LAPORAN HASIL PRAKTIKUM 2 MIKROBIOLOGI

VETERINER I
TEKNIK PEWARNAAN DAN PENGHITUNGAN JUMLAH
BAKTERI

Oleh:
SARUEDI SIMAMORA
NIM: 1209005068

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI VETERINER

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2013
 LAPORAN PRAKTIKUM 2 MIKROBIOLOGI VETERINER I

TEKNIK PEWARNAAN DAN PENGHITUNGAN JUMLAH BAKTERI

A. Tujuan
1. Untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri.
2. Untuk mengetahui cara penghitungan jumlah bakteri.

B. Dasar Teori

Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahawa setiap sel akan

hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi
indeks bagi jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik
pengitungan ini membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran dan
mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi dan
kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan yang dipilih untuk
penghitungan koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang berisi 30-
300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal dihitung dengan
cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada
cawan bersangkutan.
Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas pewarnaan negatif dan pewarnaan
positif yang terdiri atas pewarnaan sederhana dan pewarnaan differensial dan
pewarnaan khusus. Namun pada praktikum ini menggunakan pewarnaan Gram.
Pewarnaan Gram pertama kali dikembangkan oleh Christian Gram, seorang
dokter dari Denmark pada tahun 1883. Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan
differensial karena dapat digunakan untuk membedakan bakteri Gram negatif dan
bakteri Gram positif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang mengikat kuat
pewarna dasar (kristal violet) dan tidak dapat luntur oleh bahan peluntur (alkohol)
dan setelah pewarnaan Gram akan menunjukkan warna ungu. Sebaliknya bakteri
Gram negatif akan kehilangan warna dasar utama setelah tahap dekolorisasi dan
setelah pemberian warna penutup safranin akan memberikan warna merah muda.
Bila bakteri Gram positif tidak diberi mordan iodin setelah pewarnaan dengan
pewarna utama, maka pada tahap dekolorisasi pewarna akan luntur dan akan
nampak sebagai bakteri Gram negatif.
C. Langkah Kerja

1. Pewarnaan Bakteri
a. Menyiapkan isolat bakteri yang telah dibuat sebelumnya.
b. Mensterilkan gelas obyek
c. Meletakan setetes aquades pada obyek gelas dengan menggunakan ose
steril
d. Mengambil lalu mengusapkan isolat bakteri tadi pada obyek gelas
dengan ose steril, lalu mengusapkan pada aquades, dengan membuat
lapisan tipis.
e. Mewarnai bakteri siap dilakukan setelah preparat ini kering.
f. Mengeringkan gelas obyek ini pada temperatur ruang atau diangin –
anginkan.
g. Meneteskan 2-3 tetes zat warna pertama, kristal violet pada permukaan
gelas obyek yang berisi bakteri yang sudah difiksasi. Membiarkan selama
1 menit.
h. Mencuci dengan air mengalir (air kran), kemudian mengeringkannya.
i. Menetesi dengan larutan iodine (agar permukaan bakteri yang diwarnai
tertutup dengan larutan pewarna), membiarkan selama 40 – 60 detik.
j. Mencuci sisa iodine dengan air mengalir dan mengeringkannya.
k. Memiringkan sedikit gelas obyek, kemudian menyirami permukaan gelas
obyek yang berisi bakteri tadi dengan alkohol sampai larutan bekas
cucian alkohol tidak berwarna. Selama kurang lebih 30 menit.
l. Mencuci dengan air mengalir secara singkat dan mengeringkannya.
m. Meneteskan beberapa tetes pewarna penutup, safranin dan membiarkan
selama 1 – 2 menit.
n. Mencuci secara cepat dengan air mengalir dan mengeringkannya (dapat
menggunakan kertas saring)
o. Preparat telah dapat diamati di bawah mikroskop.
p. Mengamati preparat dengan pembesaran 100x menggunakan minyak
emersi)
 q. Mencatat warna yang terlihat, merah menunujukkan Gram negatif dan
biru menunjukkan Gram positif.
r. Mengamati bentuk dan susunan selnya.

2. Menghitung bakteri dengan preparat yang menggunakan metode sebar

(Plate count / Spread plate).
a. Menyiapkan media padat (media Agar) yang akan digunakan.
b. Menyiapkan sampel yang akan dihitung jumlah bakterinya. Bila
menggunakan sampel padat (daging) maka digunakan teknik
maserasi/pemijatan/pencacahan. Bila media cair (air keran) maka secara
aseptik memipet 1 ml suspensi tersebut dengan pipet dan tuangkan ke
dalam tabung pertama (10-1) yang telah berisi larutan pengencer sebanyak
9 ml, kemudian mengocok tabung.
c. Mengambil 1 ml suspensi 10-1 dan menuangkan ke dalam tabung
pengenceran yang bertanda 10-2. Tabung kemudian dikocok.
d. Mengambil 1 ml suspensi 10-2 dan menuangkan ke dalam tabung
pengenceran yang bertanda 10-3. Tabung kemudian dikocok.
e. Mengambil 1 ml suspensi 10-3 dan menuangkan ke dalam tabung
pengenceran yang bertanda 10-4. Tabung kemudian dikocok.
f. Meneteskan suspensi 10-3 sebanyak 0,1 ml di bagian tengah cawan Petri
yang berisi media pertama yang bertandakan pengenceran 10-3.
g. Meneteskan suspensi 10-4 sebanyak 0,1 ml di bagian tengah cawan Petri
kedua yang bertandakan pengenceran 10-4.
h. Setelah suspensi berada pada permukaan medium, meratakan suspensi
dengan menggunakan gelas bengkok steril.
i. Menutup cawan petri dan menunggu selama 5 menit agar suspensi tadi
terserap oleh medium dan permukaan medium tampak kering.
j. Setelah inokulasi selesai, menginkubasikan cawan petri pada suhu 37o C
selama 24 jam dengan posisi terbalik.
k. Setelah inkubasi selesai, dilakukan pengamatan dan jumlah koloni pada
masing – masing cawan petri. Menghitung rata – rata setiap pengenceran
dan hasilnya diperhitungkan untuk tiap 1 ml suspensi sampel. Jumlah
bakteri per ml sampel adalah rata – rata jumlah koloni pada cawan
 dilakukan faktor pengenceran. Faktor pengenceran adalah kebalikan dari
pengenceran yang digunakan.

3. Menghitung bakteri dengan preparat yang menggunakan metode tuang

(Total count / Poneure plate).
a. Menyiapkan media yang akan digunakan. Media yang telah terlebih
dahulu disterilkan dan dididnginkan mencapai suhu 45o – 50oC.
b. Menyiapkan sampel yang akan dihitung jumlah bakterinya. Bila
menggunakan sampel padat (daging) maka digunakan teknik
maserasi/pemijatan/pencacahan. Bila media cair (air keran) maka secara
aseptik memipet 1 ml suspensi tersebut dengan pipet dan tuangkan ke
dalam tabung pertama (10-1) yang telah berisi larutan pengencer sebanyak
9 ml, kemudian mengocok tabung.
c. Mengambil 1 ml suspensi 10-1 dan menuangkan ke dalam tabung
pengenceran yang bertanda 10-2. Tabung kemudian dikocok.
d. Mengambil 1 ml suspensi 10-2 dan menuangkan ke dalam tabung
pengenceran yang bertanda 10-3. Tabung kemudian dikocok.
e. Mengambil 1 ml suspensi 10-3 dan menuangkan ke dalam tabung
pengenceran yang bertanda 10-4. Tabung kemudian dikocok.
f. Mengambil 1 ml suspensi 10-4 dan menuangkan ke dalam tabung
pengenceran yang bertanda 10-5. Tabung kemudian dikocok.
g. Mengambil dengan pipet dan Menuangkan suspensi 10-4 sebanyak 1 ml
ke cawan Petri Steril. Dan menambahkan 20 ml media padat yang masih
cair. Melakukan dengan dua ulangan, agar suspensi tercampur homogen.
h. Memutar cawan petri membentuk angka 8, membiarkan hingga
memadat.
i. Untuk suspensi 10-5 ulangi proses (g) dan (h) namun menggunakan
cawan Petri yang kedua.
j. Setelah memadat. Menginkubasikan pada sushu 37oC selam 24 jam
dengan posisi cawan Petri terbalik.
k. Jika telah diinkubasikan.Bakteri siap dihitung.

D. Alat dan Bahan

Alat dan Bahan Pewarnaan Alat dan Bahan Penghitungan bakteri

 Isolat bakteri  Tabung reaksi seperlunya

 Gelas obyek  Cawan Petri seperlunya
 Bunsen  Media Agar
 Ose  Batang kaca bengkok
 Mikroskop  Pipet ukur steril
 Aquades  Inkubator
 Iodine
 Pewarna Gram (kristal violet)
 Alkohol
 Safranin
 Minyak emersi

Metode
Metode yang digunakan adalah dengan pengecatan Gram. Untuk
penghitungan bakteri menggunakan metode sebar (Plate count) dan tuang (Total
count).

E. Hasil Pengamatan

Dari Pengamatan pewarnaan kami mendapatkan hasil, bahwa bentuk bakteri

berupa coccus atau berbentuk rantai, ada yang micrococcus, diplococcus dan
staphylococcus.

Gambar: Bakteri Hasil Pewarnaan

Gambar: Media isolat bakteri menggunakan metode sebar (Plate count) dan
tuang (Total count)

Adapun rumus penghitungan bakteri yang umum digunakan adalah:

Jumlah Koloni
Jumlah sel per-ml atau per-gram sampel ¿
Volume inokulum x pengenceran

Dalam praktikum ini beberapa isolat bakteri tidak dapat dihitung jumlah
koloninya mungkin karena disebabkan terkontaminasinya media yang kami buat
dan alat yang kami gunakan juga tidak steril.

F. Kesimpulan

Dari hasil praktikum yang kami lakukan, kami menyimpulkan bahwa

pewarnaan bakteri harus dilakukan dengan sangat teliti dan cekatan, sehingga
harus dilakukan latihan dalam pewarnaan ini. Dari hasil yang kami perolehi,
bakteri ini berbentuk coccus menyerupai rantai (mikrococcus, diplococcus dan
staphylococcus) dan ini berarti Gram positif dengan pembesaran 100x
menggunakan minyak emersi. Namun pada mikroskop menunjukkan warna
merah yang berarti Gram negatif, mungkin karena faktor pewarnaan. Pada
pewarnaan ini yang harus diperhatikan adalah warna, bentuk dan susunan sel.
Warna merah menandakan Gram negatif dan warna biru menandakan Gram
positif.
Untuk penghitungan jumlah bakteri, digunakan teknik penghitungan
secara tidak langsung dengan teknik sebar (Plate count/Spread Plate) yaitu
dengan cara melarutkan sampel sebanyak 1 ml dengan pengenceran bertingkat.
Sehingga nantinya sampel dengan pengenceran tertentu dapat ditaruh di
permukaan media Agar kemudian diratakan. Proses penghitungan dilakukan
dengan beberapa kali ulangan untuk mengurangi kesalahan. Sehingga didapatkan
hasil koloni berupa satuan CFU/ml.