19 Estudio bioquímico de la función

iittatii!t:t: e integridad hepáticas 221

,.,.a,:a,at:::,4,
20 Enfermedad gástrica, intestinal
y pancreática exocrina 235
:;se preanalítica. Obtención de especímenes. . . 3 2"1 Enfermedad renal . 247
!.re::dología analítica l, Técnicas generales . . . . 15 22 Enfermedad cardíaca 261
'.r :: :.dología analítica ll. Arteriosclerosis...
Técnicas 23 271
- * -noquímicas y de biología molecular 29 24 Hormonas hipofisarias 279
t"f :::.0clogia analítica lll. Análisis
25 Hormonas tiroideas. 289
; : ::becera del paciente 45 26 Hormonasesteroideassuprarrenales........, 301
,I t'€s de referencia e interpretación 27 Hormonas sexuales 313
:: ':sLr tados analíticos ... 55 28 Catecolaminasyserotonina.... 327
I-es: :- del laboratorio clínico y control 29 Neoplasia. Marcadores tumorales 337
- - -- --! 65 30 Alteraciones nutricionales.
Síndrome metabólico. Alcoholismo 351

.L.;
-: electrolitos
_, 83
31 Patología molecular de las alteraciones
3.i,s¿-"s :¡
sangre y equilibrio ácido-base 95
del metabolismo de azúcares y ácidos grasos . . 363
't,,r€=:,c smo del calcio y del fosfato.
32 Patología molecular de las alteraciones
i*':*e¡ades óseas 105
def ciclode la ureayaminoácidos...,.
ll-,t::::.J- snro del hierro. Anemia ferropénica. 377
33 Alteraciones eritrocitarias.
-¡tn<¡< 1',17
j -::s s r' degradación del hemo. Porfiria. Hemoglobinopatías 391
34 Distrofias musculares 401
- EÉ': r"'ubinemia 't27
35 Enfermedadesmitocondriales.. 409
:.:-:---- ta¡7: 139
rrr;--3¡,¡ s.no de la glucosa. Diabetes mellitus. 36 Enfermedades lisosomales 4'19
.:ñr¡ 147
37 Enfermedadesperoxisomales... 429
38 Radicales libres y enfermedad 439
\,r.::-:-:,: s'no lipídico. Dislipemias 161
¡'*::: -:i 39 Bases moleculares de las enfermedades
175
i -,:-:: 187
neurodegenerativas 449
,r.-: ; s i: as alteraciones de la coagulación
,'' :"-: 55 199
:'---:s ¡ o rimidinas. Hiperuricemiaygota.... 209

vii
 -rr$rxrr'rr*rrr .'i

1 Fase preanalítica. Obtención de especímenes.

2 Metodología analítica L Técnicas generales.
3 Metodología analítica ll. Técnicas inmunoquímicas y de biología molecular.
4 Metodología analítica lll. Análisis a la cabecera del paciente.
5 Valores de referencia e interpretación de resultados analíticos.
6 Gestión del Iaboratorio clínico y control de calidad.
 Fase preanalítica.
Obtención de especímenes

lrorce DEL cAPírulo

tsi*¡ilidad preanalítica 3 Otros tipos de especímenes 11

Wdad biológica no modificable 4 ldentificación del espécimen t1

bftdl€s tÍnlógicas modificables 4 Transporte de los especímenes f 2
ifidad debida al momento de extracción 6 Manipulación y almacenamiento de los especímenes 1,2
'lllbri*¡fdad debida al espécimen 6 Obtención de muestras para monitorización
l|:pración del paciente 7 de fármacos '13
ftnción del espécimen 7 Calidad de la fase preanalítica 13
ryiri€n de sangre 7 Referencias adicionales 13
kngircnes de orina 10

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
Solicitud de análisis
¡ lder.rtificar las fuentes de variabilidad que tienen su origen
en lla fase previa al análisis. I
¡ Conocer los mecanismos fisiológicos y físicos que pueden Obtención del espécimen
rrnclificar la composición de las muestras biológicas. l
+
. EsuHecer medidas que corrijan las fuentes de variabilidad ldentificación Fase preanalítica
y error preanalítico. j

o Orentar la fase preanalítica con medidas para la calidad.

*
Transporte al laboratorio
j

'*'a ri a bi I idad pr*e,ru'e$#*&€{e Recepción y clasificación

ssuencia temporal por la cual atraviesan todas las prue-

tri"a

hsdd laboratorio incluye tres fases: una inicial o preanalítica, Cuantificación dp la

I a,mtinuación la analítica y finalmente la postanalítica. Pro- magnitud oi"q|.r-i.r
Faseanalítica
i ffiücmente, la fase preanalítica es Ia más compleja del proceso Figura 1'1. La fase preanalítica es crucial en el desarrollo de todo el
¡ porla canlid¿d de etapas que incluye y la variabilidad del per-
proceso del laboratorio.
fi romel que interviene, con diversa formación
I ¡ en muchas oca-
I rürnes- aieno al laboratorio.
t
t L^e tas€ preanalítica abarca todos los procesos (fig. 1-1) desde
t d momento en que se solicitan las pruebas hasta que la mues- interpretación de un resultado analítico. Las causas de la varia-
I'ür Ímr. r¿ preparada, entra en la fase analítica, en que se determi- bilidad biológica pueden ser endógenas, como los ritmos cir-
T
t 'nrr,,rn nas magnitudes bioquímicas. Los factores que inciden en cadianos hormonales, o exógenas, como el estrés o la actiridad
dn&¡- como la variabilidad biológica, Ia debida a algunos facto- física antes de la extracción. Algunas no cambian en una per-
ry uus en el momento de la extracción o Ia debida a algunos fac-
t
ry
sona, como la edad, la raza o él r"*o. En cambio, otras van
@
Mrs relacionados con el espécimen, afectan de forma impor- cambiando a 1o largo del tiempo, como la situación de emba-
! mmre los resultados. El efecto incluso puede invalidar la Íazo, y pueden modificarse, como el tipo de dieta o el avuno
4 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Tabla 1-1. Variables preanalíticas

Variabilidad biológica no modificable Edad
Sexo
Raza
Embarazo
Variabilidad biológica modificable Variaciones cíclicas
Dieta
Actividad: ejercicio o estrés
Entorno
Ingesta de fármacos
Variabilidad debida al momento de extracción Postura
Tiempo de aplicación del torniquete
Variabilidad debida al espécimen Características f ísicas
Estabilidad de los constituyentes
Recipiente para la muestra

:.:la 1-1). Debe tenerse en cuenta la variabilidad biológica ya viduos Ia edad cronológica no coincide con la edad bioló-
:*: :uede tener un efecto importante en la concentración de sica.
. :::qnirud biologica. No obstante, en ocasiones estas fuentes 2. h.aza. Hay algunos parámetros que varían según la raza,
:. ','::Lación escapan ai control del laboratorio y son causa de como la concentración de creatina-cinasa o de antígeno
:ll,-rL prostático específico, qlle presentan valores más elevados
en personas ae taza negra.
3. Sexo. La influencia del sexo es evidente en la concentración
Variabilidad biológica no modificable de algunas magnitudes biológicas, como el estradiol o la tes-
tosterona, que es muy diferente en hombres y en mujeres.
.:- -..largo del libro se describirán numerosas magnitudes Por lo general, la creatina-cinasa y la creatinina también son
: : *-nicas cuyos intervalos de referencia están acotados por más elevadas en hombres porque suelen tener mayor masa
., .,.:i¿bles de edad, raza, sexo o embarazo:
muscular que las mujeres. Estas diferencias de concentración
se suelen poner de manifiesto tras la pubertad.
: .;.; .; \umerosas magnitudes biológicas tienen diferentes 4, Durante el período del embarazo se producen importantes
..:-,'¿los de referencia en función de la edad. Así, los valo-
,,--
cambios en 1a concentración de hormonas, electrolitos, hie-
:=. ::
ia tbsfatasa alcalina son unas tres veces más altos rro, proteínas, lípidos, enzimas y factores de coagulación.
: -.:-'r:3 la edad infantil que durante la edad adulta porque
sangre está relacionada con
" ., : e:zima más abundante en
.- ,- .:r:iiento óseo (fig. No obstante, en algunos indi-
1-2).
Variables biológicas modificables
Variaciones cíclicas
Las variaciones cíclicas afectan, sobre todo, a la concentra-
ción de hormonas. Por ello, es necesario documentar el
momento de la extracción ya que una muestra tomada en
I
el tiempo inapropiado puede generar errores al interpretar los
: ^^ --..1
resultados.
Hay variaciones fisiológicas debidas a ciclos cortos, como el
ritmo circadiano (fig. 1-3), de ta1 manera que algunas hormo-
nas, sobre todo las que produce la hipófisis o la glándula supra-
rrenal, como la corticotropina o el cortisol, varían su concen-
tración a lo largo del día. Los viajes a través de varias franjas
horarias también afectan el ritmo circadiano y se tarda aproxi-
madamente 1 semana en volver a un ritmo normal. Ello no
sólo altera la concentración de hormonas, sino también otros
analitos, como la glucosa o el sodio.
Otras hormonas tienen una secreción pulsátil, coincidiendo
con diversas actividades, como la somatotropina o la prolac-
I
tina, que presentan picos de secreción nocturna en la fase de
sueño profundo.
<t) >15
Otrás variaciones fisiológicas presentan ciclos más largos,
t0ao (anos/ como los ritmos mensuales o estacionales. EI ciclo menstrual
en función afecta a las concentraciones séricas de algunas hormonas, como
=-.: o de referencia de la fosfatasa alcalina
las gonadotropinas o los estrógenos.
 Capítulo l-Fase preanalítica. Obtención de especímenes
r,
:mo circad ano
- pondiente. También la turbidez puede producir inierferencia
Secreción pulsátil
r'ccLrccrÓn uniforme
-812162024
Hora del día
a ..' ¿a ones de las concentraciones de las magnitudes
. --- ¡^l ¡ -
LÓ
=
:-:--.r de la ingesta depende de la composición de la
',
- " :.- tiempo que transcurra entre la ingesta y la obten-
:.- :.:ecimen. La ingesta reciente afecta de manera
-':.r.r: l nluchos componentes bioquimicos séricos por
--. :--.: s:
: :::rr:rente que va a determinarse forma parte de la
.. - .:.s una comida rica en grasa, los triglicéridos pue-
:
:r :,-:r-Zár un nivel hasta diez veces suDerior a su valor
--., -. Slucosa aumenta rápidamente t?as la ingesta de
:..-=-::,s r- r'ueh'e a los valores iniciales, en condiciones
::-..-;s. al cabo de 2 o 3 h.
i ,:,:.sia causa cambios metabólicos que afectan a los
---:;::oi que Van a determinal'se. Así, una comida rica
::- ..-ras
r- ácidos nucleicos eleva el amoníaco, la urea
: :--r.r urico. Las personas vegetarianas tienen una con-
: i..r:--trl de colesterol, especialmente lipoproteína de baja
:i :.J:.r colesterol (LDL-C, del inglés low-density lipopro-
- ".,:trol'1, )'triglicéridos inferior a ias personas que
; -::- *na dieta mixta.
- : . j -: rcorporada con Ia ingesta produce un espécimen
: valores de angiotensina, renina o aldosterona. Muchos de
- : r.. - -1 que interfiere en la técnica que se va a emplear en
:. :. :::rinación analítica.
: - .-riia de lípidos en los especímenes de plasma o suero
'---:-ie z. Puede ser consecuencia de una comida rica en
:: :islipemia y produce la dispersión de la luz, Io cual
- -- -,r:nta lmportante a todas las técnicas espectrofoto-
:: :r:.ticamente a cualquier longitud de onda. Además,
, terona, catecolaminas, prolactina, ro-ntoiroplna. corttsol.
: ^-.. - Jesplaza el agua plasmática de tal forma que los
'- :r-icS solubles en agua, como electrolitos y metabo,
- r , r;:ricffr€nte están bajos por unidad de volumen, pero
tienen una concentración normal en el volumen de agua corres-
por un mecanismo fisicoquímico ya que las lipoproteínas de
la muestra pueden incorporar constitllyentes lipofílicos que
hacen disminuir ia accesibilidad a los anticuerpos emplea¿os
en los inmunoanálisis y también plleden estai afectados los
procedimientos electroforéticos y cromatográficos. Ante 1a
sospecha de que una determinación en sangre esté interferida
por la lipemia de Ia muestra, en el caso de Ápectrofotometría
pueden utilizarse técnicas bicromáticas o, en cualquier caso,
se puede depurqr Ia muestra por ultracentrifugación o preci-
pitación y repetir ei análisis sobre la muestra depurada.
La cafeína inhibe la fosfodiesterasa y aumenñ la degrada-
ción del AMPc (adenosina monofosfato cíclico), por lo que
activa la glucogenólisis y provoca un aumento de la glucemia.
Se elevan cortisol, renina y catecolaminas en sangre, por 1o
que Ia adrenalina también colabora de forma indirecta en el
aumento de la glucemia. En relación con el metabolismo lipí-
dico, Ia cafeína puede elevar la concentración de triglicéridos
y disminuir la de colesterol, así como aumentar la áctividad
lipasa con elevación de 1os ácidos grasos libres, lo que dificulta
la cuantificación de hormonas y fármacos unidos a albú-
mina.
El etanol produce, 2-4 h después de la ingesta, una elevación
de la concentración de glucosa; en cambio, pasadas unas horas
bio-
tiene efecto hipoglucémico que provoca el aumento de lactato
por inhibición de la gluconeogénesis en el tejido hepático. La
toma de alcohol durante largo tiempo y en cierta cantidad afecta
a Ia determinación de diversas magnitudes bioquímicas, por Io
que algunas de ellas se aprovechan para el diagnóstico y la
monitorización terapéutica, como la y-glutamiltransferasa.
Por estos motivos, al paciente que tiene solicitados análisis
en sangre generalmente se le recomienda acudir en ayunas.
Sin embargo, algunas magnitudes bioquimicas casi no cam-
bian tras la ingestión de una comida estándar o la modifica-
ción no tiene relevancia clínica, por lo que en estas situaciones
no sería necesario el ayuno.
Actividad física
Algunas magnitudes biológicas se modifican con un ejerci-
cio previo. Las variaciones dependen del tipo de ejercicio que
se realice, de la intensidad y de la duración, del entrenamiento
previo, de la masa muscular del paciente y de los factores
ambientales. Ei ejercicio moderado aumenta la concentración
de glucosa, que repercute en un aumento de insulina y de cor-
tisol y altera el número de leucocitos. Algunas enzrmas tam-
bién están afectadas, sobre todo la creatiná-cinasa, y en menor
grado la aspartato-aminotransferasa, lactato-deshidrogenasa
y fosfatasa alcalina. También se han descrito variaciones en los
los cambios agudos durante el ejercicio se deben al intercam-
bio de volumen entre el espacio intravascular y el comparti-
mento intersticial, el voiumen perdido por sudor y Ios cambios
en la concentración hormonal.
El estrés que conlleva para algunos pacientes la extracción
de sangre puede provocar una elevación en 1a concent¡a-
ción de diversas hormonas, como renina, anqiotensina. aidc.s-
tirotropiná y vasopresina. También pueden aumentar otros
componentes, como albúmina, flbrinógeno, glucosa, insulina.
lactato y colesterol.
 parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patologia molecular
Entorno
Conforme aumenta la altitud, se reduce la presión parcial
:= .-,rigeno (PO,) atmosférica y el organismo se adapta-incre-
:::¿rta-ndo el nivel del hematocrito y la concentración de hemo-
.-¡'¡ina. También se produce un descenso de la proteína C
:. --tiva r de la transferrina.
La teÁperatura ambiente puede afectar al equiiibrio y. al
'.'..-umen áe los compartimentos líquidos corporales' La sudo-
'irion lntensa provoca una pérdida de líquidos y origina una
r.:roconcentración, así como un descenso de ia concentración
:. r,otasio por su captación por las células..
ia localización geógráficaliene efecto, sobre todo, en la con-
:¡itración de los-elementos traza, ya que por la riqueza del
. *elo o por la contaminación pueden variar notablemente
de
.:r¿s zonas a otras.
-
as variaclones estacionales y climáticas modifican la con-
:-i.itración de algunas magnitudes biológicas' pero general-
::r.nte. no tienen tanta importancia como las otras variables
',.:ear.ralíticas. La formación de la vitamina D depende de la
;:rr.osición al sol, por lo que su concentración es mayor en
.'.:'ano que en invierno.
tngesta de medicamentos o drogas
La medicación que toma el paciente puede afectar de forma
:::rportante los resultadot uttálíticot' La interferencia puede
s:: metodológica o puede afectar a la concentración de los ana-
..:os, Un eieñplo de interferencia metodológica es el caso de
lrdroriurea que provoca la elevación de las concentraciones
j.' -:iea. ácido uricó y ácido láctico, o el O-desmetilnaproxeno'
:,-..::bolito del naproxeno' que provoca una falsa eievación en
. ::,.,'eles de biliirubina tofal cuando se emplea el método de
.-::::¿ssik.
Algunos fármacos aumentan ia concentraciÓn
:. :-.: L.roteínai transportadoras y causan un incremento de
-, .-.:¡entración de los analitos que transportan, pero no
:: ,a :r¿¡ción libre. Por ejemplo, los anticonceptivos orales
:-:r-,.m:¿n La concentración plasmática de globulina fijadora
i. r..::t]r'rnas tiroideas, con lo cual incrementa la concentra-
-:¡r ce la tiroxina total, pero no de la libre' Otras veces' en
¡¿rrbio. compiten con el analito por Ia proteína de unión' lo
iesplazan e incrementan la fracción libre de éste'
ir,ut-tdo ha transcurrido t h después de haber fumado de
:..ri.na esporádica, se observa que aumentan triglicéridos' adre-
:::-rna. glicerol 1ibre, aldosterona y cortisoi' Sin embargo' el
,.,,.-.,.,,tñ ctónico altera el número de leucocitos, colesterol'
:,-,::'..teLrias. actividad de algunas enzimas, hormonas' vita-
,-,,,--.,. ,-,,.r.udot'es tunorales v metales pesados' En estos cam-
cianuro y tio-
--.!-: :'.-ri.3n intluir los compuestos de piridina,
.,...,,.- ¡-'¡e har en e1 tabaco. La disminución del enzima
;¡rrr.'e::,¡o: ce ¿nqiotensina en fumadores es debida a la des-
trur;iLrn cel ertdotelio del pulmón con disminución de 1a libe-
racion de I enzina a la circuiación. Los cambios también depen-
del-r de la car-rtidad. tipo de tabaco, forma de fumar, edad y
sexo.
El consumo de morfina provoca espasmos del esfínter de
Oddi, por 1o que aumentan algunas enzimas, como la amilasa
v la lipasa. También se detectan elevaciones de aspartato-ami-
iotransferasa y alanina- aminotransferasa, bilirrubina' fosfa-
:¿sa alcalina, gastrina, tirotropina y prolactina En cambio' se
disminuidoJde insulina o de noradrenaiina'
-.¡er.r ar.i ni.'e'Íes
: :'..-,:l-lrr de arrfetamina pro\¡oca una elevación en la con-
--
centración de ácidos grasos Libres. La herrrl:l: rriúuCe ülr
u.r-.n,o de 1a presión áe CO-' tirorina lT.)' ct'-¡':erttl v pota
sio, así como rLna disminución de la PO. r-de la aiburlina El
consumo de Cannabis produce un aumento de la concentra-
ción de sodio, potasio, urea, insulina y cloruro mientras que
disminuye los niveles de creatinina, glucosa y ácido úrico'
Variabilidad debida
al momento de extracción
Postura
Cuando nos incorporamos, la presión de filtración efectiva
aumenta en las extremidades inferiores y el agua se moviliza
desde el compartimento intravascular hacia el intersticiai, por
Io que se redúce el volumen plasmático alrededor del 12%' Las
pu.iículus sanguíneas con un diámetro superior a 4 nm o molé-
culas pequeñas que están unidas a proteínas no pueden atra-
,r.ru, iu membrana y no siguen al agua plasmática, por 1o que
se produce una hemoconcentración entre el 5 y el t5%' Ello
también afecta a la concentración de algunos componentes
sanguíneos, como el calcio o el colesterol, que están unidos a
la uitúmina y a las lipoproteínas, respectivamente' Estos efec-
tos pueden sór más pronunciados en pacientes con insuficien-
cia cardiovascular o cirrosis hepática ya que tienen tendencia
al edema. Por ello, es recomendable que, si el paciente ha estado
de pie, permanezca sentado unos 15 min antes de realizar la
extracción del espécimen sanguíneo'
Un cambio de postura incorporada a supina permite una
disminución en ia presión de filtración y un aumento de volu-
men en dirección inversa. Si disminuye el volumen plasmático,
disminuye la presión sanguínea ¡ por tanto, aumenta la secre-
ción de ienini-aldosterona, vasopresina y catecolaminas' De
esta forma, las determinaciones basales de 1a actividad renina
y de la concentración de aldosterona se realizan sobre una
muestra de sangre tomada con e1 paciente tumbado y en reposo
de, por lo menos. t h.
Tiempo de aplicación del torniquete
Si se utiliza una presión por debajo de la sistólica, se man-
tiene una presión dé filtración efectiva dentro de los capilares'
por lo que el líquido y las moléculas de pequeño tamaño se
i.splutun desdé el espacio intravascular hacia el intersticial'
Las macromoléculas,los coinpuestos unidos a proteínas y las
células sanguíneas no atral'iesan la pared de los capilares, por
lo que su cóncentración aparentemente aumenta' También se
prodr.t.. hipoxia ¡ por tanto, acidosis, Si se mantiene durante
t min, no iiene consecuencias importantes en los resultados
analíticos; los efectos comienzan a apreciarse a partir de los
5 min.
Variabilidad debida al esPécimen
Hemólisis
La hemólisis consiste en la liberación de los constituyentes
celulares, como la hemogiobina, desde los hematíes hasta el
piasma o el suero (fig. 1-a). Puede ser consecuencia de una
enfermedad, in vivo, o de una extracción o procesamiento prea-
nalítico de la muestra incorrecto, in vitro. Se reconoce, gene-
 Capítulo 1-Fase preanalítica. Obtención de especímenes
@ separarlo de los hematíes. La refrigeración a 4 'C prolonga la
.u.
,@
- Aspecto de una muestra s n hemol zar y oÍa con una
. -.= -:-ó is s. Ésta causa la liberación de constttuyentes rntrae-
ar'¿tn-dcsl-idronen¿s¡\ v A ,¡^.reTp1-o oe
- - - : :;-át ca.
- -: -ror el color rojizo que adquiere el plasma o el suero
- .- :qaleltubo, aunquepuedehaberunaligerahemó-
- -,¡ re ¿nrecie visualmente cuando la muestra se
r : : iemperatura sin llegar a la de congelación. La con-
.-- -:- de r-arios constituyentes es diferente en el suero y
. -..r:'.alies, r. la rotura de éstos libera, por ejemplo, pota-
-,:.,-deshidrogenasa (LDH) y diluye otros, como el
¡ ¡' ltr que puede alterarse el resultado de estas deter-
- :-... analíticas. Además, el color de la hemoglobina
: -..;:Ierir directamente en muchas determinaciones
:.:rras. según la longitud de onda a la cual se realice
' nistración del tármaco y la fase de nivel estable, la obtenida
-". :l tipo de blanco yel reactivo utilizado, como en ei
: .: :i:erminación de la bilirrubina directa por el método
- .rg.nte s que lnterfieren también pueden proceder
- cuantificar las grasas en heces o dieta carente de aditivos de
. . :r -a; plaquetas y granulocitos. Puede suceder que
-:: ¡,: .onstituventes intracelulares que se liberan inter-
- ':- :::ente en el método de reacción empleado, como
: :ra:a, que interfiere en la mayoría de los méto-
- : ::.e:minar la actividad creatina-cinasa o el efecto
-.. .- j¡l srupo hemo, que interfiere en el método diazo
. ['3C])
: :'.:.-ri.r bilirrubina. Por todos estos efectos, lahemó-
-.., :. -¿s causas más frecuentes de rechazo de un espé-
- : .:- -:-.Lrfatoflo.
I ., r-rn interferente que aparece fundamentalmente
" ningún tipo de alimento, o durante una prueba de aliento con
:',: j3 suero cuandono sehaesperadoeltiemposufi-
: ;oagule completamente la muestra o bien en
' . :: --*.
::-ientes en tratamiento con anticoagulantes. La
: : ,-.-. :linte
físico que interfiere que puede-obstruir las
: provocar errores en los resul-
r :,,to¿Llralizadores y
: :: i;i3fnrlnaclones analíticas. Para afrontar este pro-
- -. :-.ente muchos autoanalizadores disponen dásis-
.. .. i on de t'ibrina.
: Jad de los constituyentes
: ' :rrii separar el suero o el plasma de las células lo
: '. :.a11zar determinaciones analíticas durante
1as
- ::-,:-s a la obtención del espécimen. Esto no siem-
: ' iS necesario conocer la estabilidad de los dlfe-
. .,-', ertes. Con el uso de suero con gel separador,
la mayoría de los analitos tienen una buena estabilidad sln
cambios clínicamente significativos dentro de las 8-24 h
siguientes a la extracción. Algunos analitos no son estables,
como la glucosa, el bicarbonato o la LDH. Otros analitos son
estables durante largo tiempo, como el sodio, cuya concentra-
ción plasmática no se modifica durante 1 semana después de
¡
estabilidad de numerosos analitos por ejemplo, 1a fosfatasa
alcalina se mantiene estable 1 semana. Sin embargo, otros no
son tan estables ¡ por ejemplo, la fosfatasa ácida pierde rápi-
damente su actividad si no se acidifica Ia muestra.
La estabilidad de los analitos también puede depender del
tipo de tubo de recogida. Algunos geles separadores de suero
o, incluso, la composición de los tapones pueden provocar una
disminución de la concentración de alsunos fármacos.
SU COn-
El laboratorio debe proporclonar al paciente las instruccio-
nes adecuadas sobre su preparación previa a la obtención de
muestra para que los resultados analíticos satisfagan las nece-
alma-
sidades clínicas. Como recomendación general, debe acudir a
Ia extracción en ayunas previas de 12 h, a primera hora de la
mañana y en estado basal, evitando esfuerzos importantes
desde e1 día anterior a la extracción. Si es posible, se debe inte-
rrumpir la medicación y realtzar Ia extracción antes que a1
paciente le realicen otras pruebas diagnósticas o tratamientos
terapéuticos. En la monitorización de medicamentos, se con-
sidera pico o concentración máxima la obtenida tras la admi-
antes de la siguiente dosis. Los requerimientos particulares de
preparación pueden afectar a la dieta (dieta rica en 1ípidos para
vainillina en la determinación de catecolaminas en orina), la
postura del momento de extracción, como en el caso de la acti-
vidad renina, fármacos que pueden interferir (evitar e1 trata-
miento reciente con ántibióticos en la detección de Helicobac-
ter pylori con prueba de aliento con carbono l3
o
situaciones clínicas que deben evitarse (hemorragias nasales
o bucales en la determinación de sangre en heces).
Los pacientes a los cuales se les va a realizar una prueba
dinámica, que requiere la obtención de varias muestras de
sangre, también tienen que conocer cómo deben permanecer
durante la prueba. Es e1 caso de Ia sobrecarga oral de glucosa,
en la cual el paciente debe permanecer en reposo y no ingerir
H, o r3C, durante la cual el paciente no debe
comer ni
fumar.
Espécimen de sangre
Las muestras de sangre son las más frecuentes en el labora
torio clínico. La identificación de1 paciente,v de los recipi311¡¿.
en que se van a recoger las muestras tiene que ¡ealiz¡,Lls¡ j.
forma inequívoca. Además, se realiza ui-r cuestior-r¡r'-r, ;::;
saber si la preparación del paciente ha sidol¿L ade;u¡c:. .- ¡s::
en ayunas o si ha seguiclo la dieta reconrend¿da para ai{-ll;
prueba específica. La obtención de sansre puede ser de sang:t
venosa, arterial o capilat. Una rez que \e h¡ iinalizaclr¡. e:
 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Selección de l¿ vena Limpieza de la zona de extracción

Vena celá ca

: .),r.:r 'l-54. ELección de a zona de punción venos¿ y obtenc ón del espécrmen con tubo de vacío. Obsérvese que el bisel de a agu;a está co ocado

.:rportante depositar la aguja y otro material desechable en Por lo general, la sangre venosa se obtiene por punción de
--¡ contenedor de residuos seguro. las venas cubital, mediana o basílica en ia fosa antecubital
(fig. 1-5A). Una vez que se ha localizado la zona en que se \¡a a
realizar 1a punción, se realiza su desinfección con alcohol. Se
Sangre venosa emplean agujas de un calibre suficientemente pequeño para
\ormalmente, el paciente está sentado o semitumbado ¡ evitar 1a hemólisis. Muchas \¡eces se emplean sistenas que pin-
-- .: r.¡ f acilitar la exposición de la vena, se aplica un torniquete. chan la vena y tubos con tapón a1 r'acío, que facilita notable-
mente la obtenclón del espécimen y disminuye el riesgo de
infección del personal de enfermería. Tras 1a extracción del
espécimen, se mezcla en los tubos que contienen aditivos o
activadores de 1a coagulación. Para evitar una posible hemo-
rragia, se aplica una gasa en la zona mientras se retira la jeringa
y se mantiene un tiempo.
Si e1 paciente está siendo perfundido o recibe una transfu-
sión en el momento en que se \-a a realizar la extracción,
la sangre se recoge del otro brazo horas después de finalizar la
perfusión (8 h si se ha perfundido una emulsión grasa y I h en
caso de hidratos de carbono, aminoácidos y electrolitos).
Cuando e1 paciente tiene colocado un catéter y se requiere san-
gre de forma repetitiva, se puede aprovechar para obtener la
muestra a partir de é1, tras haber lavado con antelación
1a cánuia con solución salina 1. haber descartado los primeros
5 mL de sangre. Se extrae un volumen de sangre suficiente
¡ para la realización de todas las determinaciones analíticas
h
)¡ para que quede un remanente para posibles comprobaciones
i.s o adición de pruebas complementarias. No obstante, se evita
la extracción de un exceso de muestra. Esto es especialmentg]
H importante en pacientes pediátricos, para 1os cuales se emplean'
E
:r'' tubos de recogida más pequeños, de 1,5 mL de volumen,
:t¡
aproximadamente (fig. 1-58).
Las muestras de sangre más frecuentes en el laboratorio clí-
nico son e1 suero y el plasma, que se recogen en tubos especí-
10 mL 7,5 mL 5 mL '1,5 mL
ficos (fig. 1-6). El suero se obtiene cuando la sangre se recoge
en un tubo sin anticoagulante; estos tubos están siliconados
I si ntos tamaños de tubos de recoqida de especimenes para disminuir la adhesión del coágulo,v suelen contener gelosa,
que permite separar físicamente el suero tras 1a centrifugación.
 Capítulo f preanalítica. Obtención de especímenes 9
-Fase
a^^ ¡^+^
LU -ñ+i-^a^L,
OrrLrlVO9U orrLc 5in anticoagulante

i
:.
i
a
a

pa.a recog'da d retL¿ de especir.ene> de 5a"gre

:. .uando 1a sangre se recoge sobre un anti- traacético (EDTA) o e1 citrato, inhiben la actividad de algunas
- l). En el suero están ausentes los factores enzimas. E1 heparinato de litio o amonio producen interferen-
a--: 1d
ia !udóur4Llu1rr especialmente el fibrinó-
coagulación, LryLr cias con la determinación de litio o amonio, respectivamente.
'..:-rtos se liberan desde las células durante el Cuando se van a obtener varios tubos de sangre, se sigue un
.:,-ión, como el potasio o la LDH, por lo qlle orden para evitar posibles interferencias entre los distintos adi-
-. sr,rperior en el suero que en el plasma. tivos:
-: pla.nra tiene varias ventajas: no hay que
:::rrn de1 coágulo para centrifugar el tubo, se 1. Sangre para hemocuitivos.
. -:::ren de muestra, no se producen interferen- 2. Sueros sin aditivos.
:. ;oagulaclón, los resultados son más repre- 3. Plasma con citrato.
.,,-¿¡ión in vivo e implican menor riesgo de 4. Plasma con heparina.
.. :r¡mólisis o la trombocitosis. También tiene 5. Plasma con EDTA.
. :- hecho de que el fibrinógeno puede inter-
. J: algunos inmunoanálisis. Además, en la Sangre arterial
::'(rteinas aparece el pico de fibrinógeno en
:r::;o¿qulantes que actúan como agentes que En el caso de determinación de gases en sangre o pH, se
. :on calcio, como e1 ácido etilendiaminote- obtiene la muestra mediante una punción arterial, general-

:: : '-: Tipos de tubos de muestra que se emplean habitualmente en el laborator¡o

Anticoagulante Color del tapón Ejemplos de determinaciones
..1;
,
: Marrón Enzimas, glucosa, lípidos y otros
lones: Ca'*, ¡Ygz-, fst y Li.
Serología: de hepatitis, del VlH, etc.
Hormonas, marcadores tumorales y otros
ll'iiluii¡,4 EDTA-K3 Lila Hormonas
Pruebas de urgencias

Heparina de litio Verde Hormonas

Electrolitos: Na*, K*, Cl- y HCO;
Fl uoruro/oxa lato Gris Lactato
Citrato de sodio Azul Pruebas de coagulación
Velocidad de sedimentación

E DTA-K3 Lila Hemoglobina glucosi lada

Hemograma
10 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

la más frecuente es la determinación de glucosa en el segui-

miento del paciente diabético, y la sangre se obtiene habitual-
mente en la yema del dedo anular. También en los neonatos es
muy frecuente Ia obtención de sangre capilar para 1os estudios
analíticos dado que las venas son frágiles y difíciles de encon-
trar. Una zona adecuada en los neonatos es la parte exterior de
la olanta del pie.
iras limpiár lazona,se reaiiza una incisión con una lanceta
y se recoge una gota de sangre en un recipiente apropiado o se
emplea directamente en la determinación analítica. Esta sangre
capilar es una mezcla de sangre venosa, arterial y líquido inters-
ticial. Por ello,la concentración de los analitos es diferente de
la que se encuentra en sangre venosa. Un error muy frecuente
Figura'1-?. Obtención de sangre capilar med ante el empleo de es apretar tras realizar Ia incisión para intentar obtener la san-
la nceta. gre. De esta forma sale más líquido hístico, que no contiene
proteínas y, por tanto, tampoco los analitos asociados.

mente en 1a arteria femoral, braquial o radial. En niños puede

realizarse en arterias del cuero cabelludo y en recién nacidos, Especímenes de or¡na
en la arteria del cordón umbilical. La obtención de sangre arte-
rial es más dolorosa y sólo se realiza para estas determinacio- La recogida de orina se ha de realizar en un envase limpio y
nes de gasometría. desechable, y estéril si es para análisis bacteriológicos (fig. 1-8).
Para pacientes recién nacidos y niños pequeños, es recomen-
dable utilizar una bolsita adhesiva que se fija a la zona perineal.
Sangre capilar Algunos metabolitos no son estables en orina y requieren la
La obtención de sangre capilar (fíg. 1-7) es habitual en Ia adición previa de conservantes al recipiente de recogida, como
realización de técnicas analíticas a la cabecera del paciente y timol. azida sódica, CIH o carbonato sódico. A veces, el adi-
tivo interfiere en la determinación de otras magnitudes bio-
químicas diferentes (tabla 1-3).
La producción de orina varía notablemente a 1o largo del día
Orina de 24 h
en función de las necesidades de retención o excreción de agua
y, en consecuencia, hay una importante variación diurna en la
concentración de muchas sustancias en orina. Ello es especial-
mente notable en el caso de las proteínas, sodio, potasio, calcio
y fosfato, que son los constituyentes que se analizan más habi-
tualmente en este fluido.
Heces (una No obstante, para análisis cualitativos y bacteriológicos
deposición) puede ser suficiente una micción aislada. La orina de primera
hora de la mañana es la más adecuada ya que es la muestra más
| "**t,,, concentrada y 1as desviaciones por dieta, actividad física y pos-

*a tura son menores. Para análisis bacteriológicos se recomienda

lrgr,lr* 'i-8. Recipentes para recoger rnuestras de orina y heces En
el bote de orina de 24 h se ha colocado un tubo que se empiea para
recoger una parte a ícuota de orlna y evtar a manipulaciÓn de todo el
volu men.
la orina de la mitad de la micción. Idealmente, Ias muestras de
orina de una micción deberían procesarse durante la hora
siguiente a la obtención, sobre todo por la importancia en la
evaluación morfológica del sedimento urinario (los hematíes
y leucocitos se degradan con rapidez a un pH superior a Z5 y
densidad baja). Otros analitos tienden a formar cristales (cal-
cio, oxaiato y ácido úrico) o se descomponen si Ia muestra no
está estabilizada adecuadamente (g1ucosa, urea o citrato).

Tabla 1-3. *jentpi*s de editivü5 pare ¡a {*r}5erve{¡*n cie la *rin¡a

clH Ácido acético corNa, Protección de Ia luz Refrigeración
5-Aminolevulinato
Catecolaminas
Porfi ri nas

5-H idroxi i ndolacetato

Proteínas

*r%F@Ñr"
 Capítulo 1-Fase preanalítica. Obtención de especímenes 11

: - -,: :¡ obtención de orina para determinar la exis-
,: -r i,rS de abuso, es recomendable que en elaseo no
. r.,.i.rrl de adulteración de la muestra, por lo que
-: --..--sario, incluso, acompañar al paciente en el
' ,,: -: :ecogida y 1a entrega. De cualquier manera, no
. , - - .-r-orinas aportadas fuera del control del perso-
*:: lle obtención de muestras.
- . :-: ;.r¿ntitativos,espreferiblerecogerlaorinafor-
. '.: ,-r tiempo, generalmente 24h.La recogida de
, - : .r- ,-3Stras requiere colaboración por parte del
: - . .- ;_.re es fundamental proporcionarle unas ins-
:- :,-:..áS Lrara que la recogida se realice de forma
: ,r-: .:-Sunos metabolitos, como las porfirinas, es
: .": -l .\posición del espécimen a la luz. Durante
- ' --.,. :: :--nr-eniente mantener Ia muestra refrigerada
. -. -:;¡:r1iento bacteriano aunque ello puede cau-
: . : -.rriin ¿llgunas sales, como las de fosfato o ácido
. : .-.:rr.r qr-re disoh.er de nuevo para su determina-
- -: :: .rina d¡-rrante 24 h
- puede ser complicada en
, ..--.,. sobre todo 1os pedlátricos. Para évitar esto
' :: .- -:,.1t¡S .uantitativos, se realiza la determinación
- .-: :-r-¡-Lrqica que interesa en un espécimen de mic-
.... ,. ::^rere su concentración respecto a ia de crea-
: : .r rsrlo espécimen. Esto es factible porque la
:. ---'. .L)nll)uesto que se excreta de forma uniforme
. - - ,-rr \. con poca variación diurna.
-.*,-i +
pos de especímenes
, --::,r,r¡rraQuídeo se obtiene mediante punción
: ...r:S i- paclente permanece en posición fetal. Se
.:.. ;:r.r8 -j r- 4 mL en un recipiente estéril, sobre
-:,-,:¡:t¿clo determinaciones microbiológicas. Si
'..-- :t:: ,e gLucosa, hay que tener en cuenta que las
célu1as de la mue-rrapr+edqr consumirla, por lo que el proce-
samiento hará cuanto anté3:--.-
se
Ocasionalmente se realizan anáhisis en líquido perlcárdico,
torácico o abdominal, que son ultrañlt¡ados estériles del
plasma que se encuentran lubricando entre)a p-ared visceral y
la parietal. En ocasiones se pueden acumular grañdes voh+me.
nes de líquido en procesos infiamatorios o infecciosos. La
obtención de estos líquidos se realiza mediante aspirado a tra-
vés de 1a piel (paracentesis) y se recogen en un recipiente esté-
rii. Estos líquidos han de ser analizados tan pronto como sea
posible y muchas veces se obtiene simultáneamente una mues-
tra de sangre para comparar 1as concentraciones.
Finalmente, en el laboratorio también se reciben especíme-
nes sólidos. Los más frecuentes son los de heces. Dero no son
infrecuentes otros, como 1as biopsias de tejidos. Esfas muestras
han de ser aportadas en envases adecuados y en cantidad sufi-
ciente para realizar las determinaciones. Asimismo, e1 perso-
nal de laboratorio ha de comprobar que se han obtenido de
forma adecuada. Por ejempio, las muestras de tejidos para rea-
lizar determinaciones enzlmáticas se han de conselar inme-
diatamente en nitrógeno líquido tras su obtención. Una mala
manipulación, como la adición de formol, invaiida esta mLles-
tra para los aná1isis enzimáticos.
Los especímenes deben ir acompañados de suficiente infor-
mación (fig. 1-9):
1. Nombre y apellidos del paciente, fecha de nacimiento,
número de historia clínica del paciente y número de mues-
tra.
2. Nombre del médico que ha solicitado el análisis.
3. Nombre de la enfermera que ha realizado la extracción o
recepción del espécirnen, asi como el dia y hora de ésta.

Paciel'e
Histsr¡¡ .: F. N¿üimiÉnt' :n
Ftr;entE S ero r
Atru¡üon
figssli
" \19
N! AEl. l-'lBn. I rorr roo CdrFet¿ Liet¿ reali¿acjÉn lrgente
a, L
F¡ fIt Acru¿ción'füSFATA5AAt[A.Ll¡.lr¿. Posicicn Oemor¿,1:

Elb=o?
-5i
Estn'lo ,tt¡ii"t¿u Df.snlicit¡nteru
tn
Fec pl¡nific.'
-r/
-:i z> 5e¡¡uimiento -,.,1
ñe;uflado5 1 ] Trazrbilidad]
?;z
-
|

SE'tuirrienla
- 7 -?i
-- ':,:l¡,:,ti.r'j r ¿inqitóus i :'st,+¡ ;{n-
-=- :_ lEJfú.':nnqnAEinn -
-a
1E,'lt4/;ftfl9 nc 5¡ fll
,ri: r:i i li¡ii¡.1 it5/04./:¡¡9 1ü:i7:31 iDn
15/C¿i?003 l0:li.iÉ t'E
-
:le seguimiento de una muestra en el aboratorio med ante el emp eo de un sistem¿ jnformá:.a i .¿f -: r€
- a.
.,:: cbtener la nformación comoLementar
': F"aurne $- -:'oducción a la bioquÍmica clínica y patología mo ec-

r " : . - :.'.';niente que se incluyan las observaciones
:
. : - r .: nora de obtención de los especímenes. EIlo
: - : - :.:¡atc interesante enlarealización de extraccio-
:" .::> durante una prueba dinámica.
- . " .:.iación que va adherida al espécimen ha de permi-
" :';: I resto de la información. En muchos laboratorios
e sangre completa. En una muestra de sangre cory)pfea, además
- ,. -,-.izan sistemas electrónicos que transfieren los datos e
-..r:r:ren códigos de barras para la identificación de mues-
.:,.. sir.l necesidad de transcribir los datos. Es preferible la iden-
.:-:;ación directa del tubo primario que Ia identificación indi-
:ecta con la preparación de alícuotas ya que de esta manera se
er-itan errores.
congeladas. Tra. i¿s.,,-:g.-.: :la rllue stra, debe invertirse
varlas r-eces par¿ :-rr:- 'i.:.:z:: la ,iistribución de 1os analitos,
y debe tan...a cu:c¿-ct :;:¡ .-L-. no ce lbrme espuma.
La sangre compiera .c :ta de transportar a temperatura--
ambiente. No obstant¿. er l¡ medida de 1o posible, sobre,Jodo
si la di:tancia c. srande..l.bc clitar:e el envio de mr,Lestras de
del riesgo de hemólisis, eL metabolismo c,glular puede alterar
la concentración de glucosa, lactato,,o,el pH.
Las principales causas de altgracíón de 1a calidad de la mues-
tra son el metabolismo de- las células sanguíneas, la evapora-
ción de la fase acuosa, e1'desarrollo de reacciones químicas y
la descomposición microbiológica, ia existencia de procesos
osmóticos, el efecto de la luz y la difusión gaseosa. Para evi-
tarlas, se recomiendar el transporte rápido y un corto período
de almacenamiento. i

En general, cuando el laboratorio está próximo al lugar de

extracción de muestras, no se plantean problemas por el trans-
porte yya se están procesando en el plazo de t h. Si la distan-
cia hasta el laboratorio es mayor, ta1 y como sucede cuando el
área atendida por el laboratorio incluye centros periféricos de
extracción, las muestras de sangre se transportan en unos reci-
pientes adecuados, 1o que evita que éstos se agiten para mini-
mizar el riesgo de hemólisis y con los tubos en posición verti-
cal ya que esta posición acelera el proceso de coagulación.
Los recipientes son cerrados para evitar la evaporación,
incluso en nevera, porque puede causar resultados aparente-
mente aumentados de compuestos no volátiles o disminuidos
de otros volátiles. Estos recipientes, además, protegen de la luz,
que altera la concentración de algunos analitos, como la bili-
rrubina o las porfirinas.
E1 transporte se realiza preferentemente a temperatura
ambiente y en el tiempo más breve posible. Para algunas mag-
nltudes biocuímicas es necesario mantener unas condiciones
especiales dé transporte del espécimen. Algunos especímenes
han de ser transportados congelados y para ello la nieve car-
bónica es una buena elección ya que mantiene la temperatura
a -70 'C aunque muchas compañías aéreas no aceptan este
producto. Esto es muy frecuente con las hormonas peptídicas,
pues muchas de ellas son inestables y se han de transportar
Espécimen no
centrifugado
Manipulación y almacenamiento
de los especímenes
Un aspecto muy importante que debe tenerse en cuenta es
el hecho de que hay que manejar las muestras biológicas con
precaución por ser potencialmente infecciosas. Una vez que
llegan al laboratorio, las muestras anticoaguladas pueden cen-
trifugarse de inmediato, en tanto que las destinadas a la obten-
ción de suero deben esperar hasta que hayan transcurrido
20-30 min desde la extracción para formar ei coágulo; si el
paciente toma terapia anticoagulante es necesario prolongar
un poco más el tiempo de espera para evitar la formación pos-
terior de fibrina (fig. 1-10). Si no se lleva a cabo, se corre el
riesgo de que se produzca poscoagulación, con formación de
fibrina, lo que conlleva errores en e1 volumen de dispensación
y obstrucción de los sistemas de análisis.
La centrifugación, tanto de suero como de plasma, se realiza
en el tubo sin quitar el tapón de forma que se evita, sobre todo,
que se formen aerosoles. La centrifugación se realiza a 1.000-
1.200 g (3.000-4.000 rpm) durante unos 10 min, a temperatura
ambiente; cuando los analitos que deben determinarse son
t
termolábiles, se centrifugan a 4 'C. La velocidad de centrifu-
a
d
Fsnorimen ir:c tr
centrifugac ón LC
*F Iel
#g* da
mi
me_

Suero 55-60% , tra.

. riza
h
^--
ocur
ja per
en qu
del br
Gel Gel
separador Hematíes 4A-45% o bien

i-icr.rr¡ 1-iú" 5eparacrón del suero por centrifugación.

 Capítufo f_Fase preanalítica.
Obtención de especímenes
f3
.-
- , ' -.1$:,'i:!:'..*.-dl'Y".?::ii:i {ffif ilXi:HT proreínas que se unen
ras

,'. ilpb:::,* a ros rármacos Er EDrA

:':.i?L?Tr"tft:ill*:;i::***:ilhñ:
_':_-: : .pu.a.u*J."u!!l'.{.,ü::üTJi}ll,i:?ilill; ;'¡fi#{,":::.üJ::LXpmli:1Í*,:f:h}:1;kt
::-: ¿.a Concentf ación de 1',:ll1f**,:f::H:,:i*:,:rr;;;;;;;i".lxidac,ón
los anatitos, proáucióndo
.
: . : . . ,¡ :esulrados. erro,_
,iil,?i::_.:.rrnolj,:u*riÍüi;*¿*::,*:i:i::
:-:'.-:.-ioplasmase::pa^11jeJascé1ulasdurante]asiguienteH*-Poreiefplo.,esteroide'syffit", s,
r: r: ri centrifugació1::::p.'i....-fi.u,,tru".!""
g"i '";ffF:il.0";x%:.:',Hi1:.rr,áa"', árrí-liiá'.r.uu¿or.
. -.'.- -;,; -.,i*
en el prápio tubo al
flfi,,uriff31-allen9r
lizacion de los análiiis, tralnscurrido aj menos
,o , ,"*?:ili";.ü;;';.;u','ao ,rnru,,
es conveniente uiolo"gi.u, y u.ise obten-
- . :: - .rar las muestra ariun del99o/ode la fase -¿. ;TlI]1rr
: :: :::ar resurrados i"+:i#üilT*r.:i,il'.i:,:i;:'ff: *l*;1;¿rii:.,.ffiilf;;.*.'u', É".ur'i,u,.ltiempo
.' '-.:: ':udes bioquímicas tt
putd.,t toi::::lf:::ti"*1¡.. é1"iiaos rápidamente
- iero para compuestos termolábil.. u ,or,o
"r-".."1. varios días
(r¡u, cx la hemólisis o,Ia descomposición
ar rabora-

" -r.lr., ;;".t111.:"itar y las condi-

:..
.:'i'l?,L ii)i'Ji'ló'-ás protongadilJi::::']i-*g. iiTt^r:.," qu. uigu,,';.,-.o-o.r nirrazepam,
:'t' e:
d: r., -'*r.*;."!X^it1!:t:Tt:'i:$L1'fi::,t'1i; ,iu *."t"", ,J d..ó-po,,.,, .uunao
r"j;'*;i*
cc se armacenan a" 4.C.
'irar. Tras la descongeiaci¿", ;r;;;iio reatizar un
en un vórtex anres de reatizar
;jlli?;-,tllrtl,"*l.intenso las ,, ,,,:, : , ,: r, : r

La calidad de un resultado
analítico se asegura generalmen-
::.::xi;"' 1-p'::iig;; i"'#
: ,1:l:::J1 in'a en comp a.
estándares;,;;;.,;"Í:J[#:1r,ff
La determinación de los
::iffi:.| j..,:,,r:.,:
É ; r'
niveles de f¿írmar h:: i *','# l^lt
i..'1X11. li 1- " fi ái iJ i,'. ¿.,'. r i u,, i u,
p r e r.e nc ión a.
. r.. i o, tóx i c o s ; ;;;,
; ;;;
;"r""Tfi Í: i iri : :irt; .o"u.i,,,,oru.;#u,;i'.1;:.jnl j:',::X1,".::?T:ff
o una disminución dr
paraevitarniveres,;;:#,..j;!lHH;,:1ff partir det registro de incid,encias
f;:;j;;;;¿s
,llii:i
efecto deseado. La principal;"..'"".i Hi"#il:lJ nerse indicadores de c¡
pueden obre_

nileies de fármacós q#'Je determinan ios

*TF¡ii"",','t$tti:".#i":ry.'i";i+if .,,l;:ff
;¡i3¡,1e'i"".";;;.,Ti:T:?i:üT,5lilT,i;Jli,'JiJil
co¡relación entre la cr
péutico ;:i::ll:Iió"
del riírmaco
vel efecto tera- ."li:XlÍiÍ.'.:iXiijlH"t'-':l;ñ;ü;7"iar.ui.á,".¡
"il,;;;;;r;n
órina o r.li;;
algunos casos' se emplean
muestras de instruccione,ua..,,u¿'i3,'il!.'J::,Tf 'fr t:::"jff
ció, de
representar mi;or la .o"..ni*l
fü"pueden
invoiucrado yla consecuci¿" ;:?::,f";
a. lu-truruúrf ,á"¿ ¿. todo
el pro_
"._.¿"
;:ü.1'"fl:::1",1:',H:'i:::*4;F;;;;;"'."",osc,atos
el momento en que se
f :,:iü:T.:'IH*:T!:,:T:.lX:?,;::fi
La mo¡litorización :":,1".:1ff ;*.1 p.r[.r, il btención de la muéstra
citud de l.r realizala soli-
de aigunos fárm".", en el laboratorio. "''y y
aminoglucósidos, reguiáre .á_" l"s antibióticos su recepción
fu.o¡t.*iá" á.lur"io, .rp..í_.rr..
de sanqre cuando se espera
tras la administración
lu.o";;;;i'j_r máxima (C-u")
,i.=t ¡¿r_"."i;;d;,:.
centracron mínima (a,*:"r_:. espera ia con_
recorri ¿ : c ue son necesarias.
¿. í. ,ürr."ü dosis. Hay que
ap.oximad"amerrra arnao
das br t.r i t¡ g ic a s para consegui. semivi_
.t-.quitiOrlo-Jrrir. rrrg.rtu y Bonini p, plebani trI, Ceriotti
.ti_ I boli F Errors in laboratorl'
Clin chem 2002; +s: 69t -6# medicine.
^
ü:'.;:::.,Ti;i*iii?.",",..;fi
,.: -,-.a de administración i."'!*il:rffi ?,:.J,.trJ.l "' :L:¿ffi il'Xj;;il_"Jf:#I, a toor ror reducing
raboratory errors.
Eo
o
:i:-.:' .¡
rrza¡-i-
á.ii¿r_"."'q* debe moniro-
rnt¡avenosu,pu.1. obtener ,
','::ffijT;,,y;:::..üj:?i:1""r'.1
!
har .l ..peJlÁ.r, de sangre, de.r,, reon., a ia pracricr
corni,ion de r¡
c -; :::erar que la distribl.j¿lfi;r","üiJ_pt.tu, y Patología Molecular,
iedad Española de Bioquimica
Clínica
tl.o-rmadamente r to qu. ^ zo03f
,o.t;i-;¡. o z h desf'u?. J. irJu.. Guder WG, Narayanan S, \4¡isser
)Q
f i:. _: .-rr. excepto finajizado H, Zatúa B.Muestras: del paciente
ra
d. tu 'ái;;"i;u'|'tu atgitonirru,
.nl1":" al laboratorio. Impacto
de Ii
o
l :n .'.: .i =ecesario esperar de 6 a B
h."it;;ü*
6 0., q-1. no r. hnyu p.rFrnaiJá
se extraerá
r:**::iltl:'::"ii:::i't;."x"1it11*'""''nn'
.. :l '''J''¿*"*:i:l:ff
-
fir*.uu.o. -
u.' gr'i .' ; *" ; ff il,fi ':1#l1lliir'r',Tl1lg2 .,r,"
:,,. {;'sr', }' "r'
a
.a
5 *,'Í,!::^ oT"i Letrmann c,r. s.cho¡[r ,.
_

o
o
" :;l ;:;;iffnH+r:iii:i::,11il:t?;:Jii:l: ^
*,,1,"*loni.il. ..,,",..,
o
;;:T::[ ft ::] ff I;,,i,1, il J, ll, n j:t:::.
I
r
_u
"
"J
:,1 li ;

@
Iletodclogía analítíca I"
Técnicas generales

qTDICE DEL CAPíTUIO

*e"cn
icas espectrales 15 Culombimetría 22
r: :: : - =-:,e la absorción de la luz y la concentración 16 conductimetría 23
:-::i::":':::"netría 16 Técnicas cromatográf icas
i ::::-:':::metría de absorción atómica 18 Tipos de separación 23
: ', *..- . i: emisión en llama 18 Tipos de cromatografía 25
a> Técnicas electroforéticas
:-: : -::'a ;,'turbidimetría 20 Electroforesis capilar 26
Tecnicas electroquímicas 20 Espectrometría de masas
Instrumentación 27
Referencias adicionales 28

mento de medida. La luz, como energía, está formada por

CBJ ETIVOS DE APREND!ZA"IE paquetes de eneigía denominados fotones. La energía (E) aso-
" ' , ,= :.incipios de los análisis que emplean energia ciada con cada fotón está directamente relacionada con la fre-
-,_=:. cuencia (u) e inversamente relacionada con su loneitud de onda
: - j: -.?c- cas de espectrofotometria, (),) mediante la constante de Planck (h):
':':-cretría de absorción atómica, fotometría
. :- :. lama, luminiscencia y turbidimetría E=hu=h/),

- - :! rec^ cas elect.oquÍmrcas: potenc;ometría
-^ :-. ¡ c..lnrhi.net.ia v conductimetrÍa.
, :. '.
-.' :-.';ndamentos de separación cromatográfica.
. .,:' : -:"e .,emente la tecnica de cromatografia gaseosa
, 800 nm, es decir, desde Ia luz ultravioleta hasta la infrarroja.
,, a.
:" -=' :: '-ndamentos de la separación electroforética.
' -
n : - -=':-a.ernente la tecnica de espectromet|a de masas
- . -- -io de bioquimica clínica emplea gran diversidad
-
: ..,:.alrricas yes uno de los lugares en que primero
,, : .. , :'.'oluciones tecnológicas. Se ha conseguido auto-
-'. *-,:','oría de estas técnicas para ofrecer servicio a la
. . -. :-- .rda asistenciai. Muchas de las técnicas utilizadas
--
'::r:. en el laboratorio utilizan la luz como funda-
Esta ecuación muestra que, cuanto más larga sea la longitud
de onda, menor será la energía. La longitud de onda de luz que
se suele utilizar en el laboratorio clínico osciia entre 180 y
Cuando un haz de luz incide en una molécula pueden ocu-
rrir tres situaciones de interés para el análisis:
1. Parte de la luz se absorbe y otra parte se transmite sin pér-
dida de energía. Son las técnicas de espectrofotometría.
2. Lah:z se dispersa por la partícula, cambia de dirección,
pero con la misma energía. Son las técnicas de turbidime-
tría y nefelometría.
3. Laluz absorbida se pierde por interacciones intra v extra,
moleculares y por calor. En algunas moléculas parte de esa
luz se pierde por emisión de un fotón de menor energla.
Éstas son las técnicas de fluorescencia v de fostbrescén-
cia.
Este tipo de técnicas pueden proporcionar tanto informa-
ción cualitativa como cuantitativa a1 medir la intensidad de la
16 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Por su parte, 1a absorbancia (A) es el logaritmo del inverso

de la transmitancia:
rx = roo x-f A= -1ogro Q) = 2- log,o (T%)

Abs=exbxc A determinadas longitudes de onda, las moléculas tienen

mayor capacidad de absorber la luz. Si se representa la absor-
bancia de un compuesto en función de las longitudes de onda,
se obtiene una gráfica conocida como espectro de absorbancia
(fis.2-2).
Conforme aumenta la concentración de un compuesto en
.e una solución, ésta absorbe más luz. Según la ley de Beer, exis-
.! C te una relación directa entre la absorbancia de una solución y
-o a
o
la concentración del compuesto en dicha solución (c) yIaIon-
o
- c gitud del cuerpo que la luz atraviesa (b), según la siguiente for-
=
o mula:

A=axbxc
Concentración Concentrac¡ón
Figura 2-1. Relación entre el porcentaje de transmitancia y la absor- En ella, a es un coeficiente característico de cada sustancia,
bancra con la concentración. lo: radiaciÓn incidente; l:radiaciÓn emitida; llamado absortividad. Si b es de 1 cm y c se expresa en mol/L,
e. coeficiente de absorción molar. entonces en lugar de a se emplea t, que es el coeficiente de
absorción molar de esa sustancia. Su valor también depende
de Ia longitud de onda, del solvente, del pH y de la tempera-
luz absorbida, emitida, transmitida, dispersada o reflejada tras tLrra.
Iainteracción de un haz de luz de determinadas características La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración
con la sustancia de interés. sólo se cumple si Ia concentración no es muy elevada y la solu-
ción es homogénea. La ley de Beer pierde la linealidad en so-
luciones muy concentradas, en las que la concentración calcu-
Relación entre la absorción lada es inferior a la real. Una forma fácil de saber si se cumple
de fa luzy la concentración la ley de Beer consiste en reallzar diluciones de la muestra y
observar si se mantiene la relación.
Cuando un haz de luz con una intensidad determinada (Io)
incide sobre una solución, la intensidad delhaz que sale (I) será
menor que la inicial ya que una parte de su energía es absor- Espectrofotometría
bida por la solución. La transmitancia (T) de una solución para
determinada longitud de onda se define como la proporción Estas técnicas se baSan en la capacidad de los compuestos
de la intensidad de luz incidente que es transmitida (fig.2-l), para absorber energía. EI análisis espectrofotométrico puede
que en porcentaje sería: ser cualitativo o cuantitativo. En el cualitativo se compara el
espectro de absorción de la muestra con espectros de patrones
T (Vo) = 100 x (I/Io) de composición conocida para identificar las bandas de absor-
ción coincidentes. Se realiza frecuentemente en el infrarrojo,
como por ejemplo en el análisis de cálculos urinarios. Mucho
más frecuente es el análisis cuantitativo, basado en la ley de
Beer, para calcular la concentración de una sustancia en una
muestra.
Si se conoce t, que es característico de cada sustancia, se
G
puede calcular la concentración de la sustancia en una solu-
g ción:
a
c
o
c (mol/L) = A I (E x b), siendo b Ia anchura de Ia cubeta en cm
-o

Otra forma de calcular la concentración de determinada

sustancia en una solucíón consiste en medir la absorbancia de
dicha solución (Ar) y compararla con la de otra solución
de calibración (A") de concentración conocida (C.). Así:
Longitud de onda
Solución de calibración: A. = 6. ¡ t
Figura 2-2.
Selección de la longitud de onda de med da. El máximo de
Solución Problema: Ar = Cp x e
absorbancia del compuesto de interés L1 es similar a la de un compuesto
interferente. La mejor longitud de onda para realizar la cuantificaciÓn
es ),.2, para lo cual hay que sustraer la absorbancia del disolvente y del Por tanto, la concentración de la solución problema se puede
agente que interfiere, realizando un blanco. calcular como:
 Capítulo 2-Metodología analítica l. Técnicas generales 17

',.-. = Cc x A, /,\ = AP x K, siendo K = CclAc NAD++H++2e- ¡------------ >NADH

I -;:-:¡ :ra\-or sea s, mayor será la absorción del compuesto

i:-:r::'¡.::Lr1 v más sensible será la determinación. Por ello,
rrÉ:.j'¿ =::rplear cromógenos con un elevado valor de e . Siem-
rrr: ¡,JÉ .,=":.:osible, se ha de medir la absorbancia a Ia longitud
lc :rr';"r :¿ :ná-rima absorción del compuesto o en su cercania
, ii .ir*c - :o:lsigue la máxima sensibiiidad y menores errores. .o
Il *:::- :r:a serie de factores que afectan a la reiación entre -G
* ri.r:.:r:.,¿:-ia r la concentración, como son: c
o
!
i ¿::: :e ia energía también será absorbida por el solvente
, ¿ :,¿:eJ de la celda que contiene la solución.
- -¿ r'-: ::::,jente quizá no sea totalmente monocromática.
-ú i:-É:.:¿ puede ser también dispersada.

:::.: er cuenta la interferencia de estos factores, se uti-

l"l"-¡ 240 260 280 300 320 340 360
"ü;ürf lri.L-::. s ¡ue contienen todos los elementos de la solución, Longitud de onda (nm)
rx*^ren: :: : : ::rFuesto de interés. La absorbancia debida al com-
Figura 2-3. Espectro de absorbancia del NAD. y del NADH. La conver-
fliJciitL: ii':¿ -,:. diierencia entre la absorbancia de la muestra y sión de uno en otro se puede seguir facrlmente por el cambio de absor-
,rü idl\: r:¿::ila del blanco. Además, hay que tener en cuenta bancia a 340 nm. NADH: nicotinamida adenina dinucleótido reducido.
ü¡c ¡]rc'¡:: sstar Presentes otros compuestos que interfie-
'lrxr" ürrÉ n::si'rben a la misma longitud de onda que el com-
¡ulrri1ir :E ::::erés (iig.2-2) y que, por tanto, pueden producir
,iiiii,riu--uLrr :r *- r:eo s de la concentración. mediante el empleo
Otra forma de acoplar las reacciones es
de NADH o de NADPH, que absorben a longitudes de onda
de 340 nm, por lo que su producción o consumo pueden ser
furcbnes acopladas monitorizados por espectrofotometría. Por tanto, son muy
..!ü irnir'r.!: en muchas de las reacciones enzimáticas que empleados como sustrato o producto en reacciones indicado-
.lts{Früsil¡¡"r r. - c...o t d ifíciles de determinar directamente. Estas ras de tipo redox (oxidación-reducción). Un ejempio sería la
?rr]ud-:¡rmc5 .¡ ¿;.rpian a otras reacciones indicadoras que for- determinación de una enzima-transaminasa que forme piru-
nnüfi -.rm:'--i:Lrs que pueden ser fácilmente cuantificados vato de modo que la formación de este compuesto se acople a
:ljrÍi-li.]r ri -=--:. :i¿: espect rales. una oxidación de NADH (o NADPH) a NAD* (o NADP*). En
-,0r txr-:':-;:!as de la reacción inicial se utilizan como sus- este caso, el descenso progresivo de la absorbancia a 340 nm
rÍillü[iir, *:]. -;-: r<g;ndas reacciones indicadoras. Los productos será proporcional a ia concentración de la enzima-transami-
Jilür .ü r*üÉir,-:: :ndicadora que se pueden detectar por un sis- nasa (fig. 2-3):
ütssüii f¡c rÉ::¿¿ ¿decuado (p. ej., espectrofotométricamente)
riiírÍ¡ :rffxn\:N:--- -'::ales a la cantidad de sustrato inicial en la pri- Transaminasa
'mueliü rraf,:-:.- Entre la reacción principal y la reacción indi- Cetoácido + alanina- aminoácido + Diruvato
"iililriLiii!üif'1¡.
f: ;,: i:l-e acoplar una o más reacciones intermedias'
-",üür flsü;:"r::,-¡ ::idicadoras más empleadas son las reacciones LDH
m ür.i;¡. s :--_,1'- t¡¡ida un compuesto indicador, como Ia reac- NADH +H' + piruvato+ NAD* + lactato
luilrÍ: r¡É l:,:-::i- r la del seguimiento de la producción o el
r ri¡mhiütLrn,i : :*: :tt;ot i namida adenina dinucleótido reducido En otros casos, en lugar de ser consumido, el NADH (o
,l',$,;tt-- . -¿:;¿cción de Trinder se acopla a reacciones que NADPH) es un producto de Ia reacción indicadora ¡ por con-
mfnlMili)LirLlÍ u:::;:ación de H'o' como producto. El Hro, pro- siguiente, se observará un aumento progresivo de la absorban-
-ll!1.:r!tri :: ,--:-e:,jo entonces por una enzima peroxidasa ante cia a 340 nm:
uür &srrrr
' 4-¿::::rotenazona (4AF) para generar una quinona
ll.1)rllrLuü.ilr]ltg3trtii¡ : -t se detecta espectrofotométricamente: Glucosa- 6 -P-deshidrogenasa
Glucosa-6-P + NADP*-----------------..------------------- 6-fosfoqluconato +
Peroxidasa NADPH + H.
ll9-: _- :;::"., - JAF.+ quinona + 4HrO
Instrumentacíón
-ili 'lrsü¡:;r: --- ::
Trinder se acopla a métodos para cuantificar
ulLr¡![$sr]llrfrr.- :¿;.t:udes bioquímicas, como glucosa, colesterol, Los espectrofotómetros constan de las siguientes partes
,illlrllullüriil .iü*L: i ::-:1icéridos, entre otros' que empiean sus res-
(fis.2-Q:
)lüilulrÍrirü,5f ru-,:r.¿.s. En 10s métodos que emplean la reacción de
"'li¡nr¡uuls lr:;-e:c :-¿ber interferencias por Ia existencia de com- 1. Una lámpara como fuente estable de energía radiante, que
,rnrurur$r0&Trir
¡rnr:{:r:¡:ntes, como Ia bilirrubina, la hemoglobina o suele ser una lámpara de filamento (halógena o de tungs-
rrÍjr irl1lrtu¡urü üh": :,rlii,l. que pueden interferir en la reacción de oxi- teno) para emitir longitudes de onda a partir de 350 nm 1'
,lfillullllrüüllrt- lrr:',r¡': : elio se ha de evitar la utilización de muestras de hidrógeno o de deuterio para emitir en luz uitravioleta,
lllfllllllllllr" u:1tg ;n: : ::emOiiZadaS. entre 160 y 380 nm.
18 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular
Rend ii^. ¡^ ^^+"-!-,,
rlo) uÉ É rLrdud y salida
/ \
/\
@
,;Y
/\
Lampara f\4onocromador Cu
Fiqura 2-4 Esquena de un especroloton etro.
2. Un selector de longitud de onda, que puede ser de filtros en
los fotómetros, o un monocromador de prisma o de redes
de difracción en los espectrofotómetros, más sofisticados.
Puesto que Ia longitud de onda no es totalmente monocro-
mática, a éstos se les acoplan antes y después unas rendijas
de forma que se puede aislar un intervalo estrecho de longi-
tudes de onda.
3. Una cubeta de 1 cm de paso de banda (anchura) en la que
se coloca la solución cuya concentración se va a determi-
nar. La cubeta ha de permitir el paso de la radiación sin
absorberla o dispersarla. Por ello, para medir la absorban-
cia a longitudes de onda inferior a 320 nm, se han de
emplear cubetas de cuarzo. Para longitudes de onda más
elevadas se pueden usar cubetas de plástico.
4. Un detector de energía radiante, que convierte laluzreci-
bida en energía eléctrica. Los más usados son los tubos
fotomultiplicadores y los fotodiodos. Los primeros, además
de su velocidad, tienen la ventaja de amplificar la señal, lo
que los convierte en muy sensibles. Por su parte, los foto-
diodos permiten detectar fotones de un intervalo de lon-
gitudes de onda muy amplio.
5. Un sistema que recoge Ia señal eléctrica que genera el detec-
tor y se Ia presenta de modo interpretable al operador.
Espectrofotometría de absorción atómica
Esta técnica es muy sensible, precisa y específica, y es
ampliamente utilizada en el laboratorio para determinar ele-
mentos químicos, como Li, Al, Cu, Fe,Zn y otros metales
pesados.
La espectrofotometría de absorción atómica se basa en la
capacidad de los electrones de un elemento en el estado fun-
damental para saltar a orbitales más excitados gracias a la ener-
gía absorbida en forma de luz. Dado que los saltos energéticos
son característicos de cada sustancia, también lo son las lon-
gitudes de onda de 1a 1uz que absorben para pasar a esos esta-
dos excitados. Estas determinadas longitudes de onda a ias
cuales absorbe el elemento tienen un ancho de banda muy
estrecho (0,01 nm) v por ello se denominan líneas espectrales.
De esta forma, para cada elemento se crea un espectro formado
por las 1íneas espectrales.
Para reahzar la absorción atómica, la muestra se vaporiza
inicialmente y 1os elementos se disocian y se reducen a su
estado atómico fundamental:
M"t+ne tMo
beta Sistema de lectura
Para ello se utilizan sistemas de atomización que proporcio-
narán la temperatura suficiente para que los átomos alcancen
el estado fundamental. Existen distintos tipos de atomizado-
res: unos emplean una Ilama que emplea una mezcla de dis-
tintos gases como combustible, y que alcanza unas tempera-
turas de unos 2.300 oC, otros son sistemas sin llama, como el
horno de grafito, que permite alcanzar temperaturas mayores
que las de la llama. Los atomizadores con llama se pueden usar
para elementos como Zn o Fe mientras que 1os atomizadores
sin llama son necesarios para analizar Al y los metales pesa-
dos, como Pb. De esta forma, ios átomos están en disposición
de absorber energía correspondiente a su banda espeltral.
La excitación de los átomos se produce con una luz cuya
Iongitud de onda corresponde a la energía necesaria por parte
de los electrones para saltar a un orbital más excitado. Para
ello se emplea una lámpara de cátodo hueco, fabricada con el
mismo metal que va a ser analizado y rellena con un gas inerte
a baja presión, habitualmente argón o neón (fig. 2-5). Estas
lámparas emiten una energía (hu) a las longitudes de onda
características del elemento del que está hecho el cátodo ¡ por
consiguiente, se necesita una lámpara de cátodo hueco distinta
para cada metal que se vaya a determinar. Por ejemplo, una
lámpara de cátodo hueco de hierro sólo se puede emplear para
determinar hierro. La energía que emite 1a lámpara la absor-
ben los átomos de la muestra:
Mo + hu Mo excitado
El número de átomos en estado basal es más del 99,9o/o del
total de átomos, por lo que la mayoría de los átomos son capa-
ces de absorber la energía radiante emitida por la lámpara de
cátodo hueco.
Estos equipos también disponen de un sistema selector de
longitudes de onda (monocromador), un detector y un sistema
de análisis de la señal recibida. Según Ia ley de Beer, la absor-
bancia será proporcional a la concentración del elemento en 1a
muestra.
Fotometría de emisión en llama
La fotometría de emisión en llama consiste en la excitación
térmica de los átomos mediante el empleo de una llama, de
forma que éstos, al volver a su nivel basal de energía, liberan
esa energía en forma de luz de una longitud de onda caracte-
rística de cada elemento:
 Capítulo 2-Metodología analítica l. Técnicas generales 19

Rendij as de en trada y de salida

/ \
S stema de atomizac¡ón

I I
Sistema de lectura

I lr¡lonocromador
I Detector
(fotomultiplicador)

Sistema de nebulización
. - ¡ r do p<np.-rnmptn¡
-J'vvu!!-Y!!!¡v¡
de absorción atóm ca

l': -ne +Mo Exc tación

- :.- :: + Mo excitado
:.!:,::io+Mo+hu
ñ
.ñ
: : 3:.rergía emitida por los átomos en la e
c -@
¡ ;¡..porcional al número de átomos exci- c 6O
o
..:---.en a la concentración en la muestra.
: l: se ia utilizado en el laboratorio clínico
_o
*
:: :; -a concentración de elementos abun-
:,::sio r-iitio en líquidos biológicos, que
.:-¿. en la llama, pero esta técnica ya se
Longitud de onda (nm)

tiiiiflucf* frmriE :'11..,,a

Pérdida de
energia interna
: r :::: en la propiedad que poseen algunas
ilIr : ---. Cuando los eiectrones de las molécu- .a
o
- : :. ... estado fundamental a otro demayor o
c hur
''LtLi -- . :.. ¿r;itados pierden rápidamente parte
: - : -::eracciones y en forma de calor. En
:.::. de 1a energía adquirida se libera en
,, :stado fundamental. Existen diversos
: :equn el método empleado para con-
.:-:l de 1os electrones:
Figura 2-6. Esquema de a absorcion de energia a una longitud de
onda (),,) y la emisión posterior como fluorescencia a una longitud
.. .::rlea luz. de onda mayor (lr).
:-:r--l si se usa una reacción química.
-.: :- es bioquímica.
- :- -_:scencia si es electroquímica.
rece la energía de excitación, Ia fosforescencia se prolonga en
-,. . :: luminiscencia, la intensidad de la luz el tiempo.
, *.. ¡ .¿ concentración de la molécula lumi- La inlensidad de la luz emitida por la solución es proporcional
a Ia concentración del fluoróforo o molécuia fluorescente y a la
, .. :-rc¡lécula absorbe un fotón y pasa a un intensidad de la fuente emisora inicial. También depende de
-,. :r;itado. Al volver a su estado funda- otras variabies relacionadas con el equipo, por 1o que, a diferen-
:r= r irl forma luz(fig.2-6),pero ya que
de cia de la espectrofotometría, no se puede realizar una calibración
:::'.':¿t¡ente, energía que se emite es algo
1a absoluta y, en consecuencia, se mide en unidades relativas.
::-::. Como consecuencia, la longitud de Los componentes de los fluorímetros son sin-rilares a ios de
:: : i nta\-or que la que se emplea para exci- un espectrofotómetro, a excepción de los filtros (o monocro-
...:.r Jos tipos de fotoluminiscencia: fluo- madores), que se colocan antes y después de la celda para ais-
:::::.-ia, que difieren en el hecho de que, lar la fluorescencia emitida. En la ma1-oría de 1as ocasiones, e]
::-:r--li cesa en el momento en que desapa- detector está formando un ánsulo de 90' con la luz incidente.
 20 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología morecurar
Esto proporciona mayor sensibilidad ya que evita que Ia luz
incidente alcance el detector.
La técnica de fluorescencia es entre 100 y 1.000 veces más
que la espectrofotometría, por lo que se utiliza para
'ersible
ietectar analitos que están en muy baja concentración. Las
ietermi¡aciones hán de realizarse en muestras diluidas, con
,ra absorbancia menor de 0,1, ya que a concentraciones ele-
vadas el propio fluoróforo también absorbe a la longitud de
onda de excitación. Así, a medida que el haz de excitación pene-
tra en la solución, pierde intensidad y la relación entre Ia fluo-
rescencia y la concentración deja de ser lineal.
Nefelometría y turbidi metría
Cuando la luz incide en una solución, parte de la luz se dis-
persa por las partículas en suspensión, otra parte se absorbe y
otra se transmite (fig. 2-7A). La luz dispersada dependerá de
distiltos factores, como el tamaño y el peso molecular de la
particula, la longitud de onda de la energía incidente, Ia dis-
tancia entre el detector y la cubeta, y la concentración de la
muestra. Los equipos emplean longitudes de onda que evitan
aquellas a las cuales se absorben los compuestos presentes en
ia muestra. Las más frecuentes están entre 500 y 650 nm y la
energía de la luz transmitida o dispersada tiene la misma lon-
eitud de onda. La nefelometría mide la luz dispersada mientras
que la turbidimetría mide el descenso de la luz transmitida:
l- La turbidimetría mide la disminución de la luz cue atra-
'r-iesa la solución debido a la tur.bidez, por lo que el detector
se sitúa en línea con la luz incidente. Es una técnica muy
sf,<:
t señal eléctrica producida durante una reacción química en
^/
Turbidimetrla
u/
a
j\
@ que es proporcional a la concentración del anallo en la
Figura 2-7A.
w
ffiffi N"felometría
Dispersión de la luz incidente por las partículas en sus-
:,:-s 31 y detecc¡ón por un descenso de la luz transm¡tida (turbidimetría)
:.'.' ¿ uz dispersada (nefelometría).
. =: ¿c ón incidente.
u
5
;,grra 2-78. Esquema de un nefelómetro. lo: radiación incidente; lo: radiación dispersada
sencilla que se puede llevar a cabo con un equipo de espec-
trofotometría de absorción. Sin embargo, no es muy sen-
sible, por lo que se emplea para cuantificar concentraciones
relativamente elevadas.
2. La nefelometría, en cambio, mide la luz dispersada por una
solución de partículas, por 1o que el detector se sitúa for-
mando un ángulo con la luz incidente (fig.2-78). En casi
todas las aplicaciones del laboratorio la mayor dispersión
de la luz es hacia delante, por lo que el detector ü estos
equipos se coloca formando un ángulo entre 10 y 90.. El
equipo es similar a un fluorímetro, pero con la importante
diferencia de que la longitud de onda incidente y la disper-
sada con la misma. La concentración del compuesto (C) es
proporcional a la relación entre la luz incidente (IJ y la luz
dispersada (Io):
C=KxI¡/Ir
Estas técnicas basadas en la dispersión de la luz se utilizan
habitualmente en la medición de reacciones entre antígeno y
anticuerpo, en las cuales estos complejos forman agregados
que causan un incremento de la turbidez. Hay que tener en
cuenta que en la muestra pueden estar presentes macromolé-
culas o partículas, como lipoproteínas, que pueden provocar
una elevada dispersión inicial de Ialuz e interferir en la cuan-
tificación del analito. Este fenómeno se puéde minimizar,
midiendo cinéticamente la dispersión de la luz.
Y**en üeas * *ectx"mqu f r¡n leas
Las técnicas electroquímicas se basan en la medida de una
una célula electroquímica, que consta de dos electrodos conec-
tados por una solución electrolítica. Un electrodo (es decir,
media célula) consiste en un conductor metálico que está en
contacto con una solución electrolítica. Existen diversos méto-
dos analíticos que se basan en fenómenos electroquímicos:
1. La potenciometría, que mide el voltaje, o la diferencia de
potencial entre dos electrodos de una célula electroquímica,
2.
solución.
Laamperometría, que mide Ia intensidad de corriente causada
porla aplicación de unvoltaje constante en una célula electro-
química, lo que produce una reacción química en la solución.
3. La culombimetría, que mide Ia cantidad de carga eléctrica
necesaria para que reaccione un compuesto en Ia solución.
Detector
 Capítulo 2-Metodología analítica l. Técnicas generales
, ,' .-.: -rctimetría, que mide la corriente que puede trans-
- : -: '.na solución aplicando una diferencia de poten-
- . ': --r--as tienen la ventaja de que pueden usar volúme-
-:
' muY pequeños, su sensibilidad es muy alta y el
' , -::ird
:: -lrncentraciones de detección es muy amplio. Pue-
, , ::rS3 ¡ara mediciones tanto en plasma como en orina
- -,l.is biológicos, en los cuales son muy diferentes
' ::
-.::;rLrnes de cada ion. Son muy rápidas y no necesi-
r -: r:r:.-tr]-I prer.ia de la muestra, por lo que tienen una
. - : - - a en los laboratorios de urgencias o a la cabecera
' . . : -.: Se emplean habitualmente en la determinación
: . - - :. ;oll1o Na*, K*, Cl y HCO,-.
!":::rciometría
. : I - -t¡metría se determina la diferencia de potencial
- : : --.:Lrdos que se encuentran en una solución. Así,
'-- .'.ra cé1u1a electroquímica (E) está determinado
-:
E_E
L - L-rtodo -E--uoJ.
: :otencial del cátodo I Ea.o¿o, el potencial dei
:- *:.:on de Nerst, el potencial de cada semicélula
,- :r logaritmo de 1a actividad del ion en la solu-
- -s:
i = Eo + (0,059/n) x log a,
en voltios de la célula medido
..:cial estándar
,:.
¿¡tir-idades valen 1; n es el número de elec-
.---r3n en la reacción, y ar es la actividad del ion
:. r*rS, existe una relación lineal entre la acti-
- : :cncial de la célula electroquímica.
. -l:r..dos es el indicador (cuya solución electro-
- -,: que debe analizarse) y el otro es un elec-
---l Jon un potencial constante y conocido. El
-:::;ia se conecta con e1 espécimen que debe
-.. : nembrana porosa y de este modo se cierra
. :-:;irodos están conectados a un voltímetro,
j::3acia
de potencial entre ambos electrodos.
::tl: potenciométrica no existe un paso de
- --.-:.a electroquímica.
,- :--:idas, como las fisiológicas, las actividades
. - . -¿s concentraciones molares. La determi-
' -::d tiene unas diferencias respecto a otras
,. c. absorción atómica, en que se miden con-
:'.:.:ra directa no está afectada por la varia-
:-r:ración de lípidos o proteínas, que pueden
' :.. .¡;nicas que miden la concentración. En
: :-'-LrSa. se diiuye y producen resultados más
', - -. que se realiza sólo corresponde a los iones
,, -:--t-rs que están formando complejos o están
: - .: rquímicamente.
21
Electrodos de referencia y de trabajo
El eiectrodo de referencia es una semicélula electroquímica
que se usa como una referencia fija para medir el voltaje. Los
más empleados son el electrodo saturado de calomelanos y el
de plata-cloruro de plata:
1. El electrodo saturado de calomelanos está formado por
mercurio cubierto de una Dasta de caiomelanos en una
solución saturada de KCL En este eiectrodo se produce la
reacción:
ll2I.J,g,Cl (sólido) + e- ...-.- Hg (metal) + Cl
E = +0,241V
2. El electrodo de Ag/CIAg consiste en un hilo de plata
cubierto de AgCl y en una solución saturada de KCl, en que
se produce la reacción:
AgCl (sólido) + e Ag (metal) + Cl-
-
E = +0,197 V
El potencial de estos electrodos depende de Ia reacción redox
¡ según la ecuación de Nernst, de la actividad del Cl en la
solución ya que la actividad de un sólido es 1.
Los electrodos de trabaio suelen ser electrodos selectivos de
iones. Éstos contienen una membrana que reacciona de forma
selectiva con un solo ion, y cuya parte externa está en contacto
con la disolución que contiene e1 ion que debe medirse mien-
tras que la parte interna contiene una solución del mismo ion
a una actividad fija. Las muestras biológicas son mezclas com-
plejas y es muy importante que ia membrana sea restrictiva
solamente con el ion que se quiera medir. Existen varios tipos
de electrodos selectivos de iones:
l. Electrodos de membrana devidrio, que consisten en una mez-
cla de óxido de silicio o aluminio, con óxidos de cationes de
metales alcalinos o alcalinotérreos. Es el electrodo típica-
mente empleado para la determinación de sodio y de pH.
2. Electrodos de membrana de polímeros. Consisten en una
membrana de polivinilcloruro (PVC) impregnada con
una solución que contiene un intercambiador o transporta-
dor de iones. Estos electrodos se emplean para medir la con-
centración de H*, Na*, Kt, C1-, Lit, Ca2*, Mg'- y HCO, . Un
ejemplo es el electrodo empleado en 1a cuantificación de
potasio. En este caso, la membrana contiene valinomicina,
un antibiótico con gran capacidad para transportar potasio.
Otro tipo es el electrodo empleado para la medición de clo-
ruro, que emplea sales cuaternarias de amonio como com-
ponentes de la membrana selectiva y se basa en ei carácter
lipofílico del cloruro. Por tanto, no debe emplearse en situa-
ciones en que estén presentes otros aniones lipofílicos, como
los salicilatos o los tiocianatos, ya que producirán una inter-
ferencia positiva. El empleo de heparina como anticoagu-
lante de las muestras produce, en este tipo de electrodos, una
pérdida progresiva de la selectividad por el cloruro.
Electrodo de pH y de CO,
EI electrodo de pH consiste en una varilla de AgCl sumer-
gida en una solución 0,1 N de HCl. Su ertremo es una nem-
brana de vidrio selectivo y sensible a los H- (fig. 2-8). Este elec-
 =....-

22 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Voltímetro

Cátodo: electrodo de
trabajo de platino Ánodo: electrodo de
02+ 4H++ 4e- 2HzO referencia de AglAgCl

- Ago --.....--------* Ag++ e-

Puente salino Membrana

rrrcourtr
-^-hl^ -l A
dr v2

Entrada de
Salida de la
la muestra
muestra

Figura 2-9. Electrodo de Or. La cornente generada es proporcional a

:.rtrndn da nl-l la concentración de O, en la soluctón.

-- s- encuentra en combinación con otro electrodo de La intensidad de la corriente que se establece entre los elec_
:.::;ia que proporciona una diferencia de potencial fija. trodos es proporcional a la concentración de la especie elec-
:- potencial de la célula es: troactiva que produce la reacción electroquímica.
Un ejemplo es el electrodo de O, o eleclrodo de Ciark (fig.
E = E*, + 0,059 x log [Hrl 2-9). Consta de un cátodo de platino conectado a un ánodo d-e
Ag/AgCl. Los electrodos están en contacto con un tampón
,.:::!r que ei pH = -log[H"], entonces el valor del pH en el de una sal del cloruro, que está separada de Ia muestra .n q.r.
:-:rir es proporcional a la diferencia de potencial: se quiere medir la concentración de O. por una membrana
permeable sólo a las moléculas de este gai. El oxígeno del espé-
pH = (E."r- E)/0,059 cimen difunde a través de Ia membrana hacia el cátodo de ola-
tino, al cuai se le aplica un potencial constante que corresponde
*::;o el electrodo de pH se pone en contacto con el espé- al par OrlHrO y en que se produce la reducción:
:r. se qenera un incremento de voltaje proporcional a la
.:::ación de H-. Or+4Ht+4e --2HzO
:-r.trodo de CO, es similar al de pH. En este caso, la
':::ra en contacto con el espécimen sólo es permeable al En el ánodo se producen los electrones:
:.:(r no a los protones. Éste difunde al interior, donde
- . st'¡lución de HCO. . A1 entrar el CO, cambia el pH de Ag+Cl--AgCl+2e
-.! 11 quc
-:.r¡n
._
Qu€ sc
se c1e[cLLa corl un
detecta con electrodo oe
urr eleclroc.o pH. AS1
de p-r1. Así pues, e]
el
:. .e f otencial debido ai cambio de pH será proporcro- Así, se origina un flujo de electrones entre el ánodo y el
. -: --!rncentraclón de CO, en ei espécimen: cátodo que se puede medir y cuya intensidad es directamente
proporcional a Ia concentración de O, (o a la pO,).
CO. + H.O H'CO, H* + HCO.
(E,"r-E)=pQQr=pH
- -
:::,¡lema de estos electrodos es la contaminacron pro- Culombimetría
. . :: nembrana con proteínas, por 1o que es necesario
-a
:. Según la ley de Faraday, el número de moles producido por
--:;¿ cierto número de determinaciones.
un compuesto en una reacción electroquímica en un electrodo
es proporcional a Ia cantidad de carga eléctrica que pasa por
r,mperometría el circuito (Q, culombios):

: . , :: .-itr técnica especial electroquímica en que se emplea Q=zxFxN

' ' - : -:: Je algunas sustancias, llamadas especies electroac-
.

... :. --\,ldarse o de reducirse ante un electrodo inerte donde z es el número de electrones que se transfieren en la
- - :. :¡1ica una diferencia de potencial. Se emplean un reacción de oxidaciónireducción, F es la constante Faraday y
'--::.::::rldOS:
N es el número de moles del ion liberados.
La cantidad de carga eléctrica es igual a la intensidad de
' : :,.:trdo de trabajo, normalmente de platino o de oro. corriente (I) por el tiempo durante el cuai fluye la corriente (t),
: :. :i produce una oxidación de la especie electroac- por lo que se puede establecer que:
:- :, lnodo y, si se produce Ia reducción, e1 cátodo.
.. . - J.rr de referencia, normalmente de Ag/AgCl. Ixt=zxFxN
 Capítulo 2-Metodología analítica l. Técnicas generales 23

' - , -:. :L.licación de esta técnica es la titulación de la

' :- i.¡ cloruro en líquidos biológicos. En este caso, retención
: -: -.r-: ;orriente entre dos electrodos, uno de platino
ie plata (ánodo), en el cllal se oxida a Ag". Los
- : - r.. scncia del Cl de Ia muestra precipitan en forma
- - r --- ;ual la corriente es baja. Cuando se agota el
' . - ,: --r aumento de los iones Ag*, que son detecta- I
(u
' '::-rrento de la corriente:
'inodo: Ag - Ag* + e-
Solución: Agt + Cl- - AgCl 4)

-,-:-rrte e1cual se detiene y neutraliza los iones

. . -. -.r¿l a la concentración de Cl .

.:-:-:",imetría
Tiempo (min)
'--rr^ 1^
_ _._1.t1ú llltug -^-^cidad de
rd t4P4 los iones de una
Figr:r; ?-"1*, Esquema de un cromatograma.
: . ,,.-rs¡ortar la corriente eléctrica cuando se 1es
. ,--.crcrruld
- :---- -.. -:^ uc
l^
yurcrrcial. Cuanto menor sea la
-^+^--

--. s¡,ución,
. mayor será la conductividad. La con-
, . --:-, :.i.iedio acuoso depende de varios factores: mezcla. Esto es importante porque, en una mezcla tan compleja
como un fluido biológico, puede haber sustancias que coe1u1'an
..:' ..¡rr-ri cuando mayor sea la concentración, con el compuesto de interés e interfieran en la medida.
: ., :.onductivldad. La salida de los compuestos de 1a columna se controla con
, -,; -r¡s iones más pequeños y móviles, como C1-, un detector, que está seleccionado y ajustado para identificar
: .r j,rcen mejor la corrrente. sólo los compuestos que interesen. Al registro de las señales o
.,. movilidad de 1os iones aumenta con la tem- picos que aparecen en función de1 tiempo se denomina cro-
. -':,rrimadamente el 1-3% por grado Celsius. matograma (fig. 2-10). Desde que se inyecta la muestra hasta
que comienzan a salir Ios compuestos no retenidos de la
- , i: :'-¡1i.¿r a 1a determinación de la concentración columna transcurre un corto período de tiempo, que es el
, ,,-i.rt' \-a que, cuanto mayor sea la concentra- tiempo muerto. El tiempo de retención de un compuesto es
. - ,lcr\-or será la corriente que puede pasar. No el tiempo que necesita para aparecer el máximo del pico desde
- ::,-.tividad también depende de otras especies que se inyecta la muestra. Estos picos aparecen sobre una línea
: .:> irt el espécimen. base, que es la señal producida cuando por la columna sóIo
aparece fase móvil. El cromatograma proporciona la informa-
ción sobre la forma de los picos, 1os tiempos de retención, el
área y la altura de los picos que forma cada compuesto al eluir.
A partir de elios se obtiene la información:
:-.i-¡L es una técnica física de separación de los
l. . .r.r nlezcla por su diferente disLribución entre
1. La identificación de un compuesto se realiza por el tiempo de
,:,-. :ase móvil que son inmiscibles. La fase móvil
retención, que se refiere al momento en que aparece la señal
- :lL-onentes de 1a muestra sobre una fase esta-
y que se compara con un patrón de composición conocido.
. :,-.:l interaccionan. Los distintos componentes
':
.J1r.' \gP4rdlluu r¡^. lrinteraccionar con Ia fase
. -,.^"^.¡^ LrdJ
2. La cuantificación de un compuesto se realiza sobre la base
' .::r saliendo en el eluido. IJn plato teórico es la del área o la altura del pico que forma en el cromatograma.
Previamente se realiza una calibración con patrones de
: :rr cn la cual el soluto alcánza el equilibrio
concentración conocida.
:'-,-,r'i1 r- estacionaria. La eficacia de separación
- ,. ce(cribe por el numero de platos [eóricos.
La resolución o la separación entre los picos del cromato-
... l^ l^ fA-'-,,1^.
--úuu -^-
PUr l4 rullr1ur4.
grama está determinada por la diferencia entre Ios tiempos de
elución de los picos y la anchura de éstos. Cuanto más separa-
Longitud de la columna
dos y más estrechos son los picos, mejor separación obtendrán.
-,:ios teorrcos =
En cambio, unos picos anchos y solapados muestran una mala
Altura equivalente
separación.
del plato teórico

. : !ca el número de platos teóricos, mejor será la

: ::--ririo, una columna con partículas de 5 prm de
: .:go, tipica de cromatografía líquida de alta efi-
-,.- inglés high performance liquid chromatogra-
- , - ' platos teóricos. La cromatografía será tanto
.rrciS se puedan separar los componentes de la
Tipos de separación
Atendiendo a la fase móvil, 1a cromatogr¿rira se divi.le en
cromatografía líquida y de gas (tabla 2-1). Asimismo. según el
tipo de interacción que permite separar los solutos, la crona-
tografía puede ser (fig. 2-11):
 24 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Tabia 2-n " TiBos de ers¡'natografía

Fase móvil Fase estacionaria Tipo de separación
Gaseosa Sólida Adsorción
Líqu ida Pa rtición
Líquida Sólida Adsorción
lntercambio iónico
Afinidad
Gel de exclusión
Líqu ida Partición

De adsorción, basada en las diferencias de adsorción y
desorción de los compuestos que viajan en la fase móvil
con la superficie de ias partículas que forman la fase esta-
cionaria. Esta puede estar compuesta por una sustancia
apolar o polar, normalmente sílice o alúmina y en estos
últimos, la retención de los solutos se incrementa con su
polaridad. Se emplea poco debido a la dificultad de prepa-
rar soportes homogéneos.
2. De partición, basada en la separación de los solutos por
diferente distribución entre dos fases inmiscibles, una polar
y otra apolar. Los compuestos eluyen en función de su solu-
bilidad en cada fase. La fase estacionaria es una fina caoa
de líquido adsorbida o químicamente unida a 1a columna.
Si la fase móvi1 es un gas, la cromatografía será gas-líqtrido
y si es un líquido, la cromatografía será líquido-líquido. Es
un tipo de cromatografía muy usada en e1 laboratorio clí-
nIco.
De intercambio iónico, basada en la separación de los com-
puestos según su carga. Las columnas de intercambio catió-
nico contienen una resina con grupos funcionales cargados
negativamente que se usan para separar cationes y las
columnas de intercambio aniónico contienen una reslna
con grupos funcionales cargados positivamente para sepa,
rar aniones. Los iones de 1a resina están unidos a contraio-
nes, que se intercambiarán con los compuestos ionizados
de la muestra. Las moléculas unidas a la resina se eluyen
posteriormente haciendo pasar una fase móvil que las des-
placen de la resina. La separación de los distintos compo-
nentes con la fase móvi1 se puede realizar mediante varia-
ciones en el pH, que permite controlar el grado de
ionización de los compuestos, o mediante cambios en 1a
carga iónica, que establece competencia con los grupos car-
gados. Los compuestos menos cargados, que forman unio-
su nes más débiles, eluirán antes mientras que los más car-
gados, que establezcan uniones fuertes con la fase
estacionaria, eluirán más tarde.
4. De filtración por geles, o de exclusión molecular, basada en
el tamaño de las moléculas. La fase estacionaria es una
estructura porosa, como agarosa, vidrio, etc., con un
tamaño de poro por el cuai 1as partículas pequeñas puedan
penetrar. Si el tamaño molecuiar de1 compuesto que viaja
en la fase móvil es superior al tamaño del poro de Ia fase
estacionaria, no penetrará a través de éste )., por tanto,
eluirá rápidamente. Sin embargo, si el tamaño del com-
puesto es inferior al tamaño del poro, el compuesto pene-
trará en elios. Cuanto rnás pequeña es la molécula, más
profundamente entra por ios poros, aumentando su tra-
yectoria y eluyendo más lentamente. Existen distintos tipos
de resinas con difefente tamaño de poro para separar molé-
culas. Por ejemplo, la Sephadex G25 sirve para separar entre

Adsorción lnterca mbio Filtración Afinidad

tontco

* *
ceÜ * &*
*** &
ee*
€
*
*
clt *
it
*<+*
i: t
I
*** o'&
I
i

mm T (min) T (min) T (min) T (min) T (min)

N:igura 2-'l'i. Tipos de separac ón cromatográf ca Adsorción: separac ón por la adsorcjón/desorc ón. Part¡c ón: separac ón por diferente solubi idad
lnte.c¿'nb o ion co. >eparacion po. la carga io- ca. F ltración en geles. separac ón por el tamaño. Af n dad. separac ón por a un ón a un lrgando.
 Capítulo 2-Metodología analítica L Técnicas generales 25

,.r0 D mientras que la Sephadex

-,' - , r 150.000D.
G200 separa

...:.;. l¡asada en interacciones del tipo antígeno-anti-

. :'r -. :::ona-receptor o enzima-sustrato. En función de
- :.: 3rtre e1 ligandoysu receptor, latécnica serámás
' : - : - !:.cíilca. Esta técnica se utilizaparalaseparación
- - : r ::-..bina glucosiladaconcolumnasdefenil-borato
- , -,l..globulinas con columnas con proteína A.

- ::s de cromatografía
j-: -: iografía en capa fina t''l'J,1.0'
' . : :r.:-¿cas de vidrio sobre las cuales se deposita una
F!gura 2-12. Esquema de un equipo de cromatografía liquida de alta
.-: i *; e ser una flna capa de sílice, alúmina o almi- eflcacia (HPLC).
- . ::: r; coloca verticalmente sobre un eluvente oue
,' - ' j-:olvente orgánico y que ascenderá por la pláca
: -'.:. j. Las muestras se colocan por encima del nivel emplear fases móviles que son polares, como soluciones acuo-
.. : -': : ..¡ienden arrastradasporélyse separan según
sas o alcohólicas. Dado que los componentes de los fluidos
-.: -a polaridad del eluyente y de la sustancia, yla
biológicos son polares, pueden disolverse en la fase móvil. Esto
, - ,::-¡usión.
permite muchas más aplicaciones que la cromatografía de gases
y es posible determinar un gran número de compuestos, como
1,": *,atografía de gas-líquido porfirinas, aminoácidos, péptidos, etc. Los solutos se separan
' -' ... ::alía gaseosa permite una rápida separación de en función de sus características no polares, de modo que los
. i ', ,-atiles. Muy frecuentemente es necesario deri- compuestos más polares eluyen más rápido.
' . - :r:onentes
de la muestra para hacerlos más volá-
- -: :::más
reduce la descomposición del compuesto.
' - : - . r: .: r'olatiliza en la parte inicial de la columna por
: ,:.::::ada por un gas inerte, como helio o nitrógeno, Esta técnica se utiliza principalmente para separar proteí-
, . . ,-,:rdad constante. Este gas de arrastre no interac-
nas en líquidos biológicos, especialmente suero, orina y 1íquido
: -lrmpuestos. La columna suele ser de un metal
: : . j: :in líquido no volátil, como e1 aceite de silicona. cefalorraquídeo. Se basa en la aplicación de un campo eléctrico
sobre una solución en la que hay distintas moléculas cargadas,
- : -::-r! se separan en función de su solubilidad y su
" : - .: -:se iíquida. La entrada por solubilidad y saiida que migrarán hacia el electrodo de carga opuesta a la suya (fig.
2-13). La velocidad de migración depende de las siguientes pro-
- -. : - :.pite más de 6.000 veces a lo largo de la columna. piedades:
-', -.: .r es característico delacolumnayse denomina
: - : rrs compuestos salen de la columna, ya separa- 1. Carga, tamaño y forma de las partículas.
: -: :- -.:l rnediante diversos sistemas, como es la ioni-
- , ,::: o la espectrometría de masas.
2. Corriente, voltaje y potencia del campo eléctrico aplicado.
- : j--: rápidos, versátiles y sensibles, por 1o que se 3. Propiedades fisicoquímicas del medio de soporte.
, : :. -:boratorio para el análisis de ácidos orgánicos, 4. pH, fuerza iónica y tipo de iones del tampón de electroforesis.
. _ :-
: .-t\. ( LL.
5. Temperatura y tiempo de eiectroforesis.
El tampón sirve de conductor de la corriente eléctrica que
L': * aiografía líquida de alta efícacía (HPLC) se aplica al sistema ¡ además, fija el pH al cual estará la mues-
.: : : s recnicas cromatográficas más empleadas en el
, tra que se va a separar. En concreto, las proteínas tienen una
. --::ico. Existen aplicaciones para los distintos tipos constante de disociación en ácido (pK,) determinada, de forma
' ,' :::i:a. pero la más habitual es la partición. La fase que el pH del tampón fija el tipo de carga que presentará el
: -:-: i]dSár a través de una columna gracias a una soluto, su grado de ionización y el electrodo hacia el cual
. ' : -.: --:a que proporciona un flujo rápido y uniforme.
: - .¿rbién un inyector de muestra, que puede ser Fuente de alimentación

-. ,:ratico, y un detector para identificar 1os com-

. Jlr (ruI(lluu - - "'- L-t-t, /t
-.. \ttB.
-: - :ratografía de fase normal cuando Ia fase móvil
Gel de separación
- .: que la estacionaria y de fase reversa si Ia fase
": r'la táse estacionaria es apolar. Las columnas
::l son 1as empleadas más habitualmente y están
- ::i partículas de sílice de un tamaño de 5-10 ¡"rm
:: rnen unas cadenas alifáticas. Las más emDlea-
-' ,¡mnas C18, con cadenas alifáticas de octadecil- rampon
l ,¡:r cadenas de octilo. De este modo se pueden Ficura 2-13. rsn.rema de un¿ c,be-¿ oe e ect.otorer 5
26 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica V patología molecular
+ Flujo neto hacia el cátodo
+ I++
'++
cargada --¡, ",1.+,
negalrvamenle -F-
+ en función de su carga y tamaño, se recoge el gel y se fija para
t que cada elemento se mantenga en la posición correspondiente.
A
Migración contraria
Migración de las
por electroenddsmosis
moléculas cargadas
-_____-}
Punto de aplicación
íiqura 2-14. Fenómeno de electroendósmosis: los cationes del tampón
se desp azan ba.lo el campo eléctrico y arrastran el agua de hidratación. E
resultado neto es un flulo de solvente hacia el cátodo. Abajo: movimiento
taiód co de inmunog obul nas en un proteinograma por el fenómeno de
3 ec:'oercosmos s.
rnigrará. Laluerza iónica del tampón determina ei grosor de
la nube iónica que existirá alrededor de cada molécula cargada
r- su migración. Cuanto mayor sea la concentración de iones,
ntavor será 1a nube iónica por tanto, el soluto tendrá mayor
¡ sitómetro es un sistema óptico mediante el cual se mide la
dificultad para el movimiento.
Existe gran variedad de soportes sobre los cuales se van a
separar las moléculas y los más usados son los siguientes:
I. Agarosa. Este polisacárido se utiliza ampliamente para la
separación de moléculas de elevado peso molecular, como
proteínas, ADN o lipoproteínas, ya que los poros de los
geles son grandes. Se emplean concentraciones de agarosa
entre el 0,3 y el 2o/o y Ia electroforesis se realiza horizon-
talmente por el grosor del gel. Algunas agarosas captan
grupos hidroxilo del tampón mientras se cargan negati-
\-amente y se rodean de una nube de cationes hidratados.
Cuando se aplica la corriente, se produce el fenómeno de
electroendósmosis, que consiste en un movimiento de la
nube de cationes hacia el cátodo. Las moléculas débil-
mente cargadas son así arrastradas por este flujo hacia el
cátodo (fig. 2-1a). Esta propiedad es muy útll para separar
proteír.ras, pero también hay agarosas que están prepara-
das para no tener electroendósmosis, ta1 y como son las
agarosas purificadas, que se emplean para Ia electrofore-
sis del ADN.
2. Poliacrilanllda. Estos geles se preparan creando polímeros de
acrilamida gracias a catalizadores. Estos geles presentan
numerosas ventajas (son transparentes, termoestables, quí-
micamente inertes, resistentes, etc.). Estos geles son más estre-
chos y 1a electroforesis se realiza verticalmente. Sin embargo,
son más difíciles de preparar que los anteriores y no son tan
utilizados en el laboratorio habitualmente. Además, en fun-
ción de la concentración de acrilamida que se emplee en la
preparación de los geles, se puede variar el tamaño del poro
del gel, segrJrn las necesidades. Este tipo de geles también puede
utillzarse en la separación de fi agrnentos pequeños de ácidos
nucleicos puesto que permite dlscernir fragmentos con una
diferencia de 1 a 50 pares de bases (bp).
Actualmente, en los laboratorios clínicos se utilizan siste-
mas automatizados para 1a realización de electroforesis de aga-
rosa, que permiten una elevada carga de trabajo, así como
resultados reproducibles y comparables.
Una vez que ios componentes de la muestra se han separado
Posteriormente, se tiñe el gel con un colorante específico para
el tipo de compuesto que se quiera determinar:
l. El colorante más usado para proteínas por su sensibilidad
y facilidad de uso es el azul brillante de Coomassie oue
absorbe a 550 nm y con é1 se pueden detectar hasta 0,1 ,ug
de proteínas. Este colorante se puede usar tanto en geles de
agarosa como de poliacrilamida. Con la tinción de plata se
consigue incrementar unas 50 veces esta sensibilidad
mediante el empleo de geles de poliacriiamida.
2. Las lipoproteínas se tiñen con solución de sudán neqro o
con rojo oleoso O.
3. Los ácidos nucleicos se pueden identificar debido a la fluo-
rescencia que producen con bromuro de etidio y se pueden
detectar hasta 10 ng.
Tras la fijación y tinción de las proteínas, las distintas ban-
das, que pueden corresponder a una sola proteína o a un con-
junto de ellas, se cuantifican mediante densitometría. El den-
transmitancia de cada fracción teñida respecto a la del total de
la muestra. De esta forma, si se conoce IJ concentración total
de proteínas, se puede calcular la correspondiente a cada
banda. A lo largo de este libro se presentarán numerosos ejem-
plos de electroforesis. .
Electroforesis capilar
En la electroforesis capilar, las muestras se separan en un
tubo capilar largo, de aproximadamente unos 50 plm de diá-
metro y de unos 50 cm de iongitud, de sílice fundido relleno
con un tampón y en el cual se aplica un voltaje muy elevado
(10-30 kV). La muestra se coloca en un extremo del capilar v
se sitúa un detector, normalmente un espectrofotómeiro, en
el otro extremo. La separación de 1os componentes de la mues-
tra se basa en la carga, tamaño, hidrofobicidad y estereoespe-
cificidad. El flujo electroosmótico es importante debidó al
intenso campo eléctrico, de modo que el movimiento del tam-
pón hacia el cátodo arrastra todas las moléculas.
La electroforesis capilar, en cierto modo, es similar a las
técnicas de HPLC ,v con ellas comparte muchas aplicaciones.
Tiene una elevada resolución y el níimero de platos teóricos
(105-106) es de un orden de magnitud s.,.p"iior a la de la
HPLC. Tiene otras importantes ventajas, algunas de las cua-
les son el hecho de que se emplean muy pequeños volúmenes
de tampón y de muestra (del orden de nL), las condiciones
analíticas se pueden rnodiiicar fácilmente y es rápida (de
unos pocos minutos de duración). Esta técnica se ha empleado
para separar y cuantiiicar proteinas, ADN, iones y
-étabo-
Iitos, etc.
 Capítuf o 2-Metodología analítica l. Técnicas generales 27

rn+
r1 El ion más abundante en el espectro de masas se denomina
F 21n'
Vl + F-n+ pico base y se le asigna un valor relativo del 100%. A1 utilizar
'l E n+
'22 la abundancia reiativa de cada fragmento iónico, se consigue
r3
minimizar la variabilidad propia del aparato y permite com-
Pico base
parar los espectros de masas obtenidos por distintos equipos.
Para un determinado sistema de ionización, la separación,
detección, y el tipo de fragmentación de la molécula en 1os
iones es siempre igual. La fragn.rentación de cada ion en esaces
concretos depende de su estructura química, por lo que es
oosible determinar la estructura de cada analito en función de
su espectro de masas. Además, actualmente existen librerías
de espectros que ayudan en 1a identificación sin error de los
analitos.
La espectrometría de masas es una técnica rápida y los pro-
cedimientos basados en estas técnicas son muy específicos ya
n/z
que puede identificar sin error las moléculas y proporcionar
: -: :ie un espectro de masas. El ion molecular (M-)
un espectro característico de cada molécula de forma que
-, ::: ¡ co base es e fragmento más abundante, al
ofrece información estructural. Así, puede informar de la exis-
- -á ¿bundancia de los otros iones se muestra
tencia de isótopos o modificaciones postraduccionales de la
proteína. Además, es una técnica cuantitativa muy sensible ya
que permite detectar concentraciones extremadamente peque-
ñas.

:,:.: de rnasas es una técnica compleja y espe-

, :.:;rnrinación tanto cualitativa como cuan-
. , -l iundamento de ésta consiste en Ia ioni-
: - '. -: de interés y posterior separación de los
" :Jo. para medir la masa de dichos frag-
:: :lrrsigue identificar cada elemento a par-
. - :- -Lrnes mediante Ia determinación de las
, .- --::s¿ (m/z) (fig. 2-l5A). Teniendo en cuenta
- .r:-esto tiene masa, la espectrometría de
. , :- ,-nir-etsal.
r '-* ' J^ .^or Ia abundancia rela-
' : lurrlr4uu
__ ..::1\ c)Ld P
. -r¡iór"r de su relación demlz. La mayoría
: -.'.r .-nica carga positiva, por lo que la sepa-
:: :::--za de acuerdo con su masa. El ion sin
- --;,rla original se denomina ion molecu-
* ., ..:rlidad, tendrá mayor o menor fragmen-
\l - e - M* + 2e
l.i --F"-+Fru*+Frn*
Instrumentación
La instrumentación de un espectrómetro de masas consiste
básicamente en los siguientes componentes (fig. 2-158):
l. Sistema de introducción de muestra, que puede ser directo
o acoplado a un sistema de separación previo de cromato-
grafía de gases, HPLC o electroforesis capilar. Indepen-
dientemente de los métodos de separación previos, 1a mues-
tra ha de entrar en ei sistema en estado saseoso.
2. Sistema de vacío. Es necesario que los iones no colisionen
con ninguna otra molécula durante sr.r interacción con los
campos eléctricos o magnéticos. Para ello, se utilizan vacíos
de 10 3 a 10 e torr, dependiendo del tipo de analizador de
masas, que se consiguen mediante un vacío mecánico y
una bomba de vacío de alta eficiencia.
3. Sistema de ionización de la muestra. Para ello existen dis-
tintas técnicas que se emplean según las sustancias que
deben analizarse. Cuando las moléculas tienen un peso

Sistema de lonización
mn¡rin oiortrÁni¡n\

@
a --+ '*e
o--;- "G* lmán: el radio de curvatura depende
de la relacrón de m/z
vvriv
ffi
lones con una relacrón de
\ m/z a0ecua0a
C

.=--espectrómetrodemasas.Unhazdeelectronescausa aionzaciónyfragmentacónde asmce:-.; -:i,-

- -:-^co magnético, en que los iones mas pesados tienen una trayectoria más recta y os niás igeros s: Ce:'. ¿- --.
.
---:.:t.sedetectanlasabundanciasde osfragmentoscondferenterelacróndemasa/cargatm/zr.
 Capítufo 2-Metodología analítica l. Técnicas generales 27
En+ El ion más abundante en el espectro de masas se denomina
F2rn* pico base y se Ie asigna un valorlelativo del 10070. Al utilizar
6¡¡--f.- M+ -----------> En+
cn+
Fn+ '22 la abundancia relativa de cada fragmento iónico, se consigue
.J
minimizar Ia variabilidad propia del aparato y permite com-
Pico base
parar los espectros de masas obtenidos por distintos equipos.
Para un determinado sistema de ionización, la separación,
detección, y el tipo de fragmentación de la molécula en los
iones es siempre igual. La fragmentación de cada ion en esaces
concretos depende de su estructura química, por lo que es
posible determinar Ia estructura de cada analito en función de
su espectro de masas. Además, actualmente existen librerías
de espectros que ayudan en la identificación sin error de los
analitos.
La espectrometría de masas es una técnica rápida y los pro-
cedimientos basados en estas técnicas son muy específicos ya
que puede identificar sin error las moléculas y proporcionar
Eq-e-a oe un espectro de masas. El ion molecular (M*)
i un espectro característico de cada molécula de forma que
mln¡aÉa oico base es el fraqmento más abundante, al
ofrece información estructural. Así, puede informar de la exis-
s ':*: % L¿ abundancia de los otros iones se muestra
ülfrrm tencia de isótopos o modificaciones postraduccionales de la
proteína. Además, es una técnica cuantitativa muy sensible ya
que permite detectar concentraciones extremadamente peque-
etría de masas ñas.

de masas es una técnica compleja y espe-

hd*erminación tanto cualitativa como cuan-
El fundamento de ésta consiste en la ioni-
Ésh de interés y posterior separación de los
fumados para medir la masa de dichos frag-
re onsigue identificar cada elemento a par-
& bnes mediante la determinación de las
(mlz) (fig.2-15A). Teniendo en cuenta
sñryl¡€sto tiene masa, Ia espectrometría de
¡¡¡¡sas está formado por la abundancia rela-
u tnnción de su relación de ml z. La mayoría
ma ¡lnica carga positiva, por lo que la sepa-
r rc¿liza de acuerdo con su masa. El ion sin
mdn-ula original se denomina ion molecu-
a¡tfii<tad, tendrá mayor o menor fragmen-
!l+e--lNf'+2e-
lf * Fi* + F,n-+ F3n-...
lnstrumentación
La instrumentación de un espectrómetro de masas consiste
básicamente en los siguientes componentes (fig. 2-l5B):
!. Sistema de introducción de muestra, que puede ser directo
o acoplado a un sistema de separación previo de cromato-
grafía de gases, HPLC o electroforesis capilar. Indepen-
dientemente de los métodos de separación previos, la mues-
tra ha de entrar en el sistema en estado gaseoso.
2. Sistema de vacío. Es necesario que los iones no colisionen
con ninguna otra molécula durante su interacción con los
campos eIéctricos o magnéticos. Para ello, se utilizan vacíos
de 10-3 a 10 e torr, dependiendo del tipo de analizador de
masas, que se consiguen mediante un vacío mecánico y
una bomba de vacío de alta eficiencia.
3. Sistema de ionización de la muestra. Para ello existen dis-
tintas técnicas que se emplean según las sustancias que
deben analizarse. Cuando las moléculas tienen un Deso

Sistema de ionización
(¡mpacto electrónico)

_ Analizador (filtro de
| --r .}"
o'--;' -" ePc, * r,ra,ura
depen de
vvltl
nfi,,asbr¿
EAm6a *----$***
'\ 9r:::::r reraciÓn de

- Detector

mque,m¡a É J. espectrómetro de masas. Un haz de electrones causa Ia ionización yfragmentación de las moléculas. Los ionesfor-
@ .r" Grnpo magnético, en que los iones más pesados t¡enen una trayectoria más recta y los más ligeros se desvían mucho- 5i
!¡rqnetco, se detectan las abundancias de los fragmentos con diferente relación de masa/carga (m/z).
 28 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

noiecular inferior a 1.000 D y una polaridad media o baja,
se emplea normalmente el impacto electrónico, en el cual
un haz de electrones impacta sobre la muestra gaseosa y
produce la ionizacióny fragmentación del compuesto. Otra
técnica es la ionización química, que emplea energías
menores. Para moléculas más grandes, como proteínas, se
emplean otros métodos de ionización, como el bombardeo
por átomos rápidos (FAB, del inglés, fast atom bombard-
ment) o la desorción láser asistida por matriz (MALDI, del
inglés matrix-assisted laser desorption/ionization). El sis-
tema FAB sirve para moléculas de 100-5.000 kDa y el
sistema MALDI ioniza de forma no destructiva moléculas
de mayor peso molecular, hasta 300.000 D.
Analizador de masas, que separa los iones producidos en
función de su relación de mlz. Para ello existen varios tipos
de sistemas:
instrumento y finalmente colisiona con un detector fijo,
donde se destruye y es detectado por el aparato.
Detector. La mayoría de los espectrómetros de masas utili-
zan multiplicadores de eiectrones para la detección de iones.
Existen distintos tipos de multiplicadores, que se basan en
un proceso de avalancha o cascada que se repite por una
cadena de dínodos y que permite una ganancia de 10a-108
electrones.
6. Analizador de datos. En los actuales espectrómetros de
masas, Ia señal inicial producida por el áparato se digita-
lizay eI ordenador procesa esta señal. Sin embargo, la can-
tidad de información que aporta este tipo de análisis es tan
amplia que es necesario manejarla mediante los programas
de software proporcionados por el fabricante.

a) Sector magnétíco que empiea un campo magnético para

separar los iones.
b) Cuadrupolo eléctrico, que emplea cuatro polos parale-
ios de cuyo campo va cambiando por radiofrecuencia
de forma que selecciona determinados iones con una
relación adecuada de mlz.
¡) Tiempo de yuelo (TOF, del inglés time of flight), que se
emplea abundantemente en el caso de moléculas gran,
des, asociado con sistemas de ionización MALDI. En
este sistema, el ion viaia de forma acelerada a través del
ffi w{!'qxe"mms$ms ad i c i cna *ss
Burtis C, Ashwood E, Burns D (eds.). Tietz textbook ofclinical chemistry
and molecular diagnostics, 4.' edición. San Luis: Elsevier-Saunders, 2006.
González de Buitrago lM. Técnicas y métodos del laboratorio clínico, 2.. edición
Barcelona: Masson, 2004.
Harris DC (ed.). Análisis químico cuantitativo, 3," edición. Barcelona: Reverte,
2007.
Kaplan LA, Pesce Al. Clinical Chemistry: Theory, Analysis Correlation,
5." edición. San Luis: Mosby-Elsevier, 2010.
Skoog DR, Holler Fj, Crouch SR (eds.). Principios de análisis instrumental,
6." edición. México: Cengage Learning, 2008.

lfrlr
i:::ii

riii;iiii,i
i'liir,iiiii

l irii:i ii

i: i" :i
 Gaprtulo
3

lr letodolmsfa &x?&&{cica XX,

Te c n ic as inxee&xxa& m ax{xaricms
,-1e biología molecular
.qJ :E DEL
*::' ,:¡s de Análisis de longitud de fragmentos de restricción del ADN 35
Técnicas de hibridación 36
Reacción en cadena de la polimerasa 37
Algunas modificaciones del método de PCR 39
Secuenciación 41
Análisis de proteínas mediante transferencia
de tipo Ulfestern 41
Microchips 42
Referencias adicionales 43

con e1 antígeno se debe a distintas fuerzas de interacción (elec-

: 3, ETlVOS DE ApnEf\lplUA"'€
'- -- ,. e-tre inmunoanálisis competitivo y no
- - -. -:¿nálisis homogéneo y heterogeneo.
,.
: - r= ^'nunoanálrsis competitivo.
: . , - := -r anál sis de tipo sándwich.
' -=. --ida ei uso de as enzirtas
.- = ..3ratorioclínico.
: : .-ida os princ pios de as tecnicas
'' j -: le a polinerasa (PCR).
: -=:-^rida las técnicas de hibridación:
: r: - r, ::;thern, de tipo Northern
''-
" 'r "::-'r da la secuenciación del ADN.
: -: ::3 Un mlCfOChip.
- : --imicas se basan en la detección de
--- en un espécimen biológico mediante
.: --3rpo (Ac) frente a aquél. El antígeno
' : :e sustancia, como esteroides o pro-
' -:Ju por un anticuerpo especifico. Se
- : --;lonales o monoclonales y su unión
trostáticas, de van der Waals-London, dipolo-dipolo e interac-
ciones hidrofóbicas). La suma de las intensidades de estas fuer-
zas determina la fuerza de atracción o afinidad del anticuerpo
por el antígeno. De esta forma se establece un equilibrio áel
siguiente tipo:
+Ag:Ac
Ag + Ac
Esta afinidad se determina por la constante de afinidad, K",
que según la ley de acción de masas, en e1 equilibrio corres-
ponde a la siguiente ecuación:
o'
[Ag:Ac]
' -[Ag] x [Ac]
Ko se expresa en l/mol y, cuanto mayor sea el valor de K",
mayor será la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Algunos
analitos circulan unidos a proteínas con una afinidad en torno
a 106 L/mol, pero la K" dá los anticuerpos empleados en los
inmunoanálisis es superior en varios órdenes de magnitud, en
torno a 1010 L/mol, lo que permite una adecuada unión.
Las técnicas inmunoquímicas presentan una especiiicidad
que depende, principalmente, de la propia especiiicidad v de
Ia afinidad que presenta cada anticuerpo por su antígeno. Este
tipo de técnicas se pueden utilizar tanto para inmunoanálrsls
cualitativos como cuantitativos.
:U Parte l- -:'cducción a la bioquímica clínlca y patolog a r-olec- ¿'
- :: ce inmunoanális¡s
. ." ,. -t,rn¿ilisis son métodos que se emplean para la
: : - - ' -rr .intigenos o anticuerpos en las muestras biológi-
. -.. '--.r.1nite cletectarlo. Son una de las técnicas más utilizadas
::r !- l.rbor¿ltorio clínico ya que se puede cuantificar una gran
'.'.rlieclad de moléculas, como:
I. Proteínas: inmunoglobulinas, hormonas peptídicas, etc.
2. Antígenos víricos: virus de la hepatitis B, del VIH, etc.
3. Hormonas esteroideas: cortisol, testosterona, etc.
4. Prostaglandinas.
5. Medicamenfos; antiepilépticos, antibióticos, etc.
6. Drogas de abuso y otras.
En 1os inmunoanálisis se emplea una molécula marcadora,
que se une al antígeno (Ag.) o al anticuerpo (Ac*) y se detecta
y cuantifica. Dependiendo del diseño, Ios inmunoanálisis pue-
den clasificarse:
1. Según se produzca una competición entre la molécula mar-
cada y no marcada por los lugares de unión en el ligando
se clasifican en análisis competitivos y no competitivos. En
los análisis competitlvos, cuanto menor es la concentración
del analito en la muestra, mayor es la señal, mientras que
en los no cornpetitivos 1a relaclón es directamente propor-
cional, esto es, a mayor concentración del analito en la
muestra, mayor es la seña1 producida.
2. Según sea necesaria una separación del complejo Ag-Ac
dei ligando libre tras la incubación se clasifican en análisis
homogéneos o heterogéneos. En los primeros no se sepa-
ran mientras que en 1os segundos se necesita un paso de
separación del complejo, que suele realizarse mediante
lar ados con tampon.
Los inmunoantílisis competitivos y no competitivos pueden
ser, a su r.ez, homogéneos o heterogéneos, 1os cuales suelen
tener menos interferencias y son más sensibles que los homo-
géneos. Estos últirnos utilizan las características de algunas
moléculas marcadoras de que sL1 comportamiento es distinto
cuando el antígeno está unido al anticuerpo que cuando está
libre. Los análisis hornogéneos son más rápidos que 1os hete-
rogéneos al evitarse e1 paso intermedio de separación antes de
1a detección.
Reactividad cruzada y
estabilidad del antígeno
Existen dos aspectos generales que hav que tener en cuenta
a la hora de realizar un inmunoanálisls. Uno es 1a especifici-
dad de 1os antlcuerpos v otro, la estabilidad del antígeno en ei
e specrmen:
I Los onficuerpos se desarrollal-r buscando la mavor especi-
iicidad frente ¿r los determinantes antigér.ricos de las mo1é-
;rilas que se quieren detectar. Sin embargo, puede ocurrir
-r.re !'stas estructlrras antigénicas sean compílrtidas o sean
... sit.nilares en otras moléculas. Si éstas se encuentran
:i.:ltcs en 1as muestras, pueden reaccionar con el anti-
, -' .1e tbrma análoga ,v producir reacciones cruzadas
1¡, :::*,.:- : --,:- l-: --;.-er'¿fdOS. ESIO
COnSeCUentdfilil--;.
ocurre con cierta ir.. u¡--,, . ¡, : : rr -- .- .:t¿iisis de hor-
monas esteroideas. o d. :¿:::--:, : a,-.. ::-;-..¡n metaboli-
tos con estructu¡as pare.icas : -., ::'- -.:,--: -:ri¡ia1: también
puede existir analogra c, ,n l.r:::.: - J- ..: -c e sten adminis-
trando. Por el1o, en 1os equi¡-trs J.. ,:-.:::.-:r..¿nálisis suelen
incluir información de 1as posibies :¿.-:,rr:r-s ¡ruzadas del
anticuerpo. Es importanLc tclr.rl: r:
-..(ntr ¡ura evitar
falsas interpretaciones.
2. Los antígenos se determlnan habrtu¿lnrente en líquidos
biológicos, que son unos medios conrplq'i¡:. En particu-
lar, la degradación del antígeno en el especin.ien puede
causar una falta de reconocimiento de e ste por el anti-
cuerpo. La modificación del antíger.ro depende de la natu-
raleza de éste y del tipo de espécimen. ,\lqunos son muy
estables y no precisan condiclones e:1.ecter1es de conser-
vación mientras que otros, sobre todo 1.1< horn.ronas pep-
tídicas que están en concentración n'iur baia, necesitan
mantenerse en frío 1'añadir jnhLbidores de proteasas para
evitar 1a acción de 1as enzin-ias del medio. Muchos anali-
tos en ia orina, como 1as proternas, sufren una degrada-
ción por la acción bacterianr r por el pH acido. que afecta
su reconocimiento por anticuerpos. Para evitar la degra-
dación del antígeno, es necesario mantenerlo a una tem-
peratura de conservación adecuada 1'para períodos largos
generalmente es preferible 1a congelación. Hay que tener
en cuenta que también se puede producir una alteración
del antígeno por la repetida cor-rgelación y descongela-
ción del espécimen, por lo que ésta debe evitarse.
Moléculas de detección
Los lnmunoanálisis requieren el empleo de moléculas mar-
cadoras para detectar la unión entre antígeno y anticuerpo. El
inarcador ernpleado se ha de conjugar con facilidad con e1 antí-
geno o anticuerpo y no ha de interferir con la reacción. Existe
gran variedad de marcadores que se acoplan a la molécula que
se emplea para detectar el analito. El tipo de marcaje condi-
ciona el método de detección. Existen métodos radioisotópi-
cos, ios basados en la detección de luz (espectrofotométrico,
fluorescente o luminiscente), de electroquimiolurniniscencia
o los que usan microparttcLLlas.
M a rcaje rad ioi sotó P i co
Durante muchos años se han empleado en 1os análisis hete-
rogéneos isótopos radiactivos como marcadores, sobre todo
el r25I, va que las moléculas se pueden marcar fácilmente sin
alterar sus características de unión a1 ligando. Ai desinte-
grarse este isótopo, emite una radiación 1 que puede ser detec-
tada con un equipo detector de estas emisiones. Las técnicas
radioisotópicas que lo utilizan son el radioinmunoanálisis
(RIA, dei inglés radio-immunoassay), en el cual el antígeno
está marcado isotópicamente, y e1 aná1isis radioinmunomé-
trico (IRMA, del inglés immunoradiometric assay), en el cual
e1anticuerpo está marcado. Aunque 1os métodos radioisotó-
picos son muy sensibles, st1 ltso cadavez es menor. Esto es
debido, fundamentalmente, a 1os problemas de seguridad y
de necesidad de instalaciones especiales para el empleo de
isótopos radioactivos y a la corta estabilidad de estos reacti-
125I, que es de sólo 60 días.
vos, limitada por 1a semivida del
 Capítulo 3-Metodología analítica ll. Técnicas inmunoquímicas y de biología
',
r
-. ' :; te con f luorescencia
. .:::r¿ti\-ii a1 marcaje radioisotópico está el marcaje
. - .,. -luorescentes, que se unen directamente al anti-
, -: '--
,-3de conjugar fácilmente con los grupos amino
: '.::. ¿bsorbe a una longitud de onda de 400 nm y
' - :'. -\lquiros métodos emplean quelatos de tierras
:..:opio (Eu) o rubidio (Ru). Estos compuestos
' .: -: ---¿ridad de oue la emisión fluorescente dura
-: . : jc la iluoresieina, Io que permite separar los
, . : .-.:lrión 1'de emisión.
j"-; : :on enzimas
- := :r'rálisis de inmunoabsorción ligado a enzi-
, . .,. g1 e s e I 4i m e -linked immuno a d s orb ent a s s ay)
t
- : .,re tienen una elevada actividad específica,
- -:,.. :asa de conversión de sustrato en producto.
,,. '.'idad de una de las enzimas más emplea-
-,. , :e rábano picante, es de 220.000 moles de
:e enzima a 37 "C. Poniendo un sustrato
.. --:::¡drb1e, entonces se puede detectar la reac-
' :ntlcllerpo y amplificar la señal, Además
-:
, . .. :rir.rcipales enzimas empleadas son la fos-
,, ' --relactosidasa y la glucosa-6-P-deshidro-
' -.:r...s son fáciles de obtener y son estables
. : - ' err las condiciones de análisis. Con estas
.-j:::tttes
::stintos tipos de sustratos que producen
.- sensibilidades:
Una reacción muy usada es la de
--. 'r¡¡¡1,s.
:ue convierte las moléculas de p-nitro-
=:r p-nitrofenol, que absorbe fuertemente
:.¡siatasa alcalina
p-nitrofenol +
' ,,:¿ttcia. Si se emplean sustratos fluo-
:.---t!)n, se puede conseguir una elevada
.. .'.:- -c
Irueden disminuirlos tiempos de
, : :s rmportante en los sistemas automá-
. .c crrnlea amnliamenl.e es el com-
.
. - ,,¡rona-P, cuya hidrólisis por la fosfa-
---,,e 1a .1-metilumbeliferona, que
. ..:.'..a alcallna
+,tr-metilumbeliferona
.,:¡i a. Una reacción de quimiolumi-
--,rndo en la reacción química de un
._-. (e
. '-, r,lr¡¡p lr,"
-_ er¡nlea
-...r ._*n compues-
:':riinio o luminol y la reacción quí-
-,iando peroxidasa oxida el lumi-
1a
, =00-.150 nm, que se puede medir:
:-..a
----------- luminol oxidado + H,O + hu
molecular 31
Con el empleo de moléculas amplificadoras (como la lucife-
rina) se generan miles de veces más de fbtones y durante un largo
tiempo, y así aumenta la sensibilidad de Ia técnica. De hecho, este
método de detección es muy sensible, superior al método radio-
isotópico, y se emplea en métodos de inmunoanálisis altamente
sensibles con la peroxidasa unida a anticuerpos.
El instrumento de medida se llama luminómetro. Consta
de una célula de reacción aislada de la luz, un sistema de inyec-
ción y mezcla de muestra y reactivos, un detector de luz y un
procesador de señal.
La bioluminiscencia es una forma de quimiolumrniscencia
biológica en que la reacción de oxidación está catalizada por
la enzima luciferasa:
Luciferasa
Luciferina + O, + ATP.."------------------------------------ Oxiluciferina + hu
Como cada adenosina trifosfato (ATP) prodr.rce un fotón, la
cantidad de éstos es proporcional a1 ATP consumido.
E I ectroq u i m i o I u m i n i sce n ci a
E,n 1a electroquimioluminiscencia, 1a rnolécula marcada pro-
ducirá luz tras oxidarse en la superficie de un electrodo gracias
a una corriente eléctrica. Estas técnicas se han introducido
ampllamente dentro del laboratorio en los equipos de inmu-
noanálisis o de biología molecular y los quelatos de rutenio
son uno de los sustratos más utilizados. Tienen la gran i.'entaja
de que su límite de detecclón es extremadamente bajo, inferior
a 10 r5 moles, y un lntervalo de medida lineal de varios órde-
nes de magnitud. En este caso, la cubeta de reacción de los
luminómetros cuenta también con un electrodo Dara desen-
cadenar la reacción electroquímica.
Micropartículas
Las micropartículas se pueden unir covalentemente a
P
ligandos de forma que la reacción entre Ag y Ac forma"'arios
agre-
gados que se pueden detectar por técnicas turbidin-rétricas o
nefelométricas. La agregación máxir¡a se produce en la zona
de equivalencia, donde hay una proporción adecuada entre Ias
concentraciones de antígeno y las de anticuerpo (fig. 3 l).
Cuando existen concentraciones elevadas de antígeno, se pro-
duce el fenómeno de prozona o efecto <gancho>. Una concen-
tración excesiva de antígeno favorece 1a form¿ición de complejos
es solubles y un clescenso de la turbidez, 1o que produce valores
falsamente bajos de concentración. Por ello, 1os equipos auto-
máticos siguen cinéticamente e1 proceso para identificar las tres
fases y realizar la dilución de Ia muestra más adecuada.
+P
Cuantificación y sens¡b¡l¡dad analíticas
Para cuantificar el anaiito, se emplea una cllr\ra de calibraclo
con diversas concentraciones de patrones. Exister-r patrones
internacionales de rluchas moléculas proporciot.raclos p¡r¡ l¿
OMS o de sociedades científicas, como 1a Intelu¿Ltion.rl f e:.--
ration of Clinical Chemistry (IFCC). Esto t¿rcilita 1a e.t¿n.l¿-
rización de los métodos. De otros analitos no eristen fr¡ltrr-):rL's
internacionales, con lo que es n-rás diiicil conrparar resr¡lt¿rrii¡:
obtenidos con diferer.rtes métodos.
, r ¡r+mmtñt{
32 Parte l- ntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

c
o \ . _,
1L
o
= _'1
/ {L
.9 \ .* /.
o
L
! ,/\V
-{l->'</ V
"
'( L'
-lJ,
f,.
-t F'x/
rt/ "r\
Exceso de
anticuerpo Eq u iva len cia

Concentración de antígeno

Figura3-1. C-rv¿oepre(.oToco1 er'Lre¿n1rge^oy¿nLc-erpo,ydescersode arurbidezpo.elcesodearLgeno

La cuantificación de1 analito se refiere a la especie inmuno- adicionado por la unión a una cantidad limitada de anticuerpo
rreactiva. Ello significa que ia detección inmunológica no tiene (Ac). La afinidad de unión de ambos antígenos (marcado v no
que estar necesariamente asociada con una actividad biológica. marcado) por e1 anticuerpo ha de ser la misma:
Así, se pueden producir alteraciones en la proteína (a causa de
mutaciones, degradación, etc.) que provocan que la molécula no Ag + Ag* -¡,{6 AcAg + AcAg* + Ag*
tenga actir.'idad ¡ sin embargo, sea detectable inmunológica-
mente al no estar modificados los determinantes antisénicos. La adición de ambos- antígenos puede ser simultánea o
I-as técnicas de inmunoanálisis son métodos muy sJnsibles, secuencial (fig. 3-2A):
en que es posible detect¿rr sustancias del orden de pg/L o, incluso,
infériores. La sensibilidad depende de diversos factores, como I. Si el antigeno marcado y el antígeno no marcado (el de la
es 1a aiinidad del anticuerpo por e1 antígeno, el tipo de sistema muestra) se ariaden simultáneamente, competirán entre sí
de detecciór.r o las uniones inespecrticas (tab1a 3-,,. por la unión al anticuerpo durante la incubación. Por tanto,
1a cantidad de antigeno marcado unido al anticuerpo será
inr.e¡samente proporcional a la cantidad de antígeno exis-
Inmunoanálisis competitivo tente en la muestra del paciente.
2. En caso de que los reactivos se añadan de manera secuencial, Ia
una técnica en que e1 antigeno que se quiere detern.iina¡
Es muestra, que contiene el antígeno sin marcar, se mezcla inicial-
(Ag) compite con una cantidad fiia de ¿ntrgcn, nl¡ri.ado r-\g-) nente con un exceso de anticuerpo y necesita un tiempo de
'
incubación para que Ia unión entre antígeno y anticuerpo
alcance el equilibrio. Tras 1avar, se añade e1 antígeno marcado y
se deja incubar hasta que nuevamente se alcance el equilibrio.
Lri;i* 3-l. {ar*et€rísa¡eas cie alsunos
ln rxxcl*e¡'!*lisis Posteriormente, se procede a 1a separación y determinación
Límite de del antígeno marcado, 1o que será proporcional a la concentra-
Tipos Ampilttcacton ción inicial del antígeno sin marcar. En los análisis en que la adi-
oeteccron
(mol/L) oe ta senal
ción del antígeno es secuencial, se consigue que una mayor can-
Inmunonefelometría 10 ' r,l c tidad de antígeno no marcado se una al anticuerpo, lo que una
mejora el límite de detección de la técnica y la convierte en 1a
RIA tu'
técnica de elección cuando se desea determinar concentraciones
IRMA 10 - 'r C
de sustancia muy poco abundantes en las muestras biológicas.
ELISA 10- ' 5i A veces, no es posible marcar algunos analitos y, en este caso,
.; se puede preparar el inmunoanálisis, marcando el anticuerpo.
E lectroq u im iolu m in iscen cta 10 5
Inicialmente, el antígeno que va a competir con el de ia muestra
:- SA: Análsis de nmunoabsor-c:ór c¿::
:- z.. ne linked imntunaadsarbent ¿ssa: se encuentra inmovilizado en un soporte sólido. A éste se añade
.cles, tmmunoradiametlc ass¿r , i j
.

= el anticuerpo marcado junto con la muestra que contiene el ana-

: -a es, radio-immunoassal,.',
lito que se desea determinar. De esta forma, existe una compe-
 Capítulo 3-Metodología analítica ll. Técnicas inmunoquímicas y de biología molecular 33

1. Adición de la 2. Incubación y lavado 3. Detección del marcale

muestra y la ^-"-.^^-"--t^.
POrO )EPdrOr rU) y cuantificación
molécula marcada antígenos no unidos

+ +

YYYYY

1. Adición de la 2. Incubación y lavado 3. Detección del marcale

muestra y el para separar el y cuantificación
antrcuerpo marcado anticuerpo unido al
antígeno de la muestra

:o
--¡i
'
,'=
¡
c-.J*
+
j:ji
.'o¿^¿lisis competitivo en qL.re e5tá narcado el arr geno (arriba) o
- e antic-erpo labajo\

:ntigeno inmovilizado y el de la muestra por el

=.
Inmunoanálisis no competitivo
'..::ado que está en una cantidad limitante. Tras de tipo sándwich
, :.:a eliminar el anticuerpo no unido al antígeno
- ,; ;uantifica el anticuerpo que queda unidó. Se utiliza un anticuerpo de captura unido a un soporte
. .: j€ calibradores se construye una curva, en que
:: sólido (pocillos de placas, tubos de ensayo, etc.; fig. 3-3A). A
:.- l ^^- ^-^,1^ oura
-^-Í rrlV€fSdlllente
:
prOpOfCiOnal continuación, se añade la muestra del paciente que contiene eI
-: :---dr 5L11Lrdud "

-: irtrqeno en Ia muestra del paciente. La señal antígeno de interés, que se unirá al anticuerpo. La unión ines-
: ,:responde ai estándar cero. Los datos se pue- pecífica de los anticuerpos al pocillo se detecta mediante el
' '
- : :¡ ','arias maneras, como (tabla 3-2 y fig. 3-28): empleo de un blanco, que contiene todos los reactivos, pero no
la muestra que debe analizarse. Tras una serie de lavados para
- :: ::';rte a la concentración de antígeno. eliminar las moiéculas no unidas o las unidas inesoecífica-
, , - : -:ldo frente al logaritmo de la concentración mente, se añade el anticuerpo de detección que está cónjugado
con un marcador, como una enzima, por ejemplo. A1 añadir
-. B- tiente a la concentración de antígeno el sustrato correspondiente, la cantidad de éste transformado
- r. -n que en muchas ocasiones la curva de por Ia enzima será proporcional a la cantidad de antígeno pre-
- -: - rn\-ierte en lineal: sente en la muestra (fig. 3-38). Para que se cumpla esta pro-
porcionalidad, tanto el anticuerpo de captura como el de detec-
' : 3- = 1og [100 x (B/B.r,)/(1-B/B-á") ción deben estar en exceso respecto al antígeno que se desea

-acia 3-2. Ejemplo de un análisis competit¡vo

eeactivos iniciales Producto final Cálculo

; r9* Ac AcAg* Ag* Unido/libre %Unido Logit %Unido/

rlcial final AcAg*/ Ag*final '100 x AcAg*/ B.¿*
Ag* inicial
20 20,0 20,0 1,00 50,00

20 16,0 24,0 0,67 40,00

20 12 ? 26,7 0,50 ¿,5

20 10,0 30,0 0,33 25,00 2,0

6,7 33,3 0,20 16,67 11

20

20 5,7 34,3 0,17 1A )q

l: antígeno; B,é,: señal máxima

 34 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

ñ
c
óE
C') b
p
c
o =
.=
ol
)o

Concentración Log. concentración

Figura 3-2F. Inmunoanálisis competitivo. Se muestran gráficamente los resultados de la tabla 3-1 . Obsérvese la linealización de los datos

Incubación Adición
y rava0o oer.segundo 6 g
antrcuerpo _,
AnTlcueroo
L,- 0e
-----------; deteccion

''.,',.r'i.,::
.a :.: 4.i.i ..: :
\/\/\/\/\/
::l:
\\ ltIl
Anticuerpo de captura tncubacion
I
I V lavado
v
Detección
y cuantificación Adición
desustrato
s+ P( + p
,ol*; o
i:,{--¿it
o'o .o
-r!

*'*
.:

t -
1'\'¡l rs
:q
^r
ic

v\f \/\l\y \/\/\/\/\/

| ¡ | f.',f., II|| |

determinar. La incubación de la muestra con los anticuerpos

,liirttiluttl" ur;
rilrnll|ruñlllllllliiiltrtil;t
ri'Mr¡ltilriliíÍilrñifllllllllllr,
, ltir i¡¡r",,tffü*nll:.'
srr o de captura y de detección puede realizarse a la vez en el caso de
que éstos sean monoclonales y que reconozcan epítopos dis-
5Tz
& tintos del antígeno.
5T: realizan adiciones incubaciones simultáneas, puede
@ Si se a Ias
producirse el fenómeno de prozona o <efecto gancho>, cuando
5T¡
el antígeno satura tanto el anticuerpo de captura como el con-
Blanco jugado e impide que se forme el sándwich. Esto produce que se
determine una concentración aparente menor que la real.
Muestra
@ Los anticuerpos que se emplean en los inmunoanálisis están
desarrollados en otras especies, como ratón o cabra. En algu-
-_ nos especímenes de pacientes existen anticuerpos heterófilos,
:iitlil
como anticuerpos humanos antirratón (HAMA, del inglés
ü¡ .llflllll:llif't,n r i " :n :- human anti-mouse antibodies), que reaccionan con estos anti-
cuerpos usados en el análisis y producen resultados falsos v

nili

iffii
 Capítulo 3-Metodología analítica ll. Técnicas inmunoquímicas y de biología molecular
Ht[5-
o .ot': of
\/ \r rv 3&*;/d.
\
tl
tl
- o^cerrracion f¿ s¿'nente elevad¿
- : en un aná isls de t po sándwich por a existencia de anticuerpos heterófilos. HAMA, anticuerpos humanos antirratón
-,se antibodies).
- . ,. .::uación clínica del paciente. A veces, estos
'': -... : otras especies se producen por una expo-
. ": - -::ro el tratamiento con anticuerpos mono-
- , -. rero er.r 1a mayoría de las ocasiones la expo-
- '-
- . eristencia de anticuerpos heretófilos puede
. : . ie rnterferencias (fig. 3-3C):
- , . .rticuerpo de captura y al de detección y de
-- .. :simila a ia existencia del analito en 1a mues-
:-,.n resultados falsamente elevados.
:: -rl uno de los anticuerposybloquee la unión
c1
>: prodr.rcen resultados falsamente bajos.
- ..rrtrS años, ei diagnóstico mediante técnicas de
--
=- llar v proteómica ha traspasado
las barreras
: . :,--Lrn. Estas se han ido implantando progresiva-
- r: -:: técnicas habituales de laboratorio clínico. A
.:,r de forma decisiva la simplificación y auto-
"ido
:. los Drocesos v e1 abaratamiento de los costes.
., :c -¿s iécnicas de análisis de ácidos nucleicos se
: : :.¡165 de ProceSos:
, .--:ad de1 ADN de unirse a cadenas complementa-
:. :r'¡ridarse), incluso, en soluciones complejas.
- : de detenninadas enzimas, especialmente
'., -,'Las enzimas de restricción.
. . . especímenes más asequibles para obtener una ele-
,::d de ADN son las células sanguíneas. Para ello, el
:- j. sangre se obtiene con anticoagulante, como el ácido
(ACD) o ácido etilendiaminotetraacético
. : r:rr - dextrosa
::--i'or que 1a heparina. Los leucocitos se pueden separar
--.,:irrn mediante un gradiente de Ficoll o bien se puede
':,:,tnrente 1a sangre con un detergente de lisis. Otro tipo
.::-.¡n habitual es Ia biopsia de tejido. En este caso, para
,:¡rtjn de nucleasas, se congela en nitrógeno líquido la
. :r. \'ez que se ha obtenido. Las células se separan y se
::rediante métodos mecánicos, como un homogeneiza-
.r¿r¿rndo siempre sobre hielo.
j slamiento de los ácidos nucle¡cos
.:.,r oría de ios métodos de separación de ADN en la sus-
.. .: celular (acuosa) se bas¿rn e-n Ia extracción de éstos con
35
-'e o
j: s
o*.:i.y^
'*-¿
o'{
\l l,r/ \/:
',!
V
I I ttl
Concentración fa samente d sminuida
disolventes orgánicos, como es el fenol-cloroformo. Para eli-
minar las proteínas asociadas, se realiza una digestión con
enzimas proteolíticas, como la proteinasa K, que además inac-
tiva las nucleasas. El ADN se queda en la fase acuosa superior
y posteriormente se purifica mediante precipitación con eta-
nol.
El ARN es especialmente sensible a la acción de enzimas
ARN-asas, que son muy abundantes. Por ello, el material y las
soluciones que se empiean en su aislamiento se tratan con lnac-
tivadores de estas enzimas, como el dietilpirocarbonato. La
purificación del ARN es similar a la del ADN y consiste en
extraerlo de la suspensión de la muestra con fenol-ciorodormo-
acetato de sodio a pH 5 ante tiocianato de guanidinio, como
sal caotrópica. Al igual que en el caso anterior, el ARN se puri-
fica por precipitación etanólica. Asimismo, para eliminar cual-
quier resto de ADN, la muestra se trata con una ADN-asa.
Otro método más rápido de purificación de 1os ácidos nuclei-
cos se basa en la utilización de microesferas paramagnéticas, a
ias cuales se adsorben 1os ácidos nucleicos. Estas microesferas
se retienen con un imán y se elimina el resto de la suspensión,
Existen procedimientos comerciales que permiten obtener
ADN o ARN de forma rápida y eficaz mediante e1 uso de varia-
dos protocolos.
La concentración de ácidos nucleicos purificados se deter-
mina midiendo la absorbancia a 260 nm de modo que una
absorbancia de 1 corresponde a 50 mg/L de ADN o 40 mg/L
de ARN. La relación de absorbancias a2601280 nm sirve para
1as poli-
conocer la pureza de los ácidos nucleicos.
Los ácidós nucleicos obtenidos se han de conservar en con-
diciones especiales para evitar su degradación, lo que es espe-
cialmente importante para el ARN. De esta forma, el ADN se
ouede conservar de forma adecuada en trisamlnometano-EDTA
(trlr-nOte; a 4 'C, pero el ARN se ha de mantener a -70'C.
Otra alternativa de conservación tanto para el ADN como para
oC.
el ARN es en forma de precipitado etanólico a -20
Análisis de longitud de fragmentos
de restricción del ADN
Las enzimas de restricción son unas endonucleasas que reco
nocen secuencias específicas generalmente cortas de 4-6 nucleó-
tidos en cada hebra del ADN, llamadas lugares de restlicción.
e hidrolizan 1os grupos fosfatos, cortando en es.1s posicrones,
o en lugares adyacentes, en presencia de IIg: . Las enzir-nas de
restricción reconocen secuencias de nucleótidos palindlornl
cas, esto es, 1a misma secuencia en 1a direcciór-r 5'>3' de ar.l.rbas
36 parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Corte con extremos coheslvos

,
5'oro- QfiATT6 ooo J' EcoRl !'ooo- 6 3' AATTC
-.o.
3,
-
3'o.r 6¡4AÑ ... 5' J'ooo- CTTAA 5' 3' G 5'
- - -...

Corte con extremos romos

EcoRV !'oro- 3' 3'

- "'
5',...-(JAlAlL 5 GAT 5' ATC
-...
J..o-ClpÉlA(]-... ) ]'ooo- CTA 5' 3'TAG 5'
-...
FiEura 3-4A. Ejemplos de corte del ADN med¡ante enzimas de restricción.

Marcador de pares

Extracción Digestión con Electroforesis

il--_----*gffi'"*"'"':' -qrÉp
@¿*.#
f ryFl
w

redt
il @-+ Y:* ADN
Mutac¡ón
&€s
ro\/^ nr
,'""""
Nlr rnf^ do ¡nrio.'
Y""\'"'"
Nuevos fragmentos

\
5'...:GCA{TC -ooo l' |\,4utación !'oro- [i$ll.( -..! 3'
3'....:CGTAAQ-ooo !'
---'------+ 3,...- CTTAAG -ooo !'
punto de corte
Figura 3-4B. Análisis de mutaciones mediante empleo de enzimas de restricción. La aparición de una mutación causa un nuevo
poi la enzima de restricción. Los fragmentos se pueden detectar mediante electroforesis en gel de agarosa apareciendo un perfil de bandas diferente
por la mutación.

hebras de ADN. Por ejemplo, la enzima de restricción EcoRI
reconoce la secuencia GAATTC y corta entre la G y la A en
ambas cadenas, creando fragmentos más pequeños (fig. 3-aA).
Esta escisión de EcoRI sería un ejemplo de corte escalonado o
cohesivo en que los extremos cortados se pueden volver apegat.
En cambio, otras enzimas de restricción, como la EcoRV pro-
ducen cortes romos, que no se pueden cohesionar.
Las enzimas de restricción permiten obtener patrones de
fragmentos de digestión enzimática de ADN de tamaños carac-
teríiticos, que se pueden separar mediante electroforesis en gel
de agarosa o de poliacrilamida. La forma más sencilla de visua-
lizaiel ADN tris la electroforesis es mediante tinción con bro-
muro de etidio o SYBR Green. Estos compuestos producen
fluorescencia cuando se excitan al intercalarse con la doble
cadena de ADN mientras que, si están libres en solución' pier-
den la energía por interacciones con el medio y no son fluo-
rescentes. OtrJforma de visualizar fragmentos específicos es
mediante técnicas de hibridación, como la transferencia de
tipo Southern. EI número de sitios reconocidos por una endo-
nucleasa de restricción y el tamaño de los fragmentos genera-
dos son característicos.
Existen varios cientos de enzimas bacterianas que recono-
cen secuencias específicas de ADN y que se emplean como una
herramienta fundamental de diagnóstico molecular. Una
mutación es un cambio en Ia secuencia ADN por inserciones,
deleciones o sustituciones de bases. Este método es muy útil
para detectar mutaciones que causan alteraciones en la secuen-
cia diana de las enzimas de restricción. En caso de que exista
una mutación, puede ocurrir que se produzcan nuevos puntos
de corte o que la enzima no escinda el ADN al perderse el lugar de
reconocimiento. El resultado final es que se formen fragmentos
de diferente tamaño generando en el gel un patrón de bandas
diferentes (fig. 3-aB). También es útil para analizar duplicacio-
nes si se crean nuevos puntos de corte. Del mismo modo, en las
deleciones desaparecen los lugares de reconocimiento de
las enzimas de restricción de forma que en los individuos homo-
cigóticos desaparecerán los fragmentos de corte de la enzima.
Técnicas de hibridación
Se emplean para detectar secuencias de ADN (transferencia
de tipo Southern, llamada así por el Dr. Southern, qu€ la des-
cribió) o de ARN (transferencia de tipo Northern) de forma
mucho más sencilla y eficaz que si se realiza en un gel. Ambos
tipos de transferencias son muy similares en los procedimien-
tós esenciales. En el caso de la transferencia de tipo Southern'
los pasos son los siguientes:
 Capítulo 3-Metodología analítica ll. Técnicas inmunoquímicas y de biología molecular
ADN de ¿ rnuestra
-
u!' u! s9e vJU
H bridación
+
-/'a
-_____¡
\. |l\\
Sonda de ADN marcada
: '1. Técn ca de transferencia de tipo Southern
:.-. ::imer iugar, se separaADN mediante una electro-
el
' . .:is poliacrilamida si los fragmen-
en gel de agarosa o de
, :e,\DN son pequeños (fig. 3-5). La distancia de migra-
- :l depende del tamaño de los fragmentos de modo que
. -::ás pequeños migran más rápidamente. El tamaño de
--i: fraemento se determina utilizando un marcador
-. D\ .- con fragmentos de tamaño de pares de bases cono-
,.::,!.
. ..eriormente, el ADN se desnaturaliza con una solución
,.-.-ina de forma que se separan las dobles cadenas de
. l\.
-,:io se transfiere a un soporte sólido (membrana de
- . :..elulosa o de nailon) mediante capilaridad, vacío o
- .::-on. El ADN se inmoviliza posteriormente por trata-
'...:rto con calor o con iuz UV de modo que cada frag-
:-..:r:o de ácldo nucleico transferido mantiene en Ia mem-
. :r:rr sLl posición correspondiente en el gel.
-, ::rembrana con ias cadenas de ácidos nucleicos se incuba
'
- r ,ina sonda de ADN marcada que es complementaria a
, ..¡uencia que se desea detectar y se deja un tiempo sufi-
- :,--ie párd que se produzca la formación de la doble cadena
..,¡rrdación. El marcaje de la sonda se realiza radiactiva-
i'.::re con 32P o, más frecuentemente, con un fluorocromo
-:,1 biotina. En este caso se emplea un segundo paso en
- *c se incuba con avidina unida a una enzima, que pro-
-,-,e la señal de quimioluminiscencia al actuar sobre un
--i:rato.
- ::. 1a incubación y los lavados para eliminar el exceso de
- :r ja o uniones inespecíficas, la sonda hibridada se visua-
,. :'nediante la exposición a una película sensible.
, ,,s técnlcas se emplean normalmente cuando Ia reacción
-. je ra de 1a polimerasa no es adecuada, como el análisis
,- :ragmento muy grande de ADN en un translocación
:'. ,somica o porque tiene un elevado contenido de bases
37
lect rof oi'esrs
iltl
E
I Gc dc ¡narn<¡
Desnatural zación t--
ill
il|l I
r@
Tra n ste re n cia
il| l
N¡^-^"-^- ¡^
nitrocelu osa
ilt l
- il||rl
||| l Detección
TCI LU]d
ill I !
|||tl
Deteccrón del ADN
Reacción en cadena de la pol¡merasa
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés,
polymerase chain reaction) es una técnica que permite ampli-
ficar un segmento de ADN que debe estar flanqueaclo por dos
regiones de secuencia conocida ya que éstas se usan como mol-
des de iniciación para realizar las copias. Permite obtener
copias de forma rápida y en grandes cantidades, más de un
millón de veces, de una secuencia específica de ADN. La ADN-
polimerasa que se emplea para amplificar el ADN ha de ser
termoestable y la más usada es la polimerasa Taq (de la bacte-
ria Thermus aquaticus), que tiene una activldad óptima a
72'C y resiste temperaturas de 95 'C sin desnaturaiizarse.
Se utilizan dos oligonucleótidos cebadores (primers), gene-
ralmente sintéticos, de unos 20-30 nucleótidos, que son com-
plementarios a las dos regiones que flanquean el segmento
que se desea amplificar, el cual suele ser de unas 100-600
pares de bases. Uno de los cebadores es complementario a un
extremo 5' del segmento y el otro es complementario al
extremo 5' de la cadena opuesta. De este modo, la secuencia
de los oligonucleótidos usados como cebadores y ia distancia
entre e1los en el ADN que se va a amplificar, dan la especifi-
cidad del producto y el tamaño de la secuencia que se ampli-
fica.
Inicialmente se añade al ADN que se desea amplificar, los
cebadores, una ADN-polimerasa, un tampón con iones Mg2t
y los cuatro tipos de desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dTTP,
dGTP y dCTP) en exceso. La amplificación se 1leva a cabo en
un equipo llamado termociclador en que se repiten unos ciclos
de amplificación del ADN. Los productos formados en cada
ciclo sirven de molde para el siguiente ciclo, de forma que La
cantidad de ADN sintetizado crece de forma expottencial. El
proceso consta de los siguientes pasos (fig. 3-6A):
1. Una etapa inicial de unos 5 min a unos 94 oC antes de
comenzar 1os ciclos para inactivar proteasas r. nucleasas
38 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Fragmento que va
3',
a amplrficarse 5,
i:r r .,::::r1.r... r.,,.,t ..l::,ti::i::i.il
5', ;, ADN
vI
-,
t
3'
Desnatu ralización
5' ,,.., .. ...,..'.,,,..*. 3,

v
Cebadores
Hibridación
]:]]..::::,,]:,'ll¡ws

I ADN-polimerasa 25-40 ciclos

tr,_
'-..,]%s' Elongación I

100 ADN amplificado

y75 -

50
0
Min

Frgura 3-6A. Reaccior de a c¿oen¿ de polimerasa en que el ADN se somete a ciclos de desnaturalización, hibridación y elongación con la enz
l¿ -=
ADN-pol merasa. Se ndican los cambios de temperatura durante el proceso de los ciclos.

de la muestra y para desnatvralízar completamente el ADN
que se va a amplificar.
2. Después, 25-40 ciclos, cada uno de los cuales consta de los
cioricntpc nrc^c.
"'b*'",''"" r*"""'
a) Fase de hibridación (annealing), para lo cual se dismi-
nuye la temperatura a 50-65 'C durante l-2 mrnpata
permitir que 1os cebadores se hibriden con sus respec-
tivas secuencias complementarias en el ADN que se
desea amplificar.
b) Fase de elongación, en la cual se eleva ia
unos 72 'C, dependiendo de 1a
peratura es adecuada para que esta enzima sintetice una
secuencia complementaria usando el ADN como molde
a partir del cebador y de los desoxinucleótldos trifos-
fato en dirección 3'. Esta fase se mantiene durante un
tiempo suficiente para que se realice 1a copia completa
(1-3 min).
Fase de desnaturalización mediante calentamiento a
unos 94'C durante 1 min, en la cual se separan las dos
hebras del ADN para producir hebras sencillas.
3. Al terminar los ciclos, hay una etapa final, en la cual se
prolonga la última elongación unos 10 min para asegurar
que todos los fragmentos se han amplificado.
El número de amplificaciones del ADN de partida será de
2n'de ciclos con una eficacia óptima; por ejemplo, tras 20 ciclos
se forman 220 copias, esto es, el ADN se amplifica más de un
millón de veces. El producto de las amplificaciones (P) que se
--:iene también depende de la cantidad de copias de ADN ini-
.a
P=CX2n'deciclos
La detección de los productos de PCR se puede realizar
mediante técnicas como la electroforesis en gel de agarosa, Ya
que la cantidad que se produce suele ser suficiente para visua-
lizarse con tinción con bromuro de etidio o SYBR Green.
Esta técnica de biología molecular es la más utilizada en los
laboratorios clínicos ya que permite detectar de forma rápida
pequeñas cantidades de ADN y es muy específica de la secuen-
cia. Además, es sencilla y automatizable y existen tanto equipos
como sistemas comerciales pararealizarla. Se utiliza en la detec-
ción de diversos agentes infecciosos que son difícilmente culti-
temperatura a vables (VIH, etc.). También tiene aplicaciones en la detección
polimerasa. Esta tem- de mutaciones puntuales, deleciones o inserciones (analizando
la longitud del producto de la PCR), o incluso translocaciones.
Debido a su elevada sensibilidad, es necesaria una gran meticu-
Iosidad en el procedimiento y en Ia limpieza para evitar conta-
minaciones que alteren el resultado.
Un ejemplo de la aplicación de la PCR en la farmacogenó-
mica se puede observar en la figura 3-68. El medicamento
antineoplásico 5-fluorouracilo actúa inhiblendo la enzima
timidilato-sintasa e impide ei crecimiento tumoral. La presen-
cia de tres repeticiones en tándem de 28 pares de bases en la
región promotora del gen de esta enzima causa un aumento
de su expresión. Así pues, Ios individuos homocigóticos para
el polimorfismo de tres repeticiones tienen una respuesta
menor al fármaco ya que presentan mayor expresión de esta
enzima que los que tienen dos repeticiones. La detección de
Ias repeticiones en tándem se realiza mediante el siguiente pro-
cedimiento: Se extrae sangre con EDTA y se separan las célu-
las mononucleares con un gradiente de Ficoll. Posteriormente
se extrae del ADN, que se amplifica mediante PCR y los pro-
ductos amplificados se separan en un gel de agarosa. Se iden-
tifica a los individuos quimiorresistentes por Ia migración más
Ienta del fragmento amplificado de 3 repeticiones respecto al
fragmento de 2 repeticiones.
 Capítulo 3-Metodología analítica ll. Técnicas inmunoquímicas y de biología molecular 39

Repeticiones en
tándem de 2B pb
C M=50pb
Extracción t 1. PCR
del ADN s'@¡' 2. Electroforesis
+
S'W:'
Células Gen de TYMS
del paciente
-

'-'-l."pl c¿ció^dereaccionenc¿denadelapoi'ne.¿salPCR): anaLisisdelasreperc¡onese^L¿nderlenel pronorordel ger-q,e

):dro-sintas¿ l-YN/S\. -a cua'-a calle co'responde al .rarcador de l¿maio de o¿'e> de b¿ses ob\. A. ro¡oc goLo pa'" 3 'eoe-
^ n¡r¡ 7 ronor rinno< f?R/?R\ R nator¡¡ nnln t)R/lR\
^..ñr^

,,! ¡ *-:s
modificac¡ones del método de
,; '; : s Cel polimorfismo conformacional
::,i -::: -ta SenCillá de ADN
-: :rrlimorfismo conformacional de cadena sen-
:SSCP, del inglés single-strand conformation
.. :r.ia técnica que permite analizarla existencia
- :. -. :i basa en 1as diferentes estructuras secunda-
:'-: .: a1 desnaturalizar el ADN. Tras la realización
- -.:nento de interés, se procede a una desnatu-
- --:.o¡, A continuación se deja renaturalizar e1
' ' : :,-e se establezcan uniones intracatenarias. La
. - :-:¡rsionaldeestacadenadependedelasecuen-
: :. ¡'or 1o que, si varía algún nucleótido, las cade-
. : : .: -rrturas diferentes. AI realizar una electrofo-
... je poliacrilamida no desnaturalizante, la
: ' ..:..:rión de 1as cadenas depende también de su
' :. . :r: itaciones, aunque sólo sea de un nucleótido,
--.::an estructuras diferentes ¡ al realizar la elec-
. .':,.::rn nue\¡as bandas de migración.
rr -! -- - t'anscríptasa inversa
. - r-:nscriptasa inversa (RT-PCR, dei inglés,
.- -i. es un método que se emplea para la detec-
.-::: utilidad paraanalizar la expresión génica,
' '- ..:::iizar el ARNm de las células. Para ello se
.:r :nte un ADN complementario (ADNc) dei
: -: enzima transcriptasa inversa. Este ADN
, . .. arnplifica posteriormente mediante la téc-
. . -.--'-:ando los cebadores relativos a la secuencia
.'::.:ende analizar.
'
- -r -r+¡r,-
- .dLlvd
-:
. .::-r'a o PCR en tiempo real emplea el mismo
la PCR tradicional. Dero se va monitori-
' . -.
- genasa.
'... de la amplificación mediante técnicas de
. a::as COflO:
-
-
i.triforno, como SYBR Green (que se excita
- cación dei ADN existente en e1 espécimen o de 1a expresion de
: r.,ii ii 522 nm), que
se une de forma inespe-
- ., :;rleradO.
, .: :ucleótidos con dobles marcajes basado en
-: -:r.nsterencia de energía fluorescente mediante
. .., T. del inglés, J'luo r e s c e nc e r e s o n
PCR transfer). En ella, un fluorocromo dador se excita por una
fuente de luz y transfiere su energía a otro fluorocromo acep-
tor que se encuentra situado muy próximo al primero. EI
fluorocromo aceptor emite 1uz que se detecta (fig. 3-7A).
3. Las sondas de hidrólisis (TaqMan) están marcadas con dos
fluorocromos en cada extremo, uno de ellos es eI reporter
y emite fluorescencia, que es absorbida por el otro (quen-
rher\. o:¡e lo ananfalla mientras 1a sonda está intacta.
Durante la amplificación, el fluorocromo quencher se
hidroliza por la actividad 5'-exonucleasa de la Taq-polime-
rasa y se separa de fbrma que ya se detecta la fluorescencia
emitida por eI reporter.
De esta forma se puede seguir cinéticamente la amplifica-
ción del ADN en un termociclador que dispone de un sistema
de excitación y detectores para medir la fluorescencia. En la
amplificación del ADN se produce inicialmente una parte
exponencial de incremento de la señal a partir de un umbral
y luego otras dos zonas, lineal y de meseta, al ir agotándose los
compuestos y producirse degradaciones (fig. 3-7A). El ciclo de
amplificación al cual se produce ei incremento exponencial
de la fluorescencia depende de la cantidad de ADN inicial. Se
determina por el núrmero de ciclos que producen fluorescencia
por encima del ruido de fondo, que se conoce como ciclo
umbral (Ct, del inglés, cycle threshold). Habitualmente, e1 valor
de Ct 1o proporciona el equipo mediante modelos matemáti-
cos. Un Ct superior a 40 indica que no ha habido amplifica-
ción. A partir del Ct se puede deteminar la cantidad de ADN
de forma absoluta o relativa:
1. Para obtener una cuantificación absoluta, e1 Ct obtenido
se compara con una curva de caiibración creada con dilu-
ciones de un estándar.
2. Se puede realizar una cuantificación relativa, comparán-
dola con la amplificación de un gen constitutívo (house-
keeping), como la de la 13-actina o 1a glucosa-6-P-deshidro-
Cadayez es más importante 1a aplicación de la técnica de
PCR en tiempo real en el laboratorio clínico para 1a cuar-rtiii
ARN tras realizar una retrotranscripción. Es una técnica sim-
ple, rápida, muy precisa y automatizable, por lo que en el rrer-
cado existen diversos equipos comercializados por distintos
proveedores (Applied Biosystems, BioRad, Roche Diagnostics
an c e e n e r gy o Eppendorf).
N Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

"\.-n., Det<:lr

Sondal -.3''\ )--

-Sonda2
PCR

'. Tra nsferenc

Cebado'
ADN:*'¿:*:l*:w***w - ADN

.a
-o
o
o
a
c¡
J
o

oL-40
Número de ciclos
Figura 3-7A. Detección de la ampl ficación del ADN en la PCR mediante FRET y gráfico de rncremento de fluorescencia. F'l : fluorocromo daoc-
F2: fluorocromo aceptor. FREI energia fluorescente mediante resonancia (del inglés, fluorescence resonance energy transfer).

Análísís de polimorfísmos En esta técnica se emplea una sonda totalmente comple-

mediante curvas de fusíón
Es una aplicación de la PCR que tiene interés para el estudio de
poiimorfismos o mutaciones y que se basa en el análisis de la diso-
iiación de los fragmentos amplificados en la PCR al ir incremen-
tando ia temperatura. La temperatura de fusión (Tm, del inglés,
melting temperature) corresponde a la temperatura a la cual la mitad
de las cadenas de ADN se encuentran unidas y depende del erado
de homología de las cadenas complementarias, entie otros fac"tores.
Cuando las dobles cadenas de ADN se separan por e1 incremento
de la temperatura se produce una disminución de la fluorescencia
del producto de la PCR. La curva de fluorescencia en función de ia
temperatura es transformada en sus derivadas negativas (-dF/dT)
forma gráficamente unos picos cuyo máximo es la Tm.
mentaria para un tipo de secuencia de ADN (p. ej., la corres-
pondiente al alelo silvestre o wild type). En el caso de que el
individuo presente el alelo silvestre, la unión con la sonda será
completa. Si el paciente presenta una variación en la secuen-
cia, entonces la hibridación no será completa y por tanto
menos estable. Posteriormente se eleva la temperatura para la
elongación de manera que la sonda comenzará a soltarse del
ADN que se estudia. Al analizar las curvas de fusión se obser-
vará que los homocigotos silvestres tendrán un pico a una Tm
más alta y los homocigotos con el aleio dit-erente tendrán un
pico a una Tm más baja. Los individuos heterocigóticos para
el genotipo presentarán los dos picos a tras correspondientes
(fis.3-78).

Homocigoto para Heterocigoto Fhlui¡ob ga

el gen silvestre elgennrHlts
fr..r.,. i:'..,i:::,¡:, ::,:¡.,.: ¡ :..i.:.,.,,,... c
I

lHibridación
I
l¡ib,idu. .-
V +

rT-
-T- -
T
-l ,ñ -1- r- -l,f-
PCRyar: s: tr: é:-n*'9 @ rlsirff]Ír

d¡* ¡r rlii,j1¡ -€r'*oe!'atura

1,, -il i $ i I rfl c€-oi¡po particular Los fragmentos que no
 Capítulo 3-Metodología analítica ll. Técnicas inmunoquímicas y de biología molecular 41

. j::i"].:.¡:-r.. <a^móñ
rcail s' i^
lu ¡,
quq.a r]aha
uruc )s\urrr\ o rc
1. Elongación
+ ddGTP-F ADN-polimerasa ---------------+
+ ddCTP-F Añl\l nro dohe <orr ronriar<o

+ ddTTP-F Cebador
2. Desnaturalización para
separar las hebras y
electroforesis

--TTGCCATCGAT-F

tt +i'l f,fi qrhñrÉ. ?nc-rnF

--TTGCCATCGA
)ffr Nexl. Find ..TTGCCATCG-F
13U 1{t
Td:Gi:-T:.tGGGGir --TTGCCATC.F

3. Análisis --TTGCCAT-F
{- --TTGCCA
.-TTGCC-F
iáser
--TTGC-F +-
--TTG-F

--T T.F

-T. F

=-: ¿ción de ADN. La cadena de ADN se va formando hasta que se inserta un didesoxinucleótido, que esta nnarcado con fluores-
,- ', . cddenas oe oitererLe longitud, qLe se p-eden ¿nalita'oo'elecLrofo'esis.

*:":-e-craclon den unir a un nuevo nucleótido. Cada uno de éstos está

,. .-.¿lmente la secuenciación sólo se aplicaba en
--..nfbrme se ha ido secuenciando el genoma
: '. .do descubriendo la función de cada gen, Ia
.- , ::¡ictica clínica ha aumentado considerable-
' , -.,:1o, hoy día se utiliza en la tipificación del
. - - - :e¡io humano (HLA, del inglés, human leu-
,. ., diagnóstico de enfermedades causadas por
-:,. *eles, en 1a hipoxantina-fosforribosil-trans-
:'.=. en el supresor tumoral p53, etc. En este
' ::sos ejemplos de secuenciación del ADN
: apli-
. -: :--.,i1 demutaciones.
: -::. 3l material de partida es un ADN que se ha
" . : r: -rnente mediante PCRy que posteriormente
. , :,
-, deben eliminarse las sondas empleadas en
= tos se excitan al ir pasando por un Iáser y emiten su fluores-
..
: - : : icue flclación del ADN más utilizado se basa
, : .::nático de Sanger, que está automatizado y
: -.:l:es componentes (fig. 3-8):
marcado con fluorescencia distinta de modo que se puede
identificar el nucleótido final.
Inicialmente se reaiiza 1o cue se denomina secuenciación
cíclica, que reaiiza ciclos sucesivos de desnaturalización, hibri-
dación y extensión en un termociclador, que ofrece como resul-
tado una amplificación lineal de los productos de extensión.
Al ir produciéndose las cadenas, se irán incorporando los
didesoxinucleótidos trifosfato de modo aleatorio y se produ-
libro
cirán fragmentos de distinta longitud. Estos fragmentos, que
se diferencian sóIo en una base, se pueden separar por electro-
foresis en geles de poliacrilamida desnaturalizante o elec-
troforesis capiiar, migrando más rápidamente cuanto más
pequeños sean. Los fluorocromos terminales de Ios fragmen-
cencia característica, que es captada por un detector y se tras-
Iada a un sistema informático. Como cada fluorocromo se
asocia con cada una de las bases, se va identificando la secuen-
cia del ADN.

. . , ': :¡,r el ADN desnaturalizado de hebra sencilla.

- - r':to, que es complementario de unas 50 bases
, -
- ::ienzo de la secuenciación.
: --merasa termoestable, como la Taq.
l:sLr\inucleótidos trifosfato para que se pro-
, : .-..:;ión: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Este método es análogo al de tipo Southern, pero se utiLiza
- -:;leótidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP para proteínas y se le denomina de tipo Western. Esta técnica
: -; carecen del grupo 3'-hidroxilo e impiden tiene una elevada sensibilidad de detección de proteínas, supe-
,. i:.acción de elongación ya qlle no se pue- rior en más de 100 veces a 1os métodos de detección mediante
 42 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Patrón de pesos
motecutare5
.

,,f,3 ¡

.:.
W" 55:Í!?l?iili.,, ##-F1
rransrerencia F=Exposición tr-l
Exp'scón'[_-]
1
Proteínas

i:i::l:i,i. : .

:: :'rr:.: Gel de poliacriiamida Membrana Película

ii ll :''
tti . r.

::: , .

HI A-C
''-,-+
39 kDa

Figura 3-9. N,4étodo de hibridación mediante transferencia de tipo Western. Abajo se muestra un ejemplo de la detección de la proteína HLA-G:-
5 lisados celulares mediante transferencia de tipo Western e incubación con un anticuerpo específico. El peso molecular de la proteína se determ r¿
poniendo en una calle un patrón con diferentes pesos moleculares.

electroforesis y similar a la técnica de ELISA. Se emplea en el
laboratorio clínico para detectar la existencia de anticuerpos,
como los del VIH, o proteínas específicas.
En este método se realizan tres pasos sucesivos (fig. 3-9):
1. Las muestras se suspenden previamente en un tampón de
electroforesis con dodecilsulfato sódico para que Ia migra-
ción se produzca en función del peso molecular.
2. A continuación, se lleva a cabo la separación de las proteí-
nas de 1a solución mediante electroforesis desnaturalizante
en gel de poliacrilamida. En una de las calles se sitúa un
marcador de pesos molecula¡es.
3. Las proteínas separadas se transfieren a una membrana de
nitrocelulosa mediante un campo eléctrico perpendicular
al gel. Las proteínas transferidas se fijan irreversiblemente
a la membrana. Posteriormente se bloquean los lugares de
unión de proteínas de la membrana no ocupados para evi-
tar la unión no específica de anticuerpos. Las soluciones
de leche desnatada aI 5o/o o de albúmina bovina al 3% son
unos bloqueadores muy utilizados.
4. Tras bloquear la membrana, se incuba con anticuerpos
específicos de la proteína que se desea detectar. El exceso
de anticuerpo se lava y la unión se detecta mediante anti-
cuerpos secundarios marcados con isótopos radioactivos
o con enzimas. Tras la exposición de ia membrana a una
película sensible, se detecia la presencia de la proteína por
la aparición de una banda en un peso molecular determi-
nado.
, -:' ,¡' 11':, 11 ;'¡1,:;;
forma ordenada ligandos como oligonucleótidos, ADN com-
plementario o anticuerpos, que se utilizan para detectar gran
número de moléculas, especialmente ADN y proteínas (ta-
bla 3-3). Tras la hibridación entre el ligando y las moléculas
diana, esta unión se detecta por fluorescencia y se mide
mediante análisis de imagen (fig. 3-10).
Lamayoría de Ios microchips que se utilizan analizan muta-
ciones o polimorfismo de genes y también el ARN tras obtener
el correspondiente ADN complementario. Los ácidos nuclei-
cos de Ia muestra purificados se marcan con fluorescencia y
se hibridan con las sondas que están inmovilizadas en el
soporte en posiciones concretas. El peri1l de hibridación se
detecta mediante un escáner láser. Dei análisis de los datos
se pueden identificar las moléculas que están presentes o ausen-
tes. La tecnología de microchips analiza en una muestra nume-
rosos genes. Así, existen microchips de sondas de ADN que
pueden detectar y cuantificar hasta {L-1.000 genes diferentes
(A ffimetrix).
La gran ventaja de esta tecnoiogra e. la gran cantidad de
información que se puede otttene: ,ie ura muestra biológica.
Sin embargo, cuanto ma\-or es e- ::::e :t de datos que propor-
ciona el microchip, más com:ieic, r ,jiñcil es interpretar la
información, por lo cuai es Fre;::Lr c:::trner de potentes méto-
dos de análisis biointbrra::reaS- \rr obstante. existen ciertas
aplicaciones de la tecnr.L.:-¿ j.: como son los
=:;:ochips,
siguientes:
l. Estudio de gette: 'JLl- * .ri:.s¿e dit-erencialmente entre
varias condicior.e .. J..:::' a- :'€:sif,nas sanas y enfermas, o
pacientes somet:ic,s ¡ ::-- ¿ ::l tipo de tratamiento. EI
*:^..^^L:-
llllllULrrrfr
I - -: : -' :¡:.<rc.:s Blt-¡Door HCV está diseñado
uc- É!-g!: "

para el diaq::..s:::¡ -ti -¿ ::er.¿::ris C.

Los microchips consisten en una superficie sólida (como 2. Clasí_iicacjr": -: j. j-.;r- n ¿---;¿rntedades complejds, que
:lastico o cristal) sobre Ia cual se unen covalentemente y de identiiical ::e::¡ , r!-:t.i:,i-< :¿racterísticas de la enferme-
 Capítulo 3-Metodología analítica ll. Técnicas inmunoquímicas y de biología molecular 43

Tabia 3-3. tlasifieae!ón ds l*s rnier*ehips segun el material ln¡*leviliead*

Ligando Nombre Análisis
O ligon ucleótido Gene Chip M utaciones
Expresión de genes
Número de copias de genes
E pigenética
ADN complementario Chip de ADN complementario Expresión de genes
Número de copias de genes
:ra g mentos de cromosomas Chip genómico Número de copias de genes
Epigenética
)roteínas Protein Chip Interacciones de proteínas, con ADN, con pequeñas
moléculas
-e:rdos Tissue Chip lnmunohistoquímica
Expresión de genes
Apoptosis

\\---'---\- .\__.----.\ ¡\\_--.---'-.\

Extracc ón de ARN V\AA/
T,i6--"i^+---
I"^,,^"-- Marca.¡e con sonda f uorescente
| | o r>lt tPLd)d úvct )d
Q7..rl^;
--a? --? a-"? )
-.r-
ARN ADNc ADNc

ooooooo
a___-..----..- ooooooo
?..r"/" ooooooo
o-a ooooooo
-j-D ooooooo Hibridacjón y detección

ooooooo ---------------- # Anal sis de datos

ooooooo
ooooooo
ooooooo
ooooooo
ooooooo
Mrcroch p
l,1. Anál sis de expres ón de ARN medlante m crochips. El ARN se extrae y se obtrene un ADN comp ernentaro (ADNc) que se marca con
:: Posteriormente se hibrida en un nT crochip y se detectan os ADNc un dos med ante láser. La imaqen obten da se somete a un aná sis
' .cn 'r ¡. l¡ c'n-c< on de ARN en d mJe)Lrd.

, -. i: Lvmphochip es L1n microchip de ácidos nucleicos

': ' r^ '---.'
: .:uLr ^r^^:r::^^- molecularmente los linfom¿rs. El
Pdrd trdJrrru4r Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS (cds.). Inrlunología celuiar v r¡rolecular,
. ',-
-l:'ir':t¡. ll4
mutaciones en ei gen que codifica 6.'edición. \ladrid: H;rrcourt llrace, 2008.
: .---'L,fir.elr{nas de baja densidad (LDL, del Burns DE, Ashrxrod ER, Burtis (iA (eds.). Fundanrentals of \{olecular
, ::.. lipoprofeln) y ayuda al diagnóstico de Diagnostics. San Luis: Saunders, 2007.
Coleman \'\¡b, Tsongalis GI (eds.). N{olecular Diagnostics for the Clinicirl
: . ,ailli¿1 tamiliar. Laboratorr', 2.' ediclón. Totola: Hum¿na Press, .2006.
,.,. Sc'utiliza para 1a detección de mutacio- Diam¿rndis I'iP, Christopoulos TK (eds.). Irrrmuroassil\'. Sirn l)ic.{o: .\catlc'nic
. : rr!)5 asociados con el metabolismo de fár- Press, 1996.
Luclue Cabrera J, llerrácz Sánchez A. (eds.). lérto ilustraclo cle bioli¡gr¡, r¡c¡le¡uL¿r
-.; ar-ucla a la predicción de la respuesta a
--
e ingenicria genética. \'ladricl: Elsevier, 2(101.
. ,,-...--ii¡o. El Amplichip 450 detecta polimorfismos
\lircgregor P!', Squire JA. A¡rplication oimicro¡irr¡ir s to the anaLlsis of gcne
-,!' .os genes de los citocromos CYP2D6,v CYP2C19, impli erpression in cancer. Clin Chem 2002; 18: 1 1 . 0- 1 1;;.
-,rdos en el metabolismo de numerosos fármacos. \\ild D (ed.).'.fhe immuno¡rssav hanclbt¡t¡k,
-1. ecllcitln. I onclres: Eiso'ie r, :(i[)¡.
fr capítulo 4
I

\ Iet*dclogía ffi,x?&&{tácm XKK.

-{nálisis a-la cab€ctrr&
;lel pacicxa€e

'rliCE DEL eAPIT{,tL*

:: -:eoto de análisis a la cabecera Glucometría en sangre capilar 50
':.::ciente 45 Gases arteriales 51
Cooximetría y pulsioximetría 52
'::;ración en el laboratorio 46
Marcadorescardíacos 52
i: :;e: r-neneS 47
-r:-: ogía 47 Calidad de los análisis a la cabecera
,':::-e¡ría de reflectancia 48
del paciente 53
':: -:::grafía 48 Referenciasadicionales 53
: ¿ -p o de aplicaciones de los análisis
; : ::cecera del paciente 49

prenalítico y postanalítico. Los análisis a Ia cabecera del

ETTVOS pF Apmgn¡tsleA.¡€
- . ,: ¿"á rsis a la cabecera del paciente (POCT)
. - i r,,3 se realizan en el laboratorio central.
:. =^.ajas e inconvenientes de la realiz¿ción
,
:11-
-.- : papel del laboratorio central en la realización
-^aT
-.--.-1.
..- . retodología de espectrofotometría
. - -..'c a y 1a inmunocromatograf ía.
'- .' ..s pr ncipales aplicactones de los POCT.
..' ,. entajas de los POCT en la monitorización de la
.
: : iZc ar, en os gases arteriales y en 1os marcadores
, .- iermino de análisis a la cabecera del paciqnte
.:.es. point-of-care testing) para designar las prue-
- -, :ealizadas en Ia proximidad del paciente, en el
,: :3 iesarrolla el proceso asistencial. Los avances
:-: disponible han permitido este acercamiento
. , :¡i lt.iboratorio central a1 paciente, lo cual implica
, . ::r¿irima de1 tiempo de análisis y de los tienipos
paciente se pueden dividir en tres grupos según su utilidad
clínica:
1. Los que se realizan para minimizar el tiempo de respuesta,
es decir, aquellos que se realizan a pacientes en estado crí-
tico y en los cuales es necesatio un resultado para ejercer
una acción clínica inmediata ante un riesgo de morbilidad
o mortalidad. Un ejemplo es la determinación de gases en
sangre durante una cirugía cardíaca o los marcadores car-
díacos en el diagnóstico del infarto de miocardio. Los sis-
temas de análisis a la cabecera del paciente son cada -"ez
más habituales en plantas hospitalarias, unidades de cui-
dados intensivos, quirófanos y servicios de urgencias
debido a 1a importancia de ias determinaciones analíticas
en las decisiones c1ínicas con pacientes críticos.
2. Los que realizan para mejorar la calidad asistencial. Estos
análisis no son urgentes, pero, dado que 1a mayoría de las
decisiones clínicas se basan en 1os resultados analíticos, el
hecho de disponer de esta información de forma rápida
ayuda a 1a atención clínica. Un ejemplo son la determina'
ción del perfil lipídico o de la HbAlc (hemoglobina glr-rco-
silada en Ia sangre), en que la poslbilidad de disponer de
los resultados analíticos en el momento de 1a coi.lsulta
ayuda al control del paciente y a una mejor orientación
terapéutica.
3. Los que se realiza el paciente en su proplo domicilio para
un autocontrol responsable de la enfermedad. Un ejemplo
46 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Análisis a la cabecera Análisis en el

dal n¡riania laboratorio central

Solicitud del test Solicitud del test Fase preanalíüca

I
+
ldentificación del paciente
I
V
Obrención del Obtención del _ ldentificación <-
Transoorte al
especimen espécimen del espécimen laboratorio
I
!t
I

I
Preparación
- Receoción v
clasif icación
I ..i.
Cuantificación -
LUanIfr¡caclon
Validación del
Fase analítica
resuttaoo
' ::::. .: l

I
I
- Fase postanalítica
I

I
Decisión cfínica

' 1-'z 1-1 . Simplificación del proceso analítico en'los análisis a la'.ub"cera del paciente

es el autocontrol de la glucosa en sangre capilar en los fáciles de usar y los requisitos de mantenimiento son mí-
pacientes diabéticos. nimos.
3. Se evitan las visitas del paciente al laboratorio, quien, ade-
Todo el proceso preanalítico, analítico y postanalítico se más, recibe información inmediata de su estado.
realiza en la cercanía del paciente, de forma rápida y para dar
respuesta a una cuestión clínica (fig. -1). Por ello, no se con- Con todo, también presentan algunas limitaciones, unas
sideran de esta manera cuando se extrae el espécimen en un veces asociadas con la propia metodología y otras, con la
menor
centro periferico o Io hace el propio paciente en su domicilio preparación del personal que debe responsabilizarse de las
y se envía al laboratorio central, donde se procesa. Tampoco determinaciones, lo que en algunos casos causa una disminu-
se pueden incluir los realizados en oficinas de farmacia cuando ción de la precisión analítica y un aumento innecesario de las
están fuera del entorno clínico asistencial y únicamente están pruebas. Esto último tiene especial importancia porque, ade-
asociados con la atención farmacéutica. más de aumentar la complejidad de la interpretación de los
Estas determinaciones son económicamente más caras cue resultados, estas determinaciones tienen un coste muv suDe-
Ias que se realizan en el laboratorio central, aunque su utiliia- rior a las tradicionales del laboratorio. Otro probleÁa ei la
ción adecuada ayuda a reducir el coste asistencial total. Ade- dificultad para Ia integración de los resultadoi en la historia
más, tienen una serie de ventajas para el médico, el laboratorio clínica del paciente, para lo cual es necesario establecer proce-
y el paciente, como son: dimientos adecuados. Para ello es de gran ayuda la conictivi-
dad de los equipos que realizan los análisis a la cabecera del
1. Disminuyen el tiempo de respuesta ya que se reduce tanto paciente con el sistema intbrmático de los laboratorios centra,
la fase preanalítica, el tiempo de análisis y el especialista les.
clínico obtiene e1 resultado de modo inmediato. Uno de los problemas más comunes de los equipos de aná-
2. Evita los errores asociados con el manejo, transporte lisis que se realizan en ca-sa es el hecho de que no proporcionan
y almacenamiento de especímenes. Además, no requiere adecuada información de 1a-. especificaciones de sensibilidad,
personal especialmente cualificado ya que los equipos son especificidad e intert-eren.i¿-< del test. -{parte de ello, el proce-
dimiento de realizacion no $em¡'re es comprensible por el indi-
viduo que r-a a realiz¿: ¿ :-¡r:;Ls- Io que leva a errores.
Consultas
externas
¡tliügiic rCIn en el laboratori*x
Plantas t::i
Domicilio
Quirófanos ¡ COr l.: ¿=:,r¡r¡r-""r*L:lciÉ r mini¿f1¡¡i2aCión de IOS métOdOS
II an¿-hicc** :l-.¡¡ss$ .* csuro, g'eden desarrollarse fuera del labo-
I
I
ralo-c- ::r.gñfuü'im¡.:Bsl¡}$e ün un nue\¡o camDo de trabaio del
?
¿:¿-:s¿- qma Íe oe tel¡r ¡or ia selección de éstos y por lá cali-
5upervtSton
LaooratoÍo ., ;. ,
vailoacton oe resuttaoos .-*" je ss:Eaiüiln¡f,r¡m ñg 4-lr- Sin embargo, es necesario racio-
central Registro en la historia -*r.a¡- "ls mr:iiiilfullrrfi de Ou ¡n-lisis fuera del labOratorio Central
' -:-: ar':rol rernoto desde el laboratorio centrar:e :>:-: i: ¡" íms¡,mw l¡*up'r¡nut¡lg.Jrnicas superen a los inconvenientes
:::,:": l: :::e'le. F'r,5ilfi*r".mtr ,Ulw@[mü$€ls" Fn eSte aSpeCtO, eS impOrtante rea-
 Capítulo
-Metodología
,izar una comparación entre el tiempo de respuesta que se aho-
:raría sl se lo compara con el del laboratorio central. La reali-
¡¿ción de determinaciones analíticas tienen interés si éste no
:j capaz de proporcionar unos resultados con un tiempo de
:espuesta adecuado (inferior a 30 min en las determinaciones
--r rtic as).
Las magnitudes bioquímicas que se determinan a la cabe-
:e:a del paciente suelen estar duplicadas en el laboratorio cen-
::alL. por 1o que es importante asegurar que los resultados ana-
.::rcos sean similares, no sólo con los producidos por el
-::oratorio central, sino también con los producidos por otros
.:uipos periféricos. De esta forma, además de evitar confusio-
:-.s en la interpretación de los resultados, se asegura que, al
.:-t:grar los resuitados en la historia clínica, éstos sean homo-
..:reos Y comparables entre sí.
: - laboratorio central ejerce diversas acciones sobre los aná-
.-':.:ealizados fuera de sus instalaciones:
- Desde laboratorio central se realiza la elección de equi-
e1
rLrs v sumantenimiento, ejerciendo las pequeñas acciones
:orrectoras. También se evalúa la implantación de nuevas
:ruebas y se comparan con los resultados proporcionados
:o: el laboratorio central.
- :i personal técnico que realiza el análisis es ajeno al labo-
::torio y precisa una formación básica en el manejo de
::;estras y atahzadores, que es responsabilidad de los ser-
-.
:-:os de laboratorio.
: :- laboratorio central es el responsable de validar los resul-
:c;os )'registrar las calibraciones, el control de calidad y
.-'¡ resultados de pacientes. Para facilitar esta labor, los
- -'';-^' qus
:rJiPU) v4rr 4yd actualmente en el mercado
^^rreciendo
-:r.orporan tecnología que permite el control remoto desde
=- laboratorio
central. De esta manera, es posible la visua-
-,¡ación de resuitados y el control de calidad a tiempo real
:Lir los facultativos de los laboratorios, la validación de
:"¡-¡ltados e, incluso, la intervención remota sobre los equi-
l: -o anterior se deduce que Ia buena ejecución del análisis
, : -srecera del paciente depende de la colaboración multi-
: .:-:-inaria en que, además dei laboratorio, participan per-
.;--:- Ce enfermería, especialistas clínicos e, incluso, la admi-
r .::¡ción del hospital.
: ila,,l ,,4¡
-:- como ocurre con el laboratorio central, los especí-
r-
i:::.s más utilizados son los de sangre. También se usan,
r.-, r:e menos, muchos otros tipos de especímenes, como Ia
:'.:-.- la saliva (p. ej., para determinar Ia ingesta de drogas
:,: :::so), el aliento (p. ej., para determinar la ingesta de eta-
r :. - heces (p. ej., para determinar la existencia de san-
'as
* -:.ndo el espécimen es sangre, habitualmente se trabaja
- -, ::ltidades de muestra de unos pocos microlitros, lo que
r., .:r:ortante porque este tipo de aná1isis se suelen repetir en
Ir:":-,-:los cortos de tiempo. De esa forma, se evita extraer
: :,-:.:--,'os r-olúmenes de sangre con e1 consiguiente riesgo para
:,: :,!:-:nte. Aparte de ello, 1a recolección del espécimen ha de
uru r -i-rS ráoida posible y, por ello, la mayoría de los sistemas
illlllrflr -,i,u ü.--.ir; ¿stán basados en plasma o sangre total para
analítica lll. Análisis a la cabecera del paciente
conseguir el menor tiempo de respuesta posible. Por ejemplo,
la posibilidad de emplear sangre completa anticoagulada dis-
minuye el tiempo de respuesta respecto al uso de suero en unos
30 min ya que se evita el tiempo de espera para que se realice
la coagulación y el centrifugado.
Otro tipo de espécimen rápido de obtener es Ia de orina de
una micción, con el cual se obtienen resultados cualitativos o
semicuantitativos. Es preferible que la micción sea reciente y
hay que evitar la existencia de turbidez o de sedimento que
puede afectar a la absorción en las tiras, reactivar y producir
falsos negativos. En estos casos hay que realizar una centrifu-
gación previa. El voiumen de orina que se utiliza varía nota-
blemente entre los diferentes tests, desde unos pocos microli-
tros a varios mililitros.
Además, se están desarrollando yvalidando tecnologías no
invasivas que permitan detectar un tipo específico de analito
del organismo. En concreto, se han realízado grandes avances
con e1 desarrollo y la comerciaiización de pulsioxímetros que
determinan Ia saturación de la hemoglobina y se encuentran
en Ia mayoría de hospitales. También se han desarrollado dis-
positivos para determinar la concentración de bilirrubina en
neonatos y eliminar la punción. Finalmente, un importante
campo de desarrollo ha sido cuantificar la glucosa de forma
no invasiva en diabéticos, tal y como se comentará en el apar-
tado correspondiente.
'1":L,:-,1'¡i.:
I :;rii ir,¡
El mercado de aparatos de análisis para el diagnóstico rápido
ha crecido espectacularmente en los últimos años. Hasta Ia
década de 1980, las principales aplicaciones eran la glucemia
capilar, el urianálisis sencillo y los tests de embarazo. Sin
embargo, actualmente se ha ampliado el panel a.muchísi-
mas más determinaciones y está en continua expansión (ta-
bla 4-1).
Algunos tests son cualitativos o semicuantitativos y no
requieren ningún equipo especial y la lectura de los resulta-
dos se realiza visualmente. Estos tests suelen ser más econó-
micos y no precisan un personal entrenado. Algunos ejem-
plos de estos tests son la determinación de gonadotropina
coriónica humana o la detección de drogas de abuso. Suelen
ser tests de un solo uso desechable. El principal inconveniente
de estas pruebas consiste en que la interpretación es subje-
tiva, sin ningún control de calidad adecuado y los resultados
muchas veces no se incorporan a la historia clínica. Sin
embargo, la mayoría de las determinaciones son cuantitati-
vas y se emplean equipos, lo que permife realizar una valo-
ración objetiva del resultado.
La determinación de la mayoría de las magnitudes bioquí-
micas se basa en los siguientes métodos:
l. Reacciones químicas, como las de las tiras de urianálisis.
2. Reacciones enzimáticas, que proporcionan la especificidad
propia de la enzima.
3. Reacciones electroquímicas, que se emplean de forma abun-
dante en la determinación de gases en sangre e iones (Na-
y K.).
4. Reacciones inmunológicas, que se emplean en la mayoría
de los procedimientos de análisis de proteínas y drogas de
abuso. Existen tres tipos de métodos: aglutinación, inmu-
nofiltración y, sobre todo, inmunocromatografía.
48 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

.'-, -, .- . ,a*iir*e;*n*s d* *cls análisis a ta cabecera de¡ paa¡ente

Análisis
Acido-base PO2, PCO2, pH, HCOr- y lactato
Diabetes Glucosa y HbA,C
Drogas de abuso Barbitúricos, MDMA, cocaína, benzodiacepinas, etc
Enfermedades infecciosas Hepatitis, Helicobacter pylori, Chlamidia, gripe, tuberculosis, VlH, etc.
Fe rtílida d Gonadotropina coriónica humana y lutropina
Función renal Urianálisis, albúmina y creatinina
Electrolitos: Na., K*, Ca2+ y Mg2+
Hematología Hemoglobina y hematocrito
Hemostasia Tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial y recuento plaquetario
Lípicios Colesterol y trig icéridosI

Marcadores cardíacos Mioglobina, CK-MB, cTnT o cTnl y péptido natriurético cerebral

Marcadores tumorales PSA y sangre oculta en heces
Pruebas no invasivas Bif irrubina transcutánea y Ory CO, transcutáneos
CK-MB: creatina-cinasa MB; MDMA: 3,4-met lendioximetanfetamina; PSA: antígeno prostatrco especrfico tde ng es, prostate specifrc antigen),VlN
v rus de la inmunodeficiencia humana.

Los instrumentos de medida pueden ser de mano o trans- longitudes de ondas, un detector/amplificador de señal y un
portables, de mesa e, incluso, de tecnología no invasiva. Las sistema de lectura.
car¿rcterísticas que debe cumplir cualquiera de estos dispositi- Una parte de la luz se dispersa y este etbcto se corrige con
\-os so1l: ser sencillos de usar y de mantener, presentar estabili- una calibración mediante una tira reactiva negra, que corres,
dad de los reactivos v ofrecer unos resultados con suficiente ponde a la rnáxima absorbancia. La reflexión depende de los
exactitud y precisión. Además, éstos deben ser concordantes tipos de superficie de las tiras reactivas y e1 tipo de equipo,
con los que se realizan en el laboratorio central. Precisamente, como es el ár-rgulo incidente. Por ello hay que tener especial
p:rra lograr la sencillez ). robustez de manejo, estos equipos con- precaución en su manejo para no alterar las tiras reactivas. Un
tienen tecnología muv sofisticada y compleja. Los dispositivos inconveniente es que no existe una relación lineal entre Ia con-
ptrra análisis a 1a cabecera del paciente están incorporando cad¿r centr'¡cion r la señal producida, por 1o que es necesario aplicar
r-ez nt¿is a\-¿rnces tecnológicos en microfabricación, métodos de cálculos n.iatenráticos compleios.
detección ultlasensible e, rnclr.rs,r, dc tecnic¿s de detern.rina¡ión
cle biologia rrolecular. La ntini¿rturizacrór.i tambren se a¡rl1¡¿ ¿
1.,. e1.'¡trt ni¡a. dett¡lores. siste il.t: rrp:i.os r- iluido: ce los dis- ln m unocromatografía
ptr::i:ir'¡5. -\Sin-LiSnttt. ¿l r-Lu:¡ter', r .t¡ tt.t. !]Lt- irl rf¡O1'J,rrn¡ Caja
Est¿r es una técnica muy comúrn en los sistemas de análisis a
.l'lir'.r-.1-r isi.l .lLlItani¿ni(r arrtlsidil l-.1¡l't¡nt¡ 1'a.1d¿ ,,'ez ra: :1s
1¡ c¡bccera del paciente porque combina la especificidacl y la
.!'''..\'.''''..]..|'-.']''.'.'....:...]:i''.:
sensibilidad de la técnica de sándwich con elevada rapidez en
-1,::. ::- ).. -:--:-l -.,:1.-r:-r; .-: --'i.r'-:il
. -.. ...-:- .-. -.- ... - :. ....-. ..-. :-. nostrar el resultado. Estas técnicas se emplean para el diagnós-
j. tico rápi¡le en muestras de sangre, orina, saliva, etc., para detec-
. . ,- -..: *. ------ ... .. . -:.1.-..:
t.rr numerosos analitos, como hormonas (gonadotropina corió-
:-'.. .- .- -' -.. r - -- :
n:..r i- lutropina), drogas de abuso, marcadores cardíacos (cTnT
.l:..,. ...:-- ..: -.-.-.-: t cTnl, CK-I4B [creatina-cinasa MB] y mioglobina), rnarcado-
res tumorales (antígeno prostático específico [PSA, del inglés,
lrastLlt€ speciJic antigenl), o antígenos virales (VIH).
Consiste en L1n soporte de plástico sobre el cual se dispone
Espectrofotometria de ref ecta ncia I
una membrana de nitrocelulosa en que existen tres zonas suce-
Laes¡.¡¡.1-.-r - ,1-:-' -: .: :-. .- ,:: -----::1.:LrdLlloqia sivas (fig. 4-3): una primera con un anticuerpo conjugado con
mUYSit-tlilar.:-..:..:. -: - , .:. -.::--. '. -,-:tlliaa\'ia una molécula de detección, como una partícula de oro, que reco-
absorción de 1: ,--. :¡ '- . - noce el antígeno que se desee detectar, a continuación, una
de utiliz¡r'un.L :r -. .'. - segunda con un anticuerpo de captura frente a otro epítopo del
analisis a ]a a.rn.,.:. -. antígeno y una tercera zona con un anticuerpo frente al anti-
los equipos quc rn'l'.J.. . . ,:. --:lan¡ili- cuerpo conjugado. Al añadir la muestra, ésta migra por la mem-
sis.Enei1a,Llnra\-ode---.-.'--.*.. : -. - :---- .-a.forlna brana de nitrocelulosa e inicialmente entra en contacto con Ltn
directa o difusa, en qu- ;- -- .,. .: - : r: -----,: --.¡rte r"el anticuerpo conjugado. Si existe e1 antígeno, éste se unirá al con-
lesto sale de for'nlrr .iili .,. : . jugado. Posteriormente continúa migrando )¡ arrastra el conju-
trofbtómetro f dis¡r¡11¡ c. -. - - --. - -- - -::- .eiectoi de gado hasta una zona en que hay un anticuerpo de captura. En
 Capítulo 4-Metodología analítica lll. Análisis a la cabecera del paciente 49

''::::j 'jill 'j *s

'J
caso de que se encuentre el antígeno unido al anticuerpo con-
jugado, éstos quedarán retenidos en esa zona. La muestra y el
resto del anticuerpo conjugado continuarán migrando por la
membrana hasta llegar a una tercera zona, donde queda rete-
nido el anticuerpo conjugado por un anticuerpo frente a éste.
Algunos sistemas emplean varios anticuerpos para detectar

-+fl --'1
varios analitos, tal y como ocurre con los equipos para detectar

::'::"' -^.., . drogas de abuso en orina (figs. a-aA y B).

il
l]l ill
-,1 K$erxx6x*xx x*e mpXXcaa*m¡rxes de *eps
il1 il
axx¿&$*s&s cx $m ea$xe€€y& deX ¡xxc*ente
Los análisis a la cabecera están amoliamente extendidos
;,gura 4-3. Método de inmunocromatografía en una tira react¡va. tanto en medio hospitalario co*o ..riu, consultas de aten-

control
detección

=,gura 4-4A. Detección de procalcitonina en suero mediante inmunocromatografía. Se emplea un equipo de un solo uso sobre el cual se pone
-rr'És :.tasde suero (1). La muestra migra por una membrana (2). Obsérvese la positividad de detección por la existencia de una banda en la zona de
*¡:,:: ón (3). La adecuada real zación se comprueba por la aparición de una banda en la zona de control.

Test negativo para

Test positivo para
metadona
tetrah idrocannabi nol

Banda de control
Zona
I de test
Banda de detección

* Pocillo para la orina

ta
=gura 4-4B.Detección simultánea de varias drogas de abuso en orina. Se emplea un equipo de un solo uso sobre el cual se ponen unas gotas de
u :rr: una mtcción. La orina migra a la zona de test, arrastrando al anticuerpo conjugado. Si no hay droga, el anticuerpo se une a la droga antígeno
Ce

u
,rrr:, tizada en la línea de test. Si hay droga en la orina, ésta compite con la inmovilizada por el anticuerpo que está en cantidades limitadas. Por
u ¡-c-a de determinada concentración de droga, el anticuerpo no se une al antígeno inmovilizado y no aparece la línea en la zona de detección. La
¡ ,-e: :e control sirve como control de calidad interno.
50 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica v patología molecular
cion prinrarra. En casi todos los campos de análisis se están
desarrollando dispositivos que permitan 1as determinacio-
nes a 1a cabecera del paciente, por 1o que en este capítulo se
desarrollarán los que por su importancia están más exten-
didos. En 1a tabla 4-1 se muestra un resumen de algunos
campos de aplicación de los análisis a la cabecera del
paciente.
Glucometría en sangre cap¡lar
Necesidades para el análisis
a la cabecera del paciente
La necesidad de una determinación rápida de la glucemia
se puede presentar en las siguientes condiciones:
1. lvlonitorización de la administración de glucosa o insulina,
como en los pacientes diabéticos que reciben insulina.
) Seorirriento rle n:rri¿¡teS CrítiCOS metabóliCamente ineS-
tables en los cuales la concentración de glucosa puede cam-
biar bruscamente.
3. Sospecha de una situación de hipoglucen.ria o hipergluce-
nria agudas \-¿ que e1 grado de lesión depende de1 tiempo
en que se mantenga 1a alteración de la homeostasia de 1a
glr.rcosa.
Además, la determir.ración de 1a giucemia capilar tiene inte-
rés p:rra el análisis pre ,y posprandial para ajustar la dosis de
insulina en diabéticos. Aunque 1a frecuencia est:i dictada por
Lrs l)ece sidader palticulares de cada paciettte, la monitoriza-
ción de 1a glucosa debe realizarse tres veces a1 día o más en los
pacientes qne se rrr-ect¡n insr-rlina varias veces o en aquellos
qne ller-en una bonrba de insulir.ra. Esto perrnite determinar si
se están alcanzando Los niveies adecuados de glucosa, prevenlr
hrp,rgluccnri.r\ \ ajustrr'las medicaciones, la alimentación y 1a
actir-idad tlsic¿r.
Lr tl'ecuencia óptrmrr ¡rara pacientes con diabetes de tipo 2
o tratar.niento no insr-rlínico es menos clar¿r. Ésta depende de
si están en una thse de ajuste o va están controlados. Si está
estabiliz¿tlo, quiza no sea necesatia una monitorización muy
frecuente. Para aquellos que están descontrolados o están ini-
ciando l¿r medicación, la monitorizaciór.r es importante para
ajustar el modo de rnar.rejo. Los diabéticos cle tipo 2 qr-re usan
insulina debel-r realiz¿lr una monitoriz¿rción de glucosa, a1
menos, 4 veces por sem¿lna.
t<, L
LF i-
,: -' 1"
:*-=
Hay que recordar que la precisión dei ,:-, . .: -
depende del usuario, por Io que es im¡., :.... ,
nica de monitorización del pacient(:r.'..
intervalos regulares posteriormente,
Metodología
El autocontrol de la glucemia es fund¿::'...'.
trol a largo plazo del diabético. Esta técni¡¿ .= .
prueba a la cabecera del paciente y por lo.1'..
cos para nlonitorizar sus niveles de gluco-, :'..- '
permite determinar la glucosa en una gota de s.- - ,
rican Diabetes Association (ADA) recomrend* -..
tres controles diarios a aquellos diabéticos Q'1,; :: ,
insulina varias veces ai día o para 1os que utiliz;.:-. l
insulina. La sangre capilar se obtiene por puncio-: ...
del dedo y se mide con equipos portátiles en e1 pu;:. :.
tencia (fig. 4-5). La mayoría de dispositivos actuaL¿: : :' , -
muy poco volumen de muestra para el análisir, e'- - -
0,5-l prL, yel resultado se obtiene en unos pocos se:-: :
Existen numerosos fabricantes y tipos de glucón.re ::' , -
ponibles que varían en el tamaño, peso, tiempo de1 test -. :.--
cidad de memoria de los resultados. Estos aparatos ui-..- -
tiras de química seca de un único uso que emplean enz,::- .,.
que degradan ia glucosa, predominantemente mediante s---
cosa oxidasa (Ondouch, Ascensia yAssure) o hexocrnasa ¿-.,-.-
que tarnbién algunos glucómetros utiiizan la glucosa-de .:-.
drogenasa (Accu-Chek y FreeStyle). Estas reacciones est¿i:'
acopladas a otras que desarrollan color, que se evalúan visua-
mente o, preferiblemente, puede cuantificarse en equipos de
medida. La detección suele ser fotométrica (espectrofotome-
tría de reflectancia) o electroquímica.
Estos dispositivos muestran una buena correlación con la
glucosa plasmática. La concentración de glucosa en sangre
capilar difiere ligeramente de la de sangre yenosa y también es
diferente en 1a sangre total que en e1 plasma (fig. a-6). Los resul-
tados pueden estar influidos por el nivel del hernatocrito y ser
inadecuados con un nir.el del hematocrito interior al 25% ya
que pueden producir resultados más elevado-s de lo real; del
mismo n-roclo, 1a policitemia produce r esuli¡.1.'. r.nenores de 1o
rea1. Hay que tener en cuenta que. ert sitr.t¿;i,¡tl.'s de disminu-
ción del flujo de sangre periférlca (deshrJr','...',.rrrn hipotensión,
shock hipovolémico o enf-ermecled ' .,.-,--,r' pe riférica), la
cleterminación de la sangre obtenr.:.. : : . -,, -',-:r¡iorr en el dedo
quizá r-ro refleje e1 estado iisiolo!-: .: .-,r:-t' r C)tr os factores
que ir-rfluven en los tesult¿rr-1rr: : - , - - - .l -:a:t)nes nlUl, glg-
.
-lmetro coincida
: ¡é ctnñro ñ:ra
 Capítulo 4-Metodología analítica lll. Análisis a la cabecera del
7,il
) zsma:93!o de agua
-:rratíes: 73o/o de agua 83% de agua
Los compuestos hidrosolubles, como la glucosa o los
electrolitos, estarán el 10% más concentrados en el
plasma que en la sangre total
: :-'¿ 4-6, Diferencia entre la concentracjón de un analito en sangre
':.: , :- clasma. Las drferencias serán mayores cuanto mas alta sea la
- ::--: l^ de hematíes (esto es, mayor nivel del hematocrito).
-i::¡ de trigiicéridos. Además, estos sistemas son muy inexac-
:I : -Lril concentraciones de glucosa muy bajas, inferiores a
- - ::rrol/L (50 mg/dl), o muy elevadas, superiores a 27
:::::,- L (500 mg/dl). También, algunos agentes administra-
:' : ir!.Lrqenamente pueden interferir en ello, como el acetami-
-- :¡=:. ia galactosa, la maltosa o la xilosa del test de absorción
:: 1:r¡Sa.
- :. qlucómetros permiten una determinación intermitente
:. .-'¡¡osa, pero actualmente se están desarrollando siste-
:'-. :¡ monitorización continua de la glucosa mínimamente
-: ,.!i:'iLrs en piel, córnea, retina o membrana timpánica. Estos
- :.-.n especial utilidad acoplados a bombas de perfusión de
:.--:na de forma que se puede ajustar la dosis para evitar, por
. :::::1o, las hiperglucemias posprandiales y las hipoglucemias
:- . \:: ,ilas.
-\DA recomienda para los glucómetros un error analítico
-":.
. ¡r al. 5o/o. La Clinical Lab oratory Improvement Amend-
: :--
:,,":-:,. CLIA) establece que los glucómetros deben estar alre-
:r:":-.: Jel l0% del valor diana o + 0,3 mmol/L. Las recomenda-
-:r: :* del National Committee on Clinical Laboratory Standards
i; - -LS) r'arían según las concentraciones de glucosa. Por ejem-
:t,-. r¿ra nireles de glucosa superiores a 4,17 mmollL (75 mgl
:- . ¿1 error debe ser menor al2\o/o de la glucosa medida en el
¿!-,: r¿¡orio y no debe diferir más de 0,83 mmol/L (15 mg/dl-)
:.¿:: nir-eles de glucosa inferiores a 4,17 mmollL.
Gases arter¡a¡es
Mecesidades para el análísis
a Ia cabecera del paciente
-," recesidad de disponer de unos resultados rápidos de
¿:.i,r:. ¿rteriales es muy importante en determinadas estan-
-'.i: :ospitalarias, como en las unidades de cuidados inten-
:. - i. €n quirófanos, en servicios de urgencias o en neonato-
-,.-¡. Si se dispone de un sistema rápido de transporte del
::::--imen, el tiempo de respuesta que se obtiene realizando
paciente 51
los análisis a la cabecera del paciente (unos 5 min) quizá no
sea de mucha mayor ventaja clínica que en el laboratorio
de urgencias (unos 25 min). En ocasiones, esta diferencia de
tiempo es importante, por ejemplo, para detectar complica-
ciones durante una cirugía cardíaca de modo que se puede
actuar de inmediato. No obstante, muchas veces la determi-
nación rápida no implica ningún cambio en el tratamiento
elegido o sólo se emplean para confirmar la eficacia del tra-
tamiento, como comprobar que un paciente estabilizado pre-
senta buena ventilación.
Metodología
El manejo de las alteraciones respiratorias y metabólicas
depende de la determinación rápida de oxígeno y CO, en san-
gre. Los analizadores de gases llevan más de 50 años en el mer-
cado y los equipos modernos son sencillos de manejar y han
disminuido notablemente el recuerimiento de mantenimiento.
Además de pH y gases, actualmente pueden medir muchos
más analitos que se suelen denominar críticos (iones, hema-
tocrito, ácido láctico, glucosa, etc.). La mayoría de estos ins-
trumentos contiene sensores electroquímicos o electrodos que
determinan potenciométrica o amperométricamente la con-
centración del analito.
Existen tres tipos de equipos:
t. De mesa, que son los de mayor tamaño y utilizan los elec-
trodos convencionales. Permiten analizar pH, gases, electro-
litos, metabolitos, como glucosa y lactato, urea, creatinina
y cooximetría. Aunque el mantenimiento que necesitan se
ha reducido considerablemente, todavía es el sistema que
más mantenimiento requiere, pero son los más adecuados
para volúmenes de trabajo medio-altos. La principal des-
ventaja consiste en que, con el tiempo, el electrodo deriva
de su base (generalmente, por el depósito de proteínas) y
requiere calibración. El error se corrige con una calibración
a un punto al cual suele estar programado automática-
mente, en muchos instrumentos cada 30-60 min. Cambios
más pequeños, como en la línea de base, se corrigen con
una calibración a dos puntos que se suele requerir y pro-
gramar cada 4-8 h.
2. De cartucho, que son sistemas semiportátiles. Se han desa-
rrollado chips de sensores electroquímicos en una tarjeta
de plástico (Gempremier 3000). El cartucho contiene todos
los sensores, soluciones ybolsa de desechos para poner en
funcionamiento e1 equipo, por 1o que no se.requiere nin-
gún reactivo adicional. La configuración del equipo con-
siste en la introducción del cartucho en el equipo ¡ tras un
precalentamiento, calibra automáticamente todos los sen-
sores. Algunos sistemas presentan un programa de control
activo del proceso de calidad, diseñado para detectar y
corregir inmediatamente los errores del sistema, y sustituye
el uso de controles externos convencionales. Una desven-
taia es el hecho de que los cartuchos tienen una vida media
Iimitada Q-4 semánas) cuando se colocan en el instru-
mento, por 1o que los proveedores los fabrican en tamaños
diferentes (75-700 análisis por cartucho). Estos sistemas
pueden ser rentables para volúmenes de trabajo medio-
altos.
De mano o de uso único, que son cajitas o cartuchos de uso
único, portátiles, sin mantenimiento. Son útiles sólo para
volúmenes de trabajo medio-bajos.
 52 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular
Absorbancia Absorbancra
en el rojo Carboxihemoglobrna en el infrarrojo
- nvihomn¡lnhin¡
- Desoxrhemoglobina : infarto agudo de miocardio en las primeras horas en que éste se
- Metahemoglobina l produce. El tiempo de respuesta de estos marcadores cardíacos
- ha de ser entre 30 y 60 min para iniciar el tratamiento en 60-
600 800
Longitud de onda (nm)
I gura 4-7. La pulsioximetría se basa en la medida de la absorbancia
. ongitudes de onda. La saturacjón de oxígeno se puede calcuiar
= ='as
con los distintos espectros de absorbancia de las hemoglo-
;-::;..t0"
Cooximetría y pulsioxi metría
La saturación de oxígeno en los tejidos se suele determinar
¿ 1a cabecera del paciente en los hospitales de forma continua
:nediante pulsioximetría. De esta forma se detectan rápida-
nente los episodios de hipoxia y es muy importante en las
¿ctuaciones de anestesia. El principio de este sistema se basa
en el hecho de que la absorbancia de la sangre varía depen-
ciendo del grado de saturación de oxígeno de la hemoglobina.
EI aparato de pulsioximetría se coloca en una zona bien per-
i-¡ndida, como un dedo de la mano, y tiene un sensor que emite
rn haz de Iuz a 630-660 nm, que es la absorbancia máxima
iara la hemoglobina desoxigenada, y a 800-940 nm, que es la
¿bsorbancia máxima para la hemoglobina oxigenada (fig. a-7).
De esta forma mide a intervalos de tiempo Ia absorción roja e
::1*arroia y calcula la saturación de oxígeno. De acuerdo con
sus características de medida, estos sistemas producen resul-
:¿dos erróneos ante valores de hemoglobina anórmales, de ane-
rnia grave o de baja perfusión sanguínea de los dedos.
La cooximetría consiste en la medida de la hemoglobina y
sus derivados mediante técnicas esDectrofotométricas en san-
gre arterial. Además de la desoxihemoglobina y la oxihemo-
jobina, incluye Ia cuantificación de la concentración de hemo-
Elobina, la fracción de la oxihemoglobina, la saturación de
rlirgeno carboxihemoglobina y metahemoglobina. General-
::rente. los cooxímetros se conectan o están incluidos en los
-:.:¿lizadores de gases en que se mide la POr. Se utiliza la cooxi-
:::eina cuando se sospecha exposición a tóxicos, no mejora la
:-:r.ria con Ia administración de oxígeno, cuando hay discre-
:t:ria entre la PO, en el análisis de gases y la saturación de
-'rrgeno en el pulsioxímetro o si se sospecha la existencia
:= ::na dishemoglobinem ia.
Marcadores cardíacos
lndicaciones
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de
::.t falidad en los países occidentales ¡ por tanto, consumen gran
:;::idad de recursos asistenciales. La detección precoz es funda-
::,e:tal para reducir la morbimortalidad de las enfermedades car-
:.,-,;a-*-rrlares y los signos clínicos y el electrocardiograma muchas
veces son insuficientes. Los marcadores cardíacos están compues-
tos por la CK-MB_, la mioglobina y las troponinas cardioespecífi-
cas iTnT o iTnI. Éstos son fundamentales para el diagnóstico del
90 min. En algunos hospitales, el laboratorio central no puede
cumplir con los requerimientos en tiempo, por lo que es necesa-
rio realizarlamedida de los marcadores a la cabecera del paciente.
Esto está facilitado porque se disponen de dispositivor q.r. p.r-
miten cuantificar directamente en sangre total estas magnitudes
y disminuye mucho el tiempo de respuesta.
Metodología
Existen varios sistemas, tanto cualitativos como cuantitati-
vos, que permiten realizar las determinaciones de manera
rápida, en menos de 20 min, una vez que se ha colocado el
espécimen en el sistema, que normalmente es sangre total.
Existen dos formatos de analizadores: de mesa y los transpor-
tables. Los de mesa son similares a los equipos del laboratorio
central, pero incluyen modificaciones para simplificar y estan-
darizar el proceso y evitar errores del operador. Los de mano
integran varios pasos analíticos en un único sistema. Técnica-
mente, los análisis a la cabecera para biomarcadores cardíacos
utilizan principalmente inmunoanálisis y como marcaje se
utiliza oro, látex, fluorescencia o enzima
La tabla 4-2Dresenta
s.
una relación de algunos de estos dispositivos existenies en el
mercado. A continuación se describen dos ejemplos:
1. El equipo Triage'para detectar los marcadores cardíacos
emplea sangre total, que añade en una zona de la tarjeta
Iectora, que contiene un filtro que retiene las células. El
plasma detiene una zona de reaciión, donde se une con un
anticuerpo unido a un fluorocromo, ylamezclafluye hacia
ofÍa zoÍa, donde el complejo es capturado y se detecta Ia
fluorescencia con un monitor. La intensidad de fluorescen-
cia es proporcional a la concentración del marcador car-
díaco y proporciona información en menos de 15 min.
2. EI Cardiac Reader' está formado por 2 anticuerpos frente a
la cTnT, uno unido a oro y otro biotinilado. Cuanio la mues-
tra de sangre total se añade en el pocillo, los anticuerpos for-
man un sándwich con Ia cTnT. Posteriormente pasa por una
zona de separación, donde se retienen los hematíes, hasta
llegar a :una zona de detección en que hay una línea con
estreptavidina que retiene los complejos. La existencia de
cTnT se ve como una línea roja. EI exceso de anticuerpo mar-
cado con oro continúa migrando hasta una segunáa línea
control, que indica la vahdéz del resultado. La inlensidad de
color en la línea de detección es proporcional a la concen-
tración de cTnT y se puede cuantificar con un equipo.
Puesto que es necesario realizar determinaciones seriadas
de las concentraciones, en la elección de éstos hay que tener en
cuenta que los resultados proporcionados no d'ifñran de los
del laboratorio central. Si bien en los resultados de la CK-MB
existe una elevada concordancia entre los distintos métodos,
esto no ocurre con la cTnI, en que los resultados proporciona-
dos por los distintos métodos pueden ser muy dispares y puede
existir una discordancia incluso del 500%. Esto dificulta la
verificación de los resultados por la técnicarealizada en el labo-
ratorio central.
 Capítulo 4-Metodología analítica lll. Análisis a la cabecera del paciente 53

Analiaad¿3r€s a ;e eahe{6ra d*l paeient* de mareadsres fardía€es

Tiempo
Fabricante Parámetros Espé<imen (min)
First Medical cTnl, CK masa San. (EDTA) 18
CK-MB, mioglobina
Roche NT-proBNP, cTnT, mioglobina San. (heparina) 12

I - -> Nanogen mioglobina, CK-MB masa, cTnl San. (heparina) tl

Pla. Srm.

Abbot cTnl, BNP, CK-MB 5an. (heparina) 10

plasma

ThauMDx mioglobina, CK-MB, cTnl

Mitsubishi Chemical CK-MB, mioglobina, cTnl, NTPro- 5an. (heparina, EDTA) 17
BNP Pla.
11
Biomedical Response CK-MB, mioglobina, cTnl San. (EDTA)
'. :'<er
:) STAT Dade Behring cTn l, 5an. (heparina) l)
CK-MB, mioglobina, NT-ProBNP
CK-MB, mioglobina, cTnl San. (heparina) tl
-=': ac Panel I nverness
Pla.

.:: -:-¡inasa MB: EDTA: ácido etilend aminotetraacético; cTn l: Troponina I card o-específica; cTnT: Troponina T card o-específica; BNP:
péptldo natriurét¡-

Además de la utilización de materiales de control, algunos

: -,--'-¡os de aná1isis a la cabecera del paciente se con
' - --il,o el resto de 1os equipos del laboratorio y, por
' :¡s Los requisitos de calidad son aplicables a ellos.
. ::s a la cabecera del paciente deben cumplir la nor-
.: Legislación y 1os estándares existentes. Muchas
r\iste normativa específica para este tipo de aná-
:. -zados a la cabecera del paciente y la acreditación
.
::rcrS de calidad de los laboratorios convencionales
,' '-'r.incipio, aplicables a los análisls a la cabecera del
. .: El laboratorio central establece 1as pautas y la fre-
' , ,,. rara realizar los controles de calidad externos e
, . r-La revisión de todos los resultados del control de
-., 1
,,Llramiento de la calidad en análisis a la cabecera del
. s
, . .'iebe comprender tanto la fase preanalítica obtención
: . --:-imen, hemólisis, preparación del paciente, retraso en
: . ¡ación del análisis, mezcla inadecuada de la muestra,
.r,.r;ión de burbujas de aire, etc.), como el equipo y los
,.-'. os (almacenamiento, calibraciones, variación de lote a
: :rlantenimiento, etc.), e1 procedimiento, el personal (for-
dispositivos, como los analizadores de gases de cartucho Gem-
Premier, llevan incorporado un sistema de control de calidad
interno en el cual se analiza automáticamente una solución
tras cada muestra del paciente y se asegura un control de cali-
dad continuo. Otras dos soluciones se analizan autonlática-
mente cada 4y 24h. De esta manera se detecta de forna tem-
prana cualquier fallo en los sensores.
Otros sistemas presentan un control de calidad electró-
y nico. Por ejemplo, algunos glucórnetros poseen un electro-
chip que emite electrónicarnente una selial de manera que
el dispositivo ofrece una lectura vá1ida. Estos dispositivos,
a diferencia de las soiuciones, son muy estables y son un
excelente método para validar si el sistema de lectura fun-
ciona correctamente.
N,lcDonnell B, Heart,v S, Leonard B O'l(ennecly R. Cardiac biomarkers irncl the
case for point of-care testing. Clin Biochem 2009;'12: 5'19 561
Nichols H (ed.). National Acade n,v of Clinical Biochemistrl'. Laboratorl'
.f

.;ión y actualización) y el registro de resultados y la integra- Nledicine Practice Guiclelines. L,r'iclence'Based Practice tbr Point-ofiC¡ire
:r en la historia clínica del paciente. It'esting. \\¡ashington r AACC Press, 2006

.:- 1a fase analítica, generalmente se realizan controles de Price C, St John, Hicks.flvl (eds.). Point ofCare Testing, 2'edición. \\rashington:
AACC Press, 200'1.
.'¿d externos e internos. Para el control de calidad lbumi K, Laf'f'av N,f , Lefér're G, Coucler R. Reflexiones sobre los ¿rnálisis clínicos
.::.1o, cada equipo presenta un material de control que se deslocalizaclos. Acta Bioquim Clin Latinoan 200'1;38 (4):505 5i2.
..-'-2a1, se compara el resultado con 1os límites de acepta- Yager P, Doningo GJ, Gerdes .i. Point oficare diagnostics fbr global heaith.
:.,] Annu Rev Biomed Eng 2008; 10: 107-l'14.
 F capítulo 5
ii

Valores de referencia
e interpretación de resultados
analíticos

rNDrcE DEL cApíruro

Concepto de intervalo de referencia 55 Curvas ROC 59
Establecimiento del intervalo de Valores predictivos positivo y negativo 60
nef erencia 56 Valor predictivo y prevalencia de la enfermedad 60
i=t icación de los valores de referencia 56 Variación intraindividual e intervalo
--¡-s'erencia de intervalos de referencia 56
de referencia 62
5ensibilidad, especificidad y eficacia Valor de referencia del cambio 62
d,ñ.agnósticas 57 Perfiles y algoritmos de determinaciones
qfqirí(ación del punto de corte
bioquímicas 63
* ¡ ,¡s decisiones clínicas 58 Referencias adicionales 64

una población formada por individuos aparentemente sanos, es

OBJETIVOS DE APRENETZAJE deci¡ <normales>. Sin embargo, el término de valores normales
r l:'nir el concepto de intervalo de referencia. se presta a equívocos. Puede referirse bien a los vaiores en una

" :':
:car la obtención de un intervalo de referencia. población no enferma o a los más frecuentes en una población
. l:'rjr la sensibilidad, la especjficidad v la eficacia determinada. Con todo, una concentración fuera de ese inter-
:.:nósticas. valo no significa enfermedad o anormalidad. por ello, es prefe-
¡ :.a:: interpretar una curva ROC. rible emplear el término de intervalo de referencia yu qu. ..
r j::er evaluar la sensibilidad, la especificidad y el valor obtiene en un grupo de referencia para el laboratorio, io que no
:-:r ctrvo en un contexto clínico. significa que esté en un estado de salud completa. Además, desde
r :;t Cdr cómo afecta la variabilidad individual un punto de vista estadístico, muchas magnitudes biológicas no
. ¿ lterpretación de resultados. muestran ninguna distribución normal o gaussiana.
Así, según el concepto anterior, se pueden establecer inter-
r - : ^ ¡cer el concepto de valor de referencia del cambio.
valos de referencia en grupos diferentes:
¡ j,:er la utjlidad de los alqoritmos de determinaciones
- - - -t--.
:
= -LLd).
l. Si se tienen en cuenta las variables biológicas no modifica-
bles. En muchas magnitudes bioquímicas son especial-
mente importantes factores como Ia edad, el sexo o la
raza.
2. Si se tiene en cuenta determinada enfermedad o determi-
nado tratamiento, como insuficiencia cardíaca, tratamiento
.i: ,:,,:' ir i:'':t'l:' l tl" ';i:¡',r¡:r : l"t' r::'¡l,a:l:r ,l ' ']t
:... .
hormonal, etc.
';,
- -,-cuier resultado de concentración de una magnitud bio- Además, el resultado de la concentración de una masni-
. -.- ,,'¿ rrene que ser comparado con aigo puru q.i. adquiera tud bioquímica depende del espécimen en que se determina
,- '-:¿do. En la mayoría de los casos, Ia interpretación de los y de Ia metodología empleada. Por ello, cada laboratorio debe
--::: r .e:erados en el laboratorio clínico se lleva a cabo en rela- establecer sus propios intervalos de referencia, teniendo en
. : ::,:r los datos obtenidos en una población de referencia. cuenta Ia metodología que emplea y Ia población a Ia cual
*r
i::::¿-mente, esta población de referencia se identifica con atiende.
*
t
T
56 Parte !-lntroducción a la bioquímica clínica v patología molecular
Los r.alores de referencia se estiman a partir de una muestra
de la población formada por un número asequible, limitado y
representativo de individuos. Los resultados obtenidos en este
subconjunto serán más o menos representativos de 1a pobla-
ción, según el número de integrantes de la muestra de modo
que, clranto nayor sea el número de individuos que integran
la muestra, rnejor serán las estimaciones. Según las recomen-
daciones de Ia International Federation of Clinical Chemistry
and Labor¿rtory Medicine (IFCC), 120 individuos es un número
suficiente para obtener un intervalo fiable.
Una vez que se ha seleccionado la pobltrción, es necesario
definir un protocolo de recogida y procesamiento de los espe-
címenes. Éste incluye los aspectos relevantes para cada mag-
nitud biológica:
1. Condiciones del individuo o condiciones basales, como
ayuno, consllmo de alcohol, ejercicio previo, etc.
2. Técnica de recogida, como hora del día, técnica de flebo-
tomía, tipo de tubo de recogida, centrifugación, almace-
namiento, etc.
3. Técnica ernpleada para la cuantificación.
El tratamiento estadístico de los datos tanlbién influ1'e en el
establecimiento del intervalo de referencia. La representación
gráfica de 1os resultados analíticos frente a 1a frecuencia r elatir-a
se denomina ciistribución de frecuencia que, al ser e1 grupo de
referencia, se denomina distribución de reférencia. Normal-
mente se representa mediante un histograma, en el cual la con-
centración del analito se representa en abscisas y la frecuencia
relativa en ordenadas (fig. 5-1). Según el tipo de distribución de
ia población se calcula el intervalo de referencia:
1. Si es una distribución gaussiana, se define el intervalo de
valores que incluye el 95% de 1a pobiación.
ñ
.¿
Io
ñ clínico. No obstante, establecer un Lnte rr-aio de reférencia no
-C
O
-
U de un número suficiente de pol¡l¿¡inn de retérenci¡ 1', ademas,
Li
C oncentración
Ir,¡led ia
Interva o de referenc a
Istogranra que muestra a d stribuc ón de frecuencias y
:r de nterva o de referenc a de una maqnitud bioquímica que
':: 95% de a pob acón san¿ estud ¿da. Observesequeel 5%
:' - ,:- .olo) no se incluye en el ntervalo de referenc a y, por
: :--: -.'O5.
2. Si no es una distribución gaussiana \- no s¡ ¡uede norrna-
Iizar, se define entre los percentiles 2,5 r 9,.5 de la pobla-
ción.
En el caso más sencillo, el intervalo de concentraciones de
ese analito sigue una curva gaussiana (fig. 5-1). El interr-alo
de referencia comprende el 95o/o de la población estudiada
(corresponderá, aproximadamente, al intervalo comprendido
entre las 2 desviaciones estándar [DE] de la rnedia). Se rechaza
el 2,5o/o de los resultados más altos y más bajos, por lo que se
deduce que en el 5% de esa población, inicialmente sana, 1os
resultados se sitúan fuera del intervalo de referencia definido.
Por ello, no se puede definir en términos estrictos co1t1o (inter-
valo de normalidad>, sino como intervalo de referencia. Tam-
bién podemos apreciar que un único resultado no sirve para
clasificar a un individuo como sano o enférmo, sino que con-
tribuye a clarificar una situación clínica, junto con un conjunto
de datos. Lógicamente, cuanto más se aleje un resultado del
límite del intervalo de referencia, es más probable que ese resul-
tado corresponda a un individuo enfermo.
Estratificación de los valores de referenc¡a
Una forma de incrementar 1a homogeneidad de Ios interva-
1os de referencia es realizar distintos subgrupos, teniendo err
cuenta los factores preanalíticos que influyen en éstos. Una
forma sencilla para saber si se necesitan intervalos de referen-
cia partidos en subgrupos consiste en calcular la diferencia de
las medias entre los subgrupos y comprobar si ésta es superior
aI 25% del intervalo de referencia del 95% de1 grupo no sepa-
rado. En caso de que sea así, entonces es conveniente realizar
r,rna partición de 1os grupos.
Por ejemplo, el intervalo de referencia de Ia concentración
sérica de fosfato inorgánico es de 0,74-1,78 mmol/L y el 25o/o
del intervalo es de 0,26 mmol/L. La media para 1os niños es de
1,55 mmol/L y para adultos es de 1,18 mmoi/L v la diferencia
entre éstos es dé O,¡Z mmol/L. Puesto que 0,37 es ma)-or que
0,26, entonces es recomendable 1a estratiiic¡ición del intervaio
de referencia por edades.
Transferencia de intervalos de referencia
Los valores de referenci¿r estái'r deiinrdos por cada laborato-
rio y acompañan a los resultados que transrnite a1 especi:rlista
es asequible para muchos labolatorios lir que hav que disponer
es costoso. Cuando se comienz¡i a trab¿iar coll una nueva mag-
nitud bioquímica o cuando se produce un cambio de metodó,
la mayoría de los laboratorios aciopt¡1 los valores de referencia
establecidos y publicados por otros laboratorios de ref'eren,
cia o por el proveedor del re¿rctivo, No obstante, es necesarlo
comprobar que los nllevos valot'es se ajustan a la población con
que se rraDaJa.
Si el método es el mismo v ios tactores preanalíticos que
influyen en la magnitud son srr.nilares (sexo, raza, edad, pre-
paración del paciente, etc.), se pueden aceptar los valores de
retbrencia de1 laboratorio de t'trigen sin n ingun trabajo adicio-
nal. Esto es un proceso sub.ietir-o r-f ar¡ elitarlo existen unas
guías (como las de 1a IFCC ) pale tr'¡nsterir' lntervalos de refe-
rencia, basándose en estudios más cortos con 20 o 60 indivi-
 Capítulo 5-Valores de referencia e interpretación de resultados analíticos
, .:iores de referencia se han obtenido por métodos
- . -e comparan las medias y las varianza5. que, si
. - -:lclican que ambas poblaciones son iguales y se
,- ,-::.rr los valores de referencia.
:.-..¡. lá cun'a de frecuencia de resultados obtenidos
:- rrn l]orrnal se debería presentar netamente sepa-
- ..:.r a de 1a población enferma, pero es habitual que
. ,i;pa11ti.tr,o entre ambas poblaciones de manera
--.-,¿do analítico de una persona sana se podría
- :rr:ro de la cun'a de 1a población enferma v I'ice-
: I De lo descrito anteri,ormente se deduce cue no
-.-:: -rrnite preciso de separación entre ambas pobla-
' -r.r ¡l1rc hahrá individuos sanos en ios cuales el
.: : .11€ iuera del intervalo c1e referencia (falso oosr-
- , ::rio. habrá individuos enferrlos en los clrales el
.: :-iiLe dentro de1 intervalo de referencia por ser
. : lr normalidad (falso negativo).
.. : r-i¡ntifica una magnitud bioquímica, se pre-
: ..nplo, saber si el resultado permlte incluir a1
. - '-.'o de una poblacion enferma o una población
.,lar un cambio evolutivo sisnificativo o esta-
. -Jida terapeutica implantada está siendo efi-
-.-::d discriminatoria de una magnitud bioquí-
, .:'.,¡iclad de generar resultados distintos en 1a
., '.'en 1a población enferma. Su capacldad dis-
:: -lr\-e rS¿1m€r-rte proporcional al área de solapa-
Situación rdeal: la prueba discrimina entre las
ooblaciones sanas v las enfermas
Concentración
r ento de resultados de una magnitud b oquím ca entre la población norma y la poblac on enferm¿ con presenc a de falsos
=\. '¿ so ^egativo; 'P. f"l.o pos rivo; VP: re'd¿deros pos r .os. V\: vero¿dero. negar vo5.
Re!*eióg: **tr€ p*rss*as s&*:&s
Resultado
Positivo
VP
FP
VP+FP
: ía so posit vo; VN: verdadero negat vo; VP: verdadero posit vo
57
miento entre las dos distribuciones de población sana ,v
enferma: cuanto menos solapadas, más discriminatoria será
la prueba (fig. 5-2). Una prueba de laboratorio ideai para
detectar una enfermedad y con máximo rroder discrimina-
torio sería aqueila en que ios valores obtüidos en la pobla-
ción enferma fueran totalmente diferentes a los valores de
referencia. Es habitual que las curvas de distribución se sola-
pen en parte. Por ello, es necesario establecer un punto de
corte por debajo y por encima de1 cual la probabilidad
de padecer 1a enfermedacl y 1a probabilidad de estar sano sean
conocidas.
Una vez que se ha establecido ei punto de corte, si se cuan-
tifica una magnitud bioquímica en una población sana, es de
esperar que la mayoría de individuos presente un resultado
inferior al punto de corte o negativo (verdaderos negati\¡os,
VN), pero habrá algunos que presenten resultados superiores
al punto de corte o positivos (falsos positivos, FP). Ya se ha
descrito anteriormente que en la propia selección del inten'a1o
de referencia ya aparecen algunos falsos positivos.
De igual modo, si se realiza 1a determinación bioquímica en
un grupo de enfermos, la mayoría de indivicluos producirá
resultados fuera del intervalo de referencia (verdaderos posi-
tivos, VP), pero algunos producirán resultados dentro de ese
intervalo (falsos negativos, FN). Estas posibilidades se pueden
organizar en una tabla 2 x 2 en función de padecer 1a enfer-
medad o no, y en función de si el resultado está dentro o fuera
del intervalo de referencia (tabla 5-1).
La capacidad discriminatoria de la n-ragnitud bioquímica
depende de dos variables, sensibilidad y especificidad diag-
nósticas, parámetros que expresan la czrpacidad discriminato-
ria de la magnitud:
Situación habitual: existe un solapamiento entre
las poblacÍones sanas y enfermas
s
c Enf ermos
o
-
o
VP
FNIFP
Concentración
* snfcrmas:r r*s¡"*itsdca de {"ina !y{a**itud bi*guír:'¡ica
Negativo
FN VP+FN
VN FP+VN
VN+FN VP+FP+VN+FN
 58 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

,¿ >ensibilidad diagnóstica se refiere al porcentaje de per- Además, si ante un resultado bioquímico se obtiene una
enfermas con un resultado fuera del intervalo de refe- posibilidad del 50% de que el individuo esté enfermo o sano,
':::as
:¿ncia. ]Iide la capacidad de clasificar correctamente a una esto es, si la suma de la sensibilidad y la especificidad fuera del
rersona enferma como tai (VP). I00o/o,Ia prueba bioquímica no sería mejor que echar una
La especificidad diagnóstica se refiere a la fracción de per- moneda al aire.
sonas sanas con un resultado dentro del intervalo de refe-
rencia. Mide la capacidad de clasificar correctamente a una
persona sana (VN). l&p$8cmc&wm deX p&Nnto de corte
La eficiencia diagnóstica es el porcentaje de personas cla- ¿e $dx$ dxscXs&$m*s eüínicas
sificadas correctamente con la prueba como enfermas o
sanas. Lo descrito hasta este apartado es válido para determina-
ciones bioquímicas con un resultado dicotómico (sano o nega-
Así pues, se puede escribir como fórmulas: tivo frente a enfermo o positivo). Sin embargo, la mayoría de
variables analíticas son cuantitativas continuas ¡ para deter-
$ VP minar su capacidad discriminatoria, se dicotomiza la variable
Sensibilidad (70) =-x 100 en función de un punto de corte. Lo ideal es poner un punto
VP+FN de corte que clasifique correctamente a todos los enfermos
(sensibilidad = 100%) y a todos los sanos (especificidad =
VN 100%). Esto en Ia práctica no es posible:
Especificidad (%) =-x 100
VN+FP t. Si se sitúa un punto de corte en un valor extremo de la
población enferma, todos los individuos enfermos serán
VN+VP correctamente clasificados como tales, es decir, la sensibi-
Eficiencia (%) = x 100 lidad será muy alta. Sin embargo, muchos individuos sanos
VP+ FP + VN+ FN también serán incorrectamente clasificados como enfer-
mos, por lo que Ia especificidad será baja.
Por ejemplo, se está evaluando una nueva magnitud bioquí- ¿. Si este punto de corte se va desplazando hacia Ia derecha,
mica para diagnosticar una enfermedad. Se realiza un estudio la sensibilidad va disminuyendo v la especificidad va
en el que 85 personas enfermas presentaban resultados posi- aumentando hasta que ésta es márima.
tivos de la magnitud bioquímica (verdadero positivo), pero 18 3. En el caso extremo de que el punto de corte incluya a toda
presentaban un resultado negativo (falso negativo). En cambio, la población sana, la especificidad será máxima, pero la sen-
de 110 personas sanas, 101 presentaban un resultado negativo sibilidad será mínima, esto es, toda la población sana estará
(verdadero negativo) y 9, un resultado positivo (falso positivo; correctamente clasificada como tai, pero mucha población
tabla 5-2): enferma estará incorrectamente clasficada como sana.

l. La sensibilidad es el porcentaje de enfermos correctamente Aparte de ello, algunas enfermedades evolucionan de forma
clasificados con el método: asintomática y progresiva a 1o largo del tiempo, por lo que no
existe una clara separación entre el estado sano y el enfermo.
Sensibilidad (%) = 100 x (85/103) = 82,5o/o Éste sería el caso de la arteriosclerosis, que se va desarrollando
de modo insidioso durante muchos años.
2. La especificidad es el porcentaje de personas sanas correc- La elección del punto de corte puede depender de las impli-
tamente clasificadas: caciones clínicas por el uso que se le va a dar al análisis. En
función del punto de corte. :e sitúa la sensibilidad y la especi-
Especificidad (%) = 100 x (101/110) =91,8o/o ficidad diagnósticas, esto es. la et-icacia diagnóstica. Teniendo
en cuenta esto, se pueden establecer diversos puntos de corte
3. La eficiencia será el porcentaje de personas correctamente para disrintas situ;cior-es ;li¡icas si se quieré minimizar un
clasificadas: tipo de error en los resuhados ttig. 5-3).
Interesa una alta
=nsibilidad cuando se desea detectar el
Eficiencia (%) = 100 x [(85 + r0l)12r3) = 87,3o/o máximo número de Dersonas enfermas (muchos verdaderos
positit'os r poúLrs talstrs a€atir-os). Un ejemplo es un test en
un cribado neo:r¿ti ¡ara prer-enir una enfermedad grave que
tiene tratamienio. po: io que es recomendable aplicar pruebas
Tabla 5-2. Distribución de resultados de una o grupos de prueba-< qu€ presenten alta sensibilidad diagnós-
prueba en función del estado de salud tica aunque ie¿ ¿ .ssta de un número significativo de falsos
......
Resultado positiros qü¿ rec:¡en:arl pruebas posteriores, más específicas,
Total para coni-ir-r¿: h. eristencia de enfermedad. En este caso, no
Positívo Negativo
ie puede" ¿reFi¿: rei¡útados con falsos negativos ya que impli-
Enfermo 85 18 103 caria cue el :::.. ¡*¿¡rolle la enfermedad. También es impor-
Sano 9 101 110 tante u::¿.ie¡¿c¿ sensibüdad en la detección de enfermedides
serlas- ;..=,¡ ¡¡ -a:¡tilización de la troponina I en el diagnós-
Tota I 94 119 ¿t5
ti¡o ¡¿: :::¡::¡ ie miwardio, en la cual un falso negativo puede
se: :::¡::i :.r¿ el paciente. Puede ser interesante una elevada
 Capítulo 5-Valores de referencia e interpretación de resultados analÍticos 59

Elevada sensibilidad Elevada especificidad

ñ
jt Punto Punto
.o
co l\ l,y de corte
mos
,a
c
ji
i!
.:!
de corte

lr
@
f
i f
J:
I

o
r J
f,/ l, /
0 j:
i Sanos ! .A

t
Pocos falsos negativos Pocos falsos positivos
:.:-ra 5-3. Ajuste de unos valores de referencia para una elevada sensibilidad (mayoría de enfermos detectados) o una elevada especificidad
*;-,,,:': Ce individuos sanos descartados).

,c-:bilidad si el diagnóstico y el tratamiento no afectan seria-
rrc::e al paciente, como la hipertrigliceridemia suave, que se
rr;e¡e tratar dietéticamente.
l:;ambio, interesa una alta especificidad si se acepta excluir
s :¿1or número de personas sanas (muchos verdaderos nega-
:Íil:s 1 pocos falsos positivos). Así, interesa una elevada espe-
-:r:rci¿ad en el caso de una prueba que prediga una enfermedad
$L--::able y en el caso en que un excesivo número de falsos
rr:$.::los introduciría incertidumbre y preocupación en una
n:r'L¿;ión que no desarrollaría finalmente esa enfermedad.
, t¿ situación sería aquella en que el tratamiento causara una
-c-,-¿da morbilidad sin gran eficacia, como ocurre con algu-
T{t5 :::mores.
\o-nalmente, en las pruebas de detección de una enferme-
r;i.u s
busca un punto de corte para obtener una elevada sensi-
niiic¿d mientras que las pruebas confirmatorias, además de una
¡r.le:¿ sensibilidad, han de tener una elevada especificidad, que
r:cjf€rse los falsos positivos de la prueba de detección.
I * rvas Rt]fl
: r:ste una relación inversa entre la sensibilidad y Ia especi-
'i":a¿'l diagnósticas, yla capacidad discriminatoria
nitud bioquímica depende del punto de corte seleccionado.
Esta relación se expresa gráficamente con las curvas ROC (del
inglés, receiver operating characteristics). La curva ROC es un
método gráfico que muestra la capacidad discriminatoria de
un test diagnóstico para distinguir dos poblaciones. Tal y como
se presenta en la figura 5-4,para cada valor de concentración
que se elige como posible punto de corte existe determinada
sensibilidad y determinada especificidad. La representación de
éstas produce una curva ROC. Dicha curva es un gráfico de la
sensibilidad (verdadero positivo) frente a 1 especificidad (falso
positivo) en los diferentes puntos de corte de la magnitud bio-
química que diferencia a los enfermos de los sanos. El punto
de la curva que más se aproxima al extremo superior izquierda
corresponde al punto de corte con mejor eficiencia del test.
Para evaluar Ia capacidad discriminatoria de un parámetro,
se suele resumir la información de Ia curva ROC en el área bajo
la curva. En la figura 5-5 se muestran tres curvas ROC de tres
magnitudes bioquímicas para el diagnóstico de una enferme-
dad. Si la curva coincide con la diagonal, el valor diagnóstico
del test es nulo (test C en la fig. 5-5). Cuanto más se desplaza
la curva hacia arriba y hacia la izquierda, mejor es el test (test
A). La capacidad discriminatoria depende de cómo el test se-
para a aquellos individuos con y sin enfermedad. Cuanto
de Ia mag- más se aproxime el área bajo Ia curva a 1, mejor será el test. Si

Mejor relación
sensi bi lidad-especif icidad

Conc. Esp. 1 - esp. Sen.

0 1
0,15
2 0,2 0,8 oa .-o
ja
€ 0,50
B 0,9 0,1 0,3 c
O

15 nq 0,1 n?q
0,25
20 oq5 0.05 0,1

30 1 0

0,25 0,50 0,7 s

1- Especificidad
;61-13 !-{. Curva ROC de una magnitud bioquímica
 60 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

entre individuos sanos y enfermos. Esto permite r-alorar el inte-

rés de un parámetro analítico para efectuar un diagnóstico.
Sin embargo, en Ia práctica, lo que se desea conocer en un
paciente concreto, ante un resultado analítico, es la probabili-
o7( dad que éste tiene de padecer la enfermedad cuando el resul-
tado es positivo y de que no la padezca cuando el resultado es
c
a negativo. Estas probabilidades se denominan valor predictivo
p
positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN):
C
'::::: o
,i:iat,,,'
i..ut:i
1. El valor predictivo positivo es la fracción de positivos cier-
rt:t:ll: .
tos del total de resultados positivos (VPP = VP/IVP +
4,25 FP]).
*Test B 2. El valor predictivo negativo es la probabilidad de estar sano
C si el resultado de Ia prueba ha sido negativo, es decir, Ia
0 -Test fracción de sanos en el total de resultados negativos (VPN
0 0,25 0,s0 0,75 1 = VN/IFN + VN]).
1 - Especificidad
Podemos observar que pasamos a leer verticalmente la tabla
Figura 5-5. Selección de la eficiencia de un test en función del área bajo
que habíamos leído horizontalmente para obtener Ia sensibi-
la curva de una representación ROC. El test A es el más eficaz mientras
que el C no tiene utilidad alguna.
lidad y la especificidad del procedimiento, y así conocer la pro-
babilidad de enfermedad al disponer de un resultado analítico
Itabla 5-3).

está entre 0,8 y 0,9, el test es bueno; si está entre 0,7 y 0,8, nor-
mal, y si está entre 0,6y 0,7, pobre. Entre 0,6 y 0,5, la capacidad
discriminatoria es nula. Existen paquetes estadísticos que pro-
Valor pred¡ct¡vo y prevalenc¡a
porclonan el área bajo la curva de la magnitud estudiada con de la enfermedad
todos los posibles puntos de corte de la variable junto con su
En el caso presentado anteriormente se ha estudiado una
sensibilidad y especificidad. Esto permite elegir aquel que
población en que la mitad de las personas estaban sanas y la
mejor eficiencia diagnóstica proporciona.
mitad, enfermas. No obstante, en la práctica clínica diaria
E1 índice de Youden también se usa como medida resumen
Ia mayoría de las personas no tienen la enfermedad aunque pue-
de las curvas ROC. Así, mide la eficacia de un marcador diag-
dan presentar síntomas próximos. Redefinamos el ejemplo ante-
nóstico ,v permite la selección del punto de corte óptimo. Este
rior, considerando que la población sana es 100 veces superior.
indice se define como:
Tal y como se puede apreciar en la tabla 5-4, el incremento de la
población sana no afecta ni la sensibllidad ni la especificidad,
T = :ensibüdad + especificidad - i = sensibilidad - (1 - especificidad)
pero disminuye el valor predictivo positivo unas 10 veces.
La prevalencia de una enfermedad es la frecuencia de ésta
',- sus r-alores varían entre 0 y 1. La separación completa en
..r uná población determinada. El efecto de la prevalencia en
l¿ drstrib,ucion de1 marcador para enfermedad y población sana
el valor predictivo positivo es importante porque, si se restrin-
ia :n :nci¡e de Youden = 1 y, si hay solapamiento completo,
ge el uso de un anáiisis a la población que presenta ciertos ante-
e.:e es lS-a1 a [). Una r-entaja importante del índice de Youden
cedentes, factores de rlesgo o síntomas de la enfermedad, se
-renre :- :i¡¿ 5¿'o ia cu¡r'a es el hecho de que permite elegir el está aumentando la prevalencia en el grupo que debe estudiarse
,-- i. -'-
- -'i¡n r

y mejora notablemente el valor predictir-o positivo.

Antes de realizar una prueba diagnóstica, Ia probabilidad
de padecer una enfermedad para un paciente es ia prevalencia
en la población, que es la llamada probabilldad preprueba o
..:.¡:ii;idad dan idea de la capacidad probabilidad a priori, En cambio. la probabilidad de que un
discrim:r¿: - ..-:: ..-u r l_;^_,,;_i-^ -ara
L,lU9U1rl1rL4yr diferenciar paciente no presente una enfermedad es 1- prevalencia. Según

Tabla 5-3 Relación entre personas sanas o enfermasy,icálculo del valor predictivo positivo {VF,PI
y negat¡vo (VPf{} ',i'r, i,,

kiü¡do
FtEre d üill:r* D€ntro del intervalo Total
de refcr.wi¡ de referencia
Enfermo S=VP/(VP+FN)
Sa no FP .\ E=VN/(FP+VN)
vrr = ¡ ,lñr = ,'t |trN + VN) Prevalencia = (VP + FN)i(VP + FN + FP + VN)
FN: falso negativo; FP q r$íú¡ fi T+!¡É. r( ¡ - ;;:¡-: ::! - ,:
 Capítulo 5-Valores de referencia e interpretación de resultados analíticos 61

Resultado
Positivo Negativo
85 18 ( - a) qo./-
ffiiriamm

h 9 101 E = 91,8o/o

VPP = 90% VPN = 84,8%

Snsana del caso anterior x lOO

m¡numrp 85 18 S = 82,50/o
1 0.1 00 E = 91,8o/o

VPP = 8,6% vPN = 99,8%

$r ng$t¡,l-r:¿do de la prueba diagnóstica se pueden obtener dos
wnruLf,¡uios:
i -¿:rueba diagnóstica tiene un resultado positivo de Ia
s;b---:nedad, el paciente pasará a tener una probabilidad
ca *rermedad posprueba (probabilidad o posteriori o pro-
n¡¡rudad condicionada) que está expresada por el VPP y
*Lr:robabilidad de estar sano es de 1 - VPP.
: i d :esultado es negativo, la probabilidad posprueba de estar
iiii¡L:r' :€na el VPN y la probabilidad de padecer la enferme-
i,r.: ¿ prg5¿¡ de tener un resultado negativo es 1 - VPN.
Empleando el teorema de Bayes, se calculan el valor predic-
tivo positivo y el valor predictivo negativoa partir de la pre-
valencia de la enfermedad, la sensibilidad y la especificidad,
tal y como se aprecia en la tabla 5-5.
Ante un resultado positivo de una prueba diagnóstica,
obsérvese en la tabla 5-6 cómo varíala probabilidad de pade-
cer la enfermedad (VPP) o de estar sano (1-VPP) en función
de la prevalencia de Ia enfermedad, manteniendo la sensibi-
lidad (87oA) y la especificidad (95%). Con una prevalencia de
Ia enfermedad elevada, del2Qo/o, un resultado positivo indica
que es muy probable (81%) que el individuo esté enfermo. Sin

Resultado
Positivo Negativo
emfierrr€ Sensibilidad x prevalencia Prevalencia x (1 -sensibilidad) Preva lencia

'hm (1 - especificidad) x (1 - prevalencia) Especificidad x (1 - prevalencia) 'l- prevaléncia

Sensibilidad x orevalencia
rüpD lr'o)- x 100
(sensibilidad x prevalencia) + [(1 - especificidad) x (1 - prevalencia)]

Especificidad x (1 - prevalencia)
um (96) =
[prevalencia x (1 - sensibilidad)] + lespecificidad x (1 - prevalencia)]

Probabilidad de enfermedad Probabilidad de salud

Falencia de la enfermedad VPP (o/o) VPN (o/o)
tf 81,3
ql 65,9 qR5
qq?
t35 47,B

0,or 1/tq ooq

qq qq
r,ñ1 1,7
 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

embargo, con una prevalencia de ia enfermedad del 0,lo/o,Ia
probabilidad de enfermedad es muybaja, de sólo ell,7o/o.Muy
probablemente, el resultado que está señalando enfermedad
sea en realidad un falso positivo. Así pues, el valor predictivo
positivo de una magnitud diagnóstica será mayor si la pre-
valencia de la enfermedad es alta que si es baja. Sin embaigo,
si la prevalencia de la enfermedad es muy baja, un resultaáo
negativo ayuda a descartar la enfermedad. En el caso de la
prevalencia de la enfermedad del 0,1%, un resultado negativo
del test sugiere casi con total seguridad que el individlo no
padece la enfermedad.
El hecho de que muchas veces la prevalencia de una enfer-
medad varíe en función de la pobiación estudiada condiciona
la utllidad clínica de la magnitud bioquímica empieada. Esto
es especialmente importante cuando se quiere trasladar el uso
de una magnitud bioquímica desde un trábaio de investigación
a una población general.
,:t, ;'! &*,,€rs? i x tr*
,,; i:l't¡r¡:'v&i* ** l'*f*r*nii*
Si se analiza repetidamente un analito en un individuo sano
a Io largo de varias semanas, se observa que existe un intervalo
de concentraciones alrededor de un valór o punto homeostá-
tico. Las concentraciones obtenidas sucesivámente se sitúan,
en su mayoría o todas, dentro del intervalo de referencia y la
variación biológica intraindividuai (CV,) es menor que
1a variación entre diferentes personas (CV., la variabilidad bio-
lógica interindividuai; fig. 5-6). Para algunos analitos, el inter-
valo es estrecho mientras que para otros es muy amplio. Ello
significa que los resuitados obtenidos en cada uno de los indi-
viduos ocupan distintos intervalos dentro del intervalo de refe-
rercia. De esta forma, un resultado que para algunos pacientes
-::i;a enfermedad puede estar dentro del intervalo de refe-
:::.--¿. .on 1o que, en este caso, éste tiene una utilidad limitada.
, .:--:-en ouede ocurrir que, si Ia variación intraindividual se
: : -: .: ¡- ertremo del intervalo de referencia, resultados repe-
: : :: -:s determinaciones del analito pueden situarse unas
: -:: r:rirtr del intervalo de referenciá y otras veces fuera
- - __ - a:t lls r-6).
:r - , :.: -,:¿::¿lidad se puede expresar de forma matemá-
r - -: üc individualidad
Esta forma simplificada es .Lr--;:¿ s- Cr,-.. la r-ariabilidad
analítica, es menor que C\-.. que s_r-; i!¡_i-::: .on la mayoría
de los analitos si se emplean lo_.
=e:¡*j¡. ce redida actuales.
Cuando el índice de indir-írlu¿-ic:¿ e . ¿-erado. entonces la
magnitud bioiógica tiene poca:::c--;:i::-r-:iaC v tiene utilidad
para comparar los resultados de -¿ ¡..::;¡:::acion del analito
con el intervalo de referencia- S: ¿. ::-¿:;r ¿¿ indir-idualidad es
menor de 0,6, la magnitud biocu:;r::.: ::-:rÉ gran indir.iduali-
dad y et intervalo de ret-erenci¿ .s :\i.
=.=il. para detectar
los cambios grandes para el ;.;,..-:: i-.r.l jc se bcultan en ia
dispersión del intervalo de rer!r::¡:-r-
Obsérvese los ejemplos:
I. srm-Tiroxina C\- :4.9: Ci- . - , -> E- :::dice de individuali-
dad es de 4,9110,9 = 0.+--. ¡*.: .¡ c *e ;anbios en Ia concen-
tración con significadLr ir¿t!.-L,S:;u,|. ueden estar ocultos por
[a amplitud del inten-¿.ü :- :::i:.]:J:¿.
2. srm-Hierro C\-:16.:: Ci- " l_r,1. :- r:dice de individualidad
es de26,5123,2 = 1.1-1. ;.-: -¡ ;-* e- rnten-alo de referencia
: :¡gá i c{*d*:p * tiene utilidad para,i.et;--::: :..:-;::l¡a¡iones inusuales.
Una forma de inte::¿: e-'::.:^: -s:e :l:rrfl¿¡¡¿ consiste en hacer
grupos de poblacit n ::¿: :ti::ras-ret¡: de tbrma que ia varia-
bilidad sea más pec-;:.=
:,r, tí;
Halco:!:¿i:¿: a"-. a:: -Lrs resultados de todos ios pará-
que
metros ana,:::;u'. r¡:s:r ;-e::¿ r-ariabilidad debido a la varia-
bilidad bioloi:¿ -:-::¿::i:r:¿l¿1. a la r-ariabilidad preanalítica
y a los la;rr:..::..--::-;.. C:¿nJo se estandariza Ia fase prea-
nalitica, como la preparación del paciente y la obtención y
manejo del espécimen, entonces la variabilidad de ésta es
mínima. Por tanto, la variación total (CV,) se puede escribir
matemáticamente como:
CVr=(CVo2+CVr2)'/2
Considerar estos factores que influyen en la concentración
es importante para saber si la diferencia entre ios resultados es
signiticativa cuando a un paciente se le realizan determina-
ciones seriadas de una magnitud bioquímica con un intervalo
de tiempo de semanas o meses. Para que dos resultados con-
secutivos sean significativamente diferentes, la diferencia
= CV i CVc numérica entre ellos debe ser superior a la variación total o a

Magnitud bioquímica A Magnitud bioquímica B

cVr cVr
flil
t
-i=l¡ñ!*:

ffi¡--*:
llfrúll illúlf,r¡i -: #ll
ü[
Algunas repeticiones se
,Ir
lllilrilll|l]llil $tr¡liü : e'}f¿e¡ pueden situar fuera del ul

intervalo de referencia lli

íil]111il1Í11ltrÍliÍlllluuilt w{**8sw@ l l|l

rlf

t
Intervalo de referencia
: I llil1riilllllllllffitrjll Ililt :1ll - r;1"
- :-¿ :r ii':i-:lÉ-:=- :s interv¿los de concentraciones de 4 indivrduos en relación con el
f
liü
- , I llllllr lfiüiliirffir', ,, ,, { ]t'r ,
-- i É€ ir: -: , :-¿ridad mientras que la de la derecha tiene una baja individualidad. ü
llt
 Capítulo 5-Valores de referencia e interpretación de resultados analíticos

Método B Puesto que eI 167,70/o es mayor que el cambio de 47,60/o,

entonces se puede afirmar que no hay diferencia significativa-
mente estadística entre 2,1 ¡t"glLy 3,1 ptglL.
Para determinar la probabilidad de que un cambio sea sig-
nificativo, se despeja la Z de Ia ecuación y se comprueba la
Tiempo
probabilidad en unas tablas de estadística. En el caso anterior,
serÍa:
::.::rtración Concentración
(lll , I :' -=:-:ados sucesivos son diferentes si la diferencia entre Z: 47,6112t/2 x (72 + 18,12)1/,1
* -"".1:
' :" . : "arj¿ción total. Se indica el resultado y el intervalo
1iI r,. " ': -;: -¿on tLrdes b oourmicas medldas en dos ocasiones Si se despeja IaZ, es igual a 0,61. Se consuitan las tablas de
rl ' : -:-:- -:s métodos. El cambio con el método A es signifi- estadística y la probabilidad de que el cambio sea significativo
'r, :-= :l'r el B no lo es. para esa Z es deI73o/o.
Ejemplo 2. Para el colesterol, el CV, es del 5,4o/o. Por tanto,
para una CVo del 2Vo, elvalor de referencia del cambio es del
,lr, L l¡-r :¿:: propia de los dos resultados (fig.5-7). La dife- 17,5o/o, pero si la imprecisión analítica aumenta mucho y CVo
¡rril.:ü -r-:r-¿ -r \-alor de referencia del cambio es el cambio en es del 10%, entonces el valor de referencia del cambio aumenta
ilr ,r j]-:L..1:::i-:"rn de analito requerido para que adquiera sig- hasta el 32,3o/o.
r;ü-ü : :- -:l-L-). teniendo en cuenta la variabilidad total (bio- Ejemplo 3. Se ha calculado que para que la variación en el
Lrrr!,lt"ril;Jü i i.-¡-:::ca). Se calcula como: marcador del metabolismo de colágeno p crosslaps sea signi-
ficativa (cambio mínimo significativo) debe ser del 35-55o/o.
iiir.r,rr :c :::erencia de1 cambio - 2tt2 x Zx CY:' = 2tt2 xZx Una mujer osteoporótica acude por primera vez a consulta y
(CVo, + CV r2)1t2 los niveles de B crosslaps son de 500 ng/L. Tras 3 meses de tera-
pia antirresortiva, los niveles descienden a 300 ng/L. ¿Es sig-
turlr¡utur I :- :-::mero de desviaciones estándar para la probabili- nificativo el cambio?
riiü[Lrs rliq -L¿::]€: ¿1 r-alor en ese intervalo (significativo: 1,64 unidi- El porcentaje de cambio respecto al valor inicial es (500 -
'r,r,,*::ruir"r'i* ,
-.96 bidireccional para p = 95oA). Por ello, para que 300) x 100/500=40o/o.
rnrjrlr:JLrrsi.i:- :¿nbios en un analito sean significativos,
es necesa- Se observa un cambio deI 40o/o, por io que la respuesta al
1r ::r:T1.::,-:¿r al máximo todas las posibles fuentes de variación. tratamiento es satisfactoria. Si tras el tratamiento la concen-
rr
!n* frir J-É t-\- se puede asumir como constante, disminuyendo tración de $ crosslaps hubiera sido de 400 pgiml, el cambio
lu ru-*:r: r ¿nalítica, se aumenta la probabilidad de que el cam- hubiera sido (500 - 400) x 100/500 = 20o/o, por 1o que Ia res-
Iilr lrri:-j ::s resultados sucesivos sean significativos. puesta al tratamiento no hubiera sido satisfactoria.
r r!ü:,i¿: jeterminaciones de magnitudes bioquímicas se rea-
1,,,ü.T :,j :¡:ma seriada a lo largo de la enfermedad de un
'r rL-itriTrlj ::ra comprobar su evolución, por lo que el laborato-
"{ id¡:i.:--i :ntbrmar sobre cuál es el cambio mínimo signifi-
,,itiirl l i I :i!::
;ada analito. En cualquier caso, hay que tener en
.l:-udrTt:i.i. :
--. aunque un cambio no sea estadísticamente signi- Hasta este apartado se ha revisado la situación más simple
il.r-r:,i r : :;, significa que no sea clínicamente relevante. en la cual los individuos se sitúan en el grupo de sanos o enfer-
- i i,lares de CV, se pueden obtener de tablas publicadas mos según el resultado de un test. Sin embargo, es frecuente
1r , ¿,.: ¿e CV, se obtiene del propio control de calidad que se solicite la determinación de varias magnitudes bioquí-
:: i:-r,i !.i :lust¡a la utilización de estos conceptos con varios micas en la misma muestra. Si no existe correlación entre estos
tr""rn[-j ,- i resultados en la misma muestra y siguen una distribución gaus-
siana, debido al azar estrictamente, la probabilidad de que, al
- :-::io
l. El antígeno prostático específico (PSA) se emplea menos, uno de ellos salga fuera del intervalo de referencia es
:: .: s ;hequeos como un parámetro de diagnóstico precoz del de 0,05 ya que, tal y como se ha descrito anteriormente, cuando
-¿*-:er de próstata. Un paciente en una revisión presenta un se realiza una única determinación, el intervalo de referencia
l'j.-- ¿e 2,1 u,glL y al año siguiente de 3,1 ¡"LglL. ¿Realmente el excluye al 5o/o de los individuos de referencia con resultados
-; ::--:o es significativo? extremos. Esta probabilidad aumenta a 0,23 cuando son cinco
:- ;ambio de la concentración de PSA sería: Ias magnitudes bioquímicas analizadas y es casi del 0,5 con
trece determinaciones. El problema es mucho mayor cuando
(3,r - 2,r) x r00I2,1= 47,60/o existen correiaciones entre las variables y las distribuciones no
son gaussianas. En definitiva, realízar baterías de análisis de
:- C\'{ se obtiene del control de calidad interno del autoa- manera general puede conducir a gran número de falsos posi-
: o--¿ador y es delTo/o. tivos, con el consecuente encarecimiento del proceso y Ia po-
:- CYr consultado en la página web de Westgard es del sibilidad de errores interpretativos.
i -
r'¡.
Un perfil analítico estáionstituido pol pruebas que se solici-
:- r-alor de referencia del cambio para un intervalo de con- tan conjuntamente, en general aunando la distinta información
' :.--:¿ del 95oo lZ = i,64) sería: que proporcionan las magnitudes bioquímicas. Se aplica, así, el
mismo paquete analítico a muchos pacientes. Tiene ia ventaja de
'"-:-rrr
de referencia del cambio - 2tt2 x 1,64 x (7')+ 18,12)1/2 que implica la estandarización de los paquetes analíticos y Ia
= 167,70/o comodidad en ia solicitud para el especialista clínico. Desde el
64 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Tirotropina

Dentro del intervalo Fuera del intervalo

de referencia A^ -^+^"^^-t^

Dentro del intervalo Fuera del inlervalo

A^ "^+^"^^-i- A^ "^+^"^^-i-

iI
Sano Alteraciór"tiroidea Alteración tiroidea
clínica
Figura 5-8. Ejemplo de algoritmo de pruebas de la función tiroidea.

punto de vista económico, también puede ser ventajoso. Sin diabetes u obesidad) y a las embarazadas sin factores de
embargo, hay que recordar que, desde el punto de vista analítico, riesgo en las semanas 24-28 de embarazo. Inicialmente se
no se mejora la capacidad diagnóstica de los tests ya que, mate- realizaría una sobrecarga oral con 50 g de giucosa (test de
máticamente, de cada 20 análisis uno estará fuera del intervalo O'Sullivan). Ante un valor de glucosa después de t h inferior
de referencia en un paciente sano. a 140 mgldL, se descarta la diabetes gestacional. Si el resul-
Un algoritmo consiste en la solicitud de unas pruebas analí- tado es patológico, se realiza una prueba diagnóstica con una
ticas en primera instancia y comporta que Iarealizacíónde prue- sobrecarga oral de 100 g de glucosa. Éste permite descartar
bas subsiguientes está condicionada al resultado de las reaiizadas o confirmar la diabetes. Si se coni-irma la diabetes gestacio-
previamente, pues se obtiene una estructura en árbol con las nal, se deberá realizar una sobreca¡ga oral de glucosa con
actuaciones sobre el paciente. No requiere, por tanto, larealiza- 75 g a los 2 meses del parto o finaljzación de la lactancia.
ción inicial de todos los análisis. Esta aplicación en serie mejora
la capacidad de las pruebas de confirmar o excluir Ia existencia En las guías clínicas se sueie: i::;orporar estos algoritmos
de enfermedad. Hay que tener en cuenta que estos algorit- como parte del proceso p¿r¿ r:e:rrr¿r la práctica clínica. Las
mos de pruebas de laboratorio sólo son adecuados para el guías son resultado de estudios :e¿-izados con pacientes y de
grupo de pacientes sobre los cuales fueron diseñados y no valen revisiones sistemáticas r- n:.ei¿¿r¿lisir de lo publicado. Estas
para todas 1as poblaciones. Sin embargo, en numerosos algo- guías implican directarne::¿ r' es¡e;allsta de laboratorio en las
ritmos no hay una ciara estandarización. decisiones del proceso de- :a--:i::e -{.Jemas, existen guías espe-
Según el tipo de espécimen sobre el cual se realice, los algo- cíficas para asuntos ;oi;e:l¡e:-:e¡
¿l laboratorio. Evidente-
ritmos pueden ser de dos tipos: mente, en muchas o"-.Lir¡i:€s s-: ¿:i¡.-¿.ión puede depender de
aspectos organizati;¿,i ¡¿ ,,:,s :-.,*¡.los analíticos propuestos,
1. Las determinaciones añadidas en función del resultado ini- l^ l^-
UC la: -^-;L:l;-¡-
C(r:lL)L-üduc>
-l-,.-----
-i--r:=i:-Lj'*\ e:J-
cial se realizan sobre el mismo espécimen. Suelen ser rápidas
y con una suficiente organización de laboratorio comportan
una gran ventaja por ahorro de información y económico. Lh --: :3^algs
ejemplo de ello es el algoritmo de la figura 5-8 de determina- :i::! i:rf:; rrñlúli Frx[:€:ú ]r*.nibleen:
ciones de hormonas tiroideas (tiroxina y triyodotironina) en i-r-tu $-!¿-: a,u-'¡nlcan¿u'u - :c-
M

función de la concentración de tirotropina inicial. Este eiem- I' e-s:,; : : Lrr:lgÉ ft ¿ k:rt ¡ r -aia (traducción oor la
plo se desarrollará en el capítulo correspondiente. : :¿ ,¿1ru --rür.ü vi,iirl-a: ::cedad Española de Bioouímica
! u : r':€- iltlre;lre lllj::
2. Las determinaciones añadidas en función del resultado ini-
r ¿. ls.m¡{" i.üia:¡.ll'fnnS ¡n"- -,i=mg Reference Intervals in the
cial se realizan sobre un espécimen diferente. Tienen la des-
-tr;rurr rdwm,s! -uu,ruirne -:'edición. CLSI IFCC document
ventaja respecto a las anteiiores de que pueden implicar un --mla -"¡nn:rmrr iuimoa: ¡-qr-:e- 1008.
retraso en la obtención de la información. Además, conlleva I : !:es I,- :m¡i¡rrci,urom n ;nr"n¡on- medicine: new challences
a-:¿ l¡la r--': ..:
mayor complejidad organizafiva.lJn ejemplo de algoritmo
; -rgr rurg m trrfigtü ir¿tion: pros, cons and progress
sería el diagnóstico de Ia diabetes gestacional que se debe '.-.ir _¡l mror ,1W, 3f rÉ¡-_l:l:-
realizar a todas las mujeres con factores de riesgo (edad supe- :-:c',m':u :¿ irm liitr"- o lmrm€¡a -\Iolecular. Disponible en:
rior a 35 años y con antecedentes personaies o familiares de tu-M-U-*fr5-
 capítulo 6

Gestién del laboratorio clínico

v control de calidad

ü¡{ DrcE DEL cAPÍrulo

Calidad analítica 65 Organización del laboratorio 75
l:-:'¡ de calidad 66 Proceso analítico 75
6arantía o aseguramiento de la calidad 69 Gestión por orocesos 76
Gestión de la calidad 70 Gestión por objetivos 76
Sistemas de calidad 71 Gestión por competencias 76
1 :,:: cs normativos 71 Gestión económica 78
-¡,1: :i no normativos 72 Sistemas de información 79
Co¡rstitución y apertura del laboratorio 73 Producción 79
ü-egislación 74 Referenciasadicionales 80

procesos que se lleven a cabo para conseguirios se les llama

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE calidad.
. lt- rir e concepto de error sistemático y aleatorio. Es esencial valorar de forma objetiva la calidad de un método
r :: r iár' en qué consiste el control de calidad analítico analítico ya que los datos obtenidos van a influir en decisiones
- -:"1o. clínicas. Probablemente, las dos características metrológicas más
¡ I -='enc ar garantía de la calidad de gestión de la calidad. importantes son la precisión y la exactitud (fig. 6-1), que se rela-
cionan con el error aleatorio y sistemático, respectivamente:
' ,::^:;f icar los distintos sistemas de calidad aplicables
:s laboratorios clínicos,
r :::rrocer los principios normativos que afectan a la L Precisión metrológica: se refiere al hecho de que, cuando se
realizan repeticiones sucesivas de una determinación, éstas
=- , dad de ios laboratorios. han de proporcionar resultados similares. Se valora con pará-
. ,. i'at los distintos modelos de organización basados
metros estadísticos de dispersión, como Ia desviación están-
: - :'ocesos, objetivos y competencias.
dar (DE) de las repeticiones y el coeficiente de variación (CV),
r l:^ccer las bases para la gestión económica del laboratorio
ypermite llevar a cabo una estimación del grado de error alea-
. i='¿lar las ventaias oue of recen los sistemas de información torio que se está introduciendo en un resultado concreto.
::'a 1a gestión. 2. Exactitud metrológica: se refiere al hecho de que, cuando
, l:':'ibir el proceso analítico. se realiza una determinación de una magnitud bioquímica,
ésta ha de proporcionar un resultado lo más próximo al
valor real. Se utilizan parámetros estadísticos, como la
media, la diferencia absoluta entre el valor obtenido y el
:::: ii:it ia l,t;l ri.:.|1 valor real o su valor relativo resoecto a este úitimo. Se cuan-
tifica así el error sistemático ó alejamiento del resultado
- :; :¿sultados analíticos obtenidos en un laboratorio clínico obtenido respecto al valor verdadero.
, -. :¿ ser fiables, reproducibles y deben satisfacer las necesi-
:: : : or las cuales fueron solicitados. Por tanto, hay que ase- Por ejemplo, al repetir Ia determinación de glucosa plasmá-
'::= que éstos sean válidos ya que puede afectar notabie- tica en un control, cuya concentración media estimada es de
:r:: ¿ su interpretación. A este conjunto de requisitos que 6,2 mmoIlL, se obtuvieron los siguientes resultados (mmol/L):
:':- :ener los resultados analíticos y a la adecuación de los 7,1; 7,1; 6,9: 7,1; 6,9; 7,2; 7,0; 7,2; 6,8, y 7,0.
66 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

lmprectso Preciso y exacto

Inexacto
Error sistemátlco Error aleatoro

Precis ón y exactttud.

Aplicando las fórmulas estadísticas básicas, 1a media de las
determinaciones fue de Z0 mmol/L, la DE 0,13 mmol/L y el
CV, 1,9%. Esto indica una precisión aceptable, inferior a los
1ímites establecidos por la American Diabetes Association' Sin
embargo, la diferencia relativa entre el valor real y e1 obtenido
cr¡ del l2uu, lo quc indicl una birja exactittLd.
Control de calidad
:. ,.:Lr del control de calid¿rcl analítica en los laboratorios
- i c'Stá orientado al cr,rmplimiento de los requisitos de 1a
. :r¡ra el1o en:rplea herranlientrts est¡distic¡rs qLle tratan
.:lrrs de nluestr¿rs control para valorar la ineractitud
-.:-!rn cle ur-r método analíticcl. Existel-r dos tipos tle
, -. -j.¡cl:
,il interno. Emplea material cuya concen-
--.1a r- se et'a1úa con una frecuencia, al
:rf iir de los resultados se toman decisio-
--:.; -i¡s resultados anaiíticos obtenidos en
. --.-.- ld11teS.
.'. "'.';. En.rplea material cLlya concen-
: -: i¡tirlllitla en intern'alos mucho
.,: .t:-isiones no se toman Y aPli-
.'.,:.:ir ¡le los result¿rdos.
eI 95o/o de los resuitados del control, por 1o que e1 5% de los
resultados válidos no entran dentro de estos lírnltes. Incluso
si se reanaliza el control, entonces posiblemente el nuel'o
resultado entraría dentro de1 intervalo de aceptación. Si se
tiene en cuenta esta norma como de rechazo, entonces no
se admitirían 1os resuitados de una serie analítica una vez de
cada 20. Además, si se emplean dos controles, existe el 10%
de probabilidad de que alguno de ellos salga fuera del lími-
te de 2 DE. Ello incrementa de forma innecesaria el núme-
ro de determinaciones y el tiempo de espera de los resulta-
dos. Un criterio de rechazo de la serie an¿rlítica sería si e1
v¿rlor de control se desvía más de 3 DE (1..) del valor esti
mado ya que 1a probabilidad de que el control no sea válido
es mayor del 99%.
Análisís gráfico del control de calidad
Uira forma fácil de evaluar los controles de calidad es
medi¿rnte métodos gráficos que muestren los sucesivos resul-
tados del control de calidad en relación con Llna media y DE.
Una ventaja de los métodos gráficos es el hecho de que son
rápidos de interpretar y. en collsectlencia' se pueden tomar
decisiones de forma inmediata. Existen diversos registros grá-
ficos de control de calidad, como son el de Levey-Iennings' el
de Cusurn o e1 de Youden:

-:Lriere el procesamiento I. Gráfico de Levey-lennlngs. Es el más empieado y se encuen-

- - :rLt \.llu tlc rcleretlcia tra instalado como control de calidad en el sistem¿r informá-
. :-,,. irecuenci¿r lnínima, tico de nufiIerosos autoanalizadores. Se realiza un gráfica
'.; iLr/'l ltttp rovetnent por ct.ida control de calidacl, en la cual en la ordenada se sitúa
:.'.r.:ir .le 1os r'¿rlores i¿r media de la concentración de determinado control de cali-

,'. .)E )-los result¿r dad 1'a ambos lados se señalan 1as DE (fig. 6-2A). A 1o largo
.': -Lrlllp¿lftlll CO11 del eje de abscisas se van colocando los sucesivos valores de
: -- '-:ll-tll: ese control de calidad obtenidos a 1o largo del tiempo, en el
que destacan los resultados qlre se apartan más de 2 DE res-
r1:. se clrr pecto al r'alor esperado del control. Se visualiz.a tácilmente
--
-z.L.ios cómo se ajusta un resultado de control determirlado' Si apa-
recen errores aleatorios (imprecisiór-r), entonces los resulta-
dos aparecerán dispersos (fig. 6-28). Tarnbién avisa de un
error sisten-iático (inextrctitud) cutrndo ha,v un desplaza-
niento de una serie consecutir'¿r de valores de control en ei
mismo sentido respecto a 1a media. Este desplazamlento
nlLecle ser gradual (tendencia), tal r¡ como ocLlrre por un dete-
r'rrrro progresir.o de los reactivos, o un ctrmbio brusco que
ii:p¡1¿5 es continuo (desplazamietlto), como un c¿rntbio eu
.- ::'.¡todo, de lote de reactil'os o de estándares.
 Capítulo 6-Gestión del laboratorio clínico y control de calidad 67

a
-o
C
s
o
t; c
-a
óo
:"1 :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Control
:.:--:i'2A, MétodográficodeLevey-Jenningsdecontrol decalidaddeproteínastotalesensuero.Lamediaestimadadel control esde7O,7g/L,
." : :És. ¿ción estándar de 3,2 g/L. Se representa la desviación estándar respecto a la medra del controi estimado. Se señala un resultado de un
'*': :a: :f, a un error aleatorio.

ümailito A 2

1
: R¿,
n

-1

-2
:::
)
Control
3
üi¡ralito B )-
1

-0 ,

-1

-2

-3

Control
)^
3
&rrdiito C
2

0 ::-
=
-1

-2

"3

LOntroi
i:-"¡:-23. MétodográficodeLevey-Jenningsdeuncontrol decalidadde3analitos.EnAseobservaunaelevadaimprecrsión,enBseobserva
1* : :::- :nto gradual por un deterioro del reactrvo y en C se observ¿ un desplazamiento brusco por cambio de lote de reactivo. Se indican las
,':' : :: '.
=.:qard. DE: desviación estándar.
68 PaÉe l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

ñ,
cl
c
.o
o
.o
'o
G

óo -l

-3
I
,1
10 11 12 13 14 15 16 17 B 19 20 21 22 23

Control
Figura 6-3. Método gráfico de sumas acumuladas (cusum) del control de calidad de la fosfatasa alcalina durante 23 días. La media del control es de
104,1 Ul/L (desviación estándar de 3,1 Ul/L). Se puede apreciar la deriva de los resultados durante seis determinaciones consecutivas.

Gráfico de cusum. Similar al anterior, pero la representa-
ción recoge la suma acumulada de desviaciones resPecto a
la media del nivel de control en el período que se representa.
Si el control es adecuado, la gráfica va oscilando en torno
a la horizontal de valor 0, pero, si hay un error sistemático,
aparece una pendiente (fig. 6-3).
Gráfico de Youden. Se realiza un gráfico con las medias
estimadas y DE de dos niveles de control en los respectivos
ejes de ordenadas y de abscisas. Las líneas de las DE de los
dos controles se prolongan formando un cuadrado. Que-
dan destacados 1os resultados que se alejan de la media dos
y tres DE en uno o en los dos niveles. Si los puntos se agru-
pan en la diagonal de un cuadrante, indican un error sis-
temático mientras que, si Io hacen fuera de esa diagonal,
indican un error aleatorio (fig.6-q.
Reglas de Westgard
En i981, Westgard publicó un artículo sobre control de
calidad en laboratorios que sentó ias bases para la evalua-
ción de la caiidad de series analíticas en laboratorios clíni-
cos. Inicialmente incluyó seis reglas básicas. La nomencla-
tura de las reglas combina el número de observaciones que
incumplen el criterio de calidad señalado con el subíndice
que expresa ese criterio, tal y como se indica a continua-
ción:

Analito A Analito B

N N
o o
c c
o

, Método gráfico de Youden de control de calidad. En azulse indican los controles realizados en la última ocasión. Obsérvese en el gráfico
:: analito B e1 agrupamiento de resultados en un cuadrante y en la diagonal, que orienta hacia un error sistemático.
 Capítulo 6-Gestión del laboratorio clínico y control de calidad
Resultado del control de calidad
I
t
Figura 6-5. Esquema del procedimiento en una regla múltiple de Westgard , con aceptación de la serie analítica, de aviso y de rechazo de los resul-
iados de la serie analítica.
I. Regla lr,r el resultado del control queda fuera del margen
de t2 DE, pero menos de +3 DE. Es una regla de adverten-
cia y genera la aplicación de las siguientes reglas. En cual-
quier caso, llevará a la vigilancia de los siguientes resul-
tados de control de calidad. Puede considerarse una
prerregla y los laboratorios que sólo tienen en cuenta esta
regla en sus decisiones de calidad rechazan con frecuencia
series analíticas válidas.
2. Regla lr,r el resultado del control queda fuera del margen
de t3 DE y detecta fundamentalmente el error aleatorio o
el inicio de un notable error sistemático. Correspondería
al valor de control señalado en la figura 6-24, que causa
que se rechace la serie analítica.
3. Regla 2r,: dos resultados consecutivos del control se alejan
de la media en el mismo sentido más de2 DE. Detecta tem-
pranamente el error sistemático y se rechaza la serie de
resultados analíticos. Sería el caso que se produce tras el
cambio brusco de valores de control del analito C en la grá-
fica de Levey-fennings de la figura 6-28 o del punto en rojo
del gráfico de Youden en la figura 6-4.
1. Regla R,; la diferencia entre dos valores de control de los
cuatro últimos procesados excede en 4 DE. Detecta el error
aleatorio y se rechaza una serie analítica, tal y como ocurre
con el control del analito A en la figura6-2B.
5. Regla 4r,: clatro valores consecutivos del control se alejan
de la media más de 1 DE por el mismo lado (fig. 6-3).
Detecta el error sistemático aunque no debe llevar al
rechazo de Ia tanda analítica, sino a entenderlo como aviso
de necesidad de mantenimiento o calibración del sis-
tema.
6. Regla 10,: diezvalores consecutivos de control están situa-
dos al mismo lado de la media (control del analito B en la
fig. 6-28). Es una regla de aviso que detecta el error siste-
mático.
Estas reglas pueden utilizarse de forma combinada (multi-
rregla) de forma secuencial. Su combinación posibilita mini-
mizar los falsos rechazos y optimiza la capacidad de detección
de errores respecto a la utilización exclusiva del intervalo de
I DE como límite de aceptación ya que permite seleccionar las
reglas para detectar errores sistemáticos o aleatorios. Si el resul-
tado de1 control está dentro de 2DE, entonces se acepta. El
incumplimiento de la regla 1r. inicia las siguientes reglas y la
primera es la 1rr. Si ésta se cumple, entonces se aplican las
69
reglas 2.r,, &,, 4," y, finalmente, la 10- (fig. 6-5). De esta forma
se detecta tanto el error sistemático como el aleatorio:
1. Detectan error sistemático las reglas 1rr, 2r,,4r"y l0*.
2. Detecfan error aleatorio las reglas 1rs y &r.
La infracción de cualquiera de ellas debe llevar al rechazo
o aviso en tanto que Ia aceptación exige el cumplimiento de
todas.
Control de calídad externo
Al inicio de la década de 1980 surgieron los primeros pro-
gramas de control externo de calidad analítica gestionados por
sociedades científicas o centros oficiales. Larealización de con-
troles de calidad externos es muy importante para los labora-
torios y en algunos países es obligatoria su participación.
El control de calidad externo se realiza con el material pro-
porcionado por el gestor del programa de calidad y cuya con-
centración no se conoce. De este modo, el operador del labo-
ratorio no puede influir en el resultado obtenido del control.
Los resultados analíticos se envían dentro del tiempo señalado
-puede ser mensualmente- y se comparanton los obtenidos
en otros laboratorios participantes en el programa. De este
modo se obtiene una información valiosa proporcionada por
el gestor y, por tanto, de forma-independiente del laboratorio,
especialmente sobre la exactitud del método analítico y tam-
bién sobre su precisión (fig. 6-6). Además, con el control ana-
lítico externo se pueden comparar las prestac-iones analíticas
de las técnicas empleadas entre los distintos laboratorios clí-
nicos participantes en el programa. Una ventaja es que con el
paso del tiempo disminuyen las diferencias analíticas entre los
distintos laboratorios. Las sociedades científicas más relevan-
tes, como la Sociedad Española de Química Clínica y Patología
Molecular, disponen de un amplio programa de control de
calidad externo de numerosas magnitudes bioquímicas,
&cxr"*xirx*fm e e$la*W&¡r,e rffi ***mt&
d,¡* $ex s;xüüdad
La garantía de la calidad se define como el conjunto de accio-
nes planificadas, que se realizan de forma sistemática, nece-
sarias para asegurar que el resultado analítico satisfaga unos
 70 Parte l-lntroducción a ra bioquímica crínica y patorogía
morecurar

Número de laboratorios 118,121 lndice de desviación estándar

50 3

40 2

1
30
20 0
-1
10
-2
0
n,qo_l^uta_l
_ts,gz
13,28 15,04 16,80 18,56
I tt',ae I tg',qq I x',zo
', I ziilT-
-3
CND
ZO,ZZ ZZ,OI i=,eq

Número de laboratorios
Resultados Su valor
Total Aceptados Media f8.1 LlrL
esta 11.14% (r,75
Todos los laboratorios 266 262 18,12 2,21
Por su método respecto a la medida del instrumen:o
233 229 18,16 2,14
Por su instrumento Límite deseable < 19,8%
30 29 16,29 1,04

ffi foOos los laboratorios

Lim jte óptimo/deseable/mín lmo
f for su método o 0-1s
..::: POr sU tnstrUmento o 1-2s
I Su valor & 2-3s
o
.H
>3s
lndice no calculable
Figura 6-6'
Eiemplo de control de caljdad externo de la concentración
de lutropina. se muestra en gráficos de nrstograma y
en tabra el resurt¿do
-,;'_',,",:t::'":J::[i::i::?:"1.::i::lo:,::::1?l:?: er srupo quu .:.
método oúsérvese ra sran dispersión entre ros d,st,nros
I de Le,Áy-Jennins-.-rui.;;;;i1;:*,"ú.",onil1::;r'Ji:;ff:tJ:il,T':::j::nti; ,=á
=;-rtados de los laboratorjos. Asimismo, se indica (qráfico 'r,'o
=-:: :el año.

- : :::'.-rrs de calidad que han sido especificados prevramente. sitos de la calidad. Se la denomina también calidad total
-; :;::lrra de la calidad está orientada a proporcionar con_ mejora continua.
v
' !.: j; ::- ;-:re se cumplan esos
requisitos. A diferencia del con_
- : r :¿ :;_-j'd. actúa y evaiúa todo el proceso, tanto de la fase , La calidad es algo dinámico y en todo momento deben
definirse objetivos de la calidad de acuerdo con las necesida_
rLT-i.rrx-ii : -r:,: laprey de la postanalítica.
de
des de los usuarios del laboratorio. por ello, en los
-.¿ ri"r'!r:r' ; ;e la calidad exige Ia elaboración de una docu_ laborato_
rios clínicos se implantan técnicas de gestión integral
r:lrf:rlliiLrrn irrrÉ ¿-iegure la realización adecuada
de los proce_
y
mejora continua de la calidad, .upu..r-d. identificár los
¡, 'N,,, Lru_irriLrrls:
-: :anual de calidad, manual de prócedi_ aspectos del proceso analítico que nécesitan cambios
::t ur{:0;.ü!ili,. ilffi.[c_] : (-1ÉS, reqistros, etc. Todas o mejo_
las actividades ras, señalar la mejor solución posible, aplicarla y
1f"{ilil[u-i],riirfniür!ü¡üír :üm s
:n::L3srr asistencial del laboratorio deben evaluar ios
arances.
;uriürlrl,gllultin" ,ü¡ilru:Itsdr[r,&c,¿:.
:-.¿--¿ ]o cual es necesario un adecuado
Se rige por unos principios o pautas que implican
ili;lfil¡rrltlll]lflllll @milillfmtüilülrr]¡::-ü. J?:t la convic_
-e*;¿r a CabO el pfOCeSO, Se reqUiere ción.amplia y fundamental paia guiai y dir[ir una
,LLlr. úrÍillfll]r,üul0ür]ü;rijiiiüili|run[0 n lrm-lllliirJirrr cei personal, la implantáción organi_
zación encaminada a la mejora continuá de lis prestaciones,
"ril,rü]]
rlilrfiÍl|llllüüuüilrL,.lilllllll ,;r0ür¡llr6¡núL s cfr:rr-Ér ¡e indicadores como herra_
que se centran en el cliente (que son el paciente y el médico)
nr*ü*t[]il,!il1rilüu'Ífü!úüh,,üUm m' @:grli¡rrtrúc:r¡i de medidas preventivas é
i
,ir&
identifican las necesidades áe todas üs partes interesadas.
"üm¡Mmnmr",n"mnr¡r *i üI -:.iia-:ÍtentO de medida AUe
ü]lttrr'¡lmrul]lllllun,
Incluye la^participación del personal, el enfoque según
llltl lilllllH¡lri|jlilmlnmüil.J1ltr|l|llunlMülüul[0 proce_
:müidlhnffif,B l_:¿ :r::reSión matemátiCa, sos, el enfoque hacia la gestión y Ia toma de dlecisiones.
'dlúii:fi
l||ü:nilil@*.¡&@!@@¡lttlü¡,,.ütütt@¡Í
Emplea como herramienta de mejora continua el ciclo pDCA
hüil run:mE¡[:r']- el aumento de o ciclo Deming, que consta de las siguientes etapas (fig.6_7):
ic ==fo destinado
-*-:ontribuido l. Planificación (Plan): diseinr una mejora, revisando
ü .iu,i lltn@iúld q a ¡¿m:r:cor-io- tes del proceso.
las par_

2. Hacer (Do): elaborar un proyecto piloto con lo planificado

previamente.
:iililp. " tmlrr.rjff lt{lr$[¡trt 3. Verificar (Check): tras un tiempo, analizar los resultados
obtenidos según la propuesta dei proyecto piloto para com_
,il l|ailútF..müsr1- ¡ i, probar si se han producido las me¡oias esperadas.
¡:1linfimÉl-
-lctuar (Act): modificar el proceso segúnias conclusiones
,rh iir¡rs del paso-anterior para mejorarlo de aiuerdo con los
obje_
tilos de la planificación inicial.
 capítulo 6-Gestión del laboratorio clínico y control de calidao 71

Modelos normat¡vos
- Son modelos por los cuales puede optar el laboratorio clínico
de forma voluntaria para implantar un sistema de calidad. Las
normas son publicadas por el Organismo Internacional para Ia
Estandarización (ISO), aceptadas por la Unión luropea
1EN,
del inglés, European Norm) y por Eipaña (UNE, Unifiiación de
Normativas Españolas). Cuando un laboratorio implanta un
modeio normativo de gestión de la calidad, puede solicitar el
reconocimiento de una entidad externa que audita y concede
un sello de calidad. Éstas son las normas que pueden emplear
los laboratorios clínicos para implantu..rr-riirt.*u de calidad:

l. lSO 9000:2000. Es una norma de certificación que afecta a

la gestión de Ia calidad. No es específica de los láboratorios
clínicos, aunque muchos de elios optan por esta norma para
implantar un modelo de calidad, generálmente como paso
previo a la implantación de un sistema normativo de aciedi_
tación. La Asociación Española de Normalización (AENOR)
certifica a los laboratorios clínicos según esta norma.
= i-7. Ciclo PDCA de melora contjnua 2. ISO 17025. Es una norma de acrediiación que afecta a Ia
gestión de la calidad y Ios requisitos técnicos de los labo_
ratorios de ensayo y calibración. No es específica de los
- -:, .stas estrategias de calidad, además de obtener resul_ laboratorios clínicos y, por tanto, no incluyi aspectos par_
-: . ,.. más exactos posible y semejantes a aquellos que obtie- ticulares que afectan a la calidad del proceso analítico. la
- : .l :esto de los laboratorios, se pretende conseguir una Entidad Nacional de Acreditación (ENAC) acreditaba a ios
-: : -: ¡icin de los costes y mantener Ia buena reputáción del laboratorios clinicos según esta norma.
- : -:-,1)rio entre los usuarios. 3. UNE-EN-ISO 15189.Es una norma de acreditación especí_
fica para los laboratorios cIínicos. La primera edición fue
publicada en febrero (ISO) y.n o.tr.rtr. (UNE) de2003
, ti,.i] t::: a:,:::]r i : i:ti ::]: ,:.i para satisfacer las carencias de las normas ISO 9000 e ISO
17025 (fig.6-8) y contiene, en un anexo normativo, la corre_
:. ¡rtiende como sistema de calidad la estructura orqani_ Iación con elias. Incluye los requisitos de gestión de Ia cali_
-:-,
: establecida para regir y actualizar el conjunto de res_ dad, los requisitos técnicos y los requisilos médicos que
: .:¡ilidades, procesos, acciones y recursos que exige la ges_ deben cumplir los laboratorios clínicos para obtenei el
.- :e la calidad. Los sistemas de calidad que se implántañ en reconocimiento externo de la competenciá técnica para la
, ..:oratorios clínicos se ajustan, en general, a la ley vigente, reahzación de análisis. Incluye, además, dos anexoJinfor_
r : -::ras internacionales o a modelos no normativos. La apli_ mattvos, uno con recomendaciones para la protección de
- r: ,:i de los modelos tiene gran utilidad como mecanismo de los sistemas de información y otro so6re los aipectos éticos
,:.: --niento en los procesos que se evalúan y detección de pro_ del laboratorio. ENAC es el organismo que acredita a los
- ::rns. Estos problemas se someten a ciclos continuados de
* Iaboratorios clínicos según esta norma, enlre ellos los labo-
:
rra. Los modelos se diferencian entre sí en cuanto
a ios ratorios acreditados previamente por Ia ISO 17025. Hay
:
;::r-os de la evaluación, los requisitos que se pretenden eva_ disponible una segunda edición, de 2007, con cambios
-.: '- la metodología empieada en ésta. mínlmos respecto a la primera, y un documento publicado

ffi*¡
ffiw& neqülsitos técnlcos

Gestión de la calidad Requisrtos técnicos Requisitos médicos

''ra 6-8. RelaciÓn entre los requisitos de las normas ISO aplicables al laboratorio clínico
 72 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular
por la ENAC en marzo de 2008 titulado Criterios generales
de acreditación de laboratorios clínicos, que recoge las acla-
raciones o precisiones del contenido o la interpretación de
algunos apartados que son necesarios cumplir para obte-
ner o mantener la acreditación según esta norma. La estruc-
tura de Ia norma ISO 15189 es lisiguiente:
l. Objeto y campo de aplicación.
2. Normas para la consulta.
3. Términos y definiciones.
4. Requisitos de la gestión (15 apartados).
5. Requisitos técnicos (8 apartados).
6. Anexo A (normativo): correlación con las normas ISO
9000:2000 e ISO 17025.
7. Anexo B (informativo): recomendaciones para la protec-
ción de los sistemas de información del laboratorio.
8. Anexo C (informativo): ética en los laboratorios clínicos.
4. ISO 9004 y UNE 66174. Son normas propuestas por AENOR
para las organizaciones que deseen avanzar haciala excelen-
cia en ia gestión de la calidad. La ISO 9004 establece direc-
trices sobre cómo mejorar, por lo que podría ser comple-
mentaria a los modelos no normativos de calidad total, que
establecen qué hay que mejorar. Está enfocada al cliente, pero
añade la satisfacción de todas las partes interesadas, propone
Ia eficiencia y no sóio la eficacia, e incide en la autoevalua-
ción. La norma UNE 66174:2003 es la guía para realizar la
evaluación y mejora mediante el uso de Ia ISO 9004.
Modelos no normativos
Los laboratorios clínicos pueden optar también por mode-
los no normativos a Ia hora de implantar un sistema de cali-
dad. No son específicos para ellos y generalmente son modelos
supralaboratorio ya que pueden implantarse en organizacio-
nes sanitarias más amplias, como hospitales. Tras la implan-
tación de alguno de estos modelos, el laboratorio o el hospital
puede solicitar el reconocimiento externo mediante la audito-
ría correspondiente. Otros modelos no permiten la obtención
de un reconocimiento externo y se emplean exclusivamente
como herramienta para la mejora, sin la pretensión de un sello
de calidad, como imagen para el cliente:
l. loint Commission on Accreditation of Healthcare Organi-
tations (JCAHO). La fCAHO es una organización norte-
americana que emplea un modelo basado en estándares
para la acreditación de centros sanitarios (fig. 6-9). Consi-
dera el laboratorio clínico como una parte integral de la
organización hospitalaria y no un sistema aparte. Tiene
una larga trayectoria de aplicación en Estados Unidos y
actualmente existen centros sanitarios acreditados en más
de 30 países, entre ellos España. Generalmente se opta, de
forma voluntaria, por implantar un sistema de calidad,
según la Joint Commission, para todo el hospital, red de
centros de salud u otros centros sanitarios. Cada centro
acreditado por la foint Commission cumple una serie de
estándares relativos a la atención clínica del paciente y a la
gestlón propia del centro, entre ios cuales se sitúan Ia ges-
tión v la seguridad de las instalaciones, la formación y la
;ralificación de los profesionales o la gestión de la infor-
::-,":rrin. Cada uno de los estándares incluye varios elemen-
Medición, análisis y mejora continu¿
Figura 6-9. Organización de los estándares de la Joint Commission
tos de medición cuya valoración se emplea en la evaluación
de la documentación y en la auditoría que realiza el orga-
nismo acreditador. La Fundación Avedis Donabedian acre-
dita y premia en España a los centros hospitalarios que
consiguen implementar los criterios de la ICAHO.
2. Modelo europeo de calidad total (Fundación Europea para la
Gestión de la Calidad o EFQM, del inglés, European Founda-
tion for Quality Management). Es un modelo basado en la
participación de todos sus empleados, que pretende el éxito a
largo plazo, en una continua mejora de sus procesos, y el bene-
ficio de todos mediante la satisfacción del cliente v el cumoli-
miento de su responsabilidad con la sociedad. No proporcióna
ningún programa de acción, ni un conjunto de herramientas
de mejora, ni un instrumento de motivación ni un conoci-
miento completo de la calidad total. proporciona una forma
de entender la calidad total, una guía para el autodiagnóstico
y puede ser una herramienta para estructurar las áreas de
mejora. Las ideas esenciales son el cliente, la gestión con datos,
la búsqueda de problemas y mejora continua, la comparación
con los mejores, la participación o implicación de todos, la
formación, el compromiso y el liderazgo de la dirección. Los
criterios yla puntuación máxima que puede obtener cada uno
de ellos se presentan en un mapa (fig. 6-10).
No surgió propiamente como modelo de calidad, sino que
era el modelo que seguían las empresas que concurrían á Ia
convocatoria anual del premio instaurado por Ia EFeM, y
que se comprobó que era de gran utilidad para conseguir un
eievado nivel empresarial. No existe.otro reconocimiento
externo que la obtención del Award (premio principal) o
alguno delos Prizes (accésit), la seguridad de haber apren-
dido a evaluar Ia situación del laboratorio, reconocer las áreas
de mejora y poner en marcha los pianes para conseguirla.
A nivel internacional, existen premios de este tipo en
Estados Unidos (premio nacional Malcolm Baldridge) y
lapón (premio Deming).
3. Sels Sigma. Es un modelo de calidad no específico de los
Iaboratorios clínicos que surge a partir de los sistemas de
gestión de calidad total. Está orientado al cliente y emplea
una metodología para la eliminación absoluta de defectos
en los procesos. Se centra en los CTQ ftriticalto quality) o
 Capítulo 6-Gestión del laboratorio clínico y control de calidad 73

Personas
(9.o/o)

o
N\o Polltica y estrategia
3^
ñ-o
<J o-
, {8%) 9s
] L

Alíanzas y recursos
(9a1")

.1,'; :1 :.1:;,, : . 1, I :,.

1 :; :; : :..;., ; 1.,. -:, :.j
.r *''t*. Modelo EFQM (de ngles, Furopean Foundatton for Quality Management)

¿lspectos esenciales para la calidad percibida por el cliente. Todos los modelos implantados que son tributarios de ser
El Seis Sigma propone una metodología de mejora de pro- reconocidos por un o.gutrl.roo exteino pasan por un proceso
cesos y resolución de problemas, un conjunto cie herra- de evaluación que incluye, como aspectos esenciales, la solici-
mientas que se aplican en un proceso estructurado en cinco tud, la presentación de la documentación y 1a auditoría que
lhses (DMAIC): definición del proyecto (D), medición de realtzailos expertos. Este proceso concluye con un lnforme
su capacidad (M), análisis de los resultados (A), mejora del que puede ser definitivo, aceptando el reconocimiento, o bien
proceso determinando Ia relación causa-efecto (I) y control puede condicionarlo a la revisión de determinados aspectos
para asegurar que lo conseguido se mantenga una vez que no conformes a 1os requisitos exigidos. El reconocimiento obte-
se hayan implantado los cambios (C). La metodología com- nido es válido por determinado período de tiempo, plazo en
pleta se describe en la tabla 6-1. que la organización debe volver arealizar un proceso de eva-
Los laboratorios que implanten un sistema de calidad luación del laboratorio para su rcnovación.
irediante este modelo no pueden obtener un reconoci-
miento externo por una entidad acreditada.
También el Seis Sigma se emplea como escala para medir
ia calidad a partir de los def-ectos registrados, calculando
los defectos por millón y convirtiéndolos a escala seis
sigma: sigma (o) = (error total admisible - bias)/CV. E1 En muchos países, la legislación establece, entre las atribu-
mínimo exigible para Lln método analítico es de 3 o, con- ciones locales o regionales, las condiciones de apertura cie 1os
siderándose bueno entre 4-5 o y excelente entre 5-6 o. laboratorios de análisis c1ínicos. Algunas normas son más rigu-

iabla 6-1. fvt*t*d*l*gía c{}t?rp¡€?a para itrtptñntar una r*ejora según el modelo seis sigma
l Definición del problema
Crear un equipo de trabajo
Definir los estatutos del proyecto e identificar los requerimientos del cliente
Dibujar un mapa de procesos del proceso que debe mejorarse
Caracterizar el CTQ del proyecto
Def inir los niveles óptimos para el cliente para ese CTQ
Definir el sistema de medida del CTQ
Validar el sistema de medida
Establecer numéricamente el estado de oartida
:. Establecer la capacidad del proceso actual
Establecer los objetivos del proceso
ldentificar las fuentes de variación que pueden ser causa del problema
Filtrar las posibles causas para identif icar las causas vitales
Definir la interrelación entre la variable que debe mejorarse y las variables causales
Definir los sistemas de medida para las variables causales
Validar los sistemas de medida de las variables causales
Definir posibles soluciones al problema
Def inir los criterios óptimos para escoger la solución óptima
Seleccionar Ia solución final
Establecer las tolerancias exigidas para las variables causales
Plan de implementación de la solución tomada
I Representación temporal de la variable que debe mejorarse para comprobar su evolución
lmplementar un método de control del proceso
74 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

considerarse para obtener la licencia de apertura

Apartado Particularidad
Autorización de apertura Carácter obligatorio
Personal Facu ltativos especialistas
Personal titulado adecuado para la actividad
Requisitos físicos Área administrativa
Área de obtención de especímenes
Area de realización de análisis
Área de limpieza del material y eliminación de residuos
Área administrativa Confidencialidad garantizada
Área de obtención de especímenes Material adecuado para calidad óptima y respeto a la intimidad del paciente
Área de realización de análisis Medidas de orotección
Equipamiento con manual de mantenimiento
Sistemas de protección y seguridad
Manual de procedimientos
Estructura del informe analítico
Area de limpieza del material y eliminación
de residuos
Dr^\/A.+^ +Á.ñi.^ Memoria de obras e instalaciones
Plantilla
Planos
Inventario de equipos
Sistemas de eliminación de residuos
Catálogo de pruebas
Plan de oarantía de la calidad

rosas que otras hasta el punto de imponer criterios de calidad

y exigir la certificación frente a otras regiones en que no hay
normativa específica para este sector (tabla 6-2).
En el ámbito hospitalario, el Servicio de Laboratorio es un
centro de asistencia para cuyo inicio de actividad es suficiente
la licencla de apertura común del centro. Otros requisitos nece-
sarios, en todo caso, son la contratación de lapóliza de respon-
sabilidad civil, que cubra los daños derivados de Ios errores
asistenciales y el establecimiento de un plan de eliminación de
residuos sanitarios, con la contratación necesaria de empresas
especializadas.
Al crecer la sensibilidad profesional en la práctica analítica
¡ en general, asistencial, se ha generado la demanda de nuevos
desarrollos de aseguramiento de Ia caiidad, prevención de ries-
gos, seguridad de1 paciente y del profesional, protección de
datos, consentimiento informado, etc. Cada uno de estos
aspectos ha ido adquiriendo en los últimos años su legislación
específica, que compromete a la mejora de la práctica profe-
sional. En la tabla 6-3 se presentan aigunas de estas disposi-
ciones desarrolladas en España.

Tabla 6-3. t-egislac¡én y norlÍativa española que afecta a los laboratoríos clínicqs
Leyl411986,de25deabril,General deSanidad. BoletínOficial del Estadode29deabril de1986

Convenio para la protección de los derechos humanos y la dignidad del ser humano con respecto a las aplicaciones de la biología
y de la medicina (tonvenio de Oviedo), aprobado por el Comité de Ministros del Consejo de Europa el 19 de noviembre de 1996.

Ley Orgánica 15/lggg, de'l 3 de diciembre, de Protección de Datos de Carácter Personal. Boletín Ofícial del Estado de l4 de diciembre
de1 999

Ley 3/2001, de 28 de mayo, reguladora del consentim¡ento informado y de la historia clínica de los pacientes

Ley 4112002, de 14 de noviembre, Básica Reguladora de la Autonomía del Paciente y de Derechos y Obligaciones en Materia
dglnformaciónydeDocumentaciónClínica. BoletínOficial del Estadodel5denoviembrede2002

Ley 16/2003, de 28 de mayo, de Cohesión y Calidad del Sistema Nacional de Salud

Ley 4412003, de 21 de noviembre, de Ordenación de las Profesiones Sanitarias

 Capítulo 6-Gestión del laboratorio clínico y control de calidad 75

T*bl* 6-4. L*glslaci*¡t x¿"st*¡t*¡s*ica ql;e r€S{.*gá ia aperta;a'a

y e! $a;reei*namicr¡t* d* l*s 3;:h*r*t*ri*s e!{s:Eeos c* €spa**
Comunidad autónoma Publicación
Cata I u ña DOGC n." 2-031 29-3-199s
Ba lea res BOCAIB n." 163 31-12-1996
País vasco BOPV n." 25 6-2-1998
Andalucía BOJA n.'74 4-7 -1998

Valencia DOGV n.' 3.801 26-l -2000

Ga licia DOG n." 207 2 5- 1 0-2000

Castilla-La Mancha DOCM n." 44 6-4-2001

Ca na rias BOC n." 237 4-12-2003
Madrid BOCM n." 303 21-12-2006
BAC. Boletin Oficial de Canarias; BOCAIB: Boletin Ofictal de la Comuntdad Autónoma de las lslas Baleares; BOCM:
Boletín Oficial de la Comunidad de Madild; BOJA; Eoletin Ofícial de la lunta de Andalucia; EOPV: Boletin Oficial del Pais
Vasco; DOCM: Diario afictal de Casttlla-La Mancha; DOG; Diaria Oficial de Galicia, DOGC. Diarto Oficial de la Generalt-
tat de Catalunya; DOGV: Diario Oficial de la Generalitat Valenciana.

. : relativamente pocos años, los laboratorios clíni-

,r.rce
. ' e-staban regulados por 1a Ley General de Sanidad,
- --:lcuier otro establecimiento sanitario. El 29 de marzo
- -,' se publicó en Cataluña el primer decreto autonómico
- -Lr Lrara los laboratorios ciínicos que incluye los requi-
,-,::rrnistrativos, físicos, técnicos, de equipamiento, pro-
: " seguridad que debe cumplir cualquier laboratorio
- - :n Cataluña para obtener o conservar la autorización
' . , . r.ativa de funcionamiento. A partir de aquel momento,
. - ::.Lr-rnldades autónomas se han ido sumando a la elabo-
:ublicación de legislación específica, de obligado cum-
: '.:Lr. qlle regula 1a apertura y el funcionamiento de los
,: rios clínicos (tabla 6-4).
:r':ceso analít¡co
rroratorio clínico tiene como objetivo obtener, a partir
.-::irüs representativas de la situación del paciente, resul
. .: ...liticos fiables, reprodr"icibles y que satisfagan las nece-
,. - :rédlcas para el cribado, diagnóstico o seguirniento de
., --r) LLe salud. Los resultados analíticos se obtienen en ulta
: :r --i.r temporal de etapas que constituyen e} proceso anir-
:::e se inicia en el momento en el que el especialista c1í
:r¿.i la decisión de solicitar unos an¿ílisis a1 paciente y
,, ¡uando el informe con el resultado llega al solicitante,
-, :sta clínico o paclente, o incluso -'.a más allá e incluye
:: r.1¿r que e1 facultativo de1 1¿rboratorio pr-rede proporcio-
' r'c'l¡ción al resultado analítico.
r-.r.eso analítico consta de tres fases:
:.: .reanalítica. Se desarrolla desde que el médico decide
. --:liLebas analíticas que va a solicltar para un paciente hasta
.. .r rruestra del paciente está en e1 laboratorio, preparada
.
. , :.ealizar sobre ella las determinaciones. Inclr"rye distin-
. :.lrp¿1s, como la solicitud de pruebas, la preparación de1
' .- .nte, 1a obtención e identificación de 1as muestr:rs, el
. -'.spol'te hasta el laboratorio, 1a recepción de la muestr¿r v
supreparación en el laboratorio. Varias etapas de 1a fase prea-
nalítica se realizan fuera del laboratorio y en ellas interviene
personal muy variado, médico solicitante, paciente y perso-
nal extractor, muchas veces ajeno al laboratorio. Por estos
motivos, 1a fase preanalítica extralaboratorio, también lla-
mada fase pre-preanalítica, es 1a principal fuente de errores
en el laboratorio clínico. Para minimizarlos, se requiere la
elaboración de procedimientos de trabajo, formación inicial
y continuada de todo el personal implicado e información
impresa para la preparación adecuada del paciente. La fase
preanaiítica intralaboratorio puede incluir 1a centrifugación
de 1os especímenes de sangre para obtener sllero o plasma,
la preparación de alícuotas y su identificación o la conser-
vación de 1as muestras de forma que se mantenga la estabi-
lidad de los componentes hasta el momento de realizar las
determinaciones analíticas.
2. Fase analítica, En esta fase se realiza propiamente la deter-
minación de 1os componentes de 1¿rs muestras solicitados
por el médico. La mayoría de 1as determinaciones analíti-
cas se realiza en el laboratorio si bien hay algunos análisis
que, por sll sencillez técnica y la necesidad inmediata del
resr-rltado, pueden realizarse a la cabecera del ptrciente.
Gran parte de los análisis bioquímicos están automatiza-
dos en grandes equipos aunque algunas pruebas todaví¿r
se realizan manualmente o cle forma semlautomatizada v
reqllreren una prepar¿rción de 1a muestra previa al proce-
samiento en el autoanalizador.
3. Fase postanalítica. Se inicia al obtener el resultado primarlo
de la determinación anaiítica y finaliza con la emisión del
resultado definitlvo en el informe si bier-r se considera que
hal.una fase post-postanalítica qtie inclr.rve la ¿rsesoría del
facultativo del iaboratorio al especialista clínico cuando es
necesario. El resultaclo anaiítico atrar.iesa r.arios tlltros antes
de emitirse e1 informe: una validaciól-r técnica, una valida
ción f'acultativa e, incluso, una validaclór.r informática.
La obtención de unos resultados fiables 1. que re¿rlnente se¿rn
de utilidad para el diagncistico o e1 seguimiento de nn paciente
depende clei cuidado con que se re¿rlice cada una de las etapas
cue comDonen estas fases.
76 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular

Panel de pruebas disponibles Fase preanalítica ran tiempos muertos de inactivid¡d- Adenas- en estas con-
dicioneJ es difícil asegurar un tiempo de emisión de
I
I
informes.
V Los procesos se documentan en todos los pasos de su reali-
Solicitud del test por el medico zación a través del manual de calidad, que incluye los proce-
I dimientos normalizados aprobados oportunamente y revisa-
I
dos con la periodicidad que se hubiera establecido y el registro
+ nominal por cada responsable de las actividades realizadas. El
Obtención del espécimen cumplimiento de esta norma interna permite alcanzar los obje-
I tivos de la certificación del laboratorio según la UNE-EN ISO
I 9001:2000.
V La acreditación de la capacidad analítica e informativa del
Transporte y procesado laboratorio se realiza a mediante la norma ISO 15189.
del espécimen
Cada etapa del proceso de asistencia se realiza bajo la res-
I ponsabilidad de un profesional definido, con materiales iden-

t
I
T
Determ¡nac¡ón Fase analítica
ana lítica
I los que se han aplicado, constituyen la trazabilidad del proceso
I
i asistencial concreto (tabla 6-5) y fija las condiciones de reali-
Validación y entrega del Fase postanalítica
resultado al médico
Figura 6-11. El proceso de trabajo en el laboratorio es lineal
Gestión por procesos
La complejidad de la asistencia que realiza el laboratorio
aconseja establecer pautas de trabajo sobre la base de procesos,
es decir, actividades que se desarrollan secuencialmente desde
la solicitud de una prueba analítica hasta la entrega de los resul-
tados. Ello constituye, a su vez, un subproceso de soporte de
la actividad clínica.
Los procesos pueden seguir una pauta de organización
diferente según la procedencia de la solicitud: atención pri-
maria, consultas externas, Servicio de Urgencias, pacientes
hospitalizados, Unidad de Pacientes Críticos, análisis que
deben realizarse en el punto de aplicación de cuidados, etc.
Así, se establecen prioridades en la atención o se dedican
recursos exclusivos para determinados procesos. Otro crite-
rio de segregación de caminos analíticos puede ser el tipo de
espécimen remitido para análisis de manera que el líquido
cefalorraquídeo, el suero o la sangre total siguen procesos
diferenciados. Por ejemplo, la obtención de suero o de plasma
requiere un paso de centrifugación, que es innecesario Para
trabajar con sangre total, y la preparación de una muestra de
orina tiene requerimientos distintos que un derivado sanguí-
neo.
Como ejemplo, en la figura 6-11 se recogen esquemática-
mente los pasos del proceso lineal en el laboratorio hospi-
talario. La pauta diaria de trabajo suele seguir este orden ya
que la llegada continua de muestras al laboratorio es deter-
minante para su procesado. En cada etapa sucesiva del pro-
ceso se implican unos recursos humanos y unos sistemas
analíticos que no son exclusivos, sino que se puede produ-
cir confluencia de líneas en algunas actividades. En un labo-
ratorio hospitalario, el proceso se realiza de forma continua
v en cada paso se evita trabajar por lotes que, si bien redu-
cen Ios costes, enlentecen la obtención de resultados y gene-
tificados y controlados, en aplicación de protocolos aprobados
en el laboratorio. EI registro informático en cada muestra de
la secuencia temporal de etapas, con la identificación de per-
sonas responsables, materiales y equipos utilizados y protoco-
zactón para que el proceso pueda ser reproducible (fig.6-12A
v B).
Gestión por objet¡vos
Con este modelo de gestión se definen los objetivos parti-
culares de cada puesto de trabajo, especializado o técnico, de
forma que se orientan hacia Ia consecución de los objetivos del
laboratório. Éstos deben ser concretos, medibles, alcanzables,
realistas y adecuados alplazo temporal que se establezcay se
pueden negociar particularmente dentro de un sistema de
comoensación condicionada.
Pára su aplicación, se requiere un grado de particulariza-
ción, innecesario en la gestión por procesos, y se implica per-
sonalmente a cada uno de aquellos que intervienen en la aten-
ción analítica ya que se deben acompañar de plazos de
cumplimiento, evaluación del logro ¡ en ocasiones, retribu-
ción condicionada a los resultados. Fácilmente se puede inte-
grar con los procesos, como forma de orientar los resultados
perseguidos y reconocer su consecución. Por este motivo, la
adaptación a cambios importantes o Ia reorganización de pro-
cesos se lleva con frecuencia, marcando los objetivos y el calen-
dario para su realización.
Gestión por competencias
En algunos casos, la actividad y la intervención de los téc-
nicos y especialistas está orientada por el grado de competen-
cia que muestran para desempeñar un trabajo concreto, en el
cual se prima, por ejemplo, su motivación o su capacidad de
trabajo en equipo, iniciativa, dotes docentes, adaptabilidad,
formación específica, etc. La especialización diferenciada den-
tro del laboratorio determina, en ocasiones, las distintas com-
petencias con el riesgo de que fragmente excesivamente Ia asis-
tencia analítica. Las actividades de mayor especialización o
más interpretativas, como las técnicas moleculares o croma-
tográficas, se rigen habitualmente por Ia competencia técnica
y de conocimiento de determinadas personas, lo que relega el
proceso a un segundo plano. Sucede, así también, con las prue-
bas diagnósticas.
 Capítulo 6-Gestión del laboratorio clínico y control de calidad 77

Tabla G5.
l¡azable
Fase preanalítica en relación con el paciente ldentificación del paciente
Preparación para Las pruebas
Persona que realiza la extracción
Día y hora de la obtención
Especímenes que deben obtenerse
ldentificación de Ias muestras obtenidas
Día y hora de recepción de muestras en el laboratorio
Registro de incidencias
3:se preanalítica en relación con los proveedores de reactivos, ldentificación de productos
oradores, controles y f ungibles Etiouetado de la CE
= Documentación técnica
Lote de fabricación
Registro de incidencias
F¡se analítica Día y hora de realización de cada prueba
ldentificación de los técnicos que intervienen
Lotes de controles, calibradores y reactivos utilizados
Calibración vigente
Controles vigentes
Procedimiento normalizado vigente
Última revisión preventiva del equipo
Facultativo oue realiza la validación
Día v hora de validación
Registro de incidencias
Efr€ 3ostanalítica Reclamaciones
Facultativo, día y hora de revalidación, si se ha producido

ldentif icación ldentif icación

Lote Lote

Proveedor Fecha de Fecha de fabricación

fabricación Entrada en el laboratorio
Lote
Entrada en Prnnram:.la a^ntr^l
Fecha de fabricación
el laboratorio Resultado del control
Entrada en
el laboratorio Fecha de calibración Cr't+ori¡ rlo raañtAaiÁñ

Muestras Calibradores Controles

Resultado
kiente analítico
(la -: l: l
-:: .:: :ersonal
_t- ^ -l-+^ -l ^
^ Lld
r -= r>l>Lc

Reactivos Mantenimiento Documentación

preventivo
y correctivo
Proveedor ldentif icación Procedimientos normalizados
Lote Fecha del último de trabajo

Fecha de mantenrmrento
fabricación Albarán
Entrada en
: el laboratorio

iii.qrrr':;-12A. Trazabilidad de un resultado emitido

 78 Parte l-lntroducción a Ia bioquímica clínica y patología molecular

I. Traaabilidad
I

I C"[b,"dot** ] Control calidod l

Peide
Ui"toi" F Ne¡rlienro

i-]
:::, :l a::illli::a:: -

NlAct Pl¿n !17831?95

EstadÉ .Frmadi Dr. solicitanle

Fec. pl¡nit¡c I

Trazabilided j
sequrmiento
I Mmras] Resutiados]
Sequimiento |..c"|ibr!;sp.r..:l Controt catidad I

É¡liritud. ir4lu4r4€r¿s$
Ed;¡ciitr S/oü¡ddE¡'rh:oo|--:
üsúFEbagún Seguimiento i Muestrasi Fesultadosl
Validórión füñ,ii?oüq[¡4q-
- Autoanalizadores] Feaclivos I' ::.

iigur;6-1?8. EjempLo de trazab lidad de un análisis bioquímico en un sisterna informático a^ ^^ -- ^ 3n que se na procesaOo, los
reactivos empleados, los calibradores y los controles correspondientes.

En un espacio profesional, donde e1 entorno económico y

tecnológico produce tanto clientes como competidores, es
factor clave reconocer Ia misión de la empresa en la que se
inserta el laboratorio, la visión concreta, sus objetivos y los
valores que la sustentan. La pianificación estratégica en que
se idet.rtifican los productos clave del propio negocio rinde - . . : r-iiiSos generados han de com-
beneiicios \-atrae clientes por abrir nueva demanda (fig. 6-13). : i : r,. : ::-ha actuación (fig. 6-la). Los
De este n¡nto derir-arán 1os obietivos de actividad mientr3! : - i..:---: i(rmprenden, principalmente,
que del análisis de nuestras tbrtalezas v debilidaCe s ¿-: * - -::::¡s. reactivos y material fungi-
entornLr que amenaza o que olreie oporiunidJde ::l:,=.-:.--: :: : : :i-'-ipos. Además de estos costes
lllr':.1: c.-.ll..cg: j.:n-l: ¿ii,-cCr:: :lJui;i\': J: -.:.:- :- ; ::L:! :- rncionamiento ordinario del

Prueli¿s :¡;"*II.¡m :.mm[nüfliruÍilÍilNi¡ü

üurm

il¡illtrÍlJii,til||t ltLltL]lt|l/r,lii|lL

-
I
tuu$tgliitul ¡lfllm$uuililltüÍtilümlu
n rqllftu$lMúiilffi1&r

'!illilI
rll|ltfiltslülllllül

rlflllllllllÍil|l|1llll||iluillllllítL4lllf,l
x

t, ]illm|i||f

lliqrnilsillüb,.,*ffi l[ul||
 Capítulo 6-Gestión del laboratorio clínico y control de calidad
Actividad
:r " - " : : -'-1 lostes de las pruebas analíticas.
ril¡'l,, r;¡-.::o existen otros costes de carácter indirecto, genera-
r " :{- i -os servicios generales de mantenimiento, Iimpieza,
i.ii, !"1,:i:i¿. administración, dirección, etc. Estos costes son
':nr:- '::ios, con criterios apropiados, sobre aquellos que tie-
'dr ;-.1::¿rea asistencial directa sobre el paciente. Algunos de
'r jiri,! :- iies son fijos e independientes de las fluctuaciones
u ¡ ¡--::";:dad asistencial. Por ejemplo, el personal o la amor-
- ;-*. :- je equipos es un gasto fijo en el que no influye la acti-
,i ¡L-. 11 cambio, otros costes son variables y dependen de la
liu1r,r"t,:-:.1 del laboratorio, como es el gasto en reactivos.
. ,.¡-- -: ¿utomafizaciónde la fase analítica se ha alcanzado un
., 'r '.':-: - :r:nucioso de los gastos del laboratorio en reactivos a Ia
-irdr :-É :¿ disminuido el requerimiento de personal. En con-
, ,0r,, * han reducido los costes de producción y se ha elevado
;l r,::-i:;tividad. Además, gran parte de las operaciones de
,ir i,|Lsi,:.on de equipos y tecnología han desaparecido también
¡, rrl:*- " ¿gan al laboratorio dentro de concursos públicos, con-
riJl::¿:,.=:lte con los reactivos, el sistema informático y otros ser-
L.{:{ : iia concentración reduce costes, pero hay que reconocer
r:.rs ::i:¿ ¡lexibilidad al laboratorio y autonomía para tomar
l*j:rir::..es. ,{parte de ello, Ia automatización de los procedimien-
,r L:¿-::icos ha logrado que, en algunos casos, el valor añadido
rir :r::orciona el facultativo analista se vea limitado. Esto ha
*u:iJ:::rdo que, con el fin de reducir costes, algunos centros
:! *üi::,¿rios hayan exteriorizado Ia actividad analítica ¡ en
lL' \ ::-ios, se haya concentrado esta actividad en grandes cen-
1¡'r *
tr '.r aiectalatrazabilidad del proceso, aumenta las posibles
r:o::r.: de errores y disminuye la calidad asistencial total. En
u^i::r¡r l€S es necesario derivar las determinaciones analíticas a
rllr! ::lltros cuando la compleiidad analítica sea excesiva o el
::.rrr:-E:o de muestras tenga como resultado un tiempo de res-
¡L¡s¡: ¿rcesivamente largo o un coste inasumible.
I". ..¡suimiento presupuestario y la previsión para el siguiente
irc::,:-L-) requieren valorar el comportamiento de los últimos
i ri: * -{ partir de esta información y de los primeros meses del
Lri; ::- .urso, se pueden aplicar cálculos de porcentajes medios
sl :tr:iLrdo transcurrido del ejercicio para estimar el siguiente
rr::i::uesto si bien la estacionalidad o acontecimientos oca-
11, .i.s pueden falsear la apreciación final.
I i,,, I i:, ¡$* i¡l'9'*,¡'f1'!&r1*;¡
I e1 volumen de datos que se genera en los laborato-
- ri."do
es primordial el establecimiento de sistemas para el
tratamiento de la información producida. El Sistema Infor-
mático del Laboratorio (SIL) es un módulo del sistema infor-
mático hospitalario, con el cual comparte la base de datos
de la historia clínica, así como información demográfica y
administrativa. En la práctica, el SIL registra automática-
mente gran cantidad de información relativa a cada asisten-
cia, pasos de la atención analítica, persona responsable de
cada actuación, fecha y hora en que se produce, etc., 1o que
constituye una fuente de gran importancia para la mejora
continua de la calidad. También permite cuantificar con
resultados propios la validez de 1as pruebas, el cumplimiento
de protocolos consensuados, vinculación con diagnósticos
al alta, etc.
Respecto a la actividad, hay indicadores habituales, como
el total anual móvil (TAM), con el cual se sigue mes a mes el
número de determinaciones acumuladas en Ios 12 meses
anteriores; indicadores propios de atención primaria, como
Ia frecuentación (número de extracciones/pacientes atendi-
dos) o la carga de trabajo (número de pruebas/sección o espe-
cialista); indicadores de asistencia hospitalaria, como la pre-
sión de las urgencias (porcentaje de pruebas de carácter
urgente).
Esta información permite conocer el coste unitario en cada
línea de proceso de manera que las negociaciones con finan-
ciadores de la asistencia pueden objetivarse aunque evolucio-
nen hacia sistemas capitativos de pago por enfermedad, gru-
pos de población o número de pólizas.
En la actividad diaria del laboratorio hay períodos de deso-
cupación o subactividad, fácilmente reconocibles y cuantifi-
cables informáticamente, que ofrecen oportunidades de
redistribución del trabajo, contratación de nuevas asistencias
en las franjas horarias menos ocupadas o dimensionamiento
de los recursos a Ia necesidad rea1.
Otro ejemplo de aplicación de los sistemas informáticos lo
ofrece la posibilidad de conocer la ineficacia de algunos pro-
cedimientos. La adquisición de reactivos para un número de
pruebas no es plenamente efectiva, por ejemplo, por repeti-
ciones o por el volumen muerto de los envases, 1o que abre Ia
opción de Ia compra y pago de reactivos por prueba facturada
sin considerar las calibraciones v 1os controles consumidos.
g;
l: :t,:¡,{i ¡,1,:::,¡.. ¡i l':
La actividad asistencial centra Ia función de los laborato-
rios clínicos. Conceptual y técnicamente, sus funciones pue-
den incluir nuevos desarrollos, investigación clínica, docen-
cia pre y posgraduada, pero siempre impulsadas por una
eficiente asistencia clínica. Tanto en atención primaria como
en atención especializada, la principal fuente áe información
para la asistencia al paciente son los laboratorios. Los resul-
tados analíticos aportan datos para Ia detección y confirma-
ción diagnóstica, sobre todo en campos como serología, bio-
logía molecular y pruebas funcionales ¡ más frecuentemente,
datos de seguimiento, evaluación y seguimiento, respuesta
terapéutica y pronóstico.
Para que toda esta información sea asistencialmente útil,
debe ser rigurosa en cuanto al contenido transmitido y rápida,
para que pueda contribuir a la atención. La mayor parte de
los laboratorios ofrecen ambas cualidades. Durante años se
ha vivido intensamente en los laboratorios Ia evolución de
los controles de la calidad hacia programas para su asegura-
80 Parte l-lntroducción a la bioquímica clínica y patología molecular
n:en:o. tal l como actualmente se vive la certificación de los
:rocesos o ia acreditación de los resultados alcanzados. Esta
r-ir-eza ha adelanta<io a 1os laboratorios respecto a otras áreas
de asistencia de manera que la seguridaá del paciente y la
impiantación de indicadores de calidad son realidades en
1a mavor parte de los centros. En la misma línea, se ha avan-
zado en los tiempos de respuesta hasta reducir el circuito de
solicitud-obtención de muestras-emisión de informes-dis-
ponibilidad del resultado por el solicitante, lo que ha dina-
mizado la asistencia y ha fortalecido la imagen del paciente
como centro de la atención.
Como añadido a esta evolución, Ia relación entre departa-
mentos clínicos y laboratorios se está traduciendo en la apli-
cación sistemática de algoritmos que incluyen exploraciones
analíticas, realización de pruebas condicionadas a resultados
previos y aplicación de guías clínicas o consensos aprobados.
Todas ellas son manifestaciones de la integración dinamiza-
dora de los laboratorios en el proceso asistáncial.
Ke{imrs* mc**xrs,áx{$ * e* mrxa *ps X
Bennington lL, Bóer GB, Louvau GE, Westlake GE (eds.). Técnicas de dirección
y control de costes para los laboratorios clínicos. Barcelona: Reverté, i982.
Burnett D (ed.). Una guia práctica para la acreditación del laboratorio clínico.
Barcelona: ReYerté. 2002.
Caballé I (ed.). Gestión del laboratorio clínico. Barcelona: Elsevier-Masson, 2007
UNE-EN ISO 15189. Laboratorios clínicos: requisitos particulares relatiyos
a la calidad y la competencia. AENOR, 2003. Disponible en: lm.aenor.es.
Westgard JO (ed.). Basic Method Validation, 3." edición. Washington: AACC
Press, 2008. Disponible en: m.westgard.com.