Cinética do Crescimento Microbiano. Profa. Michele C. F.

Garcia

1. Introdução
A ser elaborada pela equipe.

2. Objetivo

 Construir as curvas de crescimento celular de Saccharomyces cerevisiae e consumo de substrato.

3. Material

 Espectrofotômetros;
 Agitadores para tubos;
 Shackers com agitação orbital;
 Cabine de segurança biológica (CSB);
 Centrifuga de eppendorf;
 pHmetro calibrado;
 1 frasco Erlenmeyers de 500 mL contendo 350 mL de meio de cultivo YED - Extrato de levedura 1%; Glicose 1% -
já esterilizado, para o inóculo;
 8 frascos Erlenmeyers de 500 mL contendo ~200 mL de meio de cultivo YED - Extrato de levedura 1%; Glicose
1% - já esterilizado (1/equipe) (considerar volume da taxa de inóculo);
 2 Pipetas automáticas de 5,0 mL;
 1 Pipeta automática de 1,0 mL(1/por equipe);
 160 ponteiras de 1,0 mL (20/equipe);
 200 ponteiras de 5,0 mL estéreis;
 160 cubetas de plástico (20/equipe);
 8 estantes para cubetas (1/equipe)
 200 tubos de 10 mL (25/equipe);
 8 grades para tubos (1/equipe);
 5 recipientes para descartes (1/equipe);
 4 Piçetes com álcool 70%;
 Tubos de eppendorf de 2 mL e uma estante para guardá-los no freezer (equipe)
 Detergente ou sabão para lavar as mãos (1 piçete/pia);
 Papel higiênico macio para limpar cubeta;
 Papel guardanapo;
 Identificar as estantes e grades da seguinte forma: 1A, 2A, 3A e 4A; 1B, 2B, 3B e 4B.

4. Preparo do inóculo (preparado um dia anterior à prática)

1. Preparar um frasco Erlenmeyer de 500 mL contendo 350 mL de meio de cultivo YED - Extrato de
levedura 1%; Glicose 1% (Inóculo);
o
2. Esterilizar a 121 C/15 min;
3. Inocular com oito alçadas de células da cultura estoque (em placa) de Saccharomyces cerevisiae.
Observar validade da cultura, a qual não poderá ser superior a 30 dias;
4. Incubar a 25oC overnight (15 h) em agitador rotatório a 180 rpm.

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5. Preparo do meio de cultivo (preparado um dia anterior à prática)

1. Preparar o meio de cultivo para 6 frascos de Erlenmeyer de 500mL, contendo os volumes e

concentrações abaixo descritos. Considerar a concentração para um volume final de 200mL.

- Frasco 1 Grupo A: meio YED contendo 180 mL

- Frasco 1 Grupo B: meio YED contendo 180 mL
- Frasco 2 Grupo A: meio YES contendo 180 mL
- Frasco 2 Grupo B: meio YES contendo 180 mL
- Frasco 3 Grupo A: meio YED contendo 140 mL
- Frasco 3 Grupo B: meio YED contendo 140 mL
- Frasco 4 Grupo C: meio YED contendo 140 mL (parte agitado e parte estático)
- Frasco 5 Grupo D meio YED contendo 160 mL

2. Identificar os frascos com os volumes utilizados;

3. Esterilizar a 121oC/20 min.

6. Ensaio

1. AO TÉRMINO DE CADA ATIVIDADE, MANTENHA A BANCADA LIMPA E ORGANIZADA;

2. Para os Frascos 1 Grupos A e B e Frasco 2 Grupo A e B, nos frascos Erlenmeyer contendo o
meio de cultivo já esterilizado, inocular retirando do frasco “Inóculo”, a pré-cultura de
Saccharomyces cerevisiae na fração de 10% (20 mL). Todo procedimento de inoculação deverá
ser realizado na Cabine de Segurança Biológica;
3. Para os demais grupos, inocular da seguinte maneira:
- Frasco 3 Grupo A: 30% (60 mL).
- Frasco 4 Grupo C: 30% (60 mL).
- Frasco 5 Grupo D: 20% (40 mL)

4. Agitar o frasco (cultivo) e retirar uma amostra de 2,0 mL, colocando-a em um tubo de ensaio separado
(Tempo zero);
5. Grupos A e D: Incubar o cultivo em agitador rotatório a 150 rpm/25oC;
6. Grupos B: Incubar o cultivo de forma estática a temperatura ambiente;
7. O Grupo C deverá incubar o cultivo em agitador rotatório nas primeiras 4h e depois o cultivo será
conduzido de forma estática.
8. Agitar cada tubo e transferir 1,0 mL de amostra para a cubeta;
9. Proceder às leituras das absorbâncias de suspensão celular, tomando-as como tempo zero (t=0).
Marcar os valores obtidos na Tabela em anexo. Utilizar comprimento de onda de 600 nm e água
destilada como branco;

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10. Proceder a leitura de pH;

11. Transferir 1mL para um tubo de eppendorf e centrifugar a 8000 rpm. Congelar o sobrenadante para as
análises de substrato (Técnica de DNS) e concentração de produto (CG);
12. Repetir os procedimentos 5 e 9 a cada hora, marcando o valor da absorbância lida para cada tempo
correspondente (t=1, t=2, t=3, ... t=8);
13. Lembrar que os valores de absorbância NÃO poderão exceder o limite de linearidade. Desta forma, em
determinados pontos será necessário o uso de diluições, sempre com água destilada. Os valores das
diluições devem ser registrados junto à tabela em anexo;
14. Para o cálculo da concentração celular (X), utilizar a seguinte curva de correlação obtida na prática de
técnicas de contagem de células:
15. Plotar os resultados em gráfico relacionando Concentração celular (g/L) X Tempo (h)
16. Os dados de pH podem ser apresentados na forma de tabela.
------
17. Para a análise de substrato será utilizada a técnica de DNS.
18. O sobrenadante separado anteriormente deve ser descongelado e diluído 10X, de acordo com a
equação abaixo:
Fd = Vt/Va
Sendo:
Fd: Fator de diluição
Vt: volume total
Va: volume da amostra

19. Transferir par um tubo de ensaio 0,5 mL da amostra diluída e adicionar 0,5 mL do reagente DNS, ferver
por 5 minutos, após, colocar imediatamente em um banho de gelo e adicionar 5 mL de água. Proceder a
leitura em espectrofotômetro em 540 nm. Para o cálculo da concentração de glicose [S] (g/L), utilizar
uma curva de correlação, que deve ser feita com glicose P.A, os dados planilhados serão concentração
X abs.
Para preparar a curva padrão, proceder às seguintes diluições da solução-mãe de glicose 2g/L.
- P1: 2 g/L (somente 0,5mL da solução-mãe de glicose)
- P2: 1 g/L (1mL da solução-mãe de glicose (P1) mais 1 mL de água destilada);
- P3: 0,5 g/L (1mL da solução (P2) mais 1 mL de água destilada);
- P4: 0,25 g/L (1mL da solução (P3) mais 1 mL de água destilada);
- P5: 0 g/L (somente 0,5 mL de água destilada).

OBS: A curva de correlação SEMPRE deve ser preparada do mesmo modo que as amostras.

20. Plotar os resultados em gráfico relacionando Concentração do Substrato X Tempo(h)

7. Relatório

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 Capa (apenas de papel, não usar capa de plástico dura);

 Introdução (Comentando sobre o crescimento celular e suas respectivas fases);
 Objetivos
 Metodologia
 Resultados, que deve constar:
o O gráfico Abs. celular X tempo. No gráfico deve estar descrito o início e fim de cada fase de
crescimento sugerida;
o A Tabela com os dados completos do crescimento celular;
o Um gráfico com Concentração celular X consumo de substrato (g/L);
o A Tabela com os dados completos das três variáveis analisadas.
 Discussão, comentar cada fase do crescimento e explicando porque ocorreram eventuais alterações
frente à literatura descrita no item Introdução;
 Referências bibliográficas. Deve ter no mínimo 3 referências de livros e sites serão aceitos somente
oficiais (org, gov, ufsc, usp, etc...).
 DATA PARA ENTREGA: 24/08.

8. Referências bibliográficas

1. Wiesbeck E. Univille. Material de aula prática. 2002.

2. Tortora GJ, Funke BR, Case LL. Microbiologia. 6a ed. Porto Alegre: Artes Médicas Sul; 2000.

Tabela de crescimento celular de S. cerevisiae

Grupo ________ ( _______ % inóculo)

Tempo Abs. Amostra Água Diluição

Abs. 1 X = ((a.Abs+b) x diluição
(h) Diluição (mL) (mL) (vezes)
t0

t1

t2

t3

t4

t5

t6

t7

t8

t9