UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS B�SICAS TECNOLOG�A E INGENIER�A

PROGRAMA DE INGENIER�A DE ALIMENTOS

305689 - BIOTECNOLOG�A

FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES

(Director Nacional)

GLEATHER JHON FLOREZ

Acreditador

PASTO
Julio de 2012
INDICE DE CONTENIDO

UNIDAD 1 : : ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOG�A

CAPITULO 1. Contextualizaci�n de la Biotecnolog�a

Lecci�n 1. Definici�n de Biotecnolog�a

Lecci�n 2: Historia de Biotecnolog�a

Lecci�n :3 Divisi�n y tipos de Biotecnolog�a

Lecci�n 4: Impacto de la Biotecnolog�a en el contexto colombiano

Lecci�n 5: Tendencias de la Biotecnolog�a

CAPITULO 2 : BIOTECNOLOG�A DE LAS FERMENTACIONES

13

Lecci�n 1: Nutrici�n microbiana

13

Lecci�n2: Metabolismo energ�tico

15

Lecci�n 3: Aspectos generales de los procesos biosint�ticos

19

Lecci�n 4 : Crecimiento microbiano

23

Lecci�n 5: Modelos matem�ticos que explican el crecimiento microbiano

23

CAPITULO 3 : SISTEMAS DE FERMENTACI�N

23
Lecci�n 1: Tipos de fermentaci�n

26

Lecci�n 2: Productividad y velocidad espec�fica de producci�n

28

Lecci�n 3: Coeficientes de rendimiento

29

Lecci�n 4: Biorreactores

29
Lecci�n 5: Transferencia de O2 y fermentaci�n a gran escala

31

UNIDAD 2 : BIOCATALISIS E INGENIER�A GEN�TICA APLICADA A LA

BIOTECNOLOG�A ALIMENTARIA

33

CAPITULO UNO : BIOTECNOLOG�A ENZIM�TICA

33

Lecci�n 1 : Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica

37

Lecci�n 2: Naturaleza de las enzimas

40

Lecci�n 3: Clasificaci�n de enzimas seg�n la naturaleza de la reacci�n y

cofactores

41

Lecci�n 4: Cin�tica enzim�tica

41

Lecci�n 5: Producci�n de enzimas

43

CAPITULO DOS : PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA

BIOTECNOLOG�A

44

Lecci�n 1: T�cnicas utilizadas en la manipulaci�n gen�tica in vitro.

46

Lecci�n 2: Tecnolog�a del ADN recombinante

47

Lecci�n 3: La reacci�n en cadena de polimerasa ( PCR)

47

Lecci�n 4: Mutag�nesis , Mutag�nesis dirigida por oligonucle�tidos

47

Lecci�n 5: Mutag�nesis en casette o interrupci�n g�nica

47
CAPITULO 3 : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE EN LA INDUSTRIA
ALIMENTARIA

49

Lecci�n 1: Animales transg�nicos

50

Lecci�n 2: Plantas Transg�nicas

51
Lecci�n 3: Alimentos gen�ticamente modificados

54

Lecci�n 4: Alimentos funcionales

54

Lecci�n 5: Prebi�ticos

59

UNIDAD 3 : PRODUCTOS BIOTECNOL�GICOS DE INTERES ALIMENTARIO

60

CAPITULO 1: APLICACI�N DE LA BIOTECNOLOG�A EN LA OBTENCI�N DE

PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERG�TICO POR V�A
FERMENTATIVA.

60

Lecci�n 1: Bebidas alcoh�licas

61

Lecci�n 2: Biolog�a de las fermentaciones con levaduras y condiciones de la

fermentaci�n

66

Lecci�n 3: Compuestos organol�pticos

70

Lecci�n 4 : Alimentos basados en soja fermentada

71

Lecci�n 5 : Productos c�rnicos fermentados

72

CAP�TULO DOS: OTROS PRODUCTOS DE INTER�S EN LA INDUSTRIA

ALIMENTARIA

78

Lecci�n 1: Producci�n de levadura

Lecci�n 2 : Vinagre

81

lecci�n 3 : acido L�ctico

81

lecci�n 4: acido Ac�tico

81

Lecci�n 5 : Producci�n de acido c�trico

83

CAPITULO 3 �: BIOPOLIMEROS MICROBIANOS

83
Lecci�n 1 : Polisac�ridos microbianos y PHAs

84

Lecci�n 2: Poli hidroxibutirato

86

Lecci�n 3: Los alginatosy Gelanos

88

Lecci�n 4: Xantano

88

Lecci�n 5: Dextranos

lEC

BIBLIOGRAFIA

104

LIISADO DE TABLAS

Nombre

P�gina

Tabla 1

Productos derivados de la fermentaci�n

34

Tabla 2:

Producci�n total de una fermentaci�n

continua

38

Tabla 3:

Tama�o de fermentadores para varios

procesos

41
Tabla 4

Producci�n de enzimas microbianas

49

Tabla 5

Enzimas utilizadas en la Industria

alimenticia

50

Tabla 6

Caracter�sticas de la producci�n
industrial de �cido c�trico

96
LISTADO DE GR�FICOS Y FIGURAS

Tabla

Nombre

P�gina

Figura 1

Fases del metabolismo microbiano

34

Figura 2

Curva de crecimiento microbiano

36

Figura 3

Fermentaci�n continua en quimiostato

39

Figura 4

Efecto de la velocidad del flujo sobre la concentraci�n de

sustrato

Figura 5

Productividad total y productividad m�xima

Figura 6

Productividad en relaci�n a la concentraci�n de �cidos

grasos en un proceso de producci�n de prote�na de origen
unicelular

Figura 7

Esquema de un reactor aerobio con agitaci�n mec�nica

Figura 8

Esquema de un reactor tipo Air lift

Figura 9

Enzimas complejos

Figura 10

Ejemplo de cofactor

Figura 11

Enzimas de oxido-reducci�n

Figura 12

Transferasas

Figura 13

Hidrolasas

Figura 14

Liasas

Figura 15

Ejemplo de isomerizaci�n

Figura 16

Ligasas

Figura 17

Cin�tica enzim�tica

Figura 18
Curva : Velocidad enzim�tica/concentraci�n de la enzima

Figura 19

Curva de enzimas alost�ricas

Figura 20

Esquema para la producci�n de enzimas por fermentaci�n

Figura 21

Clasificaci�n deformas de obtenci�n de enzimas

Figura 22

La separaci�n de los �cidos nucleicos

Figura 23

Procedimientos b�sicos del ADN recombinante

Figura 24

Replicaci�n del ADN, utilizando (PCR)

Figura 25

Mutag�nesis

Figura 26

Mutag�nesis dirigida

Figura 27

Mutaci�n por casette

Figura 28
Mejoramiento gen�tico en bovinos

Figura 29

Ejemplo de plantas gen�ticamente modificadas

Figura 30

Alimentos basados en soja fermentada

Figura 31

Ruta de la producci�n de citrato

ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El contenido did�ctico del curso acad�mico: Biotecnolog�a_305689

fue dise�ado inicialmente en el a�o 2007 por FEDRA LORENA ORTIZ
BENAVIDES, docente de la UNAD, ubicado en el CEAD de Pasto. Se ha
desempe�ado como tutor de la UNAD desde el 2005 hasta el a�o 2008,
en este momento es Docente Auxiliar de la escuela de Ciencias B�sicas,
tecnolog�a e Ingenier�a y ha sido catedr�tico de la Universidad de
Nari�o.

El contenido did�ctico ha tenido tres actualzaiciones: dos

desarrolladas por la misma profesora Ortiz en los a�os 2008 y 2009

El Doctor Gleather Jhon Fl�rez, tutor del CEAD Jos� Celestino

Mutis - Bogot�, apoy� el proceso de revisi�n de estilo del contenido
did�ctico e hizo aportes disciplinares, did�cticos y pedag�gicos en el
proceso de acreditaci�n del material did�ctico desarrollado en el mes de
Julio de 2009.
INTRODUCCI�N

Aunque la utilizaci�n de organismos vivos para obtener productos comerciales se

remonta a la antig�edad, cuando el hombre sin saberlo utilizaba microorganismos
para
obtener el vino, o pan, los acontecimientos cient�ficos en las �ltimas d�cadas han
revolucionado el panorama industrial con productos de diversa �ndole obtenidos a
trav�s
de la manipulaci�n o transformaci�n de los organismos vivos.

El desarrollo de la biolog�a en las �ltimas cuatro d�cadas, ha hecho posible el

desarrollo
de sofisticados, procedimientos para el aislamiento, manipulaci�n y expresi�n de
material gen�tico, lo que ha llevado consigo al avance de una nueva disciplina: La
Biotecnolog�a. , la cual tiene aplicaciones tanto en la investigaci�n b�sica, como
en la
aplicada. Las t�cnicas de esta ciencia se han utilizado para estudiar los
mecanismos de
la replicaci�n y expresi�n g�nicas en procariotas, eucariotas y sus virus. Algunos
de los
m�s importantes descubrimientos b�sicos de la gen�tica se han realizado utilizando
t�cnicas ingenieriles. En cuanto a la investigaci�n aplicada, la Biotecnolog�a
permite el
desarrollo de cultivos microbianos capaces de fabricar productos valiosos, tales
como la
insulina humana, la hormona humana del crecimiento, interfer�n, vacunas y enzimas
industriales. La aplicaci�n industrial de la Biotecnolog�a, parece tener un
potencial
ilimitado.

La Biotecnolog�a, se ha convertido en la herramienta para un nuevo desarrollo

social,
basado en el conocimiento del funcionamiento de la vida y sus posibilidades de
manipularlo y transformarlo. Su impacto en la Medicina, la agricultura, el
mejoramiento de
las especies, la evoluci�n, la industria alimenticia y la farmacolog�a, dan muestra
de la
importancia que tiene esta disciplina, que se ha convertido sin lugar a dudas en la
base de
la revoluci�n tecnol�gica que ha acaparado la atenci�n de los cient�ficos y
gobiernos
como posible estrategia para encontrar soluciones a los problemas que aquejan a la
humanidad.

Nuestro pa�s, tiene un desaf�o de gran envergadura ante fen�menos tales como la
globalizaci�n neoliberal, el deterioro ambiental, la crisis financiera y otras
amenazas que
pueden afectar seriamente sus potencialidades de desarrollo futuro. Como una
estrategia
para hacer frente a los retos de la post - modernidad es necesario aprovechar los
recursos naturales, utilizar racionalmente la biodiversidad y desarrollar proyectos

productivos.

Las expectativas se centran en el acceso a nuevas fuentes de diversidad biol�gica,

con
un suministro adecuado y oportuno de informaci�n sobre sus aplicaciones
potenciales.
Sin embargo, en la revista colombiana de Biotecnolog�a1se advierte de la urgencia
de
incorporar valor agregado a la biodiversidad mediante el conocimiento generado a
trav�s
de la investigaci�n, porque la oportunidad que nos da el hecho de ser un pa�s
megadiverso va a desaparecer si no actuamos a favor de nuestro futuro.

Es por eso que consideramos que este es un curso de gran importancia que sin lugar
a
dudas les brindara a los estudiantes de la UNAD, los conocimientos que los llevaran
a la
reflexi�n de utilizar nuestra diversidad como fuente de progreso y desarrollo
individual y
social.

En consecuencia, el programa de Biotecnolog�a pretende desarrollar en los

estudiantes
actitudes cient�ficas as� como brindarles las bases conceptuales y procedimentales
para
hacer uso sostenible del potencial bi�tico que ostenta nuestro pa�s a lo largo y
ancho de
su geograf�a.
UNIDAD 1

CAPITULO 1. CONTEXTUALIZACI�N DE LA BIOTECNOLOG�A

Lecci�n 1. Definici�n de Biotecnolog�a

Lecci�n 2: Historia de Biotecnolog�a

Lecci�n :3 Divisi�n y tipos de Biotecnolog�a

Lecci�n 4: Impacto de la Biotecnolog�a en el contexto colombiano

Lecci�n 5: Tendencias de la Biotecnolog�a

CAPITULO 2 : BIOTECNOLOG�A DE LAS FERMENTACIONES

13

Lecci�n 6: Nutrici�n microbiana

13

Lecci�n 7: Metabolismo energ�tico

15

Lecci�n 8: Aspectos generales de los procesos biosint�ticos

19

Lecci�n 9 : Crecimiento microbiano

23

Lecci�n 10: Modelos matem�ticos que explican el crecimiento microbiano

23

CAPITULO 3 : SISTEMAS DE FERMENTACI�N

23

Lecci�n 11: Tipos de fermentaci�n

26

Lecci�n 12: Productividad y velocidad espec�fica de producci�n

28

Lecci�n 13: Coeficientes de rendimiento

29

Lecci�n 14: Biorreactores

29

Lecci�n 15: Transferencia de O2 y fermentaci�n a gran escala

31
UNIDAD 1: ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOG�A.

Introducci�n: La siguiente unidad ha sido dividida en tres cap�tulos: en

el primero, se pretende que los estudiantes se apropien del concepto de
biotecnolog�a, los fundamentos b�sicos que caracterizan esta disciplina
para luego identificarlos y diferenciarlos de otros procesos. En el
segundo cap�tulo, se pretende que los estudiantes a trav�s del
conocimiento b�sico del metabolismo celular sean capaces de proponer
el mejor ambiente para que la respuesta celular sea la m�s eficiente
para la obtenci�n de productos y o servicios en la industria alimentaria.
Por �ltimo en el tercer cap�tulo se hace una introducci�n sobre sistemas
de fermentaci�n que les permita conocer a los estudiantes las t�cnicas,
procesos y procedimientos que se realizan a nivel industrial para la
obtenci�n de un producto derivado de la fermentaci�n.

Objetivos de la unidad

*
Contextualizar el estudio de la Biotecnolog�a alimentaria y
analizar su impacto en la sociedad contempor�nea
Consolidar conceptos bioqu�micos esenciales para aproximarse y
comprender la complejidad de reacciones metab�licas que se
traduce en la producci�n de biomasa � en la s�ntesis de sustancias *
Adquirir bases te�ricas que respaldan los procesos de producci�n
de biomasa y metabolitos. *
Estudiar dispositivos empleados en la producci�n de biomasa y
metabolitos *
Obtener bases te�ricas para producci�n y purificaci�n de enzimas
microbianas de aplicaci�n comercial. *
Obtener una visi�n de la importancia del control de la producci�n
para asegurar calidad de los productos *
CAPITULO 1. CONTEXTUALIZACI�N DE LA BIOTECNOLOG�A.

Lecci�n 1. Definiciones de Biotecnolog�a

Existen diversas definiciones de Biotecnolog�a provenientes de diversos

enfoques y puntos de vista, que van desde conceptos m�s generales
hasta particulares. Por ejemplo: �La biotecnolog�a, se ha definido como
la aplicaci�n de organismos, componentes o sistemas biol�gicos para la
obtenci�n de bienes y servicios�. Sin embargo, se considera que este
enunciado es muy amplio y engloba todas las operaciones de la biolog�a
aplicada desde la agricultura hasta la ciencia culinaria.

En un sentido mucho m�s estrecho, la palabra biotecnolog�a se refiere a

veces, para definir la utilizaci�n de la manipulaci�n gen�tica con el fin de
obtener la expresi�n correcta a altos niveles de un gen clonado en
c�lulas hu�sped. As� como tambi�n la aplicaci�n de la biolog�a
molecular en direcciones que se esperan sean de utilidad como el uso de
marcadores moleculares para identificar microorganismos de
importancia agr�cola. Este enfoque, supone confundir los aspectos de
moda con los principios de la biotecnolog�a y se debe m�s a la filosof�a
de las agencias de publicidad y medios de comunicaci�n que a la
industria.

Seg�n la OTA-USA (1981), la OECD (1982) y la CEPA-Canad� (1985),

la biotecnolog�a es la aplicaci�n de la ciencia y la ingenier�a en el uso
directo o indirecto de organismos vivos o parte de ellos, en sus formas
naturales o modificadas, en una forma innovadora para la producci�n de
bienes y servicios o para la mejora de procesos industriales existentes.
Desde este punto de vista se evidencia una integraci�n entre las
ciencias b�sicas con las ciencias aplicadas puesto que se pretende
emplear de forma controlada y deliberada agentes biol�gicos sencillos
como c�lulas vivas o muertas, o componentes celulares en operaciones
t�cnicamente beneficiosas, bien sea de fabricaci�n de productos o
como operaciones de servicios.

Para responder a los planteamientos de la anterior definici�n la

biotecnolog�a debe considerarse como un �rea del conocimiento
intensamente interdisciplinar, caracterizada por la reuni�n de conceptos
y metodolog�as procedentes de numerosas ciencias para aplicarlas tanto
a la investigaci�n b�sica como a la resoluci�n de problemas pr�cticos y
la obtenci�n de bienes y servicios.

Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnolog�a

son: La Microbiolog�a, Embriolog�a, Bioqu�mica, Gen�tica, Biolog�a
celular, Qu�mica, Mec�nica, Electr�nica, Inform�tica. Entre otras.

En conclusi�n, la biotecnolog�a surge como un espacio de recombinaci�n

de conocimiento de diversas �reas del conocimiento que pretende dar
soluciones a los problemas relacionados con la medicina, la agronom�a,
zootecnia, la agroindustria, la ingenier�a de alimentos, problemas
ambientales, entre otros campos. Es as� entonces, que el aporte de la
biotecnolog�a se produce en dos etapas, en la primera, seg�n Cruz
Lage (2004) la investigaci�n cient�fica b�sica que se coloca por delante
de la innovaci�n tecnol�gica, exponiendo todo su valor predictivo y
transformador, adem�s de su capacidad explicativa. No hay desarrollo
en esta rama sin investigaci�n cient�fica. La segunda fase, se caracteriza
por el desarrollo de un sistema estandarizado de m�todos secuenciales
entre los cuales se identifican claramente las relaciones y
procedimientos operacionales que condicionan el �xito del proceso.

AUTOEVALUACI�N.

Realice un mapa conceptual sobre el concepto de Biotecnolog�a

Lecci�n 2: Historia de la biotecnolog�a

La Biotecnolog�a como ciencia interdisciplinar, surge desde diversas

�reas del conocimiento y de la aplicaci�n espont�nea para la obtenci�n
de bienes y servicios desde sus primeras �pocas, por lo tanto mucho de
su desarrollo est� �ntimamente ligado con el desarrollo e historia de las
Ciencias. Como La biolog�a, la microbiolog�a, la bioqu�mica y obviamente
al desarrollo tecnol�gico.

Si bien es cierto, en las primeras etapas de la historia de la humanidad

se utilizaron los seres vivos o productos derivados de ellos para
atender las necesidades del hombre tales como el vino y el pan, entre
otros; estos productos no pueden considerarse como un resultado de
procesos biotecnol�gicos, puesto que en este estadio de desarrollo las
fermentaciones son procesos naturales que no involucran la
manipulaci�n de los sistemas biol�gicos para modificar o controlar las
propiedades del producto obtenido. Sin embargo, esta es una larga
etapa de pre�mbulo caracterizada por las ideas vitalistas o animistas
que desde un enfoque dial�ctico motivan el desarrollo de m�todos
experimentales que buscan predecir, explicar y transformar los
fen�menos biol�gicos para obtenci�n de bienes y servicios, que finaliza
con la consolidaci�n de la moderna Biotecnolog�a en el siglo XX I.

Para comprender la historia de la Biotecnolog�a es preciso dividirla en

cuatro fases.

Primera �poca o era precient�fica: corresponde a la �poca anterior a

Pasteur y sus comienzos se confunden con los de la humanidad. En esta
�poca, se realizan pr�cticas emp�ricas de selecci�n de plantas y
animales y sus cruzas, y fermentaciones como un proceso para
preservar y enriquecer el contenido prote�nico de los alimentos. Este
per�odo se extiende hasta la segunda mitad del siglo XIX y se
caracteriza como la aplicaci�n artesanal de una experiencia resultante
de la pr�ctica diaria. Era tecnolog�a sin ciencia subyacente en su
acepci�n moderna. Como ejemplos concretos cabe mencionar las
aplicaciones en :

. La domesticaci�n de plantas y animales ya comenz� en el per�odo

Neol�tico.
. Las civilizaciones Sumeria y Babil�nica (6000 a�os a.C.) ya
conoc�an c�mo elaborar cerveza.
. Los egipcios ya sab�an fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000
a.C.

Antes de la escritura del libro del G�nesis, se disfrutaba del vino en el

Cercano Oriente: recu�rdese que, seg�n la Biblia, No� "sufri�" (o
disfrut�) accidentalmente los efectos de la fermentaci�n espont�nea del
mosto de la uva (primera borrachera con vino)

Se podr�a afirmar que esta era pre-cient�fica termina en el siglo XVIII

cuando cobra cuerpo la idea de que la materia viva puede ser estudiada
como la materia inanimada, es decir, usando el m�todo experimental,
con lo que se inicia el lento declive de las ideas vitalistas (creencias
err�neas de que "la vida depende de un principio vital irreducible a otras
ramas de la ciencia"), que a�n dar�an sus �ltimos estertores casi al final
del siglo XIX.
Segunda �poca

El trabajo preliminar de los primeros microscopistas, como van

Leeuwenhoek y Hooke (siglo XVII), facilit� un par de siglos m�s tarde,
la comprensi�n, de la verdadera importancia de las c�lulas procari�ticas
y eucari�ticas, en procesos relacionados con la fermentaci�n y en el
origen de las enfermedades infecciosas.

Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia

microbiol�gica fue el establecimiento de la relaci�n que une ciertas
transformaciones qu�micas que se dan en las infusiones con el
crecimiento de los g�rmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en
1836, y Schwann y K�tzing en 1837 hab�an sugerido que las levaduras
eran las causantes de la fermentaci�n alcoh�lica por la que el az�car
pasa a alcohol et�lico y di�xido de carbono, pero se encontraron con la
cr�tica adversa de los grandes qu�micos de la �poca (Berzelius, Wohler y
Liebig). Liebig, hacia 1840, hab�a realizado importantes confirmaciones
a la "teor�a mineral" sobre la nutrici�n de las plantas, enfrent�ndose a la
"teor�a del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas
vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las
levaduras como plantas microsc�picas, se supon�a que los procesos de
fermentaci�n y putrefacci�n se deb�an a fen�menos qu�micos de
descomposici�n y muerte encuadrables en el marco de la teor�a mineral
de la fisiolog�a vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se
pod�a explicar en t�rminos de qu�mica y f�sica retras� por alg�n tiempo
la adscripci�n de estos fen�menos a c�lulas vivas.

Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades
�pticas de los cristales de tartrato, ven�a suponiendo que estos
compuestos ten�an un or�gen org�nico) quien de nuevo intervino en el
debate de forma decisiva. En 1857 demostr� que los agentes de la
fermentaci�n l�ctica eran microorganismos, trabajando sobre un
problema que hab�a surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus
cubas la fermentaci�n alcoh�lica se vio sustituida por una indeseable
fermentaci�n l�ctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que
habr�a de durar hasta 1876, en los que Pasteur identific� distintos
microorganismos responsables de diferentes clases de procesos
fermentativos. As�, en 1860 adscribe inequ�vocamente la fermentaci�n
alcoh�lica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus � �tudes sur le
vin� resume sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiolog�a
Aplicada, una de las primeras derivaciones pr�cticas no emp�ricas
emanadas de la Biolog�a. A finales del siglo XIX eminentes bi�logos
como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su
actividad en industrias y destiler�as.
Trabajando sobre los agentes de la fermentaci�n but�rica, Pasteur
descubri� la presencia de microorganismos que se desarrollaban en
ausencia de ox�geno, lo cual desment�a la creencia de que todas las
formas de vida necesitan aire para crecer. Acu�� los t�rminos aerobiosis
y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia
y en ausencia de ox�geno.

Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendi�

las distintas implicaciones energ�ticas subyacentes a la utilizaci�n de
sustratos org�nicos en presencia y en ausencia de ox�geno,
demostrando que, en el segundo caso el rendimiento (medido como
crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la
degradaci�n total de las correspondientes sustancias.

Una profundizaci�n en los fen�menos de fermentaci�n lleg� cuando en

1897 Buchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparaci�n enzim�tica
(zimasa) que era capaz de realizar la misma transformaci�n de
"fermentaci�n" que las c�lulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba
las propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia
de los enfoques qu�mico y biol�gico: las fermentaciones eran procesos
qu�micos catalizados por enzimas presentes dentro de c�lulas vivas, que
pod�an ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioqu�mica,
nacida como una rama de la qu�mica fisiol�gica, que se ven�a
especializando en la enzimolog�a, encontr� una alianza fruct�fera y
duradera con la joven Microbiolog�a, estableciendo las bases enzim�ticas
y metab�licas de muchos procesos de fermentaci�n. De esta forma se
desarrollaron procedimientos industriales para producir enzimas
(invertasa, proteasas, amilasas, etc.). y el siguiente descubrimiento por
parte de Buchner de la capacidad de las enzimas, extra�das de las
levaduras, de convertir az�cares en alcohol.

Tercera �poca

En la historia de la biotecnolog�a se caracteriza por desarrollos en cierto

sentido opuestos, ya que por un lado la expansi�n vertiginosa de la
industria petroqu�mica tiende a desplazar los procesos biotecnol�gicos
de la fermentaci�n, pero por otro, el descubrimiento de la penicilina por
Fleming en 1928, sentar�a las bases para la producci�n en gran escala
de este antibi�tico con el fin de satisfacer las demandas generadas en la
II Guerra Mundial, en esa �poca, la producci�n de penicilina es el
resultado de avances importantes en t�cnicas de esterilizaci�n a gran
escala, mejora de las instalaciones de fermentaci�n, comprensi�n y
control de procesos de fermentaci�n (incluyendo temperatura, pH,
aireaci�n), entre otros. A partir de entonces se dise�aron estrategias
para mejorar gen�ticamente las cepas microbianas industriales.

Desde esa �poca, las t�cnicas de ingenier�a qu�mica, aliadas a la

microbiolog�a y a la bioqu�mica, permiten la producci�n masiva de
antibi�ticos, �cidos org�nicos, esteroides, polisac�ridos y vacunas.

Estos desarrollos dieron un gran impulso a la aplicaci�n de las t�cnicas

de fermentaci�n en la industria alimenticia y al desarrollo industrial de
productos como las levaduras, los �cidos c�tricos y l�cticos y,
finalmente, al desarrollo de una industria qu�mica para la producci�n de
acetona, "butanol" y glicerol, mediante el uso de bacterias. Las d�cadas
de los 60 y 70 vieron la mejora de procesos de obtenci�n de peque�os
metabolitos como nucle�sidos, amino�cidos y vitaminas.

Los procesos de fermentaci�n experimentaron mejoras con las t�cnicas

de inmovilizaci�n de c�lulas y enzimas en soportes, y con la
fermentaci�n continua para obtener prote�na de c�lulas sencillas
(biomasa microbiana). As� mismo los pol�meros microbianos como
xantanos y dextranos se obtuvieron industrialmente, con aplicaciones en
el campo de la alimentaci�n (como aditivos). Y se abri� la posibilidad de
cultivar cada cepa microbiana sin mezclas con otras: cultivos puros en
medios de cultivo de laboratorio

Cuarta �poca.

Es la actual. Se inicia con el descubrimiento de la doble estructura axial

del �cido "deoxi-ribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953,
seguido por los procesos que permiten la inmovilizaci�n de las enzimas,
los primeros experimentos de ingenier�a gen�tica realizados por Cohen y
Boyer en 1973 y aplicaci�n en 1975 de la t�cnica del "hibridoma" para la
producci�n de anticuerpos "monoclonales", gracias a los trabajos de
Milstein y Kohler.(1983). Estos importantes descubrimientos han dado
lugar a numerosos trabajos de mejoramiento gen�tico tanto en plantas
como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a partir de
c�lulas madre, y el importante acontecimiento de la aparici�n de la
oveja Dolli en el contexto cient�fico, que dio un vuelco total al concepto
de Biotecnolog�a.
Autoevaluaci�n: La Biotecnolog�a evidencia como una integraci�n
entre las ciencias b�sicas con las ciencias aplicadas puesto que se
pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes biol�gicos
sencillos como c�lulas vivas o muertas, o componentes celulares en
operaciones t�cnicamente beneficiosas, bien sea de fabricaci�n de
productos o como operaciones de servicios.

Seg�n lo anterior:

. Se puede afirmar, qu� la fabricaci�n de vino en la �poca

antigua es Biotecnolog�a?
. Cu�les son los ejes te�ricos que sustentan la Biotecnolog�a.
. La obtenci�n de az�car a partir de la ca�a, se podr�a
considerar un proceso de Biotecnolog�a? Cu�les ser�an
los puntos a tener en cuenta para considerar esta
pr�ctica como tal.

Lecci�n 3: Divisiones y tipos de la Biotecnolog�a

En la historia de la Biotecnolog�a se puede apreciar que las t�cnicas y

procedimientos utilizados han tenido una aplicaci�n r�pida en �reas tan
diversas como la agricultura, la industria alimenticia, la farmac�utica,
los procesos de diagn�stico y tratamiento m�dico, la industria qu�mica,
la miner�a y la inform�tica, Como se puede apreciar existe una amplia
gama de campos de aplicaci�n y en todos ellos se han generado un
amplio n�mero de productos y servicios. Sin embargo, es de se�alar que
todos los procesos de innovaci�n tecnol�gica se caracterizan
generalmente por presentar tres n�cleos cient�ficos John Smith (1996):

1. obtenci�n del mejor catalizador biol�gico para una

funci�n o proceso espec�fico: En la mayor�a de los casos,
el catalizador biol�gico son c�lulas vivas, sobre todo
microorganismos. Por ello, uno de los pilares de la
biotecnolog�a es precisamente la microbiolog�a (entendiendo
esta en sentido amplio de biolog�a microbiana). Parte de lo
que hemos aprendido sobre el manejo de microorganismos
se puede aplicar, con modificaciones, al manejo de c�lulas
de animales y plantas, que cada vez son m�s importantes en
la biotecnolog�a. Varias son las caracter�sticas que hacen
atractivos a los microorganismos:
2. obtener el mejor ambiente para la funci�n de ese
catalizador biol�gico, mediante una serie de dise�os
t�cnicos en los que es fundamental la ingenier�a qu�mica El
segundo componente o n�cleo de las biotecnolog�as estriba
en el entorno industrial en que ponemos a funcionar las
c�lulas o las enzimas. Esto nos lleva al concepto de
biorreactor, un entorno cerrado y controlado para que
nuestros catalizadores biol�gicos hagan lo que queremos con
la m�xima eficiencia. En esta parte de la biotecnolog�a se
requiere la colaboraci�n estrecha entre los bi�logos y los
ingenieros de bioprocesos, incluyendo los ingenieros
qu�micos. Se trata de dise�ar biorreactores o fermentadores,
especies de cubas cerradas dise�adas para controlar
diversos par�metros que condicionan la buena producci�n:
temperatura, aireaci�n, pH, etc

3. procesamiento del material, consistente en separar y

eventualmente purificar el material biol�gico producido:
quiz�s esta es el �rea m�s desconocida y compleja, el
procesamiento de la biomasa o de la sustancia producida:
separaci�n de las c�lulas respecto del medio acuoso en que
han funcionado, recuperaci�n eficiente del producto
buscado, purificaci�n, entre otros procedimientos.

Atendiendo a los planteamientos anteriores la biotecnolog�a la podemos

clasificar bajo dos enfoques, el primero, de acuerdo con el nivel de
tecnolog�a utilizado en la obtenci�n de productos, y el segundo, seg�n el
campo de aplicaci�n del producto o servici�

De acuerdo al primer enfoque, las nuevas biotecnolog�as generalmente

se agrupan en tres categor�as b�sicas:

. T�cnicas para el cultivo de c�lulas y tejidos.

. Procesos biotecnol�gicos, fundamentalmente de fermentaci�n, y
que incluyen la t�cnica de inmovilizaci�n de enzimas. (Osorio M.
2005)
. T�cnicas para la manipulaci�n, modificaci�n y transferencia de
materiales gen�ticos (ingenier�a gen�tica).

Aunque estos tres grupos se complementan entre s�, existe una

diferencia fundamental entre los dos primeros y el tercero. Los primeros
se basan en el conocimiento de las caracter�sticas y comportamiento de
los microorganismos y en el uso deliberado de estas caracter�sticas (de
cada organismo en particular), para el logro de objetivos espec�ficos
como la obtenci�n de nuevos productos o procesos. La enorme
potencialidad del �ltimo grupo se deriva de la capacidad de manipular,
las caracter�sticas estructurales y funcionales de los organismos y de
aplicaci�n pr�ctica de esta capacidad para superar ciertos l�mites
naturales en el desarrollo de nuevos productos o procesos.

A diferencia de la primera clasificaci�n, que se�ala las t�cnicas

propiamente tales, la segunda se refiere tambi�n a las actividades
econ�micas en las que se hace uso de dichas tecnolog�as. La nueva
biotecnolog�a crea nuevos procesos y nuevos productos en diversas
�reas de la econom�a. Como estos procesos se basan en los mismos
principios, ya sea que se apliquen en un sector econ�mico o en otro, ello
introduce cierto grado de flexibilidad, ya que permite la movilidad entre
diferentes sectores. Por ejemplo, los procesos de fermentaci�n pueden
aplicarse para la producci�n, en gran escala, de alcohol o de antibi�ticos
como la penicilina, o en escalas menores para la producci�n de
amino�cidos en la industria farmac�utica. Esto facilita la, movilidad de
factores productivos y tiene impacto sobre la calificaci�n de la mano de
obra, la cual, aun cuando deber� adaptarse a este nuevo perfil
tecnol�gico (tanto en t�rminos, cuantitativos como cualitativos)
posiblemente logre al mismo tiempo una mayor facilidad de empleo.

Tipos de Biotecnolog�a: Dependiendo del campo de aplicaci�n del

servicio o producto obtenido la biotecnolog�a se ha clasificado en:

Biotecnolog�a Microbiana: La biotecnolog�a microbiana o como se

llamaba anteriormente microbiolog�a industrial se refiere a los procesos
donde participan los microorganismos para la obtenci�n de productos o
metabolitos de inter�s humano.

La microbiolog�a industrial comenz� con los procesos de fermentaci�n

alcoh�lica por ej. La fermentaci�n del vino y de la cerveza. M�s tarde se
desarrollaron los procesos microbianos para la producci�n de agentes
farmac�uticos como los antibi�ticos, la producci�n de aditivos
alimentarios como los amino �cidos, para la producci�n de enzimas y
sustancias qu�micas industriales como el butanol, el acido c�trico, entre
otros.

En la actualidad estamos en una nueva era de la tecnolog�a microbiana

con el advenimiento de la tecnolog�a de genes. La tecnolog�a gen�tica
permite que un microorganismo procesado gen�ticamente fabrique
sustancias que normalmente no ser�a capaz de producir, es as� como
utilizando ingenier�a gen�tica se ha podido producir insulina por una
bacteria introduciendo el gen de la insulina humana en la bacteria
Escherichia coli.

Podemos dividir a la biotecnolog�a microbiana en dos fases distintas:

1) La tecnolog�a microbiana tradicional, que implica la fabricaci�n a gran

escala de productos que los microorganismo son capaces de fabricar
normalmente. En este caso la tarea del microbi�logo consiste en
modificando el organismo o el proceso para aumentar el rendimiento del
producto deseado.

2) La tecnolog�a microbiana con organismos alterados mediante

procesos de ingenier�a, es decir microorganismos en los cuales se ha
insertado genes extra�os. En esta nueva tecnolog�a el microbi�logo
industrial trabaja estrechamente asociado con el ingeniero gen�tico en
el desarrollo de un organismo adecuado que no solo produzca el
producto de inter�s, sino que tambi�n pueda ser cultivado en la escala
necesaria para su explotaci�n comercial. (Brook y Scaligan ,2002)

Biotecnolog�a Agr�cola � vegetal: Con las t�cnicas de la biotecnolog�a

moderna, es posible producir m�s r�pidamente que antes, nuevas
variedades de plantas con caracter�sticas mejoradas, produciendo en
mayores cantidades, con tolerancia a condiciones adversas, resistencia a
herbicidas espec�ficos, control de plagas, cultivo durante todo el a�o.
Problemas de enfermedades y control de malezas ahora pueden ser
tratados gen�ticamente en lugar del uso de qu�micos. Una planta
modificada por ingenier�a gen�tica, que contiene ADN de una fuente
externa, es un organismo transg�nico. Un ejemplo de planta transg�nica
es el tomate que permite mantenerse durante m�s tiempo en los
almacenes evitando que se reblandezcan antes de ser transportados

Algunos pa�ses desarrollados como Estados Unidos y a sus

multinacionales, defienden el uso de la biotecnolog�a y pone de relieve
la importancia de su industria, que crea nuevos puestos de trabajo y
fomenta la innovaci�n tecnol�gica y podr�a acabar con el hambre del
mundo. En Europa, los casos de Soja y Ma�z transg�nicos resultan de
especial relevancia. La soja se utiliza en un 40 a 60% de los alimentos
procesados: aceite, margarina, alimentos diet�ticos e infantiles,
cerveza, etc. Espa�a importa de EEUU 1�5 millones de toneladas, el
cuarto pa�s importador detr�s de Jap�n, Taiwan y Holanda.

La comercializaci�n del ma�z transg�nico est� autorizada en EEUU,

Canad�, Jap�n y tambi�n en la Uni�n Europea desde Enero de 1997.
China planea plantar tomates, arroz, pimientos y patatas por lo menos
en la mitad de todas sus tierras de labor (500.000 kil�metros
cuadrados) en el plazo de cinco a�os. Sus investigadores analizaron el
efecto de los pimientos y los tomates transg�nicos en ratas de
laboratorio, comparando el peso y el estado de los mismos con los de
otros no alimentados, y no observaron diferencias significativas.

Para profundizar en este tema haga clic aqu�: La biotecnolog�a en la

alimentaci�n y la agricultura

Biotecnolog�a animal: Esta ha experimentado un gran desarrollo en

las �ltimas d�cadas. Las aplicaciones in�ciales se dirigieron
principalmente a sistemas diagn�sticos, nuevas vacunas y drogas,
fertilizaci�n de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento,
entre otros procedimientos. Los animales transg�nicos como el "rat�n
oncog�nico" han sido muy �tiles en trabajos de laboratorio para estudios
de enfermedades humanas.

Existen tres �reas diferentes en las cuales la biotecnolog�a puede influir

sobre la producci�n animal:

-El uso de tecnolog�as reproductivas

-Nuevas vacunas y

-cultivos celulares que producen hormonas.

En animales tenemos ejemplos de modelos desarrollados para evaluar

enfermedades gen�ticas humanas, el uso de animales para la
producci�n de drogas y como fuente donante de c�lulas y �rganos, por
ejemplo el uso de animales para la producci�n de prote�nas sangu�neas
humanas o anticuerpos.

Para las enfermedades animales, la biotecnolog�a provee de numerosas

oportunidades para combatirlas, y est�n siendo desarrolladas vacunas
contra muchas enfermedades bovinas y porcinas, que en los �ltimos
tiempos han hecho mella en estos animales.

Biotecnolog�a Humana Las t�cnicas del ADN est�n siendo utilizadas

para determinar relaciones familiares en litigios de paternidad, para
confrontar donantes de �rganos con receptores en programas de
trasplante, unir sospechosos con la evidencia de ADN en la escena del
crimen (biotecnolog�a forense).
El desarrollo de t�cnicas para el diagn�stico de enfermedades
infecciosas o de desordenes gen�ticos es una de las aplicaciones de
mayor impacto de la tecnolog�a de ADN. Al utilizar las t�cnicas de
secuenciaci�n de ADN los cient�ficos pueden diagnosticar infecciones
v�ricas, bacterianas o mapear la localizaci�n espec�fica de los genes a lo
largo de la mol�cula de ADN en las c�lulas.

El primer tratamiento exitoso en terapia g�nica fue en 1990, cuando se

trat� una enfermedad del sistema inmune de ni�os llamada "Deficiencia
de ADA". C�lulas sangu�neas con los genes correctos de ADA fueron
inyectadas al cuerpo del paciente donde produjeron suficientes c�lulas
normales que permitieron mejorar el sistema inmune.

Hoy, la terapia g�nica esta tratando enfermedades tales como tumores

cerebrales malignos, fibrosis qu�stica y HIV. Con esta t�cnica se
pretende tambi�n reparar �rganos, como por ejemplo un h�gado
cirr�tico a partir de las pocas c�lulas sanas que le quedan, un par de
ventr�culos nuevos para reemplazar los efectos devastadores de un
infarto, la regeneraci�n de una mano amputada o disponer de una
fuente inagotable de neuronas para corregir los efectos de
enfermedades tan graves como el Alzheimer o el mal de Parkinson.

Lecci�n 4. Impacto de la Biotecnolog�a en el contexto

colombiano.

Su impacto ha alcanzado varios sectores productivos: agricultura,

industria de alimentos, industria farmac�utica, bioindustria, entre otros.
Aumentando la productividad y la competitividad con la generaci�n de
nuevos productos, por lo cual se han convertido en parte clave del
crecimiento de la econom�a en la mayor�a de los pa�ses industrializados
y algunos pa�ses en desarrollo. En general, el alto valor agregado que se
genera con la moderna Biotecnolog�a, particularmente a nivel
farmac�utico, est� determinado por su novedad y especificidad de uso
en consumo humano. Osorio, (1995)

En Colombia el avance de la moderna biotecnolog�a en los �ltimos diez

a�os ha comenzado a generar algunos productos, particularmente en el
sector agr�cola. Existen cerca de 70 instituciones entre estatales y
privadas, que involucran biotecnolog�a en sus procesos de investigaci�n
y/o producci�n.

En el sector agr�cola se ha avanzado en t�cnicas de cultivo de tejidos

vegetales in vitro, en el estudio y uso sostenible de microorganismos
con el fin de buscar alternativas de control biol�gico de enfermedades y
plagas y se est�n realizando algunos trabajos en mejoramiento gen�tico
de plantas de papas, pasifloras, entre otros basados en el ADN
recombinante. Se observan trabajos escasos a nivel de estudios de
diversidad gen�tica en especies silvestres del pa�s, los cuales se
desarrollan para identificar nuevos genes �tiles en el mejoramiento de
variedades comerciales y para aumentar la eficiencia y calidad de los
bancos de germoplasma existentes en el pa�s.

En el sector pecuario, la aplicaci�n de la biolog�a se limita a la

producci�n de vacunas y a la b�squeda de razas mejoradas mediante la
implantaci�n de embriones. Actualmente se est�n realizando trabajos de
investigaci�n en la estandarizaci�n de kits de diagn�stico de
enfermedades serol�gicas y moleculares, vacunas sint�ticas y aplicaci�n
selectiva de microorganismos relacionados con la nutrici�n animal
mejorada. A nivel de diversidad gen�tica de especies nativas los
trabajos son discontinuos y aislados.

En el sector de la salud humana se desarrollan proyectos de

investigaci�n con producci�n de kits serol�gicos y moleculares para el
diagn�stico r�pido de enfermedades tropicales y se estudian los
espectros de variabilidad existentes por ejemplo, enfermedad de
Chagas.

En el sector agroindustrial y de la alimentaci�n animal, la Biolog�a es

aplicada para generar productos l�cteos, bebidas fermentadas,
destilaci�n de fermentaciones etan�licas para la elaboraci�n de licores,
producci�n de levaduras por fermentaci�n y producci�n de materias
primas como �cido c�trico y solventes org�nicos. Este sector utiliza
fundamentalmente m�todos biotecnol�gicos tradicionales.

En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel

del tratamiento de aguas residuales industriales como lodos activados y
biofiltros, m�todos de descontaminaci�n de los derramamientos de
petr�leo mediante el uso de microorganismos nativos o transformados
gen�ticamente. Algunos trabajos de investigaci�n cient�fica se est�n
realizando sobre biodigestores de alta calidad. Sin embargo, el
desarrollo nacional en este sector es todav�a discreto.

La diversidad biol�gica de Colombia es una ventaja comparativa que al

ser usada sosteniblemente puede apoyar el desarrollo del sector
productivo. As� mismo constituye una respuesta a problemas de
seguridad alimentaria, sostenibilidad de aguas, suelos y aire, as� como
un elemento de negociaci�n pol�tica internacional y fortalecimiento de la
soberan�a. Por estas razones, su conocimiento, conservaci�n y uso
sostenible es prioritario. Sin embargo, como se observa con el estado de
la biotecnolog�a en Colombia, los avances en estos campos son muy
peque�os comparativamente con otros pa�ses de Am�rica Latina como
Costa Rica, Brasil y otros del mundo .

Con relaci�n a los bio-recursos, Colombia es un pa�s privilegiado ya que

se encuentra entre uno de los pa�ses de mayor diversidad biol�gica del
planeta por �rea. Sin embargo, para aprovechar ese potencial, el pa�s
debe desarrollar la capacidad cient�fica y t�cnica que le permita
explorar, conocer, estudiar, investigar, valorar, conservar y desarrollar
esos biorrecursos como un patrimonio altamente productivo y no
simplemente como una diversidad ecol�gica, social y econ�micamente
improductiva.

Lecci�n 5: Tendencias de la Biotecnolog�a

A nivel mundial el inter�s por la biotecnolog�a es indudable, como se ve

a trav�s del, frecuente abordaje de tales temas en los peri�dicos, libros
y medios de comunicaci�n.

Algunos descubrimientos �tiles ser�n una consecuencia directa del uso

de las t�cnicas de ingenier�a gen�tica que logren transferir determinados
genes (a veces incluso genes humanos) a un determinado
microorganismo apropiado, para hacer el producto que es precisamente
requerido en el mercado. Determinadas prote�nas humanas y algunos
enzimas requeridos en Medicina se conseguir�n de esta forma, en el
futuro. Otros muchos beneficios, ser�n el resultado de la fabricaci�n
mediante t�cnicas de fermentaci�n, de anticuerpos espec�ficos para,
fines anal�ticos y terap�uticos. Estos anticuerpos monoclonales se
producir�n mediante el uso de microorganismos en grandes
fermentadores, como por ejemplo la producci�n de antibi�ticos como la
penicilina.

Se est�n desarrollando en la actualidad, importantes descubrimiento y

aplicaciones comerciales en cada uno de los campos de la Biotecnolog�a,
incluyendo las que tienen lugar en las industrias de fermentaci�n, la
biotecnolog�a de los enzimas y c�lulas inmovilizadas, el tratamiento de
residuos y la utilizaci�n de subproductos. Aquellos procesos que resulten
productivos ser�n �tiles a la sociedad, atractivos para la industria por
motivos comerciales y en algunos casos recibir�n el apoyo de los
respectivos gobiernos.

Una gran potencialidad de la biotecnolog�a se da en el campo de la

investigaci�n y el desarrollo cient�fico, ya que proporciona herramientas
que permiten una mejor comprensi�n de los procesos fisiol�gicos, por
ejemplo, del sistema inmuno-defensivo, o que reducen, en forma
considerable, los plazos de la I y D, facilitando as� los procesos de
innovaci�n tecnol�gica. A su vez, con el advenimiento de nuevas
t�cnicas en el campo biol�gico, la actividad de la I y D en este campo
tiende a hacerse cada vez m�s cient�fica y menos emp�rica,
acentu�ndose as� las caracter�sticas de intensidad cient�fica propias de la
biotecnolog�a.

Resulta claro que siendo la biotecnolog�a un sistema de diversas

innovaciones cient�fico-tecnol�gicas interrelacionadas, no todas ellas
evolucionan al mismo ritmo. Las condiciones de mercado, las
expectativas de beneficios, aspectos organizativos y de gesti�n, entre
otros, favorecen la r�pida puesta en marcha y difusi�n de algunas de
estas tecnolog�as, relegando a otras. La literatura sobre la innovaci�n
tecnol�gica acostumbra distinguir entre aquellas innovaciones que
surgen como respuesta a una situaci�n de mercado, y a expectativas de
beneficios econ�micos, de aqu�llas que se originan en el �rea de I y D
como resultado de un proceso continuo y acumulativo de desarrollo
cient�fico-tecnol�gico. En el primer caso se habla de "demand or market-
pull" y en el segundo, de "technological-push". Ha sido frecuente, en los
�ltimos tiempos, se�alar el l�ser y la biotecnolog�a como ejemplos del
segundo tipo de innovaci�n. Es decir, descubrimientos cient�ficos a los
que se arriba sin una aplicaci�n espec�fica predeterminada en mente,
pero que luego encuentran una gama considerable de aplicaciones
pr�cticas.

Sin embargo, pareciera m�s correcto considerar ambos actores, el

inherente proceso cient�fico-tecnol�gico y aqu�l que corresponde a
incentivos econ�micos, como complementarios. As�, en el caso de la
biotecnolog�a, aun cuando �sta nace e el �mbito de la I y D, de las
muchas aplicaciones posibles, las que se desarrollan primero son
aquellas que ofrecen expectativas de importantes beneficios econ�micos
en un plazo m�s � menos breve.

En la agricultura, la biotecnolog�a se orienta a la superaci�n de los

factores limitantes de la reducci�n agr�cola a trav�s de la obtenci�n de
variedades de plantas tolerantes a condiciones ambientales negativas
(sequ�as, suelos �cidos), resistentes a enfermedades y pestes, que
permitan aumentar el proceso fotosint�tico, la fijaci�n de nitr�geno o la
captaci�n de elementos nutritivos. Tambi�n se apunta al logro de
plantas m�s productivas y/ o m�s nutritivas, mediante la mejora de su
contenido prote�nico o amino�cido.
Un desarrollo paralelo es la producci�n de pesticidas (insecticidas,
herbicidas y fungicidas) microbianos. Las t�cnicas que ya se emplean, o
que est�n desarroll�ndose, van desde los cultivos de tejidos, la fusi�n
protoplasm�tica, el cultivo in vitro de "meristemas", la producci�n de
n�dulos de "rhizobium" y "micorizas", hasta la ingenier�a gen�tica para
la obtenci�n de plantas de mayor capacidad fotosint�tica, que puedan
fijar directamente nitr�geno, resistentes a plagas y pestes, etc. El
cultivo de tejidos consiste en la regeneraci�n de plantas completas a
partir de una masa amorfa, de c�lulas, que se denomina "callo".

En su forma m�s general, se aplica a todo tipo de cultivo "in vitro",

desde simples unidades indiferenciadas hasta complejos multicelulares y
�rganos. El proceso consiste en la incubaci�n, en condiciones
controladas y as�pticas, de una c�lula o parte de un tejido vegetal
(hoja, tallo, ra�z, embri�n, semilla, "meristema", polen, etc.) en un
medio que contiene elementos nutritivos, vitaminas y factores de
crecimiento (Osorio, 2005)

La magnitud del mercado potencial agr�cola para la biotecnolog�a es, en

gran medida materia de especulaci�n debido precisamente a la falta de
un conocimiento detallado de muchas de estas condiciones locales. En
este campo, la biotecnolog�a est� orientada a la utilizaci�n en gran
escala de "biomasa" para la producci�n de materias primas org�nicas,
que actualmente se obtienen mediante procesos qu�micos
convencionales. Las ventajas son que la "biomasa" es un recurso
altamente subutilizado y relativamente barato., ya que en gran parte
esta constitu�do por residuos y desechos de plantaciones forestales y de
cultivos en gran escala. Es adem�s un recurso renovable. Las principales
fuentes potencialmente disponibles para la producci�n tanto de etanol
como de otros productos qu�micos a granel son (aparte de las melazas
de la ca�a) cultivos como la yuca, el sorgo, las papas y el ma�z; los
sueros de la industria de la leche; los residuos de las plantaciones de
caf� y, en general, todo tipo de residuo celuloso.

Actualmente la biotecnolog�a est� siendo aplicada en gran escala en la

producci�n de alcohol (etanol), como combustible sustituto del petr�leo,
fundamentalmente en el Brasil y en menor medida en Estados Unidos y
la India. En el Brasil, la producci�n se logra a partir de melazas de la
ca�a de az�car, mientras que en Estados Unidos se usa el ma�z. Otro
producto importante es el �cido c�trico. Los principales productores son
los Estados Unidos, Italia, B�lgica y Francia que utilizan como materia
prima melazas de remolacha. La importancia que tiene cada una de las
aplicaciones mencionadas es incuestionable desde el punto de vista
econ�mico.

A pesar que en el siglo XX, cuando la Gen�tica hab�a resuelto el misterio

de la naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que hab�a
para actuar sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y
animales de la misma especie (o de especies similares), selecci�n de los
individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y
lento), mutaciones con agentes f�sicos (rayos UV, rayos X) o qu�micos,
con ulterior b�squeda (selecci�n o rastreo -screening) de alguna
variante de inter�s (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc.

Debimos esperar a la d�cada de los 70 para que surja un conjunto de

t�cnicas de laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten
"tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la vida. Son t�cnicas y
herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a
dise�os previos y objetivos concretos (de ah� el nombre popular de
Ingenier�a Gen�tica).

La Ingenier�a Gen�tica (I.G.), mejor llamada tecnolog�a del ADN

recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y
empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando
nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones
que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos
hospederos, para nuestro provecho.

Teniendo en cuenta lo anterior se puede inferir que las tendencias

cient�ficas mundiales a todos los niveles y clasificaci�n de la
Biotecnolog�a, se han concentrado en seis aspectos:

- Cultivos de tejidos y c�lulas para: la r�pida micropropagaci�n "in

vitro" de plantas, la obtenci�n de cultivos sanos, el mejoramiento
gen�tico por cruza amplia, la preservaci�n e intercambio de
"germoplasma", la "bios�ntesis" de "metabolitos" secundarios de
inter�s econ�mico y la investigaci�n b�sica.

- Metabolomica La manipulaci�n del metabolismo para inhibir unas

rutas biosinteticas o favorecer otras sin afectar la econom�a celular
con el prop�sito de obtener una mayor producci�n del producto de
inter�s.
- El uso de enzimas o fermentaci�n microbiana, para la
conservaci�n de materia primas definidas como sustratos en
determinados productos, la recuperaci�n de estos productos, su
separaci�n de los caldos de fermentaci�n y su purificaci�n final.
- Tecnolog�a del "hibridoma", que se refiere a la producci�n, a partir
de "clones", de anticuerpos de acci�n muy espec�fica que reciben
el nombre de anticuerpos "monoclonales".
- Ingenier�a de prote�nas � Proteomica, que implica la modificaci�n
de la estructura de las prote�nas para mejorar su funcionamiento o
para la producci�n de prote�nas totalmente nuevas.
- Ingenier�a gen�tica o tecnolog�a del "ADN", que consiste en la
introducci�n de un "ADN" h�brido, que contiene los genes de
inter�s para determinados prop�sitos, para capacitar a ciertos
organismos en la elaboraci�n de productos espec�ficos, ya sean
estos enzimas, hormonas o cualquier otro tipo de prote�na u
organismo.
- Bioinform�tica, que se refiere a la t�cnica basada en la utilizaci�n
de prote�nas en aparatos electr�nicos, particularmente sensores
biol�gicos y "bioships"; es decir, "microchips" biol�gicos, capaces
de l�gica y memoria.

A todo esto tenemos que a�adir que un factor important�simo en el

desarrollo de la biotecnolog�a es la evaluaci�n de la seguridad del
producto, sometida a controles rigurosos seg�n normativas nacionales e
internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede
convertir en limitante, de modo que las regulaciones estrictas
desincentivan ciertos desarrollos biotecnol�gicos. Por todo ello, es
importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan m�s de lo
que la evidencia cient�fica sugiere, manteniendo en todo momento la
preservaci�n de la salud y el medio ambiente. A su vez, las regulaciones
reflejan la percepci�n p�blica de los riesgos y promesas de la
biotecnolog�a. Por ejemplo, hoy en Europa la percepci�n p�blica ha
logrado pr�cticamente una parada en las plantas transg�nicas, a pesar
de los informes cient�ficos que dicen que en la mayor parte de los casos,
sus riesgos son similares a las plantas convencionales. La creaci�n o
elaboraci�n de este tipo de alimentos depende del nivel de desarrollo del
pa�s, de los intereses pol�ticos del mismo y del grado de presi�n que
ejerzan las grandes industrias privadas del sector. Hay un gran debate
en torno a la conveniencia o no de este tipo de organismos.

Habr� que llegar a un di�logo racional entre los diversos actores

(cient�ficos, empresas, consumidores, ecologistas, entre otros) para
asegurar el correcto empleo de estas tecnolog�as, que por un lado no
impida aplicaciones ben�ficas sin riesgos, y por otro regule
adecuadamente aquellos �mbitos donde las dudas razonables hagan
recomendables m�s restricciones. El ideal ser�a permitir todo aquello
que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de
prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados,
en buena parte imaginaciones y tergiversaciones de grupos de presi�n
que pueden esconder agendas pol�ticas ocultas.

ACTIVIDADES DE AUTOEVALUACI�N

Lectura 1. Aplicando el m�todo de Lectura Auto regulada IPLER;

Realice un ensayo de la siguiente lectura.

Los beneficios de la biotecnolog�a alimentaria

La biotecnolog�a ya nos est� ayudando de muchas maneras:

� Protecci�n del medio ambiente. Los cient�ficos lograron que algunos

alimentos, como la papaya y la papa, sean m�s resistentes a las plagas.
Estos cultivos necesitan ahora menos productos qu�micos para estar
protegidos de insectos o virus da�inos, lo que es mucho mejor para el
agua y la vida silvestre. Otros cultivos est�n protegidos de los herbicidas
que se usan para controlar a las malezas. El mejor control de las
malezas permite que los agricultores conserven el suelo ya que no
tienen que arar la tierra con tanta frecuencia.

� Mayores rendimientos. Los agricultores tambi�n usan la biotecnolog�a

para ayudar a las plantas a sobrevivir. Por ejemplo, las nuevas
variedades de ma�z y algod�n rechazan a los insectos da�inos, y la soya
mejorada puede tolerar los herbicidas. Los agricultores pueden esperar
mayores rendimientos de la cosecha en estas plantas m�s resistentes.

� Alimentos con mejor sabor y m�s frescos. Pimientos m�s dulces y

tomates que maduran m�s despacio son s�lo dos ejemplos de c�mo la
biotecnolog�a puede producir alimentos m�s frescos y de mejor sabor.

El futuro de la biotecnolog�a

En el futuro, la biotecnolog�a podr� ayudarnos a:

� Cultivar m�s alimentos en menor superficie. En la actualidad hay 6,000

millones de personas viviendo en la Tierra. Para el a�o 2050, seremos
9,000 millones. Al usar la biotecnolog�a, los agricultores podr�n
producir mayores cosechas en la misma superficie que utilizan en la
actualidad. Si podemos obtener los alimentos que necesitamos de estos
cultivos, ya no tendremos que destinar m�s superficie al cultivo. Los
pa�ses en desarrollo ser�n los que m�s se beneficien con esta tecnolog�a
moderna ya que en ellos se producir� el mayor crecimiento de la
poblaci�n.

� Mantener alimentos que sean seguros para comer. Los cient�ficos

podr�n detectar con mayor precisi�n cu�les son los virus y bacterias
da�inas que pueden hallarse en los alimentos. Por lo tanto, correremos
menos riesgos de contraer enfermedades transmitidas por los alimentos.

� Obtener alimentos m�s saludables. Mejorar algunos alimentos por

medio de la biotecnolog�a nos podr� ayudar a disminuir nuestro riesgo
de contraer enfermedades cr�nicas como el c�ncer y afecciones
card�acas. Por ejemplo:

o Algunas frutas y verduras contendr�n m�s antioxidantes, Vitamina C y

Vitamina E.
o Los aceites para cocinar se obtendr�n de plantas que contendr�n
menos grasas saturadas.
o Los cacahuates podr�n contener menos cantidad de las prote�nas que
causan alergias.

� Mantener seguros los alimentos para los animales. Algunos tipos de

hongos que se hallan en las sustancias que libera el ma�z pueden da�ar
a los animales que lo consumen. Estas sustancias ya est�n reguladas en
los Estados Unidos y la biotecnolog�a representa otra herramienta que
ayudar� a reducir la cantidad de estas sustancias presentes en el ma�z.

Elecciones: Arroz enriquecido

Muchas de las personas que viven en los pa�ses en desarrollo raramente

consumen las vitaminas que necesitan. Por lo tanto, es posible que
tengan problemas de salud. Por ejemplo, la falta de Vitamina A causa
ceguera, y la falta de hierro puede ser da�ina para la salud de las
mujeres y los ni�os. Sin embargo, gracias a la biotecnolog�a, los
cient�ficos han descubierto una manera de agregar mayores cantidades
de Vitamina A y hierro al arroz. En los pa�ses en que el arroz es uno de
los alimentos principales de la dieta, esta nueva variedad del cereal
puede llegar a proteger a la poblaci�n de la ceguera y de otros
problemas de salud.

La seguridad de la biotecnolog�a alimentaria

La Administraci�n de Alimentos y F�rmacos (FDA) revisa la seguridad de

todos los alimentos que est�n en el mercado. La FDA, la Agencia de
Protecci�n Ambiental (EPA), el Departamento de Agricultura de los
Estados Unidos (USDA) y la comunidad cient�fica en general est�n de
acuerdo en afirmar que los alimentos producidos aplicando la
biotecnolog�a son seguros. Los alimentos producidos utilizando m�todos
biotecnol�gicos o convencionales deben satisfacer los mismos
est�ndares de seguridad.

� La FDA regula los alimentos desarrollados utilizando la biotecnolog�a de

la misma manera en que regula los alimentos producidos por otros
m�todos.

� La FDA garantiza la seguridad de estos alimentos y requiere un

etiquetado especial si es que el contenido nutricional del alimento se
modifica o si se adiciona una sustancia que puede causar alergias.

El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y la EPA tambi�n

ayudan a regular la biotecnolog�a agr�cola para garantizar la seguridad.
Adem�s, despu�s de una completa revisi�n de la ciencia en 2002, la
Sociedad de Toxicolog�a lleg� a la conclusi�n de que los alimentos
producidos aplicando m�todos biotecnol�gicos son tan seguros como los
alimentos tradicionales.

Elecciones: Ma�z seguro para el medio ambiente

El ma�z mejorado biotecnol�gicamente para que contenga menos fitato,

uno de sus componentes del ma�s, ayudar� a reducir el impacto que
tienen los animales de granja en el medio ambiente. El ma�z con bajo
contenido de fitato puede reducir la cantidad de f�sforo no deseado en
las deposiciones de los animales, lo que representa una potencial
amenaza para la calidad del agua.

Para m�s informaci�n:

Usted puede obtener m�s informaci�n sobre los alimentos y c�mo se

producen de los profesionales de la salud, dietistas, nutri�logos,
agentes de informaci�n, agricultores locales y programas universitarios
que se dedican a estos temas. En los sitios de Internet que se
mencionan a continuaci�n hallar� la informaci�n que necesita:

Servicio de Inspecci�n de Salud de Animales y Plantas, Servicios

Regulatorios de Biotecnolog�a del Departamento de Agricultura de los
Estados Unidoshttp://www.aphis.usda.gov/brs/

Centro de Seguridad de los Alimentos y Nutrici�n Aplicada de la

FDAhttp://www.cfsan.fda.gov/

Agencia de protecci�n ambiental (EPA) http://www.epa.gov

La Asociaci�n Diet�tica de los Estados Unidos http://www.eatright.org

Consejo de Ciencia y Tecnolog�a Agr�cola http://www.cast-science.org

Instituto de Tecn�logos de Alimentos http://www.ift.org

Sociedad de Toxicolog�a http://www.toxicology.org/

IFIC Foundation http://ific.org/food/biotechnology

CAPITULO 2: BIOTECNOLOG�A DE LAS FERMENTACIONES

Lecci�n 6: Nutrici�n microbiana.

Las c�lulas contienen grandes cantidades de peque�as mol�culas as�

como de macromol�culas. La c�lula puede obtener la mayor�a de las
peque�as mol�culas que necesita del exterior o sintetizarlas a partir de
mol�culas m�s simples. Las macromol�culas, por el contrario, son
siempre sintetizadas en la c�lula.

Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son
utilizadas con fines energ�ticos o pl�sticos se denominan como
nutrientes, en cualquier caso, los nutrientes deben suministrase en los
diferentes medios de cultivo.

Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes,

los que son requeridos en grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3)
factores de crecimiento que lo son solamente en peque�as cantidades.
Empezaremos por los macronutrientes mayoritarios: carbono y
nitr�geno

Macronutrientes: Pr�cticamente la totalidad de la masa celular est�

formada por sustancias con cuatro tipos de �tomos: Carbono, ox�geno,
hidr�geno y nitr�geno. Estos cuatro elementos constituyen el esqueleto
de las macromol�culas as� como las mol�culas org�nicas peque�as.

La mayor�a de los procariotas requieren un compuesto org�nico de alg�n

tipo como fuente de carbono. Estudios nutricionales han demostrado
que muchas bacterias pueden asimilar varios compuestos de carbono
org�nico y utilizarlos para fabricar material celular. Un incontable
n�mero de compuestos tales como amino�cidos, �cidos grasos, y
compuestos arom�ticos pueden ser usados por una bacteria u otra. En
peso seco, una c�lula t�pica consta de aproximadamente 50% de
carbono y a su vez este es el elemento mayoritario de las
macromol�culas.

Despu�s del carbono, el siguiente elemento m�s abundante en la c�lula

es el nitr�geno. Una bacteria t�pica contiene aproximadamente el 12%
de nitr�geno (peso seco) y a su vez el nitr�geno es un componente
mayoritario de prote�nas, �cidos nucleicos y otros constituyentes
celulares. El nitr�geno se encuentra en la naturaleza tanto en forma
org�nica como inorg�nica. Sin embargo, la globalidad del nitr�geno
utilizable est� en forma inorg�nica, bien como amon�aco (NH3), nitrato
(NH3-) � N2. La mayor�a de las bacterias pueden utilizar amon�aco y
muchas adem�s nitrato. El nitr�geno molecular (gas), sin embargo,
puede ser fuente de nitr�geno para un reducido grupo de bacterias
(bacterias fijadoras de nitr�geno).

Otros macronutrientes: P,S,K,Mg,Ca,Na,Fe

El f�sforo acontece en la naturaleza en forma de fosfatos org�nicos o

inorg�nicos y es requerido por la c�lula para la s�ntesis de �cidos
nucle�cos y fosfol�pidos. El azufre es fundamental por ser un elemento
estructural en los amino�cidos ciste�na y metionina y porque est�
presente en vitaminas tales como la tiamina, biotina, �cido lipoico as�
como coenzima A. El potasio es necesario en todos los organismos. Una
gran diversidad de enzimas, incluyendo varias implicadas en la s�ntesis
de prote�nas, lo requiere espec�ficamente. El magnesio estabiliza los
ribosomas, las membranas celulares, los �cidos nucleicos y se requiere
tambi�n para la actividad de muchas enzimas. El calcio (que no es
nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos),
ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y juega un papel
fundamental en la termorresistencia de la endospora bacteriana. El
sodio es requerido por algunos, pero no todos, microorganismos y
cuando lo es, es debido a la naturaleza qu�mica de su h�bitat. El hierro
es requerido por las c�lulas en mayores cantidades que otros metales
traza y por ellos debe ser considerado como un macronutriente. El
hierro juega un papel fundamental en la respiraci�n celular, siendo un
componente clave de los citocromos, y de las prote�nas que contiene
hierro y azufre implicadas en el transporte de electrones. Debido a que
la mayor parte de las sales inorg�nicas son altamente insolubles,
muchos microorganismos producen agentes que unen el hierro de una
manera muy espec�fica, denominados sider�foros, que solubilizan las
sales de hierro trasport�ndolo al interior celular.

Micronutrientes (elementos traza)

Aunque los micronutrientes son requeridos en muy peque�as

cantidades son, sin embargo, tan importantes como los macronutrientes
para la funci�n celular. Los micronutrientes son metales, muchos de los
cuales forman parte de enzimas que son los catalizadores celulares.
Entre los micronutrientes m�s importantes de sistemas vivos, que son
necesarios para el funcionamiento de enzimas est�n: Cromo, Cobalto,
Cobre, Manganeso, Molibdeno, N�quel, Selenio, Tungsteno, Vanadio,
Zinc, Hierro.

Factores de crecimiento
Estos son compuestos org�nicos que, como los micronutrientes, son
requeridos en muy peque�as cantidades y s�lo por algunas c�lulas. Los
factores de crecimiento incluyen vitaminas, amino�cidos, purinas y
pirimidinas. Aunque la mayor�a de los microorganismos son capaces de
sintetizar estos compuestos, otros microorganismos requieren tomar
uno o m�s compuestos preformados del medio ambiente.

Medios de cultivo

En microbiolog�a industrial se usan dos grandes grupos de medios de

cultivo: Los qu�micamente definidos y los indefinidos (complejos).
Los medios qu�micamente definidos se preparan a�adiendo al agua
destilada cantidades precisas de compuestos org�nicos o inorg�nicos
altamente purificados. Por ellos se conoce la composici�n qu�mica
exacta. En muchos casos, sin embargo, el conocimiento exacto de la
composici�n qu�mica no es cr�tico. En estas ocasiones los medios
complejos pueden ser suficientes, e incluso presentar ventajas sobre los
definidos. Los medios complejos emplean lisados de case�na (prote�na
de la leche), de carne, de soja, de levadura o cualquier otra sustancia
altamente nutritiva (qu�micamente indefinida): Tales lisados est�n
disponibles comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados r�pidamente
y disueltos en agua destilada para dar lugar a un medio. Sin embargo, cuando se
utilizan medio complejos hay que tener en cuenta que no se conoce la
composici�n de nutrientes.

El metabolismo es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el

interior de la c�lula y que da lugar a la s�ntesis de material celular a partir de
sustancias nutritivas.

El metabolismo puede dividirse, para su mejor estudio, en tres aspectos diferentes

pero �ntimamente ligados (figura 1) : el catabolismo (Metabolismos energ�tico) que
es la suma de reacciones exerg�nicas que permiten liberar la energ�a contenida
en los nutrientes o estratos y ser acumulada en forma de ATP u otros compuestos,
el anfibolismo o metabolismo intermediario, que es el conjunto de reacciones en
que los productos de hidr�lisis del catabolismo y algunos nutrientes son
transformados en �cidos org�nicos , esteres fosf�ricos y otros compuestos como
amino�cidos; el anabolismo o metabolismo biosint�tico que es la parte del
metabolismo implicado en la s�ntesis de macromol�culas-�cidos nucleicos,
prote�nas sustancias de reserva y otros . Martinez, 1998: Madigan et al, 1999

Figura 1: Diferentes fases del metabolismo microbiano:

Lecci�n 7: Metabolismo energ�tico

Es tradicional agrupar a los microorganismos en clases metab�licas

dependiendo de la fuente de energ�a que utilicen. Todos los t�rminos
utilizados para describir estas clases emplean la terminaci�n trofo que
deriva del griego y significa �alimentarse�. As�, lo organismos que utiliza
luz como fuente de energ�a se llaman fototrofos (foto es luz en griego) y
los organismos que utilizan productos qu�micos como fuente de energ�a
se denominan quimiotr�fos. La mayor parte de los organismos que
estudia la microbiolog�a utilizan compuestos org�nicos como fuente de
energ�a; pertenecen por tanto a los quimiotr�fos y se denominan
quimiorganotrofos. Los organismos capaces de utilizar compuestos
inorg�nicos como fuente de energ�a se denominan quimiolitotrofos

Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de

reacciones de oxidaci�n � reducci�n que implican compuestos org�nicos,
pueden contemplarse en dos grandes grupos: (1) Fermentaci�n, en
que los procesos de oxido � reducci�n ocurren en ausencia de aceptores
terminales de electrones a�adidos; y (2) respiraci�n, en que el
ox�geno molecular u otros oxidantes sirven como aceptores terminales
de electrones.

Naturaleza de la fermentaci�n:

La fermentaci�n es el mecanismo m�s simple y quiz�s el m�s antiguo

desde el punto de vista evolutivo, de los procesos de obtenci�n de
energ�a. Se suponen que en las condiciones del mundo primitivo, donde
no exist�a ox�geno libre, ni los rayos del sol llegaban a su superficie, los
primero organismos solo pod�an obtener la energ�a a partir de la
contenida en los compuestos org�nicos.

Se puede definir entonces, la fermentaci�n como el proceso metab�lico

de generaci�n de ATP, en el cual los donantes y los aceptores de
electrones son mol�culas org�nicas. (Martinez, J; 1995) Los
compuestos que llevan acabo estas dos funciones son usualmente dos
metabolitos diferentes derivados de un sustrato fermentable simple
(como az�car, por ejemplo). En la fermentaci�n el sustrato da lugar a
una serie de compuestos, unos m�s oxidados y otros m�s reducidos; en
el proceso fermentativo mantiene un estricto balance O-R. El nivel de
oxidaci�n promedio de los productos finales es muy cercano al del
sustrato. De ah� que la generaci�n de ATP asociada a la fermentaci�n se
denomina fosforilaci�n a nivel de sustrato. la fermentaci�n posee tres
caracter�sticas:

1. En la fermentaci�n, tanto donantes como aceptores de electrones

son mol�culas org�nicas; en ocasiones es la misma mol�cula la
que se oxida y se reduce.
2. El proceso ocurre en ausencia de oxigeno
3. Existe un riguroso balance de C, O e H entre los sustratos y los
productos

Un ejemplo de fermentaci�n es el catabolismo de la glucosa por una

bacteria del �cido l�ctico:

2 lactatos +2 H+

Glucosa

(C6H12O6) 2(C3H4O3- + 2CO2)

N�tese que �sta es una reacci�n balanceada y que los productos, lactato
m�s protones, tienen la misma proporci�n de �tomos de hidr�geno y
ox�geno que la glucosa. Esta reacci�n puede analizarse desde tres
puntos de vista: Termodin�micamente, por la energ�a de enlace y por el
metabolismo intermediario.

Desde el punto de vista termodin�mico, las fermentaciones se

caracterizan por ser una suma de reacciones, al final de las cuales los
productos poseen un contenido energ�tico menor que el inicial. Si
analizamos la fermentaci�n a trav�s de la energ�a de enlace, tendremos
que en ella se producen reordenamientos moleculares en los que se
pasa de funciones de mayor contenido a funciones de menor contenido
energ�tico. As�, en la mayor�a de las fermentaciones se pasa de grupos
carbonilo e hidroxilo a grupos carboxilo de menor contenido energ�tico.
Existen tres rutas b�sicas empleadas por los microorganismos para el
aprovechamiento energ�tico de los sustratos.

. La v�a fructosa � difosfato (FDP) tambi�n conocida como glic�lisis

o v�a de Embden-Meyerhof
. La v�a de las pentosas � fosfato (PP) o de Warburg-Dickens
Horecker
. La v�a de Entner-Doudorff p KDPG

Cada una de estas v�as tiene funciones y unidades espec�ficas para los
microorganismos. Las dos primeras v�as son comunes tanto a
organismos respiratorios como fermentativos, procariontes o
eucariontes. La tercera se halla restringida a procariontes. Al existir
diferentes v�as de fermentaci�n se obtienen tambi�n diferentes
productos: Algunos productos derivados de la fermentaci�n se observan
en la siguiente tabla:

Tabla 1. Productos derivados de la fermentaci�n

Tipo de fermentaci�n

Producto(s)

Fermentaci�n l�ctica

Lactato

Fermentaci�n
alcoh�lica

etanol, CO2

Fermentaci�n �cida-
mixta

Etanol, succinato, acetato, formiato,

lactato, CO2, H2

Fermentaci�n
butil�nglic�lica

Butil�nglicol, CO2

Fermentaci�n aceto-
but�rica

Acetato, acetona, butirato, butanol,

etanol, CO2, H2
Fuente: Mart�nez, J. 1995
Naturaleza de la respiraci�n: La respiraci�n es un mecanismo metab�lico
de generaci�n de ATP en el que, a diferencia de la fermentaci�n, sirven
como donantes de electrones tanto compuestos org�nicos como
inorg�nicos (oxid�ndose). Generalmente el aceptor electr�nico final es el
oxigeno molecular. A diferencia de la fermentaci�n, los electrones son
transferidos a trav�s de una cadena transportadora de electrones
al final de la cual existe un aceptor ex�geno oxidado (A), que se reduce.
Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiraci�n aerobia; Si el
aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiraci�n
anaerobia.

En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la direcci�n

de mayor potencial redox positivo, con la consiguiente liberaci�n de
energ�a libre. Como veremos enseguida, esta energ�a libre se va a
traducir en un potencial electroqu�mico de protones, cuya disipaci�n a
trav�s de ATP-asas de membrana origina ATP, conoci�ndose este
proceso como fosforilaci�n oxidativa

Lecci�n 8: Aspectos generales de los procesos bios�nteticos

Diversas reacciones catab�licas producen unidades para la bios�ntesis,

pero otras pueden ser tomadas desde exterior y un tercer grupo de
unidades, al igual que las coenzimas, son el resultado de las v�as
biosint�ticas que han sido denominadas reacciones metab�licas.
Finalmente, en la s�ntesis de macromol�culas los productos mayoritarios
son prote�nas y �cidos nucleicos. Tambi�n son importantes, e incluso
pueden ser mayoritarios otros tipos de mol�culas de gran tama�o, entre
los que se encuentran los polisac�ridos y l�pidos complejos. El tipo de
estructura de estos dos �ltimos variar mucho de un organismo a otro, y
tiene especial inter�s en las bacterias.
La mayor parte de peso seco de la bacteria est� constituidos por
macromol�culas de cuatro tipos: �cidos nucleicos, prote�nas,
polisac�ridos y l�pidos complejos. Estas macromol�culas son pol�meros
formados por unidades estructurales de bajo peso molecular que tiene
que formarse como precursores. Ya sabemos que las subunidades
estructurales de los �cidos nucleicos son 8 tipos distinto de nucle�tidos,
las de las prote�nas 20 amino�cidos diferentes, las de los polisac�ridos,
unos 15 azucares diferentes, y que para la formaci�n de los l�pidos se
requieren �cidos grasos, polialcoholes, az�cares, aminas y amino�cidos
que constituyen tambi�n unos 20 tipos diferentes de mol�culas
org�nicas. Adem�s se requieren sintetizar unas 20 coenzimas y
transportadores de electrones.

Un tipo m�s interesante y bastante m�s complejo de proceso microbiano

industrial es aquel en el que el producto deseado no es producido
durante la primera fase de crecimiento, sino poco despu�s que se inicie
la fase estacionaria. Metabolitos producidos durante la fase estacionaria
son llamados metabolitos secundarios y son algunos de los m�s
comunes e importantes metabolitos de inter�s industrial. Los mejor
conocidos y los m�s extensamente estudiados metabolitos secundarios
son los antibi�ticos. Se han reconocido las siguientes caracter�sticas de
los metabolitos secundarios:

. Cada metabolito secundario se forma �nicamente a partir de

relativamente pocos organismos.
. La formaci�n de metabolitos secundarios es sumamente
dependiente de las condiciones de crecimiento, en particular de la
composici�n del medio. Es frecuente la represi�n de la formaci�n
de metabolitos secundarios.
. Los metabolitos secundarios no son indispensables para el
crecimiento y la reproducci�n.
. Los metabolitos secundarios se suelen producir como un grupo de
sustancias estrechamente relacionadas. Por ej. una sola cepa de
Streptomyces ha llegado a producir 32 antibi�ticos de antraciclina
diferentes, pero relacionados.

Lecci�n 9: Crecimiento Bacteriano

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biol�gico como el

incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese
sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que
eventualmente conduce a la multiplicaci�n celular. En organismos
pluricelulares dicha multiplicaci�n se traduce en un aumento del tama�o
del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisi�n o
por gemaci�n, lo que ocurre es un aumento de la poblaci�n. En los
microorganismos cenoc�ticos (en los que la duplicaci�n del genoma no
se acompa�a de divisi�n celular) el crecimiento se traduce en aumento
de tama�o de la �colonia� cenoc�tica. El crecimiento bacteriano podemos
estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y a escala
poblacional. Para efectos pr�cticos, esta secci�n nos centraremos al
estudio del crecimiento poblacional. El cual en cultivo cerrado atraviesa
por las siguientes fases:

Fases del crecimiento en un sistema cerrado en medio l�quido:

En sistema de producci�n cerrado, en el cual la adici�n de sustancias y

microorganismos solo se realizan al inicio de la fermentaci�n se pueden
identificar 6 fases de crecimiento. (Figura 2)

Figura 2: Curva de crecimiento microbiano

Como se puede constatar en el anterior gr�fico, el crecimiento en un
sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:

1) Fase de latencia: Es el per�odo de tiempo durante el que el inoculo

se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha
sembrado. Se trata de un per�odo de ajuste metab�lico. Su duraci�n
depende de varios factores:

Tama�o del inoculo

Estado fisiol�gico del inoculo:

Si las c�lulas est�n da�adas por alg�n agente, la fase de latencia

tambi�n es larga, ya que necesitan un tiempo para la reparaci�n de los
da�os.

Si las c�lulas del inoculo se tomaron de un cultivo previo en fase

exponencial, la fase de latencia es m�s corta.

Medio de cultivo del que procede el inoculo:

Si el medio es similar al medio fresco, la fase de latencia es m�s

corta; Si el medio del inoculo era un medio rico y el medio fresco es m�s
pobre, la fase de latencia se hace m�s larga, porque las bacterias
necesitan un tiempo adicional para activar la s�ntesis de las enzimas
biosint�ticas que estaban reprimidas en el medio rico.

2) Fase de transici�n, de crecimiento acelerado, que conduce a la

siguiente fase

3) Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase se produce

un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas
generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generaci�n (g)
es caracter�stico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:

El valor del tiempo de generaci�n (g) depende de: composici�n del

medio, temperatura, pH, osmolaridad (tonicidad), etc.

Los microorganismos heter�trofos suelen crecer m�s r�pidamente en los

medios complejos, ricos, que en los medios sint�ticos, y dentro de estos
�ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos
microorganismos tienen, a su temperatura �ptima tiempos de
generaci�n muy cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen
m�s lentamente, con tiempos de generaci�n que pueden ser de varias
horas o incluso d�as.

4) Fase de aceleraci�n negativa, de crecimiento desequilibrado, que

conduce a�

5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente

neto de crecimiento se hace nulo (. = 0), pero a�n existe crecimiento.
Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes
celulares.
En este per�odo se agotan nutrientes especiales y se acumulan
sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse
inadecuado para el crecimiento celular.

Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transici�n (de

aceleraci�n negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va
recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a amino�cidos
como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).

6) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva,

exponencial, del cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energ�a.
Algunas veces las c�lulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas
(formas �fantasmas�, �ghost�). La pendiente de esta parte de la curva
depende de las especies (por ejemplo, en bacterias ent�ricas es suave,
mientras que en Bacillus es m�s acentuada)

Lecci�n 10: Modelos Matem�ticos del crecimiento microbiano

Para muchos prop�sitos en biotecnolog�a microbiana es necesario

conocer el n�mero de generaciones, la poblaci�n de bacterias con el fin
de estimar el estado fisiol�gico de la poblaci�n microbiana y establecer
relaciones con los sustratos del medio de cultivo o los productos de
bios�ntesis.

En los organismos unicelulares la c�lula se divide por fisi�n binaria

dando lugar a dos c�lulas hijas, cada una de las cuales se divide
nuevamente produciendo dos c�lulas nuevas, por lo que en cada periodo
e divisi�n la poblaci�n se duplica. Esta multiplicaci�n representa una
progresi�n geom�trica en la cual hay una relaci�n directa entre el
n�mero de c�lulas iniciales y la cantidad de c�lulas en otro tiempo
determinado. La expresi�n matem�tica que representa esta relaci�n es:
 N = No2n Donde:

N= numero final de c�lulas,

No = n�mero inicial de c�lulas

N = n�mero de generaciones

Para explicar la anterior ecuaci�n en t�rminos de n se aplica una

transformaci�n logar�tmica cuyo resultado es:

El tiempo de generaci�n (G) de la poblaci�n es:

donde,

t = horas o minutos de crecimiento exponencial

Una expresi�n alternativa del crecimiento se deriva de asumir que la

velocidad de incremento en la masa celular o densidad celular (dx/dt)
en un tiempo (t) es proporcional a la densidad celular en dicho tiempo.
Por consiguiente:

de donde:

x = n�mero de c�lulas o alg�n componente (prote�na)constante de

velocidad de crecimiento instant�neo

Integrando se obtiene:

ln X1 �= ln Xo + .t

Tomando el antilogaritmo a cada lado se obtiene

X1 = Xoe..t
Considerando que despu�s de un tiempo la poblaci�n se duplica (td)
entonces:

X1 = 2Xo por tanto, la duplicaci�n de la poblaci�n celular se puede

expresar as�: X1/Xo = 2 reordenando los valores en la pen�ltima
ecuaci�n se obtiene:

2 = e..t
aplicando antilogaritmo a cada lado se obtiene:

Entonces:

. = 0.693/td

Ejemplo explicativo:

A continuaci�n se muestran los datos de un experimento de crecimiento bacteriano de

E. colli el
cual se realizo durante 5 horas. El numero de celulas fue cuantificado por unidades
formadoras de
colonia por cajas petri. Con los datos de la tabla calcular el numero de
generaciones, el tiempo
generacional y la velocidad especifica de crecimiento (�).

Debido a que el crecimiento bacteriano es una progresi�n geom�trica, existe una

relaci�n directa
entre el n�mero de c�lulas presente en el momento inicial y el habido en un momento
determinado
del crecimiento exponencial de modo que:

N= N2n

Donde N = n�mero final de c�lulas, No= n�mero inicial de c�lulas y n = numero de

generaciones,
por tanto despejando la ecuaciones anteriores tenemos que:

n= ( logN-logNo) / log 2
n =( log N � log No ) / 0,301; remplazando tenemos
n= log 108 � log (2 x 107 ) / 0.301, resolviendo :

n= (8 � 7,301) /0,301

n = 2,32

G = t/n

G= 5hr/2.32 generaciones

G= 2.15 horas

....ln 2 /td

..= 0.693/td

....0.6931/ 2.15

....0.3223.

Una aplicaci�n especialmente importante de la constante de velocidad

instant�nea, es el quimiostato, el cual es un dispositivo de cultivo
continuo donde el Volumen es constante y el nutriente entra con la
misma velocidad con la que sale. En este equipo el tama�o de la
poblaci�n y la velocidad de crecimiento pueden mantenerse constantes,
puesto que la velocidad de crecimiento es una funci�n de la
concentraci�n de nutrientes. Monod propuesto la siguiente ecuaci�n
para representar esta relaci�n:

Donde �m�x. es la velocidad de crecimiento a saturaci�n de nutriente, S

es la concentraci�n de nutriente, y K es una constante de saturaci�n
que es num�ricamente igual a la concentraci�n de nutriente a la que
�= � de �max La ecuaci�n anterior es formalmente equivalente a la
ecuaci�n de Michaelis- Mente usada en el an�lisis de la cin�tica
enzim�tica. La determinaci�n de los par�metros desconocidos �max y Ks
se puede hacer representando 1/sobre el eje y frente a 1/S sobre el eje
X. Se obtendr� una l�nea recta que corta al eje Y, y el valor en el punto
de intervenciones 1/ �max .La pendiente de la recta es Ks/m�x y como se
conoce m�x se puede calcular Ks. En general los valores de Ks son muy
bajos.

Capitulo 3: SISTEMAS DE FERMENTACI�N

Lecci�n 11: Tipos de fermentaci�n

1) Fermentaci�n discontinua Una fermentaci�n discontinua (en

�batch�) puede ser considerada como un sistema cerrado. A tiempo
cero t = 0, la soluci�n esterilizada de nutrientes se inocula con
microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubaci�n en con-
diciones �ptimas de fermentaci�n. A lo largo de toda la fermentaci�n no
se a�ade nada, excepto ox�geno (en forma de aire), un agente antiespu-
mante y �cidos o bases para controlar el pH. La composici�n del medio
de cultivo, la concentraci�n de la biomasa y la concentraci�n de
metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado del
metabolismo de las c�lulas. Despu�s de la inoculaci�n de una soluci�n
nutritiva est�ril con microorganismos y su cultivo en condiciones
fisiol�gicas se observan cuatro fases t�picas de crecimiento: fase de
latencia, fase logar�tmica, fase estacionaria y fase de muerte

2) Proceso de fermentaci�n alimentada (fed-batch)

En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir,

todos los substratos se a�aden al principio de la fermentaci�n. Una
mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentaci�n alimentada,
que se utiliza en la producci�n de substancias como la penicilina. En los
procesos alimentados los substratos se a�aden escalonadamente a
medida que progresa la fermentaci�n. La formaci�n de muchos
metabolitos secundarios est� sometida a represi�n catab�lica por altas
concentraciones de glucosa, por otros carbohidratos, o por compuestos
nitrogenados. Por esta raz�n en el m�todo alimentado los elementos
cr�ticos de la soluci�n de nutrientes se a�aden en peque�as
concentraciones al principio de la fermentaci�n y contin�an a�adi�ndose
a peque�as dosis durante la fase de producci�n.

Puesto que generalmente no es posible medir la concentraci�n del

substrato directa y continuamente durante la fermentaci�n a fin de
controlar el proceso de alimentaci�n, tienen que ser medidos
par�metros indirectos que est�n correlacionados con el metabolismo del
substrato cr�tico. Por ejemplo, en la producci�n de �cidos org�nicos, el
valor del pH puede ser utilizado para determinar la velocidad de
alimentaci�n de la glucosa. En fermentaciones con valores osm�ticos
cr�ticos la alimentaci�n puede ser regulada controlando el valor de pO2 o
el contenido en CO2, en los gases que se liberan.

3) Fermentaci�n continua.

En la fermentaci�n continua se establece un sistema abierto. La soluci�n

nutritiva est�ril se a�ade continuamente al biorreactor y una cantidad
equivalente de soluci�n utilizada de los nutrientes, con los
microorganismos, se saca simult�neamente del sistema. Entre las
distintas clases de fermentaciones continuas pueden ser distinguidos
dos tipos b�sicos:

a. Birreactor mezclado homog�neamente. Este es utilizado como

un quimiostato o como un turbidostato. En el quimiostato en
estado de equilibrio, el crecimiento de las c�lulas se controla
ajustando la concentraci�n de un substrato (Fig. 3.A). cualquier
substrato que se requiera (carbohidrato, compuesto nitrogenado,
sales, a,) puede ser utilizado como substrato limitante. En el
turbidostato el crecimiento de las c�lulas se mantiene constante
utilizando la turbidez para controlar la concentraci�n de biomasa y
la velocidad de alimentaci�n de la soluci�n de nutrientes se ajusta
de forma apropiada (Fig. 3).

Figura 3: Fermentaci�n continua en quimiostato A), Turbidostato B) y Fermentador de

flujo de
tap�n

Fuente: Crueger y Crueger, Manual de Microbiolog�a industrial. 1993

b. Reactor de flujo de tap�n. En este tipo de fermentaci�n continua la

soluci�n de cultivo fluye a trav�s de un reactor tubular sin mezclado. La
composici�n de la soluci�n de nutrientes, el n�mero de c�lulas, la
transferencia de masa (suministro de O2) y la productividad var�an en
distintas posiciones dentro del sistema (Fig. 3C). A la entrada del
reactor las c�lulas deben a�adirse continuamente junto con la soluci�n
de nutrientes (generalmente como un flujo que revierte de una
desviaci�n desde la salida del fermentador o desde una segunda
fermentaci�n continua).

En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la p�rdida de c�lulas

debida al fluido que sale debe ser balanceada por el crecimiento del
microorganismo

La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volum�trico

(que entra y sale) a trav�s del volumen del fermentador.

Utilizando la ecuaci�n de Monod que describe la dependencia de la

velocidad espec�fica de crecimiento sobre la concentraci�n de substrato
limitante pueden ser determinados en el biorreactor la constante de
rendimiento biomasa/substrato (Y X/S), la densidad de las c�lulas (X) y
la concentraci�n de substrato (S).

A velocidad m�s baja de flujo el substrato es casi completamente

agotado por las c�lulas (S . O). La concentraci�n de c�lulas es
entonces X = So/Y. Si D aumenta, X desciende lentamente, al principio
en forma lineal y luego a D = �m cae bruscamente hasta O. S aumenta
lentamente al principio y se aproxima a So a D = �m. Cuando X es cero
en la ecuaci�n que explica el sustrato (S), se alcanza el punto de lavado
Dm.

Por encima de Dm no es posible un estado de equilibrio. Si la velocidad

de flujo es s�lo ligeramente m�s baja que D" el sistema es muy sensible
a las influencias externas. Peque�as desviaciones en la alimentaci�n
pueden originar cambios extremos en la biomasa o en la separaci�n de
las c�lulas. La Figura 4 muestra la interdependencia de la velocidad de
flujo, la concentraci�n de substrato, la concentraci�n de c�lulas y la
velocidad de formaci�n de c�lulas (�m = 1 h-1 Ks = 0,2 g/l Y = 0,5).

Figura 4. Efecto de la velocidad de flujo sobre la concentraci�n de substrato (5),

la
concentraci�n de c�lulas (X). Tiempo de duplicaci�n (1,) y velocidad de
fermentaci�n
de c�lulas (D * X)

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiolog�a industrial

La velocidad espec�fica m�xima de crecimiento en los procesos

industriales se escoge de forma que se obtenga el rendimiento m�s alto
en el volumen m�s peque�o de fermentador y en el tiempo m�s corto.
El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentaci�n
continua a velocidades muy bajas o muy altas de diluci�n. A velocidades
medias de diluci�n la relaci�n molar entre la biomasa producida y el CO2
que se desprende es constante. A bajas velocidades de diluci�n la
proporci�n de CO2 se hace m�s grande. Esto se debe a que se utiliza
m�s fuente de energ�a para el mantenimiento de la estructura celular,
para la regulaci�n osm�tica o para la motilidad. Por otra parte, a
velocidades altas de flujo una parte del carbono a�adido es oxidado
incompletamente (a productos como piruvato, acetato o �cidos
tricarbox�licos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas
velocidades de flujo, con nitr�geno como substrato limitan te, se forman
materiales de reserva, como polisac�ridos, lo que resulta en un aumento
en el tama�o de la c�lula y por tanto de la biomasa.

Lecci�n 12: Productividad y velocidad espec�fica de producci�n

La productividad de una fermentaci�n se define como

Productividad P = Concentraci�n de producto / I = unidades

Tiempo de fermentaci�n h x L

Para evaluar la econom�a de un proceso deben ser considerados varios

factores, el tiempo de producci�n de la fermentaci�n, el tiempo
requerido para limpiar y poner a punto el fermentador, el tiempo de
esterilizaci�n y la duraci�n de la fase de latencia. En la Figura 5 la
pendiente de la tangente de la curva de formaci�n del producto es una
medida de la productividad m�xima y la pendiente de la l�nea recta, al
final de la curva de formaci�n de producto, indica la productividad total.

Que el proceso de fermentaci�n termine al tiempo de la productividad

m�xima o m�s tarde depende de los costes de operaci�n, que incluyen
la energ�a, gastos generales, costes de mano de obra, gastos en
personal y la capacidad del sistema. Utilizando una gr�fica como la de la
Figura 5 se puede hacer una estimaci�n de como optimizar el proceso.
En fermentaciones a tiempo corto (8-70 h) el tiempo para la puesta a
punto es significativo, mientras que en fermentaciones largas (>3 d�as)
el tiempo de puesta a punto es menos crucial.
Las condiciones de fermentaci�n afectan directamente la productividad.
La Figura 6 muestra la productividad de un proceso para la obtenci�n de
prote�na de origen unicelular en relaci�n al contenido del substrato
(hidrocarburo). Existe un aumento lineal de [a productividad a medida
que el contenido del substrato aumenta, hasta que se alcanza la
concentraci�n a la que el hidrocarburo se convierte en la fase continua
(aceite y agua no son miscibles). Por encima de esta concentraci�n la
productividad decrece.

Figura 5. Productividad total y productividad m�xima

Fuente: Crueger y Crueger, Manual de Microbiolog�a industrial. 1993

En fermentaciones continuas la productividad puede ser expresada

como:

P = D * X (g/l *h)

Cuando se utiliza la relaci�n de la ecuaci�n sobre sustrato (S) resulta la

siguiente ecuaci�n

P=D*Yx/y (S0 � D*Ks/�m-D)

Figura 6. Productividad en relaci�n a la concentraci�n de �cidos grasos en un

proceso
de producci�n de prote�na de origen unicelular.
Fuente: Crueger y Crueger, Manual de Microbiolog�a industrial. 1993

En fermentaciones continuas la productividad m�xima es igual a la

productividad total ya que el tiempo de establecimiento y la fase de
latencia pueden ser despreciados. Por ejemplo, si el tiempo inicial de
puesta a punto requiere 24 h Y la propia fermentaci�n continua funciona
durante 24 horas con una velocidad de flujo de O,1 h-l, 24 h con 0,15 h-
l Y al menos 72 h con 0,2 h-l, la productividad total para el producto X
se calcula como se muestra en la Tabl

Tabla 2:
Productividad total de una fermentaci�n

Periodo de
tiempo: h

Velocidad de flujo
: h-1

Productividad
total X(g/l). D(h-1)

0-24

Discontinuo

--

24-48

0,1

X .0,05
48-72

0,15

X.0,08

>72

0,2

300

0,2

X.0,171

1000

0,2

X.0,191

5000

0,2

X.0,198

Fuente: Cruger y Cruger. Manual de Microbiolog�a industrial. 1993

La velocidad espec�fica de producci�n qp deriva de la ecuaci�n 1 de la

siguiente forma:
El valor P1 es la concentraci�n de producto y la velocidad espec�fica de
producci�n qp es equivalente a la velocidad espec�fica de crecimiento �
en la ecuaci�n 1. Sin embargo, en los procesos de tipos II y IlI no hay
correlaci�n directa entre � y qp

Lecci�n 13: Coeficientes de rendimiento

Monod defini� originalmente el coeficiente de rendimiento Y como la

relaci�n de c�lulas producidas a substrato consumido:

Hoy los coeficientes generales de rendimiento se utilizan para

caracterizar los procesos de fermentaci�n, es decir las relaciones de las
c�lulas producidas a los substratos individuales convertidos o a la
energ�a liberada o energ�a consumida. Sin embargo, los coeficientes de
rendimiento no son constantes, ya que dependen de par�metros
biol�gicos (X, �) y de par�metros qu�micos (pO2 relaci�n C/N, y
contenido en f�sforo del medio.

Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos. El

primer grupo de coeficientes (Ys Y02 Ykcal) da informaci�n acerca de los
procesos t�cnicos y por tanto acerca de la econom�a. El segundo grupo
(Yc Yp YN Yave) describe el catabolismo, anfibolismo y anabolismo.

El tercer grupo incluye YATP un coeficiente que describe las relaciones de

energ�a de las c�lulas (Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores
utilizan otros coeficientes de rendimiento que deben ser propiamente
designados, como muestra:

Lecci�n 14: Biorreactores

Como ya se dijo, el equipo donde se realiza el proceso se denomina

biorreactor o fermentados. El mismo provee todos los servicios que son
necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatizaci�n,
suministro de ox�geno, entradas para adici�n de nutrientes, control del
pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o,
tambi�n, m�todos de cultivo, se hace referencia al modo de operar el
biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. En esta fase nos
ocuparemos de los birreactores.
El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la
microbiolog�a industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su
dise�o debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para
los microorganismos. Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden
resumirse del siguiente modo:

. Mantener las c�lulas uniformemente distribuidas en todo el

volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentaci�n o la
flotaci�n.
. Mantener constante y homog�nea la temperatura.
. Minimizar los gradientes de concentraci�n de nutrientes.
. Suministrar ox�geno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
. El dise�o debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una
vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente
sembrado con el microorganismo deseado.

Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el

biorreactor est� provisto de un sistema de agitaci�n, a dem�s para el
punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el cultivo.

Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy

difundido: el tanque �agitado� y al "air lift". En el primero de ellos
(Figura 7) la agitaci�n se realiza mec�nicamente mediante un eje
provisto de turbinas accionado por un motor.
Figura 7. Esquema de un reactor aerobio con agitaci�n mec�nica

Fuente: De Chisti y Moo-Young, 1993

El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una
corona que posee peque�os orificios espaciados regularmente. El chorro
de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la
turbina inferior gener�ndose de este modo miles de peque�as burbujas
de aire, desde las cuales difunde el O2 hacia el seno del l�quido. El
sistema de agitaci�n se completa con cuatro o seis deflectores que
tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que
imprimen las turbinas al l�quido, generando de este modo mayor
turbulencia y mejor mezclado. El tanque est� rodeado por una camisa
por la que circula agua, lo que permite controlar la temperatura. Para
tanques mayores que 1000 � 2000 litros este sistema ya no es eficiente
y es reemplazado por un serpent�n que circula adyacente a la pared
interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a medida que es mayor
el volumen de cultivo tambi�n lo es la cantidad de calor generado, por lo
que se hace necesario una mayor �rea de refrigeraci�n. Los tanques son
de acero inoxidable y est�n pulidos a fin de facilitar la limpieza y
posterior esterilizaci�n.

Figura 8. Esquema de un reactor tipo Air lift.

Fuente: De Chisti y Moo-Young, 1993

El aire que ingresa al biorreactor debe estar est�ril, lo que se consigue

haci�ndolo pasar por un filtro cuyo di�metro de poro es de 0,45
micrones, que impide el paso de microorganismos y esporas. En los
reactores de tipo "air lift" (Figura 8) es el mismo aire inyectado al cultivo
lo que promueve la agitaci�n. B�sicamente consiste en dos cilindros
conc�ntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior, se
inyecta aire. De este modo se genera una circulaci�n de l�quido
ascendente en el comportamiento interno y descendiente en el externo,
lo que favorece el mezclado.
Lecci�n 15: Transferencia de O2 y Fermentaci�n en gran escala.

La velocidad de transferencia de 02, R02, desde el seno de la fase

gaseosa (burbujas) hasta la fase l�quida est� dada por la siguiente
ecuaci�n:

Donde KLa es el coeficiente volum�trico de transferencia de ox�geno, C

la concentraci�n de 02 disuelto en el seno del l�quido y C* la
concentraci�n de 02 disuelto que estar�a en equilibrio con la presi�n
parcial de ox�geno de la fase gaseosa. El KLa depende del dise�o del
biorreactor, de las condiciones de operaci�n (caudal de aire, agitaci�n) y
de la viscosidad del cultivo. A mayor viscosidad menor K La. El KLa es
una medida de la capacidad que posee un biorreactor para sum�nistrar
O2 y el rango de valores usuales est� comprendido entre 50 h-1 y 1000
h.

Es �til en este punto retomar el ejemplo visto al final del y calcular el

KLa necesario para que la velocidad de transferencia de 02 sea igual a la
de consumo; esto significa que R02 deber� ser igual a 1,526 mg 1-1 h-
1. Asumiendo que C* = 7,8 mg 1 -1 y C = 0,5 mg 1 -1, resulta Por
tanto valores de KLa iguales o superiores al calculado asegurar�n, que el
cultivo no est� limitado por 02. Cuando la velocidad de consumo del
ox�geno var�a con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo
"batch", el c�lculo de KLa necesario se realiza empleando el m�ximo
valor de RO2 esperado, a fin de asegurar un adecuado suministro de 02
durante todo el cultivo.
Caracter�sticas de la Fermentaci�n en gran escala.

El fermentador donde se lleva a cabo los procesos industriales pueden

variar en tama�o de la escala peque�a de laboratorio 5-10 litros a la
enorme escala industrial de 400.000 litros. Las dimensiones dependen
del proceso y de c�mo opera. Los procesos manejados en lote o batch
requieren fermentadores m�s grandes que los manejados en forma
continua o semicontinua.

Tabla 3. Tama�o de fermentadores para varios procesos

Tama�o del fermentador

(litros)

Producto

1-20.000

Enzimas para diagn�stico,

sustancias para biolog�a
molecular

40-80.000

Algunas enzimas, antibi�ticos

100- 150.000

Penicilina, antibi�ticos amino-

glic�sidos, proteasas, amilasas,
transformaciones de esteroides,
amino �cidos

450.000

Amino �cidos ( �cido glut�mico)

Fuente: Cruger y Cruger. Manual de Microbiolog�a industrial. 1993

11.1 Control y monitoreo del proceso.

Debido a los elevados costos de producci�n, los fermentadores

industriales est�n cuidadosamente controlados. No solo se necesita
controlar el crecimiento y la formaci�n del producto, sino que se deben
controlar otros factores ambientales a medida que el proceso se efect�a.
Los factores ambientales controlados m�s frecuentemente son: la
concentraci�n de ox�geno, pH, masa celular y concentraci�n del
producto. Tambi�n es necesario en muchos casos controlar la espuma
dentro del fermentador y ajustar la temperatura. En la actualidad se
utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentaci�n ya
sea en la obtenci�n de datos que reflejen los cambios que tienen lugar
durante el proceso de fermentaci�n o en el control de varios factores
ambientales que se deben ajustar o alterar durante la fermentaci�n. La
obtenci�n de datos a medida que el proceso de fermentaci�n tiene lugar
se llama adquisici�n inmediata y tiene un valor especial cuando estos
datos se puedan procesar para convertirlos en cifras que puedan
interpretarse en t�rminos microbiol�gicos o bioqu�micos. Las
computadoras tambi�n permiten graficar los datos obtenidos
permitiendo al operador del fermentador tener una representaci�n visual
del progreso de la fermentaci�n. Finalmente la computadora nos permite
almacenar los datos en forma legible de modo que estos datos se
puedan traducir a otro sistema, o analizar en forma mas sofisticada.

Un uso m�s sofisticado de las computadoras es el control inmediato del

proceso de fermentaci�n por ej. cambiando los par�metros ambientales
a medida que la fermentaci�n progresa o agregando un nutriente a la
velocidad de equilibrio exacto del crecimiento, en esta forma el nutriente
es a�adido cuando se necesita evitando en algunos casos que el mismo
sea metabolizado a productos indeseables.
Finalmente, las computadoras pueden ayudar a modular los procesos de
fermentaci�n, para ello se debe desarrollar un modelo matem�tico del
proceso de fermentaci�n, el cual incorpora ecuaciones diferenciales para
describir el crecimiento microbiano y la formaci�n del producto. El valor
del uso de una computadora para modelar el proceso de fermentaci�n
es que se puede ensayar el efecto de varios par�metros sobre el
crecimiento y sobre la formaci�n del producto en forma r�pida e
interactivamente, y entonces hacer modificaciones en los par�metros
para ver como afectan al proceso. De esta forma se pueden estudiar con
gran econom�a muchas variaciones de la fermentaci�n en la Terminal de
la computadora y no en forma m�s costosa en la planta piloto o en la
planta industrial.

Escalamiento del proceso de fermentaci�n. Uno de los aspectos

m�s importantes y complicados de la microbiolog�a industrial es la
transferencia de un proceso del equipo de laboratorio a peque�a escala,
al equipo comercial a gran escala, procedimiento que se llama
escalamiento. Es sumamente importante comprender los problemas del
escalamiento ya que es raro que un proceso microbiano se comporte de
la misma forma en fermentadores a gran escala que en un equipo de
laboratorio a peque�a escala. La mezcla y la aireaci�n son mucho m�s
eficientes en el matraz de laboratorio peque�o que en el fermentador
industrial grande. A medida que cambia el tama�o del equipo, cambia la
relaci�n superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho
mayor para un �rea superficial determinada. Como la transferencia del
gas y la mezcla dependen de la superficie expuesta m�s que del
volumen del fermentador, es obvio que sea m�s dif�cil mezclar el
contenido del tanque grande que del matraz peque�o. Como la mayor
parte de las fermentaciones industriales son aer�bicas, es indispensable
una transferencia efectiva del oxigeno. Con el medio de cultivo rico que
se utiliza en los procesos industriales se obtiene una alta biomasa, que
origina una gran demanda de oxigeno. Si se reduce la aireaci�n, aun
durante un periodo corto, el cultivo puede experimentar una
anaerobiosis parcial, con serias consecuencias en t�rminos de
rendimiento del producto.

El escalamiento en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero

bioqu�mico, quien esta familiarizado con la transferencia de gases, la
din�mica de fluidos y la termodin�mica. El papel del microbi�logo
industrial en el proceso de escalamiento es trabajar estrechamente con
el ingeniero bioqu�mico para asegurar que se han abarcado los
par�metros necesarios para una fermentaci�n exitosa y que se dispone
de las cepas microbianas apropiadas para una fermentaci�n en gran
escala.

Las distintas etapas que deben realizarse para llegar de un proceso de

laboratorio a un proceso industrial son las siguientes:

1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la

primera indicaci�n que es posible un proceso de inter�s industrial.

2) El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala peque�a,

generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el
fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio
de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos tanto
en el equipo como en los medios de cultivo.

3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de

300 a 3000 litros. Aqu� las condiciones se acercan mas a la escala
industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el
fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa
instrumentaci�n y un control con computadora, de modo que las
condiciones que se obtengan sean lo m�s similares a las del
fermentador industrial.
Actividades:

Investigue en su localidad los sustratos o subproductos que pueden

utilizarse como fuente de Carbono, nitr�geno y f�sforo. Enuncie sus
caracter�sticas relacionadas en cuanto a producci�n mensual del
sustrato, estabilidad del sustrato y concentraci�n de los nutrientes.

Investiga sobre m�todos de cuantificaci�n del crecimiento microbiano,

realiza un foro con tus compa�eros y compara las diferentes t�cnicas.

Establece las ventajas e inconvenientes de la producci�n de metabolitos

intracelulares con los metabolitos extracelulares.

Bibliograf�a:

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Organizaci�n de Estados Am�ricanos, OEA. Biotecnolog�a. 2002

UNIDAD 2

CAPITULO CUATRO : BIOTECNOLOG�A ENZIM�TICA

Lecci�n 16 : Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica

Lecci�n 17: Naturaleza de las enzimas

Lecci�n 18: Clasificaci�n de enzimas seg�n la naturaleza de la reacci�n y

cofactores

Lecci�n 19: Cin�tica enzim�tica

Lecci�n 20: Producci�n de enzimas

CAPITULO CINCO : PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA

BIOTECNOLOG�A

Lecci�n 21: T�cnicas utilizadas en la manipulaci�n gen�tica in vitro.

Lecci�n 22: Tecnolog�a del ADN recombinante

Lecci�n 23: La reacci�n en cadena de polimerasa ( PCR)

Lecci�n 24: Muta g�nesis , Muta g�nesis dirigida por oligonucle�tidos

Lecci�n 25: Muta g�nesis en casette o interrupci�n g�nica

CAPITULO SEIS : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE EN LA

INDUSTRIA ALIMENTARIA

Lecci�n 26: Animales transg�nicos

Lecci�n 27: Plantas Transg�nicas

Lecci�n 28: Alimentos gen�ticamente modificados

Lecci�n 29: Alimentos funcionales

Lecci�n 30: Prebi�ticos

UNIDAD 2: BIOCATALISIS E INGENIER�A GEN�TICA APLICADA A
LA BIOTECNOLOG�A

INTRODUCCI�N: La siguiente unidad ha sido dividida en tres

cap�tulos: en el primero, se pretende que los estudiantes se apropien del
concepto de biocat�lisis, los fundamentos b�sicos que caracterizan esta
disciplina para luego identificarlos y diferenciarlos de otros procesos. En
el segundo cap�tulo, se pretende que los estudiantes a trav�s del
conocimiento b�sico de biolog�a molecular sean capaces de identificar
los procesos biol�gicos ambiente para que la respuesta celular sea la
m�s eficiente para la obtenci�n de productos y o servicios en la industria
alimentaria. Por �ltimo en el tercer cap�tulo se hace un an�lisis del
impacto de la utilizaci�n de estas t�cnicas en la Industria alimentaria.

Objetivos

Consolidar conceptos de Biolog�a molecular esenciales para

aproximarse y comprender las transformaciones gen�ticas en
los seres vivos que se pueden traducir en la obtenci�n de
nuevos alimentos � mejoramiento de procesos de inter�s en la
industria alimentaria. *
*
Adquirir bases te�ricas que respaldan los procesos de ingenier�a
gen�tica aplicada a la industria alimenticia.
*
Analizar y discutir las oportunidades y desventajas que ofrece
la Biotecnolog�a en la alimentaci�n mundial
*
Obtener una visi�n hol�stica del debate que se ha planteado a
cerca de las ventajas y desventajas sobre la introducci�n de
alimentos transg�nicos en la alimentaci�n mundial.

Capitulo CUATRO: BIOTECNOLOG�A ENZIM�TICA

Lecci�n 16: Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica

El choque entre dos mol�culas produce energ�a que puede ser absorbida
por las mol�culas mismas, o puede ser disipada bajo forma de calor en
el medio.

Si la energ�a absorbida por el substrato (S) es suficiente para franquear

la barrera de potencial, llamada energ�a de activaci�n, el substrato se
puede transformar y conducir a la formaci�n de un producto (P), es
decir llegar a un estado final, diferente del estado inicial.

Esta energ�a de activaci�n generalmente es elevada y no es compatible

con las condiciones del medio en el cual se deben desarrollar las
reacciones del metabolismo de los organismos vivientes: pH vecino de la
neutralidad, temperatura comprendida entre O y 40�C, presi�n vecina a
la presi�n atmosf�rica. Por tanto, la realizaci�n de esas reacciones
necesita de catalizadores bioqu�micos, las enzimas cuya acci�n consiste,
como la de todo catalizador abatir la energ�a de activaci�n lo que tiene

por efecto acelerar la reacci�n, cuya velocidad se encuentra multiplicada

por un factor del orden de 1012-1020.

Al final de cada ciclo de reacci�n, la enzima permanece inalterada.

E + S ES E + P

Las enzimas son pues, catalizadores biol�gicos de naturaleza prot�dica

que intervienen en todas las reacciones metab�licas energ�ticamente
posibles, que ellas aceleran por activaci�n espec�fica. Permiten alcanzar
r�pidamente el estado de equilibrio de la reacci�n sin modificarlo. Son
las llaves �tiles de la biotecnolog�a y de la bioindustria. Son ellas las que
en la ingenier�a microbiol�gica, catalizan las reacciones metab�licas
puestas en juego y aseguran su regulaci�n. Son ellas igualmente las que
conducen la ingenier�a gen�tica para realizar las modificaciones del
equipamiento enzim�tico de ciertos microorganismos con vista a
hacerlos aptos para la bios�ntesis de metabolitos interesantes

El conocimiento de las enzimas, de su naturaleza y de sus propiedades,

as� como de la cin�tica de las reacciones que catalizan es fundamental
en biotecnolog�a

Lecci�n 17: Naturaleza de las enzimas

Todas ellas son macromol�culas que corresponden a la clase de las

prote�nas globulares. Algunas son holoprote�nas constituidas �nicamente
por un encadenamiento de �cidos aminados; otras son heteroprote�nas,
que poseen una parte no prote�nica, el cofactor, necesario para la
actividad catal�tica y asociado m�s o menos fuertemente a la prote�na.

Especificidad de la cat�lisis enzim�tica sitio activo:

Una de las caracter�sticas m�s importantes de la cat�lisis enzim�tica
reside en su especificidad, mucho m�s marcada que la especificidad de
la cat�lisis qu�mica.

Esta especificidad presenta un doble aspecto:

. Especificidad de reacci�n. Una enzima no puede catalizar sino un

solo tipo de reacci�n, por ejemplo: hidr�lisis de enlaces
glucos�dicos o hidr�lisis de enlaces �steres (lip�lisis), etc. Esta
especificidad sirve de base a la clasificaci�n de estos catalizadores
bioqu�micos.
. Especificidad en cuanto al substrato. Esta propiedad resulta
delhecho, plenamente establecido, de que toda reacci�n
enzim�tica implica la fijaci�n del substrato en puntos bien precisos
de la prote�na enzim�tica. Esta fijaci�n se hace por el
establecimiento de enlaces de tipo del de hidr�geno, hidr�fobos o
de Van der Waals.

La conformaci�n de la prote�na enzim�tica es tal, que no reconoce sino

un tipo de substrato. Ciertas enzimas presentan una especificidad
estricta y son capaces de asociarse a un �nico substrato; �ste es el caso
de la fumarasa (EC. 4.2.1.2) que transforma el L-malato en fumarato y
que no tiene acci�n sobre el D-malato o sobre ning�n otro compuesto
relacionado. Otras enzimas, por el contrario, se pueden fijar a
substratos diferentes, pero de la misma naturaleza y provocar un mismo
tipo de reacci�n qu�mica.

La enzima, despu�s de haber fijado el substrato, lo transforma en

seguida. Para esto, su estructura espacial es tal, que en la vecindad y a
las distancias adecuadas se encuentran grupos funcionales en donde las
acciones diferentes y complementarias realizan la reacci�n. La peque�a
porci�n de la enzima, implicada en la fijaci�n y posicionamiento del
substrato, as� como en la reacci�n de cat�lisis, delimita un volumen
denominado "sitio activo".

En las enzimas holoprote�nicas, �stos son principalmente los

agrupamientos funcionales libres situados en los radicales de algunos
�cidos aminados que intervienen al nivel del sitio activo (funci�n OH de
la serina, n�cleo imidazol de la histidina, funci�n fenol de la tirosina,
funci�n COOH de los �cidos asp�rtico o glut�mico, funci�n tiol de la
ciste�na).
En lo que concierne a las enzimas del tipo heteroprote�nico, la fijaci�n
al substrato se hace sobre la parte prote�nica, la apoenzima, mientras
que la cat�lisis de la reacci�n es hecha por la parte no prote�nica, el
grupo prost�tico o el cosubstrato.

La parte "apoenzima" de la mol�cula enzim�tica que lleva el sitio de

fijaci�n al substrato es por consiguiente responsable de la especificidad
en cuanto al substrato de esa enzima. Pero tambi�n puede intervenir en
la especificidad de la reacci�n e inducir un tipo particular de reacci�n.
As� es, por ejemplo, que en el metabolismo de los �cidos aminados, el
fosfato depiridoxal puede, de acuerdo a la apoenzima con la cual est�
combinado, catalizar reacciones, sean de transaminaci�n, sean de
descarboxilaci�n, de desaminaci�n, o de racemizaci�n.

La actividad de las enzimas es funci�n directa de su estructura terciaria

o de la cuaternaria. En estas condiciones, todo tratamiento que
modifique la conformaci�n de la enzima (calentamiento, modificaci�n del
pH), es decir estorbando o impidiendo, la fijaci�n del substrato a la
enzima o cambiando la estructura del sitio activo, alterar� las
propiedades catal�ticas de la enzima y por tanto su funci�n.

Gr�fico 9: Enzimas complejos

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php

Lecci�n 18: Clasificaci�n de enzimas seg�n la naturaleza de

reacci�n y cofactores

Las enzimas heteroprote�nicas utilizan diversos tipos de cofactores:

algunos son iones met�licos (Mg++, Fe++, eu++, Mo+++, Zn++), Fig.
otros cofactores son org�nicos (heme, nicotinamida, flavina, coenzima
A, fosfato de piridoxal, tiamina, etc.). Este tipo de enzima adopta
diversas formas de funcionamiento, lo que con frecuencia entra�a una
confusi�n en la terminolog�a de estos cofactores. En efecto, algunos
est�n combinados fuertemente a la apoenzima por intermedio de enlace
covalente; son parte integrante de la enzima y no se le separan: se les
designa con el nombre de grupos prost�ticos. Otros, por el contrario,
son co-substratos; se fijan en un primer tiempo sobre la apoenzima,
provocando la transformaci�n del substrato sufriendo una modificaci�n
en su estructura qu�mica; despu�s se separan de la apoenzima: se les
denomina coenzimas. Regresan a su estado inicial en el transcurso de
una segunda etapa enzim�tica fij�ndose sobre otra apoenzima.

Para ilustrar esta distinci�n, tomemos el caso de dos enzimas responsa-

bles de la oxidaci�n de �cidos aminados: la L-amino�cido-oxidasa y la
glutamato deshidrogenada.

La primera (EC. 1.4.3.2) es una flavoprote�na en la cual el cofactor, la

flavina adenosina dinucle�tido (FAD) se comporta como un grupo
prost�tico. Permaneciendo fija a la apoenzima provoca la oxidaci�n por
deshidrogenaci�n y desaminaci�n del �cido aminado y se reduce a F
ADH:z. La enzima regresa a su estado inicial cediendo los dos
hidr�genos, fijados transitoriamente, a un segundo substrato, oxidante
m�s potente, que provoca la reoxidaci�n del F ADH:z a F AD.

A la inversa, la glutamato deshidrogenasa (EC. 1.4.1.2) cataliza una

reacci�n del mismo tipo, la oxidaci�n del �cido glut�mico a �cido 2-
oxoglut�rico con ayuda de la coenzima nicotinamida adenina
dinucle�tido (NAD). Esta se encuentra reducida. Abandona la superficie
de la apoenzima. En seguida ser� reoxidada a expensas de otro
substrato que es reducido por otro sistema enzim�tico del medio. El
NAD se comporta en estas dos reacciones sucesivas como un substrato.

Figura 10: Ejemplo de cofactor

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-
funcoes1.php, 2007
La nomenclatura y la clasificaci�n de las enzimas han sido normalizadas
por la Comisi�n sobre Enzimas de la Uni�n Internacional de Bioqu�mica,
creada en 1955 antes de solucionar la confusi�n que hab�a y el-riesgo
de que la situaci�n se agravara con el r�pido progreso del conocimiento
acerca de las enzimas.

Los objetivos que fueron asignados a esa Comisi�n sobre Enzimas desde
su creaci�n fueron:

. Hacer un inventario de las enzimas identificadas y caracterizadas,

precisando para cada enzima la naturaleza exacta de la reacci�n
catalizada.
. Establecer, a partir de este inventario, una clasificaci�n de las
enzimas.
. Definir, con base en esta Clasificaci�n, reglas de nomenclatura
que permitan designar, sin ambig�edad, a una enzima dada,
proporcionando la mayor informaci�n posible sobre la
naturaleza de la reacci�n catalizada.

Para cada enzima es preciso:

. La reacci�n catalizada.
. Su nombre sistem�tico en nomenclatura normalizada.
. Y sobre todo su n�mero de identificaci�n que define sin ninguna
ambig�edad, el lugar de la enzima en la clasificaci�n normalizada.
Este I n�mero contiene 4 cifras o n�meros, separados por puntos,
cada uno de ellos corresponde a los elementos siguientes:

a) La primera cifra indica la clase a la cual pertenece la enzima.

Estas clases, en n�mero de 6 se definen de acuerdo a la
naturaleza general de la reacci�n catalizada. Hay: l-
oxidorreductasas, 2-Transferasas, 3-Hidrolasas, 4-Liasas, 5-
Isomerasas, 6-Ligasas (o sintetasas). I

b) La segunda y la tercera cifras designan la subccase y la sub-

sub- I clase, definiendo en cada clase, seg�n ciertos criterios
que se precisar�n m�s adelante.

c) La cuarta cifra da el n�mero de orden de la enzima en la sub-

clase considerada
La regla general adoptada para designar a una enzima de acuerdo a
la nomenclatura sistem�tica es que el nombre de una enzima se
forme de dos partes:

La primera lleva el nombre del substrato; o en el caso de reacciones

bimoleculares, los nombres de los dos substratos separados por "dos
puntos".

La segunda parte indica la clase a la cual pertenece la enzima; el nom-

bre de la clase puede. Precisarse por un prefijo que precede al tipo
exacto de reacci�n catalizada.

OXIDORREDUCTASAS: Catalizan las reacciones de oxido-reducci�n:

transferencia de hidr�geno o de electr�n(es) de un donador, que est�
oxidado, a un receptor, que est� reducido.(Fig. 5) En esta clase, que
lleva la cifra, se reagrupan todas las enzimas llamadas: oxidasas,
reductasas, deshidrogenasas y peroxidasas.

Los nombres comunes que se han retenido son del tipo "donador: deshi-
drogenasa" o "receptor: reductasa". El t�rmino oxidasa no se ha
conservado salvo cuando el receptor es el ox�geno.

Fig. 11. Enzimas de oxido � reducci�n

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php
. 2007

TRANSFERASAS

Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de

agrupamientos (metilo, hidroximetilo, carboxilo, acilo, glucosilo, amino,
etc.).

En esta clase, que lleva la cifra 2, se reagrupan las transferasas,

fosforilasas, cinasas, entre otras Las sub-clases se definen por la
naturaleza del agrupamiento que es transferido (agrupamientos de un
carbono, de dos carbonos, nitrogenados, etc.).

El nombre sistem�tico est� formado seg�n el modelo: donador: receptor

o grupo transferido: transferasa.

Fig. 12: TRANSFERASAS

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php

HIDROLASAS

Provocan la hidr�lisis de diversos tipos de enlaces: �ster, acetal

(os�dico), amida (pept�dico), (Fig. 13)

Las subclases son definidas por la naturaleza general del enlace que es
hidrolizado. El nombre sistem�tico se forma de acuerdo al modelo
"substrato hidrolasa", un prefijo que precisa la naturaleza del grupo
eliminado cuando la enzima es espec�fica para este enlace.

El nombre com�n que se recomienda es, en la mayor parte de los

casos, formado por el nombre del substrato al cual se adiciona el sufijo
"asa". En general las hidrolasas son holoprote�nas. Algunas pueden
tener un grupo prost�tico, por ejemplo el fosfato de piridoxal.

Fig.13 HIDROLASAS

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-
funcoes1.php, 2007
LIASAS

Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u alg�n otro,

por medios diferentes a la hidr�lisis o a, la oxidaci�n, con formaci�n de
un doble enlace en alguno de los dos fragmentos. Cuando ellas act�an
en sentido inverso -condensaci�n de dos mol�culas con desaparici�n de
un doble enlace se les designa con el nombre de sintetasas.

Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub.
clases precisan la identidad de la fracci�n eliminada: CO2, aldeh�do,
amoniaco, etc. El nombre sistem�tico se forma de acuerdo al modelo,
substrato: fracci�n eliminada-liasas.

Fig. 14: Liazas. Condensaci�n de mol�culas con desaparici�n de doble enlace

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-
funcoes1.php, 2009

ISOMERASAS

Catalizan las reacciones de isomerizaci�n: racemizaci�n, epimerizaci�n,

isomerizaci�n cis-trans, o tambi�n originan modificaciones
intramoleculares tales que transfieren un agrupamiento o producen
oxidorreducci�n.

Para su nomenclatura se retiene el principio "substrato. . .asa", pero el

t�rmino iso�nerasa se reserva a ciertas subclases; un prefijo hace
precisa la naturaleza de la isomerizaci�n, por ejemplo cis-trans
isomerasa.
Fig. 15: Ejemplo de Isomerizaci�n

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-
funcoes1.php, 2009

LIGASAS O SINTETASAS

Son enzimas que catalizan la reacci�n de uni�n de dos mol�culas,

acopladas a la ruptura, sin intervenci�n del agua, de un enlace
pirofosf�rico en el ATP o eventualmente en un nucle�tido trifosf�rico del
mismo tipo.

Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - �, C -

S, C - N, C - C) y la sub-subclases se refieren a la naturaleza del pro-
ducto formado (amida, p�ptido, etc.) o a la reacci�n que es catalizada.

El nombre sistem�tico es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa

(formando ADP), X Y , son los dos substratos que se condensan; el
producto formado a partir del nucle�tido trifosf�rico implicado .en la
reacci�n (ADP o AMP) se indica entre par�ntesis.

Para darle nombre com�n se utiliza, en general, el nombre del producto

formado seguido del t�rmino "sintetasa".

Fig. 16: Ligazas

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-
funcoes1.php, 2009
Lecci�n 18: Cin�tica enzim�tica

El objeto de la cin�tica enzim�tica es el estudio de las enzimas en su

funcionamiento. Se propone, en particular, establecer las relaciones que
existen entre la velocidad de la reacci�n enzim�tica y las
concentraciones del substrato (S) y de la enzima (E), as� como la
influencia de algunos factores: pH, temperatura, presencia de efectores
y eventualmente, actividad del agua.

La Comisi�n sobre Enzimas ha definido una unidad internacional de

actividad enzim�tica, el katal, cantidad de enzima que transforma un
mol de substrato por segundo bajo las condiciones experimentales
est�ndar. Esta es una unidad de valor elevado: por ello se utilizan m�s
corrientemente sub. m�ltiplos de ella: microkatal (JLkat), nanokatal
(nkat) y picokatal (pkat), que valen, respectivamente 10-6, 10-9 y 10-
12 katal (kat).

Las enzimas se pueden presentar bajo la forma pura, o bajo la forma de

preparaciones enzim�ticas, m�s o menos purificadas. Con frecuencia es
interesante determinar la actividad enzim�tica de una cantidad unitaria
de preparaci�n enzim�tica no purificada o de una enzima purificada. Se
refiere entonces la actividad, sea a 1 kilogramo de prote�na, sea a una
mol�cula gramo, as� se define una actividad espec�fica, katal por kg de
prote�nas y una actividad molar, katal por mol de enzima.

Enzimas Michaelianas

Principales hechos experimentales: Debemos subrayar, como un

pre�mbulo, la necesidad absoluta de que las enzimas sean puras y
desprovistas de actividad par�sita.

Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes

generales de la cin�tica enzim�tica son:

a) El substrato, S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario

transitorio ES. Este complejo resulta de una complementaria de la
estructura entre el sitio activo de la enzima y la mol�cula del substrato.

b) La velocidad de la reacci�n en el tiempo t, es decir la velocidad de

dS/dP desaparici�n del substrato, o de aparici�n del producto, dt/dt
que se representa por la pendiente de la tangente a la curva, P o S =
f(t) no es constante para las concentraciones dadas en enzima o en
substrato (fig.9), y disminuye en funci�n del tiempo debido a la
desaparici�n del substrato en el curso de desarrollo de la reacci�n.

Siempre, al principio de la reacci�n, se puede considerar que la

tangente a la curva se confunde con aqu�lla en que la velocidad perma-
nece constante.

Los estudios de cin�tica enzim�tica corresponden siempre a esta parte

lineal de la curva; lo que implica el trabajar a velocidades in�ciales. En
estas condiciones, al principio de la reacci�n, la concentraci�n en
producto es muy d�bil; puede despreciarse, as� como la reacci�n inversa
de transformaci�n del producto en substrato. Entonces se puede escribir

k1 k3

E + S . ES . E + P

k2

Figura 17: Cin�tica enzim�tica

Fig. 9. Curva de aparici�n del producto en funci�n del tiempo

Fuente: Scriban, Biotecnolog�a, 1992

1985

c) Por otra parte, para una concentraci�n dada de substrato, el estudio

de las variaciones de la velocidad inicial de reacci�n en funci�n de la
concentraci�n de enzima (fig. 18) muestra que esta variaci�n no es
lineal. La curva presenta un trazo hiperb�lico correspondiente al hecho
de que para una cierta concentraci�n de enzima, la totalidad del
substrato se encuentra bajo la forma de complejo enzima-substrato; lo
que resulta que la velocidad inicial, funci�n de la concentraci�n de este
complejo, permanece constante. Para los estudios cin�ticos, es
necesario situarse en las condiciones que corresponden al principio de la
curva, donde es lineal, es decir a concentraciones bajas de enzimas.

Fig. 18. Curva que representa la velocidad enzim�tica en funci�n de la

concentraci�n de
la enzima

Fuente: Scriban, Biotecnolog�a, 1985

En otros t�rminos, la cantidad de enzima debe ser peque�a en

comparaci�n a la concentraci�n del substrato, de tal manera, que la
formaci�n del complejo enzima-substrato, ES, no modifica, o modifica
poco la concentraci�n del substrato,

Hip�tesis de Michaelis-Menten: Al establecer la ecuaci�n de la

velocidad, Michaelis y Menten toman como principio de que la velocidad
de transformaci�n del complejo ES en E + P es muy lenta, con relaci�n a
la velocidad de la ruptura del complejo que vuelve a dar E + S.

Esta hip�tesis significa que k3 ~ k2 Y que E y ES est�n en equilibrio,

sea:
Hip�tesis del estado estacionario de Briggs y Haldane: Estos autores
consideraron que la hip�tesis de Michaelis-Menten es demasiado
restrictiva y que es preferible postular un estado estacionario, estado
para el cual la velocidad de formaci�n del complejo ES es igual a su
velocidad de descomposici�n en todas las direcciones (formaci�n de
productos y aumento del substrato).

Velocidad de formaci�n de ES = k1 [E] [S]

Velocidad de desaparici�n de ES = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3)

[ES]

El estado estacionario se describe entonces:

Al escribir que la cantidad de enzima que se ha puesto en el medio de

reacci�n [ET] se reparte en una fracci�n libre [E], y una fracci�n que
forma un complejo [ES], se tiene:

[ET] = [E] + [ES]

Al sustituir E por su valor, se obtiene:

La velocidad de formaci�n del producto est� dada por: v = k3 [ES], la

ecuaci�n general es de la forma:
Ecuaci�n de Michaelis-Menten: Cuando la concentraci�n en substrato
cambia al infimito; la velocidad inicial tiende hacia k3 [Er], o sea hacia
la velocidad m�xima V m; toda la enzima se encuentra entonces bajo la
forma ES.

La ecuaci�n es en su forma m�s simple:

Esta es la ecuaci�n de Michaelis-Menten, seg�n la cual la velocidad de la

reacci�n enzim�tica es una funci�n hiperb�lica de la concentraci�n del
substrato.

Los resultados experimentales en el caso de las enzimas michaelianas

con un solo substrato corroboran la validez de esta ecuaci�n.

Significaci�n de Km Y de Vm: Vm representa la velocidad m�xima que

puede alcanzar la reacci�n: toda la enzima se encuentra bajo la forma
compleja ES.

Cuando la velocidad de la reacci�n alcanza la mitad de la velocidad

m�xima, v = 1/2 Vm, Km es entonces igual a (S].

Si kz > k3, Km = kz/k1 que es la hip�tesis de Michaelis-Menten : [E] +

[S] y [ES] est�n en equilibrio y la formaci�n del producto representa
una ligera fuga. En este caso, Km puede ser asimilada a la inversa de la
afinidad de las enzimas por el substrato. Mientras m�s peque�a sea Km,
mayor ser� la afinidad y viceversa.

Si kz < k3, la hip�tesis de Michaelis-Menten no tiene validez y Km ya no

tiene relaci�n con la afinidad de la enzima por el substrato. Tambi�n es
preferible considerar Km como una constante emp�rica igual a la
concentraci�n del substrato para la cual la velocidad inicial es igual a V
m/2en las condiciones experimentales definidas.

Reversibilidad y relaci�n de Haldane: En distintos puntos de la curva las

reacciones enzim�ticas son reversibles, es decir las enzimas pueden
catalizar la reacci�n inversa:
Keq = constante de equilibrio de la reacci�n global. Como
se explica en la siguiente gr�fica:

Representaci�n gr�fica de la cin�tica michaeliana de un substrato: La

representaci�n de Michaelis-Menten, v en funci�n de S.

Figura 11: Representaci�n gr�fica de

Michaelis-Menten

Fuente: Scribian, Biotecnology, 1990

Esta relaci�n resalta la interdependencia de la constante de equilibrio y
de los par�metros cin�ticos de una reacci�n enzim�tica reversible y
muestra que no es posible olvidar la reacci�n inversa en la que los
productos se acumulan.

Enzimas alost�ricas

Las enzimas con m�ltiples subunidades tienen estructura cuaternaria.

Una consecuencia de las subunidades m�ltiples es que cada subunidad
catal�tica individual tiene su propio centro activo. Esto significa que una
enzima con estructura cuaternaria puede unir m�s de una mol�cula de
sustrato. Alost�rico significa "forma diferente". Las enzimas alost�ricas
cambian de forma entre las formas activas e inactivas como resultado
de la uni�n de los sustratos en el centro activo y de las mol�culas
reguladoras en otros sitios. En el caso simple de una enzima alost�ricas
con una forma activa e inactiva, el cambio en la velocidad de reacci�n
con el incremento de la concentraci�n de sustrato es t�picamente una
curva de forma "S".

El significado de la curva de forma S para una enzima alost�ricas A

bajas concentraciones de sustrato, la enzima est� en la forma inactiva
(conformaci�n inactiva). Cuando la concentraci�n de sustrato aumenta,
el sustrato se une a la enzima y provoca un cambio de conformaci�n a
la forma activa de la enzima. Despu�s de que el primer sustrato este
unido, la segunda y siguientes mol�culas de sustrato se unen con mayor
afinidad. Este fen�meno es lo que se llama "cooperatividad", y la forma
S de la curva indica la uni�n cooperativa del sustrato. El resultado del
cambio a la forma activa es un fuerte incremento en la uni�n de los
otros sustratos, y como resultado, la velocidad de reacci�n aumenta
muy r�pidamente en un estrecho margen de concentraci�n de sustrato.
Cuando todos los centros activos de una enzima alost�ricas est�n

ocupados con sustrato, la velocidad de la reacci�n es constante y se

alcanza la meseta de la Vmax.

Figura 19: Curva de enzimas alost�ricas

Lecci�n 20: Producci�n de enzimas

La producci�n mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5

millares de millones de d�lares, 60% de ellos con utilizaci�n en las
industrias agroalimentarias.

Las enzimas que se utilizan en procesos agroalimentarios son objeto de

una reglamentaci�n estricta, en lo que concierne a su producci�n, su
pureza qu�mica y microbiol�gica. En su presentaci�n comercial, sea bajo
la forma m�s o menos diluida, fijada sobre soportes inertes, o diluyentes
est�n tambi�n igualmente reglamentadas. Las enzimas, biocatalizadores
utilizados en la bioindustria o en otras diversas industrias (farmacia,
textiles, pieles...) pueden provenir de varias fuentes, especialmente:

De origen vegetal, de origen animal y de origen microbiano. Cada una

de estas fuentes se estudiar� tomando en cuenta s�lo algunos ejemplos.

Enzimas de Origen Vegetal

Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por

orden decreciente de inter�s tecnol�gico, una de las m�s importantes
enzimas vegetales de uso industrial se encuentran: la papa�na que
proviene de una planta ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la
bromelina, extra�da de la pifia (Ananas comosus Merr) y la ficina
proveniente del higo (Ficus carica).

La preparaci�n de papa�na industrial m�s pura (papa�na refinada) ha

sido desarrollada en 1969 por Baudard en Zaire (Jones y Mercier, 1974).
El l�tex fresco es guardado en fr�o, agitado, diluido, centrifugado,
filtrado sobre kieselgur y a trav�s de placas esterilizantes, a fin de
eliminar toda impureza y finalmente atomizada al vac�o a 50�C. Se debe
obtener un polvo blanco y evitar por un lado cualquier obscurecimiento
debido a la oxidaci�n y el empleo de temperaturas anormales, adem�s
evitar toda infecci�n microbiol�gica (Escherichia co/i, Salmonella, . . .).
El l�tex fresco contiene alrededor de 12% en peso de papa�na.

Son numerosas las aplicaciones de la papa�na industrial (alrededor de

300 ton.), de las cuales se usa 75% en la industria cervecera para la
estabilizaci�n coloidal de la cerveza; 10% en la industria de la carne
(ablandamiento), 5% en la fabricaci�n de hidrolizados de pescado
destinados a la alimentaci�n animal, 2% en la industria farmac�utica,
entre otros. La tasa de utilizaci�n puede variar seriamente en funci�n de
la legislaci�n alimentar�a de cada pa�s. El desarrollo de la papa�na
industrial es ciertamente interesante de seguir, pues puede sufrir
fluctuaciones por razones diversas (producci�n, acontecimientos
pol�ticos, cambios de tecnolog�as). En los �ltimos a�os se han
introducido exigencias muy estrictas sobre la calidad del producto.

Enzimas de origen animal

Un ejemplo importante de este tipo de enzimas en la pepsina, esta

enzima es producida industrialmente a partir de la mucosa g�strica del
cerdo donde se encuentra en forma de un precursor, el pepsin�geno,
de una masa molecular de 42,000. La preparaci�n industrial de la
pepsina se puede hacer de acuerdo a varios m�todos: en general se
practica la auto digesti�n de mucosas g�stricas de cerdo, raspadas y
trituradas, en medio acuoso. acidificado con �cido clorh�drico, en
presencia de cloroformo. Despu�s de flltraci�n se efect�a una
concentraci�n por liofilizaci�n. La pepsina purificada es blanquecina y
soluble en agua.

Su actividad enzim�tica es m�s elevada entre pH 1 Y 4 con un m�ximo a

valores de 1.8 y var�a seg�n la naturaleza del substrato; es
termosensible en soluci�n arriba de los 55�C, lo que limita su utilizaci�n
en tecnolog�a.

Sin embargo, puede ser utilizada en bebidas refrescantes, en cervecer�a

en el transcurso de la estabilizaci�n coloidal durante la pasteurizaci�n en
botellas (Trolle, 1949) en raz�n de su actividad en medio �cido (pH de la
cerveza = 4 a 4.5). Tiene, como la papa�na, la propiedad de precipitar
las prote�nas o los polip�ptidos en medio l�quido (leche, cerveza.)
(efecto "coagulante ").

Finalmente es necesario advertir que la pepsina puede provocar la

hidr�lisis de enzimas como las amilasas, la tripsina, la papa�na
industrial, lo que debe tenerse en cuenta para su uso tecnol�gico
ocasional.

Enzimas de Origen Microbiano

Desde que el desarrollo de la microbiolog�a ha permitido comprender

mejor los sistemas que condicionan la s�ntesis de enzima s en los
microorganismos, la producci�n industrial de enzimas se ha orientado
hacia los procesos de fermentaci�n. Las principales ventajas de las
enzimas en la fermentaci�n con relaci�n a las enzimas en la extracci�n
son las siguientes:
- Una producci�n independiente de restricciones estaci�nales o geogr�-
ficas.

- La posibilidad de utilizaci�n de materias primas de f�cil adquisici�n.

- Los rendimientos en la producci�n se pueden aumentar en proporci�n

importante al mejorar las capas microbianas y aplicar las �pti mas
condiciones de fermentaci�n.

Por otro lado, las enzimas de origen microbiano presentan propiedades y

especificidades diversas.

Estas ventajas predominan sobre los inconvenientes propios de las

industrias de fermentaci�n (fuertes inversiones, consumo de energ�a,
riesgos de contaminaci�n...) y en el transcurso de los �ltimos treinta
a�os se han desarrollado un n�mero importante de fermentaciones
productoras de enzimas.

Las principales producciones se presentan en la Tabla 1.

Tabla 4: Producci�n de enzimas microbianas

Enzima

Toneladas de
enzima pura/a�o

PROTEASA

500

GLUCOAMILASA

300

AMILASA

300

GLUCOSA
ISOMERASA

50

AMILASA F�NGICA

10

PECTINASA

10

PROTEASA F�NGICA

10

RENINA
MICROBIANA
10

Fuente: Aunstrup y col., (1979)

La fundamentaci�n de la producci�n de enzimas microbianas exocelula-
res es muy simple: un microorganismo es cultivado en un medio
apropiado, a partir del cual es extra�da la enzima (para las enzimas
endocelulares es necesario Un tratamiento previo de la biomasa). Los
problemas radican en los detalles de proceso.

En la Industria alimentar�a, existe una gran variedad de enzimas de

mucha importancia. En el cuadro (2) se muestran algunos ejemplos:

Producci�n Industrial de enzimas

En la producci�n industrial de las enzimas se consideran las siguientes

etapas. (Scriban, 1985)

A. Definici�n de la enzima que se busca

La producci�n de una enzima industrial que responda, en principio, a

una exigencia potencial de quienes la pueden utilizar, hace necesario
determinar las propiedades que esta enzima pueda tener.
Prioritariamente, de acuerdo a Sicart (1980):

- La especificidad: Aunque en la industria las enzimas sean utilizadas

para la hidr�lisis de macromol�culas complejas en las cuales los sitios de
acoplamiento con, frecuencia se desconocen, el efecto global que se
busca involucra, generalmente, la utilizaci�n de un tipo preciso de
enzima. En ciertos casos, como sucede con la pectinasa, una enzima
asocia tres actividades diferentes, y se debe precisar estrechamente la
relaci�n entre estas tres actividades de acuerdo al producto que se vaya
a tratar.
Tabla 5: Enzimas utilizadas, en la industria alimenticia.

Fuente: http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_54.asp,
(2008)

- El valor �ptimo de pH: Este factor tiene una influencia variable seg�n
las enzimas; algunas de ellas, como la proteasa alcalina a�n son activas
a pH = 10, en tanto que las enzimas f�ngicas funcionan a�n a pH = 3.

- El valor �ptimo de temperatura: Generalmente, quienes utilizan en-

zimas se interesan en poder disponer de enzimas que soporten tem-
peraturas elevadas, ya que estas temperaturas conservan en parte la
esterilidad del medio de fermentaci�n.

Despu�s, es necesario definir el sistema que se adoptar� para medir su

actividad, pero conviene disociar la noci�n de actividad que se aplica a
la cantidad de enzima presente en una preparaci�n, la que se puede
determinar mediante un m�todo de laboratorio, de la noci�n de eficacia
que caracteriza el comportamiento de la misma preparaci�n colocada en
las condiciones industriales en las que vaa utilizarse. (Sicart, 1980).

B. Selecci�n de una cepa microbiana

Los microorganismos que son capaces de producir enzimas de
degradaci�n de ciertos compuestos se localizan generalmente en donde
abundan esas substancias. Por ejemplo, los microorganismos que
secretan celulosas son numerosos en el suelo de los bosques.
Inicialmente, las cepas se han aislado del suelo o de elementos
naturales.

Los m�todos de aislamiento que se utilizan son los m�todos cl�sicos, el

m�s importante es el cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub
cultivo en un medio selectivo. En el medio selectivo ideal, el substrato
de la enzima es la �nica fuente de uno de los elementos vitales. Por
ejemplo, el almid�n como �nica fuente de carbono. para aislar a los
microorganismo s que tienen una amilasa.

Las t�cnicas de difusi�n en agar se han desarrollado para la detecci�n

de la actividad enzim�tica. Esta prueba, en las condiciones est�ndar,
puede dar informaci�n de orden cualitativo. Para que la cepa aislada sea
retenida definitivamente debe presentar algunas caracter�sticas, de
acuerdo a Aunstrup y col. (1979) y Sicart (1980):

- Desarrollarse sobre un medio sencillo f�cilmente asequible.

- Producir el menor n�mero posible de metabolitos secundarios, como

antibi�ticos, por ejemplo.

- Excretar la enzima en forma que se facilite su separaci�n y su purifi-

caci�n. .

- No originar contaminantes diversos

- No ser pat�gena ni producir compuestos t�xicos.

Con los progresos de la gen�tica, las posibilidades de mejoramiento de

las cepas son, te�ricamente, ilimitadas; por una 'parte por una
mutaci�n, por otra parte, mediante la nueva v�a de la ingenier�a
gen�tica.

En cualquier forma, la gen�tica de los microorganismos que se utilizan

en la producci�n industrial de enzimas (Bacillus, Aspergillus) a�n est�
mal conocida para que puedan realizarse las aplicaciones de la
ingenier�a gen�tica y son las mutaciones las m�s utilizadas.
Las cepas industriales deben ser protegidas contra la degeneraci�n, la
p�rdida de viabilidad y las contaminaciones. Los medios m�s seguros
son la liofilizaci�n o la conservaci�n a temperatura del nitr�geno
l�quido. Estas t�cnicas permiten conservar las cepas casi inde-
finidamente.

C. Producci�n industrial de la enzima

Tradicionalmente, las enzimas microbianas eran producidas por cultivo

en superficie, en una delgada capa de medio l�quido o de medio
semis�lido. Esta t�cnica es a�n utilizada para algunas producciones, en
particular de enzimas de origen f�ngico, tales como las amilasas de
Aspergillus, las proteasas de Aspergillus y de Mucor o las pectinasas de
Penicillium. Pero existen varios problemas en el control de la
temperatura, de la aireaci�n y de la humedad, por ello se prefieren los
cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos en medio
l�quido, profundos, agitados, son mejor adaptados a los diferentes
controles mediante m�todos modernos y reducen los riesgos de
contaminaci�n. Adem�s se prestan mejor a las operaciones de
extrapolaci�n y de optimizaci�n necesarias para el paso del fermentador
piloto de laboratorio al fermentador industrial.

Preparaci�n del in�culo

En esta etapa de preparaci�n del inoculo, la capacidad de producci�n

de la cepa debe conservarse y eliminarse todo riesgo de
contaminaci�n. Para ello es necesario evitar que haya un n�mero
excesivamente grande de cultivos sucesivos. Es preferible el sembrar
directamente un matraz de medio gelosado, a partir de la cepa
liofilizada, despu�s, a partir de este cultivo se sembrar� un �nico
fermentador que servir� el mismo de in�culo para el fermentador
industrial. El volumen del inoculo representa generalmente de 3 a 10%
del volumen del fermentador de producci�n y la composici�n del medio
para la preparaci�n del in�culo se aproxima bastante a la del medio de
producci�n. El tiempo de permanencia en el fermentador var�a de 10 a
80 horas seg�n el procedimiento, la cepa, las condiciones de cultivo, .
. . (Aunstrup y col., 1979)

D. Composici�n del medio de cultivo

El medio de cultivo debe contener la fuente de carbono, la fuente de

nitr�geno y los principales factores de crecimiento necesarios para la
cepa microbiana. Se pueden adicionar ciertos factores para abreviar la
fase de latencia. De todas formas, la producci�n de enzima puede no
tener lugar a pesar de que el medio sea el conveniente para un buen
desarrollo. Hay que tomar en cuenta la necesidad de un inductor, de las
represiones posibles debida a alg�n componente del medio, de la
represi�n catab�lica producida por la glucosa. Esta represi�n puede ser
evitada reemplazando la glucosa por gl�cidos fermentables lentamente
o por almid�n parcialmente hidrolizado.

Para aumentar la productividad, se utilizan medios concentrados, pero

esta concentraci�n puede igualmente -ser causa de aumento en la
presi�n osm�tica y dificultar la aireaci�n.

A menudo se adicionan sales para complementar la cantidad de

nitr�geno en el medio

E. Fermentaci�n y equipo necesario

Vincent y Priestley (1975) han detallado las condiciones de fermentaci�n

que deben mantenerse para producir una enzima.

Los fermentadores utilizados habitualmente contienen vol�menes de

100 a 200 m3. Deben estar equipados de un sistema de agitaci�n de
gran potencia, capaz de agitar medios relativamente viscosos, ya que
pueden contener hasta 350 g/lt. de materia seca (Sicart, 1980).

Los fermentadores est�n equipados de una corona cl�sica de aereaci�n,

ya que la mayor parte de las fermentaciones productoras de enzimas
tienen una fuerte demanda de ox�geno. Generalmente, estas
fermentaciones son conducidas en condiciones limitadas de oxigenaci�n.
Para la glucoamilasa, la productividad est� limitada a la transferencia de
ox�geno (Aunstrup y col., 1979).

Los equipos de medici�n y de control del fermentador permiten seguir y

regular los par�metros del cultivo. Los controles se ejercen
generalmente sobre el pR, la temperatura, el ox�geno disuelto, la
espuma y la evoluci�n de la concentraci�n de ciertos nutrientes. Adem�s
la medici�n de la aparici�n de la actividad enzim�tica se efect�a a
intervalos regulares por el laboratorio de control. A�n no existen
reguladores que permitan hacer esas mediciones en forma continua.
(Sicart, 1980). Esta medici�n es importante porque de ella depende la
decisi�n de detener la fermentaci�n.

Para la producci�n de enzimas, son necesarias condiciones rigurosas de

asepsia, por una parte para obtener un buen rendimiento, por otra parte
para no tener el riesgo de secreci�n de substancias t�xicas como
contaminantes. Esta asepsia es dif�cil de mantener, siendo el medio muy
rico y el pH cercano a la neutralidad.
Se necesita tomar precauciones a nivel de la construcci�n del fermenta-
dor y para la elecci�n de las instalaciones y los equipos colaterales.
Durante toda la fermentaci�n, una ligera supresi�n de aire en el
fermentador impide la penetraci�n de contaminantes, esta precauci�n la
refuerzan las protecciones de vapor en todos los puntos de
comunicaci�n con el exterior (fig. 20).

A�n no se ha establecido el modelo cin�tico general para la s�ntesis de

enzimas, pero, ya se ha estudiado la regulaci�n de la formaci�n de
algunas enzimas. Algunas enzimas se forman durante la fase
exponencial de crecimiento, pero la mayor parte aparecen en la fase
postexponencial. Seg�n sean las enzimas y los procedimientos, la
fermentaci�n dura de 30 a 150 horas. La cantidad de prote�na -enzima
en el medio, al final de la fermentaci�n, representa de 1 a 5% de la
materia seca inicial, en tanto que la biomasa celular puede alcanzar de 2
a 10%.

La calidad de las enzimas producidas est� en estrecha relaci�n a la

forma en que se condujo la fermentaci�n. La selecci�n de las materias
primas, el m�todo de esterilizaci�n, el procedimiento para regular la
formaci�n de espuma, la aireaci�n y la agitaci�n, as� como la duraci�n
de la fermentaci�n afectan, no solamente al rendimiento y al costo de
producci�n, sino tambi�n al color, olor y a la estabilidad de la enzimas

Fig. 20: Esquema para una producci�n de fermentaci�n

para la producci�n de enzimas

Fuente: Aunstrup, 1979

Utilizado este biocatalizador. En la pr�ctica, la mayor parte de las
operaciones industriales se realizan de forma discontinua, en lotes,
con la renovaci�n de la enzima al principio de cada ciclo.

Para los enzim�logos, la fijaci�n sobre un soporte realiza un modelo

cercano a las condiciones de la c�lula viviente, en donde las enzimas
se encuentran con frecuencia asociadas a la membrana � a organelos
intracelulares.

Desde 1916, Nelson y Griffin hab�an demostrado que la invertasa

adsorbida sobre carb�n activo, conservaba su actividad. Pero de
cualquier modo hubo que esperar hasta la d�cada de los 50's para que
aparecieran las primeras aplicaciones de esta t�cnica, en particular con
los trabajos de Grubhofer y Schleith.

Despu�s de 1960, las investigaciones se han intensificado y bajo el

impulso de los equipos de Katchalski en Israel y de Manecke en
Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales de las
enzimas inmovilizadas. En1969 Chibata y sus colaboradores
desarrollaron en Jap�n el primer reactor industrial con enzima fijada,
una L-amino�cidos a partir de la correspondiente mezcla rac�mica.
Esta t�cnica permitir�a, seg�n los autores, disminuir el precio de costo
a menos del 40% con relaci�n al procedimiento convencional.

En la actualidad, se han desarrollado numerosos m�todos de fijaci�n de

inter�s para m�s de 100 enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como
en escala piloto y se ha abierto un campo de experimentaci�n, despu�s
de algunos a�os, para la inmovilizaci�n de c�lulas intactas, vivas o
muertas. Esta multiplicaci�n de trabajos ha dado lugar a una abundante
literatura cient�fica.

Inmovilizaci�n de enzimas

La actividad de las enzimas est� ligada al mantenimiento de la

integridad de su conformaci�n temaria, en particular al nivel de su sitio
activo. Los procedimientos de inmovilizaci�n deben, por consiguiente,
ser m�todos suaves, bien regulados, que respeten la estructura nativa
de la prote�na, que los enlaces que se crean entre el soporte y la
enzima, excluyan los �cidos aminados involucrados directamente en la
reacci�n catal�tica..

Se han propuesto diversos tipos de m�todos y en 1971, en la primera

conferencia de Ingenier�a Enzim�tica de Henniker (E.U.A.) se defini� una
clasificaci�n de enzimas inmovilizadas, seg�n el m�todo de fijaci�n
utilizado.
Figura 21: Clasificaci�n de formas de obtenci�n de enzimas

En esta clasificaci�n, las enzimas inmovilizadas se consideran como un

caso particular de las enzimas modificadas. Despu�s apareci� la t�cnica
de reticulaci�n (enlazamiento cruzado) en el cual las mol�culas
enzim�ticas son polimerizadas por intermedio de un ligando
polifuncional.

- Propiedades de las enzimas inmovillzadas

Los efectos de la inmovilizaci�n sobre la actividad de las enzimas

resultan de la interacci�n de diferentes factores:

a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a

causa

de tensiones durante la fijaci�n.

b) Modificaciones del microambiente: pH local, interacciones

electrost�ticas.

c) Fen�menos disfusionales en el interior del complejo.

d) Impedimentos est�ricos.

Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y

la estabilidad de la enzima.

- Medici�n de la actividad
Las condiciones �ptimas de acci�n de las enzimas inmovilizadas difieren
a menudo de las de las enzimas en soluci�n y deben ser perfectamente
conocidas para evitar todo riesgo de error de interpretaci�n. As� para la
ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de pH 7.7 no alcanza sino a
75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de 100% a pH
7.1.17

La Comisi�n Internacional de Hennicker en 1971,ha propuesto caracte-

rizar la actividad de los complejos por la velocidad inicial de reacci�n
expresada en microkatales (JIkat): cantidad de producto formado en
micromoles por segundo y por mg (materia seca) o por unidad de
superficie del soporte; precisando las condiciones de determinaci�n de la
materia seca, el tenor en prote�nas fijadas y la actividad espec�fica de la
enzima antes de la inmovilizaci�n.

Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilizaci�n entra�a con
frecuencia una p�rdida de actividad, muy variable seg�n sea la
naturaleza de la enzima y el modo de fijaci�n; pero tambi�n se han
se�alado algunos casos en los que hay aumento de actividad. Estas
variaciones en un sentido o en otro podr�an explicarse por una
modificaci�n est�rica del sitio activo de la enzima bajo el efecto de un
cambio de conformaci�n de la cadena polipept�dica.

Gracias a la gran especificidad en su acci�n, las enzimas constituyen

una herramienta de fabricaci�n y de an�lisis indispensable en
numerosos sectores de la investigaci�n, del control y de la producci�n
industrial.

La introducci�n de las t�cnicas de insolubilizaci�n de los

biocatalizadores suscita un inter�s considerable en raz�n de las ventajas
que presenta: tratamientos en continu�, control automatizado,
mejoramiento de los rendimientos por unidad de enzima, obtenci�n de
derivados m�s puros, disminuci�n de requerimientos energ�ticos. . . y
los recientes desarrollos de los m�todos de inmovilizaci�n de c�lulas
enteras han abierto nuevas perspectivas.

A pesar de los numerosos trabajos de investigaci�n, las instalaciones de

producci�n industrial son a�n muy limitadas. Es necesario buscar la
causa en la complejidad del funcionamiento de los reactores, en donde
la matriz es a menudo muy delicada y en la gran inestabilidad de los
catalizadores biol�gicos; sin olvidar las limitaciones debidas a
regulaciones legales.

La obtenci�n de nuevas fuentes de enzimas m�s estables, el desarrollo

de sistemas multienzim�ticos, la recuperaci�n y la re utilizaci�n de
cofactores de. Las enzimas son las v�as de investigaci�n susceptibles de
ampliar el campo de las aplicaciones actuales:

AUTOEVALUACI�N

1. Realice un Glosario, del cap�tulo estudiado:

2. Realice una investigaci�n bibliogr�fica sobre las enzimas m�s

importantes en la industria alimenticia, escoja una de ellas y realice un
diagrama de flujo para la producci�n de la misma.

3. Para mayor comprensi�n lea el articulo de Miguel Arroyo en el

siguiente link: Inmovilizaci�n de enzimas: Fundamentos, m�todos y
aplicaciones. Y realice una comparaci�n de los diferentes m�todos
teniendo en cuenta sus ventajas y desventajas.

CIBERGRAFIA:

http://www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html. Sitio que incluye

informaci�n acerca de las enzimas, su funci�n y caracter�sticas.

http://minnie.uab.es/~veteri/21264/t4_els_enzims.pdf. Las enzimas en

los alimentos

Biotecnolog�a de los alimentos. Introducci�n. ILSI � International Life

Sciences Institute. Serie de monograf�as concisas de ILSI Europa.
http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/

Alimentos y tecnolog�a de modificaci�n gen�tica. Salud y seguridad en el

consumidor. ILSI � International Life Sciences Institute. Serie de
monograf�as concisas de ILSI Europa. http://www.ilsi.org/ y en
Argentina http://argentina.ilsi.org/
CAP�TULO 11: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA
BIOTECNOLOG�A

El principal objetivo de la ingenier�a gen�tica en el campo de la

Biotecnolog�a es alterar la composici�n gen�tica de los seres vivos de
importancia industrial, con el fin de incrementar la eficiencia global del
proceso para el que se emplea dicho ser vivo. Aunque el objetivo
principal es incrementar el rendimiento de un producto espec�fico, es
interesante tener en cuenta otros par�metros, particularmente los que
se refieren a las mejoras en las caracter�sticas de crecimiento y la
eliminaci�n de subproductos perjudiciales. (Wiseman, A,1986)

El desarrollo de organismo s�per productores, se considera el principal

objetivo de este campo de la biotecnolog�a, aunque se podr�an a�adir
otros dos: en primer lugar, la obtenci�n de nuevas especies que
produzcan productos nuevos o modificados y en segundo lugar, el
conocimiento de las rutas biosint�ticas que conducen a la producci�n de
metabolitos de inter�s comercial, as� como mecanismos de control que
regulan estas rutas. (Wiseman, A. 1986)

La estructura y funci�n b�sica de los genes se conoc�a desde finales de

los a�os sesenta. M�s a�n, la labor de los bioqu�micos hab�a producido
un gran c�mulo de conocimientos respecto de los conjuntos de
reacciones qu�micas que ocurren dentro de los seres vivos. Las v�as
metab�licas fundamentales para la generaci�n de energ�a y la
bios�ntesis de la mayor�a de los compuestos esenciales para la vida ya
estaban establecidas. (Saberon, 1997)

Este conocimiento se basaba en la aplicaci�n inteligente de m�todos de

ensayo y purificaci�n de enzimas clave, y de la identificaci�n y an�lisis
de sus sustratos y productos. Al mismo tiempo, otras disciplinas como
la inmunolog�a y la gen�tica, realizaban avances y eran actividades de
gran complejidad y finura.

La biolog�a molecular, sin embargo, se encontraba en un punto en el

que su desarrollo se hab�a hecho muy lento. Una vez sentadas las bases
fundamentales de la replicaci�n y expresi�n de la informaci�n gen�tica,
el siguiente paso era desentra�ar; en forma detallada, los mecanismos
de regulaci�n de la expresi�n gen�tica.
Todas las v�as metab�licas, la expresi�n de anticuerpos, la actividad de
los virus, en fin, todas las manifestaciones del fen�meno viviente, est�n,
en �ltima instancia, orquestados por la expresi�n ordenada y regulada
de los genes, por medio de la producci�n de prote�nas espec�ficas.

El extraordinario proceso por el cual una sola c�lula, el huevo

fecundado, da origen a un organismo complejo, es decir; las etapas de
diferenciaci�n celular; constitu�a un reto extremadamente atractivo,
pero a la vez formidable. Un descubrimiento clave inici� el cambio
dram�tico que conocemos hoy como ingenier�a gen�tica o ADN
recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel Nathans descubren una
enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias espec�ficas,
que les vali� el Premio Nobel de fisiolog�a o medicina, compartido con
Werner Arber, en 1978.

Este descubrimiento (consecuencia de un hallazgo accidental, en el que

los investigadores profundizaron con gran sentido) dio origen a una
sucesi�n de nuevos descubrimientos y potenci� el desarrollo de toda una
serie de otras disciplinas y metodolog�as. En este cap�tulo revisaremos
los fundamentos de algunas de las m�s importantes.

Lecci�n 21: T�CNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACI�N

GEN�TICA IN VITRO.

Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o

rompen el ADN. Estos sistemas, llamados de modificaci�n-restricci�n,
son an�logos a un sistema inmune, los cuales probablemente
evolucionaron como un mecanismo de protecci�n de los
microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las bacterias, por
ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacteri�fagos, que inyectan
su propio ADN en la c�lula bacteriana para despu�s controlar su
maquinaria celular y redirigirla hacia la s�ntesis de sus propios
componentes, dando como resultado final la ruptura de la c�lula y la
liberaci�n de cientos o miles de nuevos virus. En algunas bacterias el
ADN propio est� modificado en ciertas secuencias. Una enzima de
modificaci�n se desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa
con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce un peque�o
grupo qu�mico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de
restricci�n, tambi�n se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la
secuencia GAATTC, corta el ADN en esa posici�n. La enzima, sin
embargo, no corta el ADN modificado, por lo que efectivamente es
capaz de degradar el ADN extra�o que puede entrar a la c�lula, sin
alterar el ADN propio.

Hoy en d�a se conoce miles de diferentes enzimas de restricci�n,

provenientes de otros tantos distintos microorganismos. M�s de cien
distintas secuencias peque�as de ADN pueden ser rotas,
espec�ficamente, por medio del uso de la adecuada enzima de
restricci�n. Otra interesante propiedad de las enzimas de restricci�n es
que, en general, reconocen secuencias palindr�micas, es decir;
secuencias que son iguales si se leen en una direcci�n, o en la direcci�n
contraria. Por ejemplo:

� 5�GAATTC3��

� 3�CTTAAG5��

Es una secuencia palindr�mica. Cuando act�a la enzima que reconoce y

corta esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con
extremos que se proyectan fuera de la doble cadena:

� 5�G AATTC3��

� 3�CTTAA G5��

Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a

aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de
ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con
otro extremo generado por la misma enzima. Los descubridores de las
primeras enzimas de restricci�n pronto se dieron cuenta de que su
acci�n sobre el ADN (com�nmente llamada "digesti�n") produc�a un
conjunto definido de diferentes segmentos.

S�bitamente, el ADN dej� de ser una sustancia mon�tona y fr�gil,

donde purificar un segmento espec�fico resultaba una tarea ardua o
imposible. Al poder generar segmentos espec�ficos, con las enzimas de
restricci�n, la mol�cula de la vida qued� a merced del bi�logo molecular
y por lo tanto nos facilit� el camino para manipular la secuencia del
ADN, de cualquier especie. Este, entonces se convirti� en la nueva
herramienta de la Biolog�a moderna y por lo tanto de la
BIOTECNOLOG�A.
Figura 22. La separaci�n de los �cidos nucleicos

Cuando se utiliza la electroforesis, es posible

visualizar la acci�n de las enzimas de restricci�n. Si
se colocan muestras que contienen ADN de
diversos tama�os en los pozos de un gel en forma
de placa, y se aplica corriente el�ctrica, la diferencia
de velocidad de migraci�n de estas mol�culas las
distribuir�, por separado, al cabo de un tiempo,
dentro del gel. Si despu�s se agrega una sustancia
que se hace luminosa al interaccionar con el ADN y
ba�arse con luz ultravioleta, directamente se puede
observar el patr�n de distribuci�n de las bandas
constituidas por las mol�culas de diversos tama�os,
por medio del cual es factible deducir sus
respectivas dimensiones

Al usar diferentes enzimas de restricci�n, se generan

diferentes segmentos. Por ejemplo, si la secuencia
reconocida por la enzima Sall aparece en la mol�cula
del ejemplo una vez, cortar�a el segmento en dos
partes. Si la secuencia reconocida por EcoRI,
aparece dos veces, generar�a tres pedazos. Al usar las
dos enzimas simult�neamente, se producir�an cuatro
segmentos.

Fuente: Saberon Maneiro, 1997

Lecci�n 22: Tecnolog�a del ADN recombinante.

Como se menciono anteriormente, los fragmentos generados por las

enzimas de restricci�n tienen adem�s la propiedad de reasociarse unos
con otros, por medio de sus extremos cohesivos. La importancia de
manipular este procedimiento(tambi�n conocido como tecnolog�a del
ADN recombinante) es la que nos permite en primer lugar evitar los
m�ltiples mecanismo que restringen la transferencia de genes entre
organismos no relacionado y, en segundo lugar, que se lleven a cabo
manipulaciones precisas y sutiles aprovechando estas caracter�sticas del
proceso de recombinaci�n Este procedimiento consite, entonces, en
cortar el ADN en fragmentos espec�ficos utilizando enzimas llamadas
endonucleasas de restricci�n y ligar los fragmentos a un vector, es
decir, una mol�cula de ADN que es capa de ser incorporada y replicada
por la c�lula hospedadora..
En resumen, los elementos esenciales de la t�cnica de ADN
recombinante (v�ase la figura 2): son los siguientes
1. Obtenci�n de fragmentos espec�ficos de ADN (enzimas de
restricci�n).
2. Ligaci�n (o reasociaci�n covalente) de las mol�culas para obtener
hebras contin�as de ADN (enzima ligasa).
3. Mecanismo para introducir al interior de c�lulas vivas el ADN
recombinante (transformaci�n).
4. Mecanismo para asegurar la replicaci�n e identificaci�n de la
mol�cula recombinante dentro de la c�lula (veh�culo molecular).

El primer experimento en el que se puso en pr�ctica este concepto,

realmente simple, que se conoce como clonaci�n molecular se logr� al
utilizar pl�smidos bacterianos como veh�culos y ADN, tambi�n
bacteriano, como pasajero. (Fig.23)

El producto de la digesti�n del ADN con endonucleasas de restricci�n

est� constituido por muchos fragmentos espec�ficos, cuyos extremos son
compatibles o cohesivos unos con otros. Estos fragmentos se ligan
despu�s a un segmento especial de ADN, el veh�culo de donaci�n
(usualmente un pl�smido), que fue cortado con la misma enzima. Las
mol�culas recombinantes resultantes contienen un ADN veh�culo o
vector y un ADN pasajero, constituyendo una nueva mol�cula circular
continua.

Estas mol�culas se introducen a c�lulas bacterianas y se seleccionan por

medio de "genes marcadores" presentes en el veh�culo de donaci�n.
Dentro de su secuencia de ADN los veh�culos de donaci�n contienen
se�ales que inducen la replicaci�n del ADN, y otras que producen,
t�picamente, resistencia a alg�n antibi�tico. As�, las c�lulas que reciben
una mol�cula recombinante la perpet�an en su interior, y se pueden
detectar porque �sta confiere a la c�lula la capacidad de sobrevivir en
presencia del antibi�tico
Fig. 23. Los procedimientos b�sicos del ADN recombinante

Fuente: Raven, J. 2002

A. Corte y ligadura del ADN

Hasta el momento hemos mencionado a la ADN ligasa, una importante

enzima que permite ligar o unir mol�culas de ADN. La investigaci�n
sobre la fisiolog�a de los �cidos nucleicos ha proporcionado, adem�s,
una serie de enzimas que se utilizan ampliamente para manipular los
�cidos nucleicos en el tubo de ensayo, y que forman parte importante
de las herramientas del ADN recombinante. Cada una de estas enzimas,
al igual que las endonucleasas de restricci�n, cumple un papel dentro de
la c�lula viva, para alterar el material gen�tico (por ejemplo, para
repararlo, replicarlo, degradarlo, recombinarlo, etc.). en el laboratorio se
pueden usar estas enzimas, despu�s de purificarlas de sus fuentes
naturales, para efectuar transformaciones �tiles a los prop�sitos del
experimentador. Por ejemplo, la enzima transcriptasa reversa, que
naturalmente producen ciertos virus para invadir el genoma de sus
c�lulas blanco, se utiliza ampliamente para clonar genes a partir de sus
ARN mensajeros

Dado que el propio desarrollo del ADN recombinante , ha potenciado, a

su vez el desarrollo de herramientas moleculares, hoy en d�a contamos
con un enorme n�mero de enzimas y reactivos que permiten gran
versatilidad en la manipulacion del ADN.

B- SECUENCIACI�N DEL ADN

Una consecuencia inmediata de la clonaci�n molecular es que permite

disponer de cantidades ilimitadas de cantidades espec�ficos de ADN
pasajero se encuentra formando parte de un pl�smido, es factible
separarlo f�cilmente del resto del ADN celular, que se encuentra en el
cromosoma bacteriano, una mol�cula mucho m�s grande. A partir de un
cultivo de E. coli, se puede separar suficiente ADN plasm�dico para
caracterizarlo. Una vez que se dispuso de genes individuales purificados,
el escenario estaba listo para la siguiente etapa.

Walter Gilbert, en la Universidad de Harvard, y Frederic Sanger, en

Cambridge, Inglaterra, se dieron a la tarea de desarrollar t�cnicas para
determinar la m�s importante caracter�stica del ADN, su secuencia de
bases. Pocos a�os despu�s lograron su objetivo, y compartieron el
Premio Nobel de qu�mica en 1980. Las t�cnicas de secuenciaci�n
actuales (v�ase el recuadro II.5) son usadas abundantemente e,
inclusive, han sido automatizadas. A la fecha, genes de las m�s diversas
fuentes han sido secuenciados, acumulando una base de datos que
representa cientos de millones de nucle�tidos: Esta cantidad crece a
paso inexorable y se espera que lo haga cada vez m�s aceleradamente .

C. Vectores para el clonaje

Adem�s de las enzimas que hacen posible la transformaci�n y

manipulaci�n del DNA, hay otro elemento indispensable para el trabajo
del ingeniero gen�tico: los vectores. Los vectores no son m�s que los
portadores del fragmento de DNA que se quiere aislar o �clonar�.
Se usan tres tipos de vectores diferentes:

. Pl�smidos
. Fagos
. C�smidos

Pl�smidos: Son mol�culas de DNA circular de doble cadena

extracromosomales presentes en bacterias que son capaces de
autoreplicarse.

Fueron descubiertos en bacterias, quienes adem�s de sus

cromosomas principales de 4x 106 bp, poseen estos elementos de
peque�o tama�o (~103 bp). Ellos fueron descubiertos como
elementos portadores de la resistencia a antibi�ticos. El hecho de que
estos genes de resistencia a antibi�ticos fueran hallados en pl�smidos
no fue una casualidad ya que la resistencia a antibi�ticos requiere de
grandes cantidades de enzima que neutralice quimicamente los
antibi�ticos. Al estar presentes en un No. De copias mayor que lo que
estuvieran representados en el cromosoma principal.

- En la naturaleza existen una amplia diversidad de estas mol�culas.

Ellos especifican:
. Resistencia a antibi�ticos
. Resistencia a metales pesados
. Sensibilidad a mut�genos
. Sensibilidad o resistencia a fagos
. Producci�n de enzimas de restricci�n
. Producci�n de amino�cidos raros
. Catabolismo de sustancias complejas

La replicaci�n de los pl�smidos puede o no requerir de prote�nas

codificadas por ellos y puede o no estar sincronizada con la del
cromosoma bacteriano.

Ya en la d�cada de los 70, en los primeros trabajos de Biolog�a

Molecular y de I.G. se construyeron muchos pl�smidos naturales para
ser usados como vectores
Todos los pl�smidos que se usan como vectores poseen tres
caracter�sticas comunes:

1. Un sitio replicador
2. Un marcador de selecci�n
3. Un sitio de clonaje (Polylinker o Multiple cloning site)

. Sitio replicador: El replicador es el segmento de DNA que

contiene el sitio a partir del cual se comienza a replicar el DNA
usualmente llamado origen de replicaci�n: ORI. Este sitio incluye
los genes que codifican para las prote�nas y RNAs que se
requieren para la replicaci�n. El n�mero de copias de un pl�smido
puede ser alto o bajo en dependencia del control al que est�n
sometido los replicadores. Este control puede ser de dos tipos:
relajado o restringido

Control relajado: La replicaci�n del pl�smido no depende de las

prote�nas sintetizados al comienzo del ciclo celular bacteriano:
prote�nas de la iniciaci�n de la replicaci�n. Por tanto estos
pl�smidos se pueden amplificar aun cuando se trate la cepa
bacteriana con inhibidores de la s�ntesis de prote�nas
(cloranfenicol). Produce un n�mero de copias alto del pl�smido
(>20 copias por c�lula en condiciones determinadas)

Control restringido: La replicaci�n precisa de la s�ntesis de

prote�nas inestables que participan en la iniciaci�n de la
replicaci�n y por tanto est� sincronizada con el ciclo celular o sea
con la replicaci�n del cromosoma bacteriano. Produce un bajo
n�mero de copias (<20 copias por c�lula)

. Marcadores de Selecci�n: Los marcadores de selecci�n m�s

usados sobre todo en bacteria son genes que codifican para la
resistencia a determinados antibi�ticos. Los antibi�ticos son
sustancias qu�micas que producen la muerte de los
microorganismos pero son relativamente poco t�xicos a las c�lulas
eucari�ticas.

Los vectores plasm�dicos o de fagos portan genes para la

resistencia a estos antibi�ticos. Estos genes son normalmente
dominantes y por lo tanto las c�lulas que los contengan pueden
ser identificadas por su capacidad de crecer y formar colonias en
presencia del antibi�tico. Los pl�smidos que contienen tales genes
le confieren a las c�lulas donde son isertados la capacidad de vivir
en presencia de tales sustancias.

Los antibi�ticos se a�aden usualmente a medio s�lido reci�n

autoclavado antes que la temperatura haya disminuido por debajo
de 50 oC. En casos de emergencia se pueden a�adir directamente
a placas ya preparadas, dando tiempo para que el antibi�tico
pueda difundir (~60 min). Se deben guardar a 4 oC pues los
antibi�ticos pierden potencia a RT. Algunos como la Tet y la
Rifampicina deben guardarse en la oscuridad pues son sensibles a
la luz En levaduras se emplea la auxotrofia a determinados
amino�cidos como marcadores de selecci�n.

. Sitio de Clonaje: Es una regi�n donde un n�mero diverso de

enzimas de restricci�n tienen sitios de reconocimiento y por tanto
pueden insertarse el DNA for�neo sin causar interferencias ni con
la habilidad del pl�smido de replicarse ni con su capacidad de
conferirle a la cepa hospedera la resistencia a antibi�ticos.
Usualmente se le conoce con el nombre de Multiple Cloning Site o
Polylinker

Lecci�n 23: La Reacci�n en cadena de Polimerasa (PCR)

Otro de los avances metodol�gicos m�s importantes es la reacci�n en

cadena de polimerasa (PCR, siglas en ingles polymerase chain reaction).
Este procedimiento constituye un ejemplo sumamente interesante de la
importancia de la metodolog�a en el desarrollo cient�fico. Tambi�n ilustra
la manera como ocurren muchos de los descubrimientos: a partir de
intuiciones que integran conocimientos que han estado disponibles
durante cierto tiempo.

En efecto hacia 1985 �con el ADN recombinante ya plenamente

establecido como una t�cnica aplicada rutinariamente por cientos de
laboratorios en el mundo�, Kary Mullis, quien a la saz�n trabajaba para
la compa��a Cetus, en San Francisco, California, tuvo una s�bita
inspiraci�n mientras manejaba su auto y se dirig�a hacia una caba�a en
la que se dispon�a descansar el fin de semana. Como muchos otros
investigadores, Mullis se encontraba desarrollando aplicaciones para los
oligos sint�ticos. Concibi� entonces la idea de que combinando el uso de
los oligos con varios ciclos de replicaci�n in vitro se pod�a amplificar, es
decir; obtener en gran cantidad, un segmento de ADN espec�fico (por
ejemplo, un gene en particular).

En esencia la idea consiste en que la enzima ADN polimerasa participa

en la replicaci�n del ADN (Ver fig. 3) . Para convertir una mol�cula de
ADN de doble cadena en dos mol�culas id�nticas, la enzima requiere
que las cadenas de la mol�cula inicial se separen, para as� tener un
molde disponible.

Adem�s, la enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre,

que sirve para cebar o iniciar la reacci�n de replicaci�n y los nucle�tidos
precursores. Si se colocan estos sustratos en un tubo de ensayo, la ADN
polimerasa puede incorporar uno por uno los nucle�tidos
correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar� T en
la cadena creciente; frente a G, C, etc.

En realidad, �ste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde

mucho antes de que se concibiera la t�cnica de la PCR. Lo original de la
idea de la concepci�n de Mullis fue pensar qu� suceder�a si se aplica
este procedimiento en ciclos sucesivos, en una reacci�n en cadena. Los
oligos sint�ticos, en virtud de su propiedad de hibridaci�n de los �cidos
nucleicos, definen los puntos de partida para el copiado de las cadenas
de ADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia define los extremos de
un segmento determinado de ADN, se hacen hibridar con las hebras del
molde, previamente separadas, y se someten a una reacci�n con ADN
polimerasa, de lo que resultar�n dos mol�culas cuyos extremos est�n
definidos por los oligos y que corren en sentido opuesto. Las cadenas
resultantes son complementarias entre si: existen ahora el doble de
mol�culas con la secuencia que demarcan los oligos. , por lo tanto s� el
proceso se replica c�clicamente entonces, la replicaci�n del ADN, ser�
exponencial. En el siguiente ciclo de separaci�n de cadenas, hibridaci�n
con los oligos y reacci�n con ADN polimerasa, se obtendr�n cuatro
mol�culas de la regi�n entre los oligos. Los ciclos subsiguientes
generar�n 8, 16, 32, 64 mol�culas, y as� sucesivamente. (Fig. 24 )
Fig. 24: Replicaci�n del ADN, utilizando (PCR)

Fuente: Raven, J. 2002

As�, con la t�cnica de la PCR se pueden amplificar segmentos espec�ficos

de ADN para crear muchos millones de mol�culas a partir de unas
cuantas, o incluso de una sola. Para esto se requiri� adaptar el concepto
b�sico haciendo uso de ADN polimerasas provenientes de
microorganismos term�filos (que crecen a temperaturas de m�s de 70
grados en manantiales termales). De otra manera, la enzima se
inactivaba cada ciclo, pues se requiere aplicar calor para separar las
mol�culas del ADN molde. Hoy d�a un ciclo puede tomar cinco minutos o
menos, por lo que el proceso de amplificaci�n se lleva a cabo en menos
de dos horas (normalmente 20 o 30 ciclos son suficientes).

La aplicaci�n de la PCR, en s� misma, constituye un avance

revolucionario en la investigaci�n biol�gica moderna.

Lecci�n 24: Mutag�nesis

La tecnolog�a del DNA recombinante ha abierto todo un nuevo campo de

mutag�nesis. Mientras que los mut�genos convencionales act�an al
azar, mediante el uso de DNA sint�tico y las t�cnicas del DNA
recombinante es posible introducir mutaciones en sitos determinados
con toda precisi�n en los genes. Este proceso se denomina mutag�nesis
dirigida. Es de esperar que las prote�nas fabricadas a partir de cepas que
cuyas mutaciones tengan propiedades diferentes de las prote�nas de las
cepas silvestres, propiedades que pueden predecirse al conocerse la
estructura de la prote�na. A continuaci�n se esquematiza los
procedimientos b�sicos utilizados en esta t�cnica (Fig. 25)

Figura 25: Mutag�nesis

Lecci�n 24: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos

Consiste en sintetizar un corto oligo desoxirribonucleotido que contenga

el cambio de bases deseado y dejar que se hibride con un ADN
monocatenario que contenga el gen de inter�s.

El procedimiento completo de mutagenesis dirigida, ha

sido modificado continuamente, encaminadas a
incrementar la tasa de mutantes obtenido, se debe
empezar con el gen de inter�s clonado en un ADN
monocatenario. Un vector ampliamente utilizado para la
mutag�nesis dirigida es el bacteri�fago M13que tiene
propiedades �tiles en la tecnolog�a del ADFN
recombinante. El AFN diana se clona en M13. Como las
c�lulas infectadas con este fago permanece viva, se
dispone de una fuente continua de ADN

Esta tecnolog�a puede utilizarse para obtener un gen

completo. Insertado en la localizaci�n deseada. Aunque es
dif�cil sintetizar el gen de una sola pieza, se lo puede
obtener por partes y luego unirlo para producir el gen
completo. A�adiendo sitios adecuados en los extremos del
gen, �ste puede unirse luego a un vector y ser clonado. Las
posibilidades de este m�todo son pr�cticamente
ilimitadas.

Fig. 26 Mutag�nesis dirigida, utilizando

cortos fragmentos de oligo
desoxirribonuce�tido

Fuente: Brock, Biolog�a de los microorganismos,

1998
Lecci�n 25: Mutag�nesis en Casette o interrupci�n g�nica

Fig. 27 Interrupci�n de un gen utilizando la

mutaci�n por casette: (a) Un plasmado
que contiene una copia clonada del gen X
del tipo silvestre se corta con la enzima de
restricci�n EcoRi u se mezcla con un
fragmento de ADN (la casette dela
kanamicina y que se ha obtenido
utilizando la misma enzima de restricci�n.
Se ligan el pl�smido cortado y la casete. (b)
El producto dela uni�n es un pl�smido que
ahora contiene la casette de la kanamicina
como una mutaci�n por inserci�n dentro
del gen X. (c) La c�lula transformada
contiene el pl�smido linealizado con un
gen X interrumpido y su propio
cromosoma con una copia del gen del tipo
silvestre.

Fuente: Brock, Biolog�a de los microorganismos, 1998

CAPITULO 6: APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE:

Sin lugar a dudas, estas t�cnicas han revolucionado la forma obtener

productos y su comercializaci�n, sin embargo existen todav�a muchos
inconvenientes de costos y �ticos que aun no se han resuelto. Una de
las mayores controversias se ha suscitado ha ra�z de la obtenci�n de
animales y vegetales transg�nicos con fines terap�uticos y /o
alimenticios.
Lecci�n 26: Animales Transg�nicos

Las investigaciones con sistemas de microinyecci�n y cultivo de

embriones, en la actualidad, permiten introducir genes a varias especies
en forma estable, entre las que se encuentran entre otros animales
como las ovejas.. A partir de las ovejas se obtienen grandes cantidades
de leche, rica en prote�nas. En efecto, en la medida que sabemos acerca
de la expresi�n de los genes de la gl�ndula mamaria, podemos pensar
en manipular este sistema para que se elaboren en ella productos
diferentes. Utilizando estos conceptos, ya existen los primeros animales
transg�nicos que producen prote�nas de inter�s m�dico.

La posibilidad de utilizar "granjas moleculares" en las que los animales

producen leche prote�nas de alt�simo valor y utilidad es realmente un
triunfo may�sculo de la biotecnolog�a moderna.( Fig7). Con gran
seguridad, en pocos a�os los enfermos con deficiencias de alguna de
estas prote�nas, por ejemplo los hemof�licos, dispondr�n de una fuente
relativamente barata para conseguirlas. Recientemente se anunci� ya la
obtenci�n de vacas transg�nicas.

Los animales transg�nicos tambi�n pueden usarse para muchos otros

prop�sitos.

Fig.28. Mejoramiento gen�tico de

bovinos

Fuente: Raven, J. Biology, 2002

Lecci�n 27: Plantas transg�nicas

Las posibilidades de beneficiarnos a trav�s del mejoramiento gen�tico

de las plantas ya existentes por medio del trasplante de genes es
enorme, puesto que uno de los problemas que se han generado a partir
del cultivo intensivo es el uso exagerado de fertilizantes y pesticidas.
Debido a esto, el desarrollo de bioinsecticidas ha recibido importante
atenci�n en los �ltimos tiempos. En particular, el microorganismo,
Bacillus thuringiensis, que naturalmente produce una prote�na t�xica
(toxina BT) para diversas especies de artr�podos (insectos y ar�cnidos,
por ejemplo). Estas bacterias pueden ser cultivadas y administradas a
los cultivos, y constituyen un insecticida biodegradable y seguro. El paso
siguiente consisti� en introducir el gene que codifica para esta toxina a
una planta de tabaco (por supuesto fusionado a una regi�n regulatoria
que permitiera su expresi�n en la planta, particularmente en las hojas).
Las plantas transg�nicas resultantes son inmunes a las larvas de
palomillas que normalmente merman este cultivo. Al cabo de consumir
un poco de la hoja, la larva se vuelve inactiva y muere, envenenada por
la toxina BT. Es importante resaltar que esta toxina es completamente
inocua para otros animales, incluido, desde luego, el ser humano.

Una caracter�stica muy interesante del reino de las plantas es que para
vivir se han adaptado a ambientes extremos, ya que no pueden huir de
ellos. As�, encontrarnos plantas capaces de vivir en condiciones de
sequ�a, salinidad, etc. Tambi�n los vegetales han desarrollado funciones
para defenderse de ser ingeridas indiscriminadamente. Cada especie
animal gusta s�lo de ciertas plantas y las puede comer sin enfermarse.(
Por encima de todo esto, los seres humanos tendemos a ser muy
selectivos en nuestra alimentaci�n. Algunos de nosotros s�lo
compramos frijol "flor de mayo", sin importarnos si nos resulta un poco
m�s caro, o si sus propiedades alimenticias no son tan buenas como las
de alguna otra variedad. As� que no todas las caracter�sticas apreciadas
se encuentran juntas en la misma planta. T�picamente encontraremos
que unas variedades son sabrosas, otras son nutritivas, otras m�s,
resistentes a las inclemencias del clima, etc�tera.)

La nueva biotecnolog�a de plantas permitir� ir introduciendo, al

principio uno por uno, los genes que se vayan identificando como
responsables de conferir ciertas caracter�sticas atractivas a las
variedades de plantas que son m�s �tiles. (Fig. 29)
Fig. 29 .Ejemplo de plantas gen�ticamente
modificas

Fuente: Wisseman A, Principios de Biotecnolog�a .1886

Lecci�n 28: Alimentos gen�ticamente modificados

La demanda de alimento global ha aumentado la necesidad de cultivos

mejorados. la biotecnolog�a ofrece la tecnolog�a necesaria para producir
alimentos m�s nutritivos y de mejor sabor, rendimientos m�s altos de
cosecha y plantas que se protegen naturalmente contra enfermedades,
insectos y condiciones adversas.

esto permite efectuar la selecci�n de un rasgo gen�tico espec�fico de un

organismo e introducir ese rasgo en el c�digo gen�tico del organismo
fuente del alimento, por medio de t�cnicas de ingenier�a gen�tica. esto
ha hecho posible que se desarrollen cultivos para alimentaci�n con
rasgos ventajosos espec�ficos u otros sin rasgos indeseables.
Resumiendo, se puede decir que la biotecnolog�a tiene un ampl�simo
rango de aplicaci�n en la industria alimenticia, ofreciendo los medios
para producir alimentos de mejor calidad en forma m�s eficiente y
segura para la salud y el medio ambiente. una de las promesas de la
biotecnolog�a es generar innovaciones y mejoras en los alimentos
conduciendo a pr�cticas agr�colas m�s ecol�gicas, contribuyendo a una
agricultura sustentable que utiliza con respecto los recursos del
medioambiente.

El �rea de mayor aplicaci�n de la biotecnolog�a en alimentos y la m�s

antigua, corresponde a las fermentaciones, de gran importancia dentro
de la tecnolog�a de alimentos y que abarca varios campos, como
fermentaciones alcoh�licas, fermentaciones c�rnicas y fermentaciones
l�cticas.

El �rea m�s reciente y de mayor proyecci�n dentro de la biotecnolog�a

de alimentos est� en el desarrollo de alimentos gen�ticamente
modificados o transg�nicos, cuyas principales ventajas se ven en
mejoras nutricionales, mayor productividad de cosechas y mayor
protecci�n medioambiental. Adem�s, alimentos gm poseen hoy en d�a
gran importancia en las soluciones de graves problemas de escasez de
alimentos, desnutrici�n y problemas de salud p�blica en general del
mundo en v�as de desarrollo.

Lecci�n 29: Alimentos funcionales

El concepto de alimento funcional se emplea para describir a aquellos

alimentos adicionados con ingredientes de diversas clases y or�genes
que pueden ejercer efectos beneficiosos sobre quien

los ingiere. Este concepto surgido en Jap�n ha ido populariz�ndose y

expandi�ndose hacia otros continentes como Europa fundamentalmente
debido a la preocupaci�n sobre la nutrici�n, la dieta y la salud de la
sociedad actual. Los pro bi�ticos representan una gran �rea dentro de
los alimentos funcionales y se ha intensificado la investigaci�n para
desarrollar productos pro bi�ticos y profundizar en el conocimiento de
los efectos sobre la salud humana. Los pro bi�ticos se definen como
"suplementos alimentarios microbianos vivos que afectan de forma
ventajosa al animal hu�sped mejorando su equilibrio intestinal
microbiano". Son microorganismos que estimulan las funciones
protectoras del tracto digestivo, y tambi�n son conocidos como
bioterap�uticos, bioprotectores o bioprofilacticos, ya que se utilizan para
prevenir las infecciones ent�ricas y gastrointestinales. Un
microorganismo prebi�tico efectivo debe poseer una serie de
caracter�sticas: no ha de ser no pat�geno ni toxico, debe ejercer efectos
beneficiosos sobre la salud de quien lo ingiere, tener origen humano, ha
de ser tecnol�gicamente utilizable, ha de presentar un elevado
porcentaje de c�lulas viables, debe ser capaz de sobrevivir a la flora
intestinal, ha de permanecer viable durante su almacenamiento en
refrigeraci�n, y tener capacidad de adherirse a la superficie mucosa, etc.
El establecimiento de criterios de selecci�n y controles de calidad para
productos pro bi�tico se considera una prioridad debido a la r�pida
incorporaci�n de estos productos en el mercado y su distribuci�n en el
�mbito internacional sin la existencia previa de una normativa
com�nmente aceptada. En los �ltimos a�os ha aumentado el inter�s por
los productos elaborados con microorganismos pro bi�tico,
perteneciente a los g�neros Lactobacillus y Bifidobac.

Por otra parte, los prebi�ticos son ingredientes no digeribles que afectan
ben�ficamente al hospedero estimulando selectivamente a un n�mero
limitado de bacterias del colon promoviendo el crecimiento, la actividad
o los dos aspectos en estas poblaciones microbianas. Los dos prebi�ticos
m�s estudiados son los fructo-oligosacaridos o FOS conocidos como
oligofructosa e inulina. Otras de las sustancias m�s comercializadas
est�n:

. Fructooligosacaridos-Suntory(Jap�n),
. Isomaltooligosacarido, Showa Sangyo(Jap�n)
. Oligomate(galactooligosacaridos) -
. Yakult(Jap�n)
. Palatinosa-Sudzucker(Alemania)
. polidextrosa

.Estos carbohidratos presentes en vegetales como ajo, cebolla, puerros,

esparrago, alcachofas, tomates, pl�tanos, entre otros.

Lecci�n 30: Probi�ticos: es de origen griego y significa "a favor de la

vida� este t�rmino se utiliza para bacterias ben�ficas que viven en el
cuerpo de los animales o del hombre trabajando en simbiosis con el
hospedero. Entre las bacterias que presentan esta caracter�stica se
puede mencionar a Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus,
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
infantis

Este tipo de microorganismos se consideran como la primera l�nea de

defensa de nuestro cuerpo contra los microorganismos potencialmente
pat�genos que se inhalan o ingieren. Estas bacterias est�n presentes en
la piel, la boca, el sistema digestivo y la mucosa vaginal, donde realizan
numerosas e indispensables funciones para proteger al cuerpo y los
�rganos contra las bacterias pat�genas. Entre los mecanismos por los
cuales act�an estas bacterias se pueden mencionar: primero, la
transformaci�n de la lactosa en acido l�ctico, este ultimo compuesto
funciona como un antis�ptico del sistema digestivo, segundo, el acido
l�ctico facilita la absorci�n del calcio y fosforo contenido en la leche,
tercero, el aumento de la poblaci�n bacteriana ben�fica suministrada en
alimentos, incrementa la producci�n de vitamina B6 potenciando y
fortaleciendo el sistema inmunol�gico. Cuarto, Al mismo tiempo
minimizan la proliferaci�n de agentes pat�genos peligrosos responsables
de graves enfermedades seguidas de muerte compitiendo por
alojamiento o espacio f�sico en las paredes intestinales. Quinto, los
microorganismos prebi�ticos pueden sintetizar bacteriocinas, las cuales
son sustancias que inhiben el crecimiento de bacterias pat�genas.

Un producto para que sea considerado como pro bi�tico debe reunir las
siguientes caracter�sticas:

. Contienen microorganismos vivos que pueden estar refrigeradas o

en estado fresco o en productos fermentados, pueden estar en
alimentos, capsulas o p�ldoras)
. Mejoran la salud y el bienestar de animales y humanos
(Contribuyen al crecimiento de los animales)
. Pueden afectar todas las superficies mucosas del hospedero
incluyendo la boca y el tracto gastro intestinal, el tracto
respiratorio superior o el tracto urogenital

A los alimentos que contienen estos microorganismos se los denomina

como �alimentos funcionales�. Los cuales tienen una amplia aceptaci�n
en la poblaci�n de los pa�ses desarrollados, lo que ha generado una
contribuci�n significativa a la expansi�n de estos productos en el
mercado. El t�rmino �alimento funcional� se origina en la d�cada de los
80s en el Jap�n, donde los alimentos se suplementaban con otros
ingredientes que beneficiaban la salud del consumidor. Las definiciones
de alimento funcional var�an considerablemente a lo largo de los a�os
debido al gran desarrollo de este sector, los ingredientes de los
alimentos funcionales incluyen los pro bi�ticos, prebi�ticos, vitaminas, y
minerales.

AUTOEVALUACI�N

Realice un Glosario de la Unidad estudiada. Recuerde que para ello es

necesario sacar palabras o conceptos que encuentran en el texto;
organizarlos por orden alfab�tico y definirlos de acuerdo a las
caracter�sticas esenciales de cada uno.
Realice un mapa conceptual sobre las diferentes t�cnicas de ingenier�a
gen�tica aplicadas a la industria alimentaria. Para ello, tenga en cuenta,
las caracter�sticas y procedimiento de cada una.

Organice un foro con sus compa�eros sobre las ventajas y desventajas

de los alimentos Gm en la alimentaci�n mundial, saque las conclusiones
correspondientes y pres�ntelas en un informe. Para ello busque
informaci�n en p�ginas Web.
UNIDAD 3

CAPITULO 7: APLICACI�N DE LA BIOTECNOLOG�A EN LA OBTENCI�N DE PRODUCTOS

DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERG�TICO POR V�A FERMENTATIVA.

Lecci�n 31: Bebidas alcoh�licas

Lecci�n 32: Biolog�a de las fermentaciones con levaduras y condiciones de la

fermentaci�n

Lecci�n 33: Compuestos organol�pticos

Lecci�n 34 : Alimentos basados en soja fermentada

Lecci�n 35 : Productos c�rnicos fermentados

CAP�TULO OCHO: OTROS PRODUCTOS DE INTER�S EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Lecci�n 36: Producci�n de Biomasa

Lecci�n 37 : Vinagre

lecci�n 38 : acido L�ctico

lecci�n 39: acido Ac�tico

Lecci�n 40 : Producci�n de acido c�trico

CAPITULO NUEVE �: BIOPOLIMEROS MICROBIANOS

Lecci�n 41 : Polisac�ridos microbianos y PHAs

Lecci�n 42: Poli hidroxibutirato

Lecci�n 43: Los alginatosy Gelanos

Lecci�n 44: Xantano

Lecci�n 45: Dextranos

UNIDAD 3: PRODUCTOS BIOTECNOL�GICOS DE INTERES
ALIMENTARIO

INTRODUCCI�N Los microorganismos han sido utilizados durante

siglos para modificar los alimentos, y tanto �stos como las bebidas
fermentadas constituyen un sector primario y extremadamente
importante de la industria aumentar�a. En esta Unidad se describir�n
algunos procesos para la obtenci�n de compuestos derivados del
metabolismo energ�tico (fermentaci�n), metabolismo intermedio y
bios�ntesis:

Objetivos de la Unidad

*
Estudiar diferentes procedimientos Biotecnol�gicos utilizados en la
obtenci�n de productos de inter�s alimentario
*
Identificar los diferentes microorganismos y condiciones de cultivo
en cada unos de los bioprocesos utilizados para la obtenci�n de
productos de inter�s alimentario
*
Brindarle a los estudiantes herramientas tecnol�gicas que les
permita desarrollar productos Biotecnol�gicos de inter�s alimentario

Capitulo 7: APLICACI�N DE LA BIOTECNOLOG�A EN LA

OBTENCI�N DE PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO
ENERG�TICO POR V�A FERMENTATIVA.

Lecci�n 31: Bebidas alcoh�licas

Las bebidas alcoh�licas se producen a partir de diversas materias

primas, pero especialmente a partir de cereales, frutas y productos
azucarados. Entre ellas hay bebidas no destiladas, como la cerveza, el
vino, la sidra y el sake, y destiladas, como el whisky y el ron, que se
obtienen a partir de cereales y melazas fermentadas, respectivamente,
en tanto que el brandy se obtiene por destilaci�n. del vino. Otras
bebidas destiladas, por ejemplo el vodka y la ginebra, se elaboran a
partir de bebidas alcoh�licas neutras obtenidas por destilaci�n de
melazas, cereales, patatas o lactosuero Fermentados. Adem�s tambi�n
se obtienen una gran variedad de vinos de alta graduaci�n mediante
adici�n de alcohol destilado a los vinos normales con objeto de elevar su
contenido alcoh�lico hasta el 15 o el 20 %; entre �stos se incluyen
productos tan notables como el jerez, el aporto y el madeira.
Un detalle com�n importante en la producci�n de todas estas bebidas
alcoh�licas es el empleo de levaduras para convenir los az�cares en
etanol. Por consiguiente, la primera parte de esta secci�n se concentrar�
en la biolog�a de las fermentaciones de levaduras y seguidamente se
discutir�n los procesos concretos de obtenci�n de la cerveza, el whisky y
el vino.

Lecci�n 32: Biolog�a de las fermentaciones con levaduras

Aproximadamente el 96 % de la fermentaci�n del etanol se lleva a cabo

mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas,
particularmente S. uvarum. El etanol se produce en la ruta de Embden-
Meyerhof-Parnas (EMP), en la que el piruvato producido durante la
glicosilaci�n se convierte en acetaldeh�do y etanol. La reacci�n global es
la siguiente:

Glucosa + 2ADP-2 Etanol + 2CO~ + 2ATP

El rendimiento te�rico de 1 g de glucosa es de 0,51 g de etanol y 0,49 g

de CO2. Sin embargo, en la pr�ctica, aproximadamente el 10 % de la
glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento en etanol y CO2
alcanzan el 90 % del valor te�rico. El ATP formado se utiliza para las
necesidades energ�ticas de la c�lula.

La envoltura de la c�lula de levadura incluye una membrana plasm�tica,

un espacio peripl�smico y una pared celular constituida principalmente
por polisac�ridos y una peque�a cantidad de p�ptidos. La pared tiene
una estructura semirr�gida permeable al soluto que proporciona a las
levaduras una considerable fuerza compresional y tensil. Los grupos
carboxilo de los p�ptidos de la pared celular confieren a las levaduras
utilizadas en la elaboraci�n de cerveza una capacidad de floculaci�n
importante, lo que facilita la separaci�n s�lido-l�quido despu�s de la
fermentaci�n. Se cree que la floculaci�n se debe a la formaci�n de
puentes salinos entre los iones calcio y estos grupos carboxilo de la
pared celular.

Condiciones de la fermentaci�n

En la fermentaci�n las levaduras utilizadas para la elaboraci�n de

cerveza (S. cerevisiae) utilizan los az�cares sacarosa, fructosa, maltosa
y maltotriosa en este orden. La sacarosa es hidrolizada primeramente
por la invertasa localizada en el espacio peripl�smico extracelular. Los
az�cares son transportados a trav�s de la membrana celular por
transporte activo o pasivo mediado por permeasas producidas
constitutivamente o inducibles. La maltosa y la maltotriosa son
hidrolizadas intracelularmente por la a-glucosidasa, Saccharomyces
uvarum (S. car/sbergensis) se distingue taxon�micamente del S.
cerevisiae en que tambi�n Utiliza melibiosa. El Kluyveromyces fragilis y
Kluyveromyces lactis, que a diferencia de S: cerevisiae pueden
fermentar la lactosa, tienen un sistema lactosa-permeasa para
transportar la lactosa dentro de la c�lula, donde se hidroliza a glucosa y
galactosa, que entran en la glic�lisis. Excepto los Saccharomyces
diasraucus, que no son adecuadas para la elaboraci�n de cerveza todas
las levaduras Saccharomyces son incapaces de hidrolizar el almid�n y
las dextrinas, y por consiguiente, el empleo de materiales basados en
almid�n para la fermentaci�n alcoh�lica requieren la acci�n de enzimas
ex�genos como las a y �-amilasas de la malta o enzimas microbianos
como a-amilasa, amiloglucosidasa (glucoamilasa) y pululanasa. Los
az�cares mayoritarios del mosto son la glucosa y la fructosa y puesto
que el S. cerevisiae metaboliza preferencialmente la glucosa; el az�car
no fermentado que permanece en el vino resultante es la fructosa. Por
el contrario, las levaduras del vino de Saurernes fermeman la fructosa
m�s r�pidamente que la glucosa.

El mosto de cerveza producido a partir de malta contiene 19

amino�cidos adem�s de otros nutrientes. Estos amino�cldos son
asimilados a distintas velocidades durante la fermentaci�n. Un
amino�cido permeasa general (GAP puede transportar todos los
amino�cidos b�sicos y neutros excepto la prolina. En las levaduras
existen al menos otros 11 sistemas de transpone de amino�cidos m�s
espec�ficos. La prol�n permeasa es inhibida por otros amino�cidos: por el
amon�aco.

Aunque !as fermentaciones alcoh�licas son en gran medida anaer�bicas.

las levaduras necesitan algo de ox�geno para sinterizar algunos esteroles
y �cidos grasas insaturados componentes de la membrana. El mosto de
la cerveza contiene normalmente niveles sub�ptimos de esteroles y
�cidos grasos insaturados. pero cuando el medio se suplementa con
�cido oleico u oleanoico, la necesidad de ox�geno desaparece.

Muchas cepas de S. cerevisiae pueden producir concentraciones de

etanol de hasta el 12-14 Existe un cierto inter�s en el empleo de
levaduras tolerantes de cantidades elevadas de alcohol en los procesos
de fabricaci�n de cerveza con gravedad elevada y la producci�n de
alcohol para la destilaci�n con vistas a incrementar la productividad de
la planta y disminuir los costos de destilaci�n. Existen cepas
seleccionadas capaces de producir hasta un 18-20 % de alcohol, aunque
la velocidad de fermentaci�n se ve fuertemente reducida cando la
concentraci�n de etanol aumenta. Los mostos con un contenido muy
elevado de az�cares fermentan �nicamente con levaduras osmof�licas
como Saccharomyces rouxii y S. bailli, que poseen una gran capacidad
para fermentar la fructosa.
La composici�n en fosfol�pidos de la membrana plasm�tica es
importante para la tolerancia del etanol, observ�ndose un incremento
de �sta cuando el contenido de �cidos grasos insaturados aumenta. La
tolerancia alcoh�lica puede elevarse suplementando el medio de
crecimiento con �cidos grasos insaturados, vitaminas y prote�nas. Los
factores fisiol�gicos tales como la forma de aporte del substrato, la
acumulaci�n de etanol intracelular, la presi�n osm�tica y la tem-
peratura influyen en la tolerancia de las levaduras al etanol. Los
enzimas glicol�ticos de las levaduras, hexoquinasa, gliceraldeh�do-3-
fosfato deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa son sensibles a la
concentraci�n de etanol. .

En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la

mayor�a de las veces favorables al crecimiento y actividad fermentar�a;
esta �ltima es mayor cuanto mayor sea el pH y se produce una ca�da
notable a valores de pH de 3-4. El pH influye en la formaci�n de
subproductos; por ejemplo, a valores de pH elevados se incrementa la
formaci�n de glicerol. El pH del mosto de uva est� generalmente
comprendido entre 3 y 3,9 debido a su elevado contenido de �cidos
(5-15 g/I), principalmente tart�rico y m�lico, de forma que, como la
mayor�a de las bacterias, con excepci�n de las bacterias del �cido
ac�tico y l�ctico prefieren pH m�s neutros, la susceptibilidad del mosto
de vino a la contaminaci�n bacteriana es reducida.

Las temperaturas �ptimas de la fermentaci�n, la respiraci�n de las

levaduras y el crecimiento celular son claramente diferentes. La
velocidad de fermentaci�n aumenta. generalmente con la temperatura
entre los 15 y los 35�C y los niveles de glicerol, acetona, buteno-2,3-
diol, acetaldeh�do, piruvato y 2-cetoglutarato se elevan en los caldos
de fermentaci�n. La formaci�n de niveles elevados de alcohol tambi�n
depende de la temperatura. En los vinos blancos, la menor
temperatura de fermentaci�n da lugar a vinos m�s frescos y afrutados,
y el riesgo de infecci�n bacteriana y de producci�n de �cidos vol�tiles
como resultado es reducido. Para la producci�n de vino tinto se utilizan
temperaturas m�s elevadas, de 22 a 30oC, y la fermentaci�n con los
hollejos conduce a la intensificaci�n del color y a la producci�n de un
rico aroma.

Lecci�n 33: Compuestos

organol�pticos:

En la producci�n de bebidas alcoh�licas deben controlarse las

fermentaciones de forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos
y otros nutrientes y se conviertan en alcohol y en compuestos con
aromas caracter�sticos y deseables, y por otro lado, se minimice la
formaci�n de aromas y sabores indeseables. Entre los componentes del
aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del etanol,
�steres, compuestos carb�nicos, �cidos org�nicos, compuestos
azufrados, aminas y fenoles.

Cuantitativamente, y en funci�n de su papel en el aroma y sabor, los

componentes m�s importantes presentes en las bebidas alcoh�licas son
los alcoholes superiores, denominados tambi�n alcoholes de fusel o
aceites de fusel, entre los cuales los m�s significativos en la cerveza Y el
vino son el alcohol amlilico, el isoam�lico y el 2-fenoetanol. El vino tinto
tiene una concentraci�n mayor de estos compuestos que el vino blanco.
Las bebidas destiladas tienen un espectro bastante diferente de
alcoholes superiores, que incluyen butanoles y pemanoles. El glicerol,
alcohol polih�drico, est� presente en casi todas las bebidas alcoh�licas.
En el vino, el glicerol se encuentra a concentraciones de hasta el 1 %
(peso/volumen) y confiere cuerpo a esta bebida.

En muchas bebidas y licores, los �steres constituyen un grupo

importante de compuestos vol�tiles debido a su penetrante aroma
afrutado. Entre ellos, el acetato de etilo est� presente en muchas
bebidas a concentraciones organol�pticamente importantes. Otros
�steres importantes incluyen el formiato de etilo y el acetato de
isoamilo.

El acetaldehido, con propiedades organol�pticas indeseables, se produce

como un compuesto intermedio durante las fermentaciones alcoh�licas,
obteni�ndose niveles altos por tasas de levaduras elevadas o excesiva
aireaci�n. El diacetilo y la pentano-2,3-diona, formados fuera de las
c�lulas de la levadura por decarboxilaci�n oxidativa del a-acetolato y el
a-cetohidroxibmirato, tienen aromas y sabores indeseables
caracter�sticos. Las levaduras pueden reducir el diacetilo y la pentano-
2,3-diona. La presencia de exceso de diacetilo en la cerveza se produce
cuando el a-acetolactato aparece en una etapa en la que las levaduras
ya han sedimentado o han perdido su capacidad para reducir el diacetilo
a aceto�na o el exceso de diacetilo en la cerveza tambi�n puede deberse
a fa presencia de organismos que la deterioran, como Pediococcus y
Lacrobacillus.

Durante la fermentaci�n primaria del mosto de la cerveza se producen

cantidades considerables de SH2 provenientes de la reducci�n de los
compuestos azufrados. Aunque en la cerveza pueden ser aceptables
cantidades peque�as de compuestos azufrados, y en la cerveza normal
el SO2 est� usualmente presente a concentraciones por debajo de su
umbral de sabor, el exceso produce aromas y sabores. desagradables. El
di�xido de azufre influye positivamente en la fermentaci�n alcoh�lica,
puesto que se une al acetaldehido y adem�s inhibe algunas de las
reacciones de oxidaci�n indeseables. En el mosto del vino, el SO2 inhibe
algunos microorganismos indeseables, entre ellos las bacterias del �cido
l�ctico y �cido ac�tico, as� como algunas levaduras naturales que
producen un exceso de �cidos vol�tiles, piruvato y a-cetoglutarato.
Adem�s la producci�n del desagradable sabor del �cido ac�tico tambi�n
inhibe las fermentaciones de levaduras, particularmente combinado con
el etanol, Saccharomyces cerevisiae es m�s susceptible a esta inhibici�n
que Saccharomycoides ludwigii, Schizosaccharomyces pombe. En los
mostos cuya acidez total es baja, es muy �til emplear S02 para inhibir la
fermentaci�n malo-I�ctica por las bacterias del �cido l�ctico, impidiendo
la disminuci�n posterior del nivel de �cido. Una concentraci�n elevada
de S02 puede retrasar el comienzo de la fermentaci�n.

El bajo pH del mosto y del vino suministran un medio selectivo para el

crecimiento de las bacterias del �cido ac�tico y del �cido l�ctico, aunque
la supervivencia de !as primeras sea usualmente corta debido a las
propiedades reductoras del medio. Las bacterias l�cticas del vino son
anaerobias facultativas u organismos microf�licos que son
homofermentivos (todas las Pediococcus y algunos Lactobacillus
producen �cido l�ctico a partir de glucosa) y heterofermentivos (todos
los Leuconostoc y algunos Lactobacillus producen �cido l�ctico, etanol y
CO2 a partir de la glucosa). Las bacterias l�cticas pueden metabolizar los
�cidos m�lico y tart�rico presentes en el vino a concentraciones
elevadas, as� como al �cido c�trico, presente en cantidades m�s bajas.
Existen m�todos qu�micos para reducir la acidez. La reducci�n de los
�cidos puede impedir el deterioro de los vinos de pH elevado. A pH 3,3-
3,4, los Leuconostocoenus fermentan el �cido m�lico aunque los
Pediococcus no lo hacen. Los Lellconosto se adaptan bien a los pH bajos
y generalmente se prefieren siempre que se desee una fermentaci�n
malo-I�ctica. Una fermentaci�n malo-l�ctica por Pediococcus va con
frecuencia acompa�ada de la formaci�n de diacetilo e histamina,
indeseables.

Lecci�n 34: Alimentos basados en soja fermentada

Las fermentaciones de productos a base de saja y otras materias primas

relacionadas se llevan a cabo desde hace muchos siglos, especialmente
en Oriente. Entre las fermentaciones m�s importantes se encuentran
los procesos de producci�n de salsas de saja, misa y tempeh, ilustrados
en la Figura 30
Fuente: Crueger, Manual de Microbiolog�a industrial, 1989

Aunque existen diversos tipos de salsas de soja, la producida

predominantemente en Jap�n, denominada �koikuchi�, se obtiene por
fermentaci�n de una mezcla de saja y trigo, que da lugar a una salsa
con fuerte aroma y color marr�n-rojizo oscuro. El proceso consiste
inicialmente en una fermentaci�n primaria de una mezcla al 50 010 de
saja cocida al vapor, empapada y trigo tostado y triturado, con un nivel
de humedad del 27 al 37 %, que se extiende en bandejas y se incuba
con Aspergillus oryzae, que tiene actividad amilol�tica y proteol�tica
elevada, durante 2 � 3 d�as a 25-30 oC. Despu�s de adherirle agua
salada, para hacer que el contenido de sodio alcance el 18 %, la masa o
�moromi� se transfiere a tinas grandes donde se produce la
fermentaci�n secundaria, con bacterias holof�licas y levaduras
osmof�licas; el proceso tiene lugar a una temperatura de 35-40 oC, con
agitaci�n intermitente, y el tiempo de fermentaci�n oscila entre 2 y 12
meses. Al finalizar esta fermentaci�n secundaria, se recupera la salsa
l�quida y se pasteriza. Los enzimas producidos en la fermentaci�n
primaria o fermentaci�n �koji� hidrolizan las prote�nas a p�ptidos y
amino�cidos libres y convierten el almid�n en az�cares simples. Estos
productos de ruptura son a su vez metabolizados por otros
microorganismos, produciendo diversos compuestos aromatizantes y
saborizantes. Utilizando in�culos de levaduras, bacterias y hongos puros
el proceso de fermentaci�n se controla mejor y se obtiene un producto
de calidad, aroma y sabor consistentes.

En Oriente, las pastas de soja fermentada se preparaban

tradicionalmente en casa para su utilizaci�n en sopas y salsas. En Jap�n,
el producto, denominado misa, se elabora en la actualidad a gran
escala, mediante un proceso que implica inicialmente la fermentaci�n
koji del arroz empapado al vapor (o cebada, o soja, con menor
frecuencia), que despu�s se extiende en bandejas, se inocula con cepas
seleccionadas de A. oryzae y se incuba a 28-35 oC durante apro-
ximadamente dos d�as. A continuaci�n el material se mezcla en
recipientes con soja empapada y cocida al vapor en una relaci�n 1:2, y
se a�ade cloruro de sodio para dar una concentraci�n del 4 al 13 %, La
mezcla se inocula con bacterias y levaduras y se deja fermentar entre 1
y 52 semanas. Finalmente, el producto se amasa y se pasteriza,
pudiendo obtener distintos tipos de miso con diferentes grados de
dulzura, salinidad y color, variando la materia prima koji, el contenido
de sal, los edulcorantes y la duraci�n de la fermentaci�n.

La producci�n de tempeh se basa en una fermentaci�n en bandejas de

soja remojada cocida al vapor inoculada con Rhizopus oligosporus, e
incubada a 30-38 oC durante 24 horas. El producto, que usualmente se
corta en rebanadas, se sala y se consume frito, tiene una vida corta.

Lecci�n 35: Productos c�rnicos fermentados

La mayor�a de los productos c�rnicos fermentados consisten en fiambres

(secos o semiseco), con una relaci�n humedad-prote�na que oscila entre
1,5 y 3 a 1. En general, la etapa de fermentaci�n microbiana tiene lugar
a una temperatura �ptima, previa a la de calentamiento y/o secado.

La fermentaci�n microbiana, que da lugar a la formaci�n de �cido,

ayuda al procesado de muy distintas formas, puesto que contribuye a la
estabilidad y alarga la vida del producto, facilita la posterior eliminaci�n
de humedad y genera aromas y sabores caracter�sticos. Generalmente
se recomienda que el pH del producto sea inferior a 5,3, basados en la
creencia de que dicho valor sirve para controlar los Staphylococcus
aureus. El proceso de fermentaci�n para reducir el pH por debajo de 5,3
deber� ajustarse a las normas de seguridad temperatura/tiempo
especificadas, comprendidas entre 23,9 y 43 oC durante un per�odo de
incubaci�n de entre 80 y 18 horas. Con frecuencia se utilizan in�culos
comerciales, como los Pediococcus, que tienen una buena capacidad
para producir �cido l�ctico. Los Staphylococcus carnosus, especies
inocuas coagulasa negativas, se emplean de forma rutinaria en la
producci�n de embutidos secos. Los nitritos influyen positivamente en la
conservaci�n de la carne, puesto que controlan el desarrollo de
Clostridium botulinum. Las especies de Micrococcus capaces de reducir
los nitratos a nitritos, de forma controlada, contribuyen a la curaci�n de
la carne as� corno al control de los e boculinum. Tambi�n pueden
utilizarse cultivos �startem en el procesado del bacon, con objeto de
eliminar cualquier nitrito residual presente, disminuyendo o anulando la
formaci�n de nitrosaminas, carcin�genos, durante la fritura.

Se puede predecir que a partir del mayor empleo de los in�culos

comerciales, los procesos de fermentaci�n de los productos c�rnicos se
caracterizar�n por su elevado nivel de control del proceso, lo que dar�
lugar a productos de calidad y consistencia reproducibles y manteniendo
siempre las mayores condiciones de seguridad.

Capitulo 8: Otros productos de inter�s alimentarios

Lecci�n 37: Vinagre

El vinagre es una soluci�n acuosa de �cido ac�tico, se obtiene mediante

la fermentaci�n por oxidaci�n de una soluci�n diluida de etanol. El
proceso metab�lico se basa en la conversi�n del etanol, bajo la acci�n
del alcohol deshidrogenasa, en acetaldeh�do y del acetaldeh�do
hidratado en �cido ac�tico por la acci�n de la acetaldeh�do
deshidrogenasa:

C2H5OH.CH3CHO+H2O.CH2CH OH2.CH3COOH+H2O

La materia prima de la fermentaci�n del vinagre de alcohol (white spirit)

consiste usualmente en etanol purificado diluido. Los vinagres de vino,
sidra, malta y arroz se obtienen por fermentaci�n alcoh�lica de zumos
de uva, manzana, cebada malteada y arroz, respectivamente. La
fermentaci�n del vinagre requiere tambi�n una fuente de nitr�geno y
una combinaci�n apropiada de minerales y con frecuencia es necesaria
la suplementaci�n con nutrientes. Las modernas fermentaciones de
vinagre consisten en procesos sumergidos muy aireados. El acetator
Frings (Fig. 7.8), muy utilizado en la producci�n comercial de vinagre,
es un fermentador provisto de deflectores, cuyo fondo contiene una tur-
bina de cuerpo hueco que gira a 1.450-1.750 rpm, cuya rotaci�n hace
que el aire sea succionado a trav�s del rotar hueco y se distribuya
radialmente a lo largo de toda la secci�n trasversal del fermentador.

Los procesos comerciales t�picos, que producen �cido ac�tico del 12 al

15 OJo, se llevan a cabo de forma semicontinua. Las concentraciones de
alcohol y de �cido ac�tico al comienzo del ciclo son del 7-10 % y del 5
1110 respectivamente;

la fermentaci�n se efect�a entre 27 y 32 �e hasta que la concentraci�n

de alcohol desciende al 0,1-0,3 %, momento en el cual se descarga una
parte del vinagre (aproximadamente la tercera parte) y el recipiente se
vuelve a llenar con una mezcla que contiene del O al 2 % de �cido
ac�tico y del 12 al 15 % de etanol y el ciclo se repite. Un alcal�grafo
mide la concentraci�n de etanol y hace que las operaciones de descarga
y llenado se puedan llevar a cabo autom�ticameme, sin interrupci�n del
proceso de aireaci�n/mezclado de forma que impida el agotamiento
total del etanol en el caldo de fermentaci�n. El mezclado r�pido continuo
es esencial para minimizar los gradientes de concentraci�n. Los tiempos
del ciclo var�an de 24 a 48 horas.

Las bacterias acidoac�ticas, que oxidan el etanol a �cido ac�tico y

pueden existir a valores bajos de pH, pertenecen a los g�neros
Acetobacter y Gluconobacter, estrechamente relacionados. Los cultivos
puros de estos organismos se caracterizan por su alto grado de
variabilidad y en las fermentaciones industriales se pueden desarrollar
posteriormente cultivos mezclados a partir de cultivos puros. Los
cultivos industriales se seleccionan en funci�n de que toleren una acidez
elevada y de que las velocidades de producci�n de acetato sean altas.
Estas bacterias son extremadamente sensibles y se mueren en ausencia
de ox�geno y etanol y tambi�n resultan da�adas a gradientes de
concentraci�n de etanol y acetato. La sensibilidad a la falta de ox�geno
aumenta a medida que lo hace la concentraci�n total de �cido ac�tico
m�s etanol. No obstante, con una aireaci�n suficiente, puede
conseguirse una utilizaci�n del 80 % de ox�geno sin producir efectos
adversos en la fermentaci�n. La sobreoxidaci�n, esto es la conversi�n
de �cido ac�tico en CO2 y H20 puede impedirse manteniendo la concen-
traci�n de �cido ac�tico por encima del 6 % e impidiendo el agotamiento
total del etanol.
Lecci�n 38: �cido L�ctico

Aproximadamente la mitad de la demanda mundial de �cido l�ctico se

obtiene mediante fermentaci�n. Sus principales usos industriales son
como acidulante alimentario (50 % del mercado), y para la manufactura
de estearoil-2-lactilato (20 %) as� como en la industria farmac�utica y
en otras aplicaciones.

El �cido L-( + )-l�ctico se obtiene por fermentaci�n anaerobia con

Lactobacillus de/bruckii y cepas homofermentativas relacionadas. El
medio contiene aproximadamente un 15 % de sacarosa o dextrosa y
nitr�geno en forma compleja. El pH se controla en fa regi�n de 5,0 a 6,5
mediante neutralizaci�n con CaCO3 o Ca(OH)2. la temperatura se
mantiene entre 45 y 60 �C y el tiempo de fermentaci�n es de 3 a 4 d�as.
con lo que se obtiene un rendimiento en �cido l�ctico del 90 al 95 %,
basado en el contenido inicial de az�car. El proceso de fermentaci�n se
basa en la conversi�n de hexosa en piruvato por la ruta de Embden-
Meyerhof-Parnas y su conversi�n en L-( + )-lactato por el enzima L--
lactato deshidrogenasa

Lecci�n 39: Acido Ac�tico

El mercado mundial anual del acetato es de unos 2,5 millones de Tm.

Desde 1950 los m�todos sint�ticos han proporcionado la mayor parte
del suministro mundial de �cido ac�tico, pero, como el etileno es la
principal materia prima utilizada y su precio se ha incrementado de 6
centavos/Kg a 30 centavos/Kg desde 1970 a 1980. han ido ganando en
importancia distintas rutas de producci�n alternativas, incluyendo los
m�todos biol�gicos. Brasil produce �cido ac�tico por conversi�n qu�mica
de etanol, obtenido �nicamente a partir de biomasa. Tambi�n tienen
aplicaci�n potencial los m�todos de fermentaci�n para la producci�n de
acetato como materia prima qu�mica.

En este mismo cap�tulo ya se ha descrito el proceso aerobio para la

producci�n de vinagre. En las fermentaciones acidog�nicas anaerobias
se producen una gran variedad de �cidos grasas vol�tiles. El �cido
ac�tico constituye el componente mayoritario de la mezcla, aunque
tambi�n se producen cantidades significativas de �cido propi�nico y
but�rico. Los Clostridium butyricum producen una mezcla de �cido
ac�tico y but�rico a partir de glucosa. Los Clostridium thermocel/um y e
thermoaceticum fermentan la glucosa y la fructosa casi estequio-
m�tricamente a acetato. En la acidog�nesis, es imperativo suprimir los
metan�genos, asociados frecuentemente con los formadores de �cido en
los cultivos mixtos, ya que convertir�an el �cido en metano y C02.
Aunque en el proceso aerobio pueden obtenerse concentraciones de
acetato m�s elevadas, el rendimiento te�rico en el proceso de
acidog�nesis anaerobio es de 1.0 comparado con el 0,66 de aquel. Las
dos mol�culas de C02 producidas durante la conversi�n de piruvato en
acetil CoA se asimilan justificando la tercera mol�cula de acetato
formada a partir de glucosa . Adem�s, las necesidades energ�ticas para
el proceso anaerobio son menores y tambi�n es menor el valor de los
substratos, puesto que pueden emplearse desechos de destiler�a y
desechos de plantas de celulosa. En consecuencia., las fermentaciones
acetog�nicas anaerobias pueden llegar a ser el m�todo de elecci�n para
la producci�n de acetato destinado a la industria qu�mica.

Lecci�n 40: Producci�n de acido c�trico

El �cido c�trico, ampliamente distribuido en la naturaleza, se utiliza

desde hace tiempo en la manufactura de bebidas refrescantes como
acidulante, como auxiliar en la fabricaci�n de mermeladas y como
aditivo general en las industrias de reposter�a. Inicialmente se extrajo
del zumo de lim�n, posteriormente se sintetiz� a partir de glicerol y de
otros compuestos qu�micos y finalmente, desde 1923, se obtiene por
fermentaci�n industrial. En 1933, la producci�n mundial anual super�
las 10.000 Tm, de las cuales, m�s del 80 % se obtuvieron por
fermentaci�n. Con la substituci�n de los polifosfatos por el citrato de so
dio en los detergentes en 1970, el mercado anual creci� r�pidamente y
actualmente se estima que se producen exclusivamente por
fermentaci�n unas 300.000 Tm. Inicialmente se utilizaron m�todos de
cultivo en superficie con Aspergillus niger; despu�s de la segunda guerra
mundial se introdujeron procesos de cultivo sumergidos tambi�n con A.
niger y aproximadamente en 1977 se comercializ� un' proceso de cultivo
sumergido con levaduras del g�nero Candida.

En la Tabla 6 se muestran las principales caracter�sticas de los procesos

industriales empleados en la producci�n de �cido c�trico. Actualmente
a�n se utiliza ampliamente el cultivo en superficie con A. niger, puesto
que, aunque es un proceso que requiere m�s trabajo que el de cultivo
sumergido, las necesidades energ�ticas son menores. En los procesos
sumergidos se prefieren fermentadores agitados por aire, que permiten
utilizar recipientes de mayor tama�o, ya que este producto es de un
volumen de producci�n alto entre los obtenidos por fermentaci�n. La
materia prima m�s utilizada para la producci�n de citratos son las
melasas, cuyo mayor problema consiste en la gran variabilidad del
material. En las fermentaciones sumergidas con A. niger las
concentraciones elevadas de az�car estimulan la producci�n de citrato
obteni�ndose rendimientos bajos cuando la concentraci�n de az�car es
inferior a 140 kg m - 3. En general, se suministra nitr�geno a una
concentraci�n de 0,1-0,4 g 1 - l. La adici�n de NH4- durante la
fermentaci�n aumenta la producci�n de citrato.

Tabla 6: Caracter�sticas de la producci�n industrial de Acido c�trico

Fuente: Crueger, Manual de Microbiolog�a

industrial, 1989

La producci�n de �cido c�trico con A. niger es extremadamente sensible

a la concentraci�n de iones Mn2+, de forma que su producci�n se \'e ya
dr�sticamente reducida a un nivel de manganeso del orden de 3 mg 1- 1.
Por tanto, es necesario pretratar las molasas con agentes que
acomplejen o precipiten este metal. por ejemplo con hexacianoferrato
(HCF) o con cobre, que contrarresta el efecto del manganeso al inhibir
su absorci�n por las c�lulas. Las condiciones deficientes en manganeso
tambi�n favorecen la producci�n de peque�os gr�nu los micelianos con
superficies lisas y compactas, caracter�sticos de las buenas
fermemaciones f�ngicas de citrato. Cuando la concentraci�n de
manganeso aumenta, la morfolog�a f�ngica se vuelve fijamentosa,
incrementando dr�sticamente la viscosidad del cultivo y disminuyendo
r�pidamente de forma concomitante la tensi�n del ox�geno disuelto.
Como la producci�n de �cido c�trico necesita ox�geno, la velocidad de
producci�n de �cido aumenta a medida que aumenta la cantidad de
ox�geno disuelto. Adem�s, una corta interrupci�n del suministro d~
ox�geno puede conducir al cese irreversible de la producci�n de citrato.
Para la bios�ntesis de citrato es esencial mantener el pH por debajo de
2.0, puesto que a pH superiores, el A. niger acumula �cido gluc�nico en
vez de citrato. La producci�n de citrato con Candida
gu�llermondi difiere en varios aspectos del proceso sumergido con A.
niger. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no es un prerrequisito,
siendo innecesaria una etapa de pre tratamiento para eliminar este
metal del medio; el citrato se produce a un pH superior (3,5-5,0).
Adem�s, la limitaci�n de nitr�geno provoca la acumulaci�n de �cido. La
principal ventaja del proceso que emplea Candida respecto al que
emplea A. niger consiste en que la productividad global de la
fermentaci�n es superior, ya que se pueden utilizar concentraciones de
az�car m�s altas debido a la naturaleza m�s osmotolerante de los
organismos y adem�s la fermentaci�n es m�s r�pida.

- Bioqu�mica de la producci�n de citrato con A.

niger

El proceso metab�lico que conduce a la acumulaci�n de citrato implica

(a) la descomposici�n de las hexosas a piruvato y acetil CoA, (b) la
formaci�n anapler�tica de oxalacetato a partir de piruvato y CO2 y (c) la
acumulaci�n de citrato dentro del ciclo del �cido tricarboxliico. En este
esquema no deber�a eliminarse CO2 durante la producci�n de c�trato,
puesto que el CO2 liberado en la decarboxilaci�n oxidativa del piruvato a
acetil-CoA deber�a utilizarse en la conversi�n de piruvato en oxalacetato.
El enzima clave que cataliza esta reacci�n, la piruvato carboxilasa, lo
producen intr�nsecamente las especies AspergiIlus. Las concentraciones
elevadas de az�car aumentan adem�s la actividad de este enzima as�
como la de los enzimas glicoliticas y pueden inhibir algunos de los
enzimas del ciclo del �cido tricarboxilico. Para que se acumule citrato es
necesario que al menos uno de las enzimas de este ciclo resulte
inhibido. Las evidencias recientes sugieren que la principal etapa
reguladora es la de la excetoglutarato deshidrogenasa, etapa limitante
de la velocidad en el ciclo y la �nica reacci�n irreversible. Este enzima
se inhibe al incrementar las concentraciones fisiol�gicas de oxalacetato y
NADH durante la producci�n de citrato. La fosfofructoquinasa es inhibida
por el citrato, aunque esta inhibici�n puede contrarrestarse con
concentraciones intracelulares elevadas de NH4+
La deficiencia de manganeso reduce la actividad de algunos de los
enzimas de la ruta de la pentosa fosfato (que podr�an desviar las
hexosas de la glicolisis y la producci�n de citrato) y tambi�n inhibe el
ciclo del �cido tricarboxilico, y adem�s perjudica el metabolismo
anab�lico en general, incluyendo el recambio de las prote�nas y los
�cidos nucle�cos. Durante estas deficiencias, se forma una proteasa
�cida y la reserva intracelular de �cidos nucle�cos y prote�nas disminuye
con la producci�n concomitante de p�ptidos, amino�cidos y niveles ele-
vados de NH4+. Por tanto, en conclusi�n, el principal efecto de la
deficiencia de manganeso es su impacto en el recambio proteico,
haciendo que la concentraci�n de iones amonio se incremente en tanto
que contrarreste la inhibici�n de la fosfolactoquinasa por el citrato.

Para la re oxidaci�n metab�lica del NADH durante la producci�n de �cido

c�trico se necesita ox�geno. Durante la acumulaci�n de citrato, un
sistema respiratorio alternativo sensible al �cido salicilhidrox�mico
(SHAM), mantiene el sistema respiratorio con la re oxidaci�n del NADH,
aunque sin producci�n concomitante de ATP (Fig.31). El hecho de que la
acumulaci�n de �cido c�trico est� fuertemente inhibida por el SHAM
indica la importancia de este sistema. La respiraci�n sensible al SHAM
depende de una tensi�n elevada de ox�geno y el sistema se inactiva por
una corta interrupci�n de la aireaci�n.

La producci�n de �cido gluc�nico con A. niger est� catalizada por una

glucosa oxidasa extracelular, parcialmente unida al micelio, que se
inactiva a pH inferiores a 2,0. A pH superiores, se produce �cido
gluc�nico a partir de glucosa mediante la acci�n de A. niger. La glucosa
induce este enzima a pH superiores a 4,0, lo que hace necesario
mantener en las fermentaciones para la producci�n de citrato un pH
inferior a 2,0.

En resumen, la producci�n de citrato por A. niger se caracteriza por:

. Una actividad elevada de los enzimas glicol�ticos y de la piruvato

carboxilasa inducida por los carbohidratos que conducen a la
s�ntesis de citrato.
. La inhibici�n de un enzima del ciclo del �cido tricarbox�lico que
podr�a causar la descomposici�n del citrato.
. La producci�n mediada por una deficiencia de manganeso de una
concentraci�n elevada de NH: intracelular que contrarresta la
inhibici�n de la fosfofructoquinasa por el citrato.
. Una tensi�n de ox�geno elevada y el suministro continuo de
ox�geno para mantener activa la respiraci�n sensible al SHAM para
la re oxidaci�n del NADH.
. Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.

Figura 31: Ruta de la producci�n de citrato por

Asspergillus N�ger

Fuente: Crueger, Manual de Microbiolog�a industrial, 1989

Capitulo nueve: Biopolimeros microbianos

A trav�s de procesos derivados de la fermentaci�n es posible obtener un

numero amplio de compuestos org�nicos derivados del anabolismo entre
estos se destacan los Biopol�meros que son aplicados en diferentes campos
de la actividad humana por ejemplo: prote�na unicelular, enzimas, dextrano,
pululano y polihidroxialcanoatos entre otros.

Para fines pr�cticos en esta lecci�n nos centraremos en los polisac�ridos y

en polihidroxialcanoatos (PHAs).

Lecci�n 41: Polisac�ridos Microbianos y PHAs

Tradicionalmente, los polisac�ridos industriales se obten�an a partir de

plantas y algas marinas. Los polisac�ridos microbianos son una
alternativa viable para substituir algunos de los productos derivados de
las plantas o de las algas pero tambi�n para utilizar las en un amplio
rango de nuevas aplicaciones industriales. La ingenier�a gen�tica de
algunos de estos organismos productores y/o la regulaci�n de las
condiciones medioambientales en las que se lleva a cabo la
fermentaci�n brindan la posibilidad de manipulaci�n de las propiedades
y caracter�sticas del producto, ampliando por tanto la diversidad de
biopol�meros disponibles.

Lecci�n 42: POLI ��- HIDROXIBUTIRATO (PHB)

La principal aplicaci�n potencial del poli-�-hidroxibutirato (PHB) es como

substituto de los pl�sticos en casos en los que sus propiedades de
biodegradabi!idad representen una ventaja. La capacidad de las
bacterias para reoxidar el NADH llega a ser limitante a concentraciones
bajas de ox�geno, y entonces la reoxidaci�n da lugar a productos como
el PHB, el etanol o el butano!. De esta forma el PHB es acumulado como
material de reserva por una amplia variedad de bacterias entre ellas
Alcaligenes eutrophus, que puede llegar a almacenar el 70-80 % de su
biomasa como PHB.

En el PHB la unidad repetitiva o mon�mero, el �-hidroxibutirato, se

sintetiza a partir de dos unidades de acetil CoA; el peso molecular ideal
del pol�mero oscila entre 200.000 y 300.000. La s�ntesis de PHB,
adem�s de estar influida por la concentraci�n de ox�geno, se ve
favorecida por la limitaci�n del nitr�geno o el f�sforo. El proceso de
fermentaci�n para la producci�n comercial de PHB deber�a consistir
probablemente en dos etapas, una de crecimiento, sin limitaci�n de
ox�geno o substrato, que acumule concentraciones altas de biomasa, y
otra de formaci�n de producto en condiciones �ptimas de limitaci�n de
nutrientes o Aunque la glucosa es Utilizada com�nmente como substrato
por los A. eutrophus, comercialmente ser�a deseable la posibilidad de
Utilizar substratos m�s baratos que redujesen de forma significativa los
costos de producci�n.

Lecci�n 43: Los alginatos

se obtienen a partir de algas marinas, aunque como esta fuente est�

sujeta a una gran variabilidad, se ha considerado interesante a nivel in-
dustrial el substituirlos por polisac�ridos similares obtenidos por
fermentaci�n, por ejemplo el polisac�rido de Azotobacter vinelandii.
Entre otros polisac�ridos microbianos de inter�s comercial se incluyen el
pululano, producido por Aureobasidium pullulans, el seleroglucano,
producido por especies de Selerotium y el gelano, producido por
Pseudomonas elodea.

Los procesos destinados a la producci�n de exopolisac�ridos microbianos

se caracterizan por la elevada viscosidad del medio de fermentaci�n. Las
bajas concentraciones de producto obtenidas y los cambios
conformacionales del pol�mero ocurridos durante la fermentaci�n. El
control de los constituyentes del medio as� como de otros par�rnetros de
la fermentaci�n es cr�tico para conseguir las velocidades de s�ntesis
deseadas. Los estudios limitados realizados indican que la modificaci�n
del exopolisac�rido mediante manipulaci�n del medio de cultivo parece
influir en el grado de polimerizaci�n m�s que en la estructura real y en
la composici�n de la unidad repetitiva.

Lecci�n 44: La goma Xantano

Es el �nico polisac�rido microbiano obtenido por la fermentaci�n que

representa una parte significativa del mercado mundial. Su unidad
repetitiva b�sica consiste en un pentasac�rido que contiene glucosa,
manosa, �cido glucur�nico, acetato y piruvato. Esta goma tiene una
viscosidad elevada a concentraciones bajas, que es estable en un amplio
rango de pH y es independiente de la temperatura y de la presencia de
cationes. En soluci�n acuosa y combinada con polisac�ridos de las
plantas forma geles estables, por lo que se utiliza como estabilizante de
suspensiones y para controlar la viscosidad. Debido a sus propiedades
pseudopl�sticas, combinadas con su estabilidad frente a la temperatura
ya los cationes, se emplea como lubricante. Tambi�n se utiliza junto con
surfactantes e hidrocarburos para mejorar la recuperaci�n de aceites.

En el caso de la producci�n de goma xantano, el contenido de piruvato

como substit�yete se puede hacer variar del O al 75 % mediante una
selecci�n adecuada de la cepa y el medio, lo que puede influir en las
propiedades reol�gicas del pol�mero, cuando la concentraci�n del
pol�mero cambia o cuando se alteran la fuerza i�nica o la temperatura
del medio. Algunos medios de crecimiento para la producci�n de
xantano dan lugar a la formaci�n de mutantes 'que no producen
polis�ridos, aunque esto puede evitarse mediante una elecci�n adecuada
del medio limitando la cantidad de nutriente para el crecimiento. En ge-
neral, en la producci�n de polisac�ridos microbianos cargados debe
controlarse el pH; por ejemplo, el pH �ptimo para la producci�n de
xantano es de 7.0 cesando el crecimiento y la formaci�n de producto a
un pH de 5,5. A lo largo de la fermentaci�n, las propiedades del caldo
cambian, pasando de ser un fluido newtoniano con viscosidad baja a ser
un fluido no newtoniano con viscosidad alta, a medida que la
concentraci�n de exopolisac�rido aumenta. Estos cambios influyen
profundamente en el mezclado yen la transferencia de masa y calor en
la fermentaci�n, por lo que el dise�o y las condiciones de operaci�n del
fermentador deben optimizarse ajust�ndose a estas condiciones
reol�gicas. La concentraci�n final de xantano en los caldos de los
fermentadores es de unos 50 g. 1 - 1 Y los rendimientos, basados en la
glucosa consumida, son del 50 al 60 %.
La mayor�a de las s�ntesis de exopolisac�ridos bacterianos se producen
intracelularmente, mediante la v�a de los az�cares, activados con un
nucle�tido. Los az�cares se transfieren desde el nucle�tido a un l�pido
transportador, activado por transferencia inicial de un az�car fosfato,
dando lugar a la formaci�n de la unidad repetitiva de az�car. El m�todo
exacto de elongaci�n de la cadena y de extensi�n del polisac�rido es
desconocido.

Lecci�n 45: Los dextranos

Son polisacar�dos de elevado peso molecular, que consisten en unidades

de a-D-glucose ligadas predominantemente por enlaces glicos�dicos 1-6.

Los dextranos son formados a partir de la sacarosa durante el

crecimiento de bacterias pertenecientes a los g�neros Leuconostoc,
Streptococcus y Lactobacillus, todas pertenecientes a la familia
Lactobacillacea. La mayor�a de los dextranos son, entretanto,
sintetizados por la bacteria de la especie Leuconostoc mesenteroides.

Los dextranos son neutros, solubles en agua, f�cilmente filtrables,

biocompatibles y biodegradables.

Aplicaciones:

. Aplicaciones biom�dicas (agentes de contraste para imagiologia

m�dica, s�ntesis de hidrogeles)
. Industria farmac�utica (en colirios, anticoagulantes, complejos con
hierro)
. Industria fotogr�fica (emulsiones de plata)
. Uso veterinario
. Industrias alimentarios

El mayor productor mundial de dextrano es Pharmacia (Suecia), sin

embargo, existen otros tales como: Fisons (Reino Unido), Meito (Jap�n),
Pfeiffer & Langen y UEB Sermwerke (Alemania), Polfa (Polonia),
Pharmacia (EEUU y Suecia), Knoll/Schiwa (Alemania), Abbott (EEUU),
Travenol (EEUU) y Fisons (Reino Unido).

Actividades

Investiga los procesos de producci�n de cerveza y vino. Realice

comparaciones relacionadas con: Tipo de Microorganismos utilizados,
Substratos y Procesos.
Investiga sobre metabolitos derivados del metabolismo intermedio y su
aplicaci�n en la Industria alimenticia.

Elabore un mapa conceptual que permita visualizar las diferentes

aplicaciones de la Biotecnolog�a en la industria alimenticia

Consulte un proceso Biotecnol�gico, y realice un estudio de casos, a

partir del proceso que se desarrolla y sust�ntelo ante sus compa�eros.

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