DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA VIROLOGÍA
Nombre: Abad Myriam; Quishpe Jean Pierre
Fecha: 12/11/2018 NRC: 3807
Resumen: Cómo los virus de ARN mantienen la integridad de su genoma.
Mecanismos de mantenimiento para proteger todo el genoma del virus.
La replicación del genoma la lleva a cabo un complejo de replicasa viral, la subunidad catalítica de este complejo se denomina ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp). Los virus NSV de ARN no segmentados pueden ser susceptibles a inserciones en las regiones codificantes a causa de su propio programa de edición. Las mutaciones en el genoma de ARN viral pueden ser internas o en los extremos, existen mecanismos que causan su mutación y reparación. En el interior del genoma las mutaciones se dan por errores de polimerasa durante elongación, factores ambientales y los mecanismos de reparación se dan por: exonucleasas, regla de seis, recombinación de RNA y actividad AlkB (enzima que repara daños por alquilación). En los extremos del genoma las mutaciones se dan por errores de la polimerasa durante la iniciación o terminación, nucleasas celulares y los mecanismos de reparación son; recombinación de RNA, transcriptos abortivos como primers, primers “no- templados”, actividad de transferasa terminal y enzimas celulares. Revisión de RdRp Se estima que la tasa de error del RdRp viral está entre 1.5x10-3 bp-1 (fago Q β) y 7.2 x 10-5 bp-1 (virus influenza). La relajada fidelidad de la polimerasa proporciona diversidad de secuencias que pueden permitir variantes, especiación y adaptación de virus, también llevan a “catástrofe de error” que es el resultado de una tasa de error donde se han generado demasiadas plantillas no viables que reducen la capacidad viral en general, haciendo una población de virus insostenible, posiblemente muchas RdRp actúan cerca de este umbral. Edición de ARN y la 'regla de seis' Algunos NSV de ARN no segmentados poseen una secuencia de "edición" especializada que puede permitir que la RdRp a veces agregue nucleótidos sin plantilla durante la transcripción del ARNm, permitiendo la expresión de múltiples polipéptidos de una sola unidad transcripcional, esencial para que el virus exprese su complemento completo de proteínas. Sin embargo, si ocurrieran adiciones sin plantillas durante la replicación del genoma, esto podría conducir a la acumulación de genomas defectuosos, que podrían ser letales para el virus. Los virus con una función de edición de ARN comparten un requisito estricto de que la longitud del nucleótido de su genoma sea divisible entre seis, un fenómeno conocido como la "regla de los seis". Se cree que la "regla de los seis" refleja la estequiometría de los nucleótidos de ARN a la proteína N (nucleocápside). Si se produjeran inserciones sin plantilla durante la replicación del genoma, se generan genomas de longitud no hexamérica. La "regla de los seis" es un mecanismo de detección, no catalítico para eliminar los genomas que contienen inserciones sin plantilla del conjunto de genomas y para ayudar a mantener la integridad genómica en la población de virus. Reparación del daño de alquilación al ARN genómico. La alquilación es la modificación química de los genomas de virus, al agregar cadenas de carbonos o un carbono (metilación) a átomos de N y O en las bases de ARN. Los genomas de virus también pueden ser susceptibles de modificación química. La alquilación aumenta la tasa de mutación y los agentes alquilantes se encuentran en el ambiente y en el interior celular. Varios virus de cadena positiva de plantas contienen un dominio AlkB que repara daños mediante desmetilacion oxidativa, es decir lo virus han adquirido este mecanismo de protección. Recombinación en virus ARN La recombinación en un contexto viral generalmente ocurre cuando un RdRp replicante deja de copiar una cadena de ARN y se transfiere a otra. Cuando los sitios de transferencia comparten secuencias comunes, se dice que el evento de recombinación es homólogo. La recombinación de ARN da lugar a diversidad de secuencias también funciona como un mecanismo de reparación de genomas defectuosos o debilitados frente a la presión selectiva intensa, permitiendo la restauración del genoma por errores de la RdRp, modificación química y daño luz UV. RdRp tiene la capacidad para realizar una reparación mediada por recombinación dada la presencia de plantillas adecuadas de donantes y aceptadores. Por ejemplo el bacteriófago MS2 se sugirió que la reparación (secuencia Shine-Dalgarno restaurada) estaba mediada a través del reclutamiento de nucleótidos adicionales a través de un evento de recombinación no homóloga. En la reparación de secuencia interna de 87 nucleótidos faltantes del gen de la nucleocápside del virus de la hepatitis del ratón y la reparación de los nucleótidos faltantes del gen replicasa del bacteriófago Q β , ambos casos, los nucleótidos faltantes se suministraron mediante recombinación homóloga a partir de plantillas de ARN suministradas en trans. La recombinación también puede ocurrir en secuencias terminales como, experimentalmente se observó en bunyavirus donde su RdRp era capaz de corregir las eliminaciones del promotor de 2 o 15 nt, por lo que la RdRP podría iniciarse en un promotor intacto externo y luego "saltar" a la secuencia del promotor interno dañado, generando así un producto corregido, reparando los terminales dañados, habiendo una fuente de plantillas intactas iniciales. Mecanismos para proteger y restaurar los extremos del genoma Los genomas poseen adaptaciones para evadir actividades de nucleasa. Algunos genomas de virus de ARN de cadena positiva tienen una capucha unida de forma covalente una cola de poli (A) y / o una proteína en sus extremos, y los genomas de los virus de ARN de cadena negativa se encuentran secuestrados dentro de una nucleocápside helicoidal a lo largo del ciclo de infección. Muchos virus de ARN se replican en compartimentos membranosos que podrían ofrecer protección contra las nucleasas. Reparación como consecuencia del proceso de iniciación. Los genomas de ARN del virus son lineales, requieren mecanismos de replicación que permitan la iniciación frente al nucleótido 3´-terminal de la plantilla o la recreación de los nucleótidos terminales durante el proceso de inicio, para ello existen mecanismos como la iniciación con cebadores de proteínas, cebado / realineación (RdRp inicia internamente en la plantilla, alinea el ARN naciente y lo utiliza como cebador), y las RdRps estructuradas para asegurar el inicio frente a el término 3´ de una plantilla de una sola hebra con una fuerte preferencia por el NTP de inicio correcto. Estos mecanismos altamente coordinados facilitan la replicación precisa y ofrecen la posibilidad de reparar terminales que carecen de un pequeño número de nucleótidos. En picornaviruses coxsackie B3 virus (CB3V), poliovirus, potyvirus(virus de papa) y virus de la viruela del ciruelo, se ha demostrado que pequeñas deleciones de 1 o 2 nt de los términos del genoma se restauran a secuencia de tipo salvaje, el pequeño tamaño de las eliminaciones podría potencialmente permitir la reparación como consecuencia de la iniciación de la replicación. Reparación mediada por cebadores utilizando transcripciones abortivas Un medio que puede usar el RdRp viral para reparar los extremos dañados es utilizar material genético derivado de los terminales virales intactos o de los extremos de los ARN satélites asociados. El inicio de la síntesis de ARN incluye una etapa en la cual el RdRp hace la transición de un complejo iniciador a uno alargador. Si el RdRp no ingresa al modo de alargamiento con éxito, resulta en la producción de un breve transcrito abortivo de oligonucleótidos, de aproximadamente 3 a 12 nt, proceso conocido como ciclo abortivo. La reparación mediada por cebadores implica el inicio de la replicación del ARN utilizando transcripciones abortivas generadas a partir de ARN viral intacto como cebadores para reparar un ARN dañado. La reparación con transcripciones abortivas se produce para un ARN satélite del virus del rizado del nabo (TCV). El ARN satelital C (satC) , está asociado con el genoma de TCV y es replicado por la RdRp viral. La RdRp de TCV genera abundantes transcripciones abortivas cortas (4–8 nt) y puede usarlas in vitro para extender plantillas con eliminaciones o deleciones terminales parciales. El mecanismo parece implicar la unión de la RdRp de TCV al ARN de la plantilla defectuosa, reclutando oligorribonucleótidos de secuencias específicas en su sitio activo y usándolos para iniciar la síntesis de ARN. Polimerización sin plantilla por la replicasa viral para generar cebadores aleatorios Guan y Simon (2000) proporcionan un modelo para explicar otro proceso de reparación de ARN, en el cual RdRp de TCV genera un pequeño ARN aleatorio independientemente de la plantilla y luego utiliza este ARN como cebador para iniciar la síntesis de ARN en el extremo 3' de la secuencia del ARN satC. Basándose en estudios de la replicasa del fago de ARN Q β se plantean dos explicaciones para la reparación mediada por TCV: 1) la replicasa es capaz de generar ARN de novo en ausencia de una plantilla o 2) se puede utilizar cualquier ARN disponible, que pueda encajar adecuadamente con RdRp y ser utilizado como cebador. Transferasa terminal y mecanismos de reparación de cola poli (A) Muchos virus de ARN de cadena positiva poseen 3' poli (A), que cumple funciones en la traducción, la estabilidad del ARN y la replicación del genoma. Hay evidencia de que existe un mecanismo viral que restaura los adenilatos que se pierden del extremo 3' poli (A) durante la replicación del genoma normal, y que las colas de poli (A) completamente eliminadas pueden ser reparadas. Es posible que las colas de poli (A) sean restauradas por una actividad celular de poli (A) polimerasa. Además también se ha demostrado que algunos virus poseen actividad adeniltransferasa terminal, codificada por virus, que les permite transferir secuencias de poli (A) al extremo 3' de sus plantillas. Algunos flavivirus que no poseen cola poli (A) codifican la actividad de la transferasa terminal. El mecanismo para la actividad de la transferasa terminal viral no se ha dilucidado completamente, pero se dice que depende del sitio activo de RdRp, ya que las ribonucleotidiltransferasas celulares utilizan un motivo catalítico similar. Independientemente del mecanismo específico, parece probable que, si todos los elementos para el inicio de la polimerización dirigida por la plantilla estuvieran presentes, el RdRp se uniría de forma normal a la plantilla e iniciaría la replicación del ARN. Sin embargo, si las señales del terminal 3′ no estuvieran intactas, el RdRp no podría formar un complejo de iniciación estable, aumentando su propensión a adoptar una orientación de transferasa terminal (RdRp y la plantilla giran entre sí) hasta que el ARN se haya reparado lo suficiente. Un mecanismo de reparación común pero no caracterizado: un posible papel para la maquinaria de degradación del ARN celular Se encontró que algunos genomas de virus poliadenilados que fueron sometidos a reparación para restaurar la cola de poli (A) adquirieron nuevas secuencias ricas en U. Una posible explicación de cómo los genomas de virus adquieren secuencias ricas en U no virales es que un ARN viral truncado se enlaza con la poli (U) polimerasa para marcar su degradación, de manera que algunos virus pudieron haber desarrollado mecanismos que les permitan interceptar la vía de degradación y promover la poliadenilación para darle estabilidad al genoma del virus y permitir la replicación y propagación del genoma. Reparación de terminaciones 3' por mimetismo de tRNA Debido a que muchos virus ARN de plantas tienen secuencias en el extremo 3' que pueden adoptar una estructura similar a la de los ARNt, pueden ser sufrir acilación amino mediada por la aminoacil ARNt sintetasa modificando así su terminal 3'. Por ejemplo la terminal 3' del genoma de BMV termina en CC, pero se modifica a CCA al ingresar a la célula. La similitud entre las estructuras de ARNt 3' virales y los ARNt celulares, brinda al genoma del virus la capacidad de unirse a la nucleotidiltransferasa ARNt, permitiendo que esta enzima restaure el residuo 3'A de la misma manera que repararía un ARNt celular. Beneficios potenciales de las deleciones terminales: genomas truncados y persistencia viral Varios virus ARN están asociados con infecciones persistentes se asocia frecuentemente con truncamientos en las secuencias que actúan en terminales cis. Ejemplos de asociaciones entre truncamientos terminales e infecciones persistentes Se observó que LCMV, miembro de la familia Arenaviridae, tenía segmentos de genoma viral dañados por eliminaciones terminales cortas y adiciones de hasta 4 nt y estos genomas dañados aumentaban con el tiempo. Y se demostró que eran competentes para la replicación, pero deficientes en la transcripción del ARNm, lo que es ocasiona disminución de la expresión de proteínas virales y el bajo rendimiento de virus infecciosos que son características de la infección persistente. También se ha demostrado que las eliminaciones de secuencias terminales desempeñan un papel en la transición entre infecciones agudas y persistentes de un virus de ARN de cadena positiva. Evidencia de un mecanismo específico para el truncamiento terminal El mecanismo por el cual estos virus adquieren truncamientos en sus términos puede diferir. El ambiente celular tiene una fuerte influencia, en el caso de CB3V las deleciones terminales surgen más rápidamente en tejidos del corazón intactos o en cultivos celulares primarios de miocardio que en otras células. Sin embargo, un virus asociado con infecciones persistentes parece haber desarrollado una estrategia específica para truncar sus terminales, aunque ese mecanismo aún no se ha dilucidado, aparentemente implica una actividad que deja un resto monofosfato en el extremo 5', en lugar del trifosfato 5' que normalmente se encontraría. Observaciones finales Los estudios descritos anteriormente demuestran una variedad de mecanismos que existen para permitir el mantenimiento y la restauración de la integridad del genoma en los virus de ARN.