inmovilización – Unión Covalente

3. Unión a través de enlace azo

Activación del soporte para obtener una sal de diazonio

NaNO2
R NH2 R N2 Cl
HCl

Unión a la enzima a través de un residuo de tirosina

HO
R N2 Cl + HO Enzima R N N
Enzima

 Inmovilización covalente selectiva a través de residuos de tirosina

 Evita entrecruzamiento enzima-enzima
 Métodos de Inmovilización

Retención física Inmovilización química

Atrapamiento o
Adsorción Unión covalente Entrecruzamiento
inclusión
 Métodos de Inmovilización

Entrecruzamiento
Formación de enlaces covalentes intermoleculares
(entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte
 Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones
extremas de pH y temperatura

 Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el

acceso del sustrato al centro activo  Pérdidas de actividad tras
la inmovilización altas

Reactivos bifuncionales más utilizados

CHO O O
H H
(CH2)3 N2 N2 ICH2 C N (CH2)6 N C CH2I

CHO
Glutaraldehido Diazobenzidina Hexametileno-bis(iodoacetamida)
O O O
O
N O C (CH2)2 S S (CH2)2 C O N

O O
Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato
 Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento

Ejemplo- Entrecruzamiento con glutaraldehido

N- Enzima
NH2-ENZIMA CHO CH
+ (CH2)3 (CH2)3
NH2-ENZIMA
CHO CH
N-Enzima

 Método simple y sencillo

 Se verifica en condiciones de pH neutro

 Para minimizar las pérdidas de actividad enzimática

se puede optar por un método de co-reticulado:
entrecruzamiento de la enzima con una proteína sin actividad
enzimática y rica en lisina, ej. albúmina bovina.
 Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas

Las propiedades de las enzimas inmovilizadas difieren

de las de las enzimas en disolución debido a efectos del
material soporte y a cambios conformacionales de la enzima

Inmovilización Efectos sobre la estabilidad

Efectos en las propiedades cinéticas

1. Efectos en la Estabilidad
 Estabilización conformacional de la enzima
por uniones multipuntuales enzima-soporte

Mayor resistencia a
desactivación térmica o química

 Alteración del microentorno de la enzima

Por ejemplo mayor estabilidad en medios

orgánicos sobre soportes hidrofílicos
 Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas

2. Efectos de la inmovilización sobre las propiedades cinéticas

[S]superficie < [S]disolución

v′max [ S]
1
v=
K′M + [ S]
[S2]
[S]
[S1]
[S]dis. Los valores de KM y vmax para las enzimas
inmovilizadas son aparentes (K’M y v’max)

Capa de difusión Disolución

K´M suele ser mayor que KM
0 Distancia a la
Superficie del soporte
 Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas

Efectos de microentorno  Cambio del pH óptimo de la enzima

Quimotripsina/
portador catiónico Quimotripsina en disolución
100
% Quimotripsina/
Actividad portador aniónico
relativa

4 6 8 10
pH

Sobre soportes catiónicos: Sobre soportes aniónicos:

[OH-]superficie>[OH-]disolución [H+]superficie>[H+]disolución
pHsuperficie> pHdisolución pHsuperficie< pHdisolución
 Aplicaciones Analíticas

SENSORES QUÍMICOS

Esquema general de un sensor químico

ELEMENTO DE
TRANSDUCTOR ELECTRÓNICA
RECONOCIMIENTO

Un sensor es un dispositivo que responde de forma directa, continua, rápida,

selectiva y reversible a los cambios de concentración de una especie química en
una muestra compleja, idealmente sin tratamiento previo de la misma.
Consta de un elemento de reconocimiento molecular (que produce una interacción
selectiva (específica) con el analito), en contacto físico con un transductor.
 Elementos de reconocimiento molecular empleados en el desarrollo de sensores

Componentes de
reconocimiento molecular

Bióticos Abióticos

Bioafinidad Biocatalíticos

Cambiadores Ligandos Polímeros

Reactivos Nucleótidos Células líquidos neutros
Enzimas Molecularmente
inmunológicos ADN/ARN Tejidos
impresos
Membranas
sólidas
 Transductores empleados en el desarrollo de sensores

analito

Proceso de reconocimiento selectivo

Transducción Energía

Piezoeléctricos
Electroquímicos Ópticos Térmicos
(de masa)

Amperométrico Potenciométrico Conductimétrico

Respuesta-Procesamiento de datos

Secuencia de procesos en la operación de un sensor químico.

Se resumen los distintos tipos de transductor que pueden ser utilizados
BIOSENSORES POTENCIOMÉTRICOS ENZIMÁTICOS: Sensor de Urea

Ureasa
(NH2)2CO 2 NH3 + CO2

Transductor Interferencias Tiempo de Rango de

(Electrodo selectivo) respuesta linealidad
Control pH
pH 1 min 5×10-5-10-3 M
(tampón dil.)

NH4+ K+ (Na+) 35 s 5×10-5-10-1 M

Capa de enzima
inmovilizada
Métodos de inmovilización Estabilidad
del enzima del sensor
Encapsulación en membranas
10 d.
de diálisis
Inclusión en gel de poliacrilamida 21 d.
Inclusión + enlace covalente
>30 d.
en ácido poliacrílico
Entrecruzamiento con albúmina
>60 d.
(glutaraldehido)
 SENSORES ENZIMÁTICOS AMPEROMÉTRICOS.

Sensor de oxígeno de Clark (no enzimático)

Proceso catódico:
-600 3.25 O2 + 2 H+ + 2 e- H2O2
Eap./ mV i./ µA
Proceso anódico:
Electrolito interno (KCl)
2 Ag(s) + 2 Cl-(aq) 2AgCl(s) + 2 e-

Ánodo de Ag/AgCl

Cátodo de Pt Características de respuesta

Membrana de
Corriente de difusión estacionaria:
Polímero (PTFE)
ε D δ= espesor de la membrana
i = nFA C o* ε= porosidad de la memb.
δ q q = factor de tortuosidad

Tiempo de respuesta:

δ2 test ≈ 20 – 50 s
test. =2
(D/q)
 SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS
1. Basados en el empleo de enzimas oxidasas

Señal (i/ µA) E

Eapl = cte SH2 + O2 S + H2O2
1. Medida del peróxido de hidrógeno generado

SH2 + E(FAD) E(FADH2) + S

transductor
E(FADH2) + O2 E(FAD) + H2O2

H2O2 O 2 + 2 H+ + 2 e- Reacción electródica

2. Empleo de un mediador de transferencia electrónica (Med)

Enzima (el O2 se sustituye por un aceptor de electrones no fisiológico)
inmovilizada

Medred E ox SH2 SH2

E(FAD)
e-

E(FADH2)
Medox Ered S S

Sensor Enzima y mediador Disolución

inmovilizados
 SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS
2. Basados en el empleo de enzimas deshidrogenasas

E DIFICULTADES
SH2 + NAD
+
S + NADH + H+

Cinética lenta Selectividad

Mecanismo Estabilidad
electrodo
NADH NAD+ + 2e- + H+ complejo
Reproducibilidad

EMPLEO DE MEDIADORES DE TRANSFERENCIA ELECTRÓNICA

Medred NAD+ SH2 SH2

Medox NADH S S

Electrodo Disolución