CROMATOGRAFIA

1. Objetivos
Aprender y hacer uso de los métodos de cromatografía por columna y capa fina
Caracterizar al disolvente y a la capa adsorbente que permita obtener resultados
óptimos.
Comprobar mediante la separación la polaridad de cada componente de los
compuestos
Identificación de los compuestos naturales que se presentan en la experiencia.

2. Fundamento Teórico

a. La clorofila

La clorofila es uno de los compuestos químicos fundamentales de todas las

plantas; esta biomolécula no sólo es la responsable de color verde que tienen la
mayoría de los integrantes del reino vegetal, sino que también es la principal
involucrada, junto con la luz, en el proceso de fotosíntesis, por la cual las plantas
se nutren.

Una curiosidad de la clorofila es que su estructura molecular se asemeja mucho a

la de la sangre. Las moléculas responsables del color rojo de la sangre y de
transportar el oxígeno, conocidas como hemoglobinas, tienen una estructura muy
similar a la de la clorofila, excepto por la de su átomo central: en la hemoglobina
está compuesto principalmente por hierro y en la clorofila por magnesio, de allí
que con buena razón se denomine a la clorofila como “la sangre de las plantas”.

Tipos de Clorofila:

Clorofila A (C55H72O5N4Mg): Es el tipo de clorofila más habitual, ya que las tres

cuartas partes de clorofila pertenecen a este tipo. Los higos, tomates, espinacas y
las hojas de stevia son muy ricos en este tipo de clorofila.

Clorofila B (C55H70O6N4Mg): Menos frecuente que la clorofila A. Aparece en

plantas, algas verdes y en otros organismos como algunas cianobacterias.

Otros tipos de Clorofila son la clorofila C1y C2 que aparecen en algunas algas rojas y
en algunas más primitivas. La clorofila D es más exclusiva, apareciendo en la
cianobacteria (Acaryochloris marina) y una alga marina.

b. Los carotenoides
Los carotenoides son pigmentos liposolubles naturales que son sintetizados por las
plantas, algas y bacterias fotosintéticas. Los carotenoides son las fuentes de los
colores amarillo, naranja y rojo de muchas plantas, p. ej., el color rojo y anaranjado
de las naranjas, los tomates y las zanahorias y el amarillo de muchas flores.
Los carotenoides se pueden clasificar en general en dos tipos:
 Carotenos, p. ej., el beta caroteno y el licopeno,
  Xantofilas, p. ej., la luteína y la zeaxantina.

Algunos de los carotenoides, como el beta caroteno, se pueden convertir en

vitamina A y son denominados carotenoides provitamina A. Puesto que los
carotenoides no pueden ser sintetizados por los humanos, es necesario
obtenerlos a partir de los vegetales en la dieta.
Los suplementos dietéticos constituyen fuentes adicionales de carotenoides.
También se utilizan para enriquecer o dar color a alimentos y bebidas
procesados, ya sea en forma de extractos naturales o como compuestos puros
fabricados mediante síntesis química.
Los carotenoides son factores importantes para la salud humana y son
esenciales para la visión. Está bien estudiado el papel que tienen algunos
carotenoides (p. ej., el beta caroteno) como la principal fuente dietética de
vitamina A. Además, se han reconocido los potenciales efectos protectores de
los carotenoides contra las enfermedades oculares degenerativas y otros
trastornos carenciales. Por lo tanto, la ingesta de suficientes carotenoides es
crucial para prevenir el desarrollo de enfermedades carenciales. Más aún,
algunos carotenoides tienen un potencial considerable para la promoción de la
salud y el tratamiento de enfermedades.

c. Polaridad de la clorofila y los carotenoides

Las primeras en formarse corresponden a los compuestos más grandes y

polares, que no han podido ser arrastrados bien por el propanol en éter de
petróleo, es decir: los carotenoides polares: Xantofilas, las siguientes serán las
Clorofilas más polares: Clorofila b, las siguientes las Clorofilas apolares:
Clorofila a; y por último los carotenoides más apolarares: Carotenos.

De esta forma tenemos esas bandas amarillentas por debajo, unas bandas
verdes encima de éstas, otra banda verde más intenso y una banda amarilla
arriba del todo.
 3. Datos
Tabla 1 Propiedades del n-hexano

Propiedad
Punto de ebullición 69 °C
Punto de fusión -95°C
Densidad relativa respecto al agua 0.7
Solubilidad en agua 0.0013
Presión de vapor 17 kPa
Punto de inflamación -22 °C
Temperatura de autoignición 225 °C
Inflamable Altamente
Explosiva En mezclas
vapor / aire
Reacciona
Liquido Incolora
Volátil

Tabla 2 Propiedades de la acetona

Propiedad
Aspecto Liquido, incoloro
Punto de ebullición 56.5 °C
Punto de fusión -94 °C
Punto de inflamación -20 °C
Presión de vapor 233 hPa
Toxicidad 5800 mg/kg

Tabla 3 Propiedades de la silica de gel

Propiedad
Color Blanco
Olor Inodoro
Solubilidad Insoluble en agua
Estabilidad Temperaturas ambientales
Toxicidad No se considera peligroso
Reactividad No va a polimerizar
 4. Diagrama de procesos

Armado del sistema con la Sistema con la fase Compuesto

fase estacionaria para estacionaria coloca en un orgánico del cual
realizar la experiencia Erlenmeyer, en aquí se 1 mL va para el
utiliza también el vacío sistema armado
para acelerar el proceso.

Aquí se observa
El agregado del Recolección del a la clorofila de
compuesto pigmento un color verde
orgánico para la amarillo al inicio oscuro. El cual
separación de los del descenso y el nos indica mayor
componentes concentrado. concentración
del tipo a
Preparación de papilla Adición de la papilla Calentamiento a T°
(silica de gel) en las placas constante

Preparación del
Enfriamiento a T° disolvente y añadido
ambiente Insertar las placas en
en un vaso de 250 mL
el vaso de 250 mL

Obtención de los componentes

presentes en la muestra
5. Discusión de resultados

a) Resultados obtenidos
- Para la relación de n-hexano puro

Componente Relación de
desplazamiento
Amarillo 9.9 ∗ 10−2

- Para la relación de n-hexano con acetona de 5 a 1

Componente Relación de
desplazamiento
Verde 9.9 ∗ 10−2
Gris oscuro 0.2545
Amarillo 0.8181

- Para la relación de n-hexano con diclorometano de 4 a 1

Componente Relación de
desplazamiento
Verde 0.1754
Gris oscuro 0.2631
Amarillo 0.9649

b) Observaciones
 En la preparación de la silica de gel se observa que al añadir al solido una
cantidad pequeña de agua se muestra una formación de una masa viscosa, así
como el levantamiento de polvillo, la consistencia de la masa disminuye con la
adición del agua haciéndose una mezcla acuosa flexible. La cual es añadida a
unas pequeñas placas de vidrio de tal manera que resulte una capa uniforme
sin grumos. Luego de ello se lleva a la estufa de tal manera que se obtendrá
que la capa de gel se adhiere a la placa volviéndola una masa sólida. Se coloca
dos gotas de la muestra de pigmentos de tal manera que tenga una buena
concentración. Se continua con la adición de soluciones en vasos que incluyen
papel filtro del cual se observa que las soluciones suben por las paredes del
papel humedeciéndolos, entonces se inserta las placas en estos vasos y se
observa que luego de unos minutos se ve la formación de puntos coloreados
sobre la placa con separaciones entre ellas.

 En la cromatografía en columna, la fase estacionaria utilizada, es decir, el

absorbente, se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza
con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna.
Observamos que al agregar el compuesto orgánico el color verde se queda
 impregnado en la arena sin descender, mientras que el color amarillo es
arrastrado por la fase móvil.

 Cuando el pigmento de color amarillo empieza a descender notamos un color

amarillo-anaranjado clara, luego sigue el color amarillo intenso el cual es
recolectado.

 Notamos que la parte verde que no descendió se disolvió en cierta parte pero
permanece en la parte superior.
 Al agregar hexano-diclorometano empezó a descender lentamente el color
verde quedando la parte superior poco a poco transparente y sin rastro del
compuesto orgánico. Se recolecto el color verde oscuro.
 Al agregar acetona observamos un verde más claro que desciende también es
recolectado para nuestro dato
c) Explicaciones
 Se usa la silica de gel como absorbente debido a que es inerte con la muestra y
no actúa como catalizador en reacciones de descomposición. El absorbente
funciona debido a que interacciona con las sustancias mediante dipolo-dipolo
o por enlace de hidrogeno si lo presenta. Se puede usar otro tipo de
absorbentes, pero tiene que permitir separar sustancias más polares. Cuando
se hace uso de los solventes que funcionaran como la fase móvil este
ascenderá por capilaridad a través del absorbente, se produce un reparto
diferencial de los productos presentes entre el disolvente y el adsorbente.
 La retención se puede explicar en base a la competencia que se establece
entre el soluto a separar y la fase móvil por adsorberse a los centros activos
polares de la fase estacionaria. Así, las moléculas de soluto se encuentran
adsorbidas en la fase estacionaria y a medida que se produce la elución van
siendo desplazadas por la fase móvil. La retención y la selectividad en la
separación dependen de los valores respectivos de las constantes de los
diferentes equilibrios químicos se toma en cuenta la polaridad del compuesto
y la naturaleza del disolvente.

 La clorofila a es el pigmento involucrado directamente en la transformación de

la energía lumínica en energía química, las células fotosintéticas casi siempre
contienen un segundo tipo de clorofila, la clorofila b y otro grupo de pigmentos
llamados carotenoides.

 La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil, la mezcla orgánica

que nos interesa separar, dejamos descender lentamente y adicionamos
hexano para que arrastre el pigmento de color amarillo que desciende
lentamente entonces la fase móvil podrá ir atravesando el sistema.

 Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco

saldrán de la columna cromatografía, y se recogen en fracciones. Las fracciones
menos polares, que son por lo general las que se retienen poco o nada en el
absorbente, serán las primeras en salir de la columna. En cambio, las sustancias
más polares, quedan retenidas por más tiempo en el absorbente, y a menudo
es necesario el uso de la fase móvil por la que el hexano se vuelve a adicionar.
  El pigmento que primero se pudo obtener fue el caroteno, ya que al ser no
polar como lo indicado anteriormente, la retención en la columna fue muy
poco por lo que su extracción fue la más rápida.
 Siguiendo el orden de polaridad lo segundo obtenido fueron las xantofilas, que
poseen tonalidades amarillentas pero también poseen tonalidades
anaranjadas (muy poca), al ser un compuesto polar.
 Para eluir la segunda fracción utilizamos hexano – diclorometano (10:1), la
polaridad nos indicó que el siguiente pigmento obtenido fue la clorofila a, del
cual se logró obtener la mayor cantidad y una parte de la b en proporción
mínima
d) Conclusiones
 La mezcla de disolventes debe tener bajos puntos de ebullición y viscosidad, lo
que permitirá moverse con rapidez, si se requiere identificar la polaridad
resulta ser el promedio de la cantidad de cada disolvente.
 La característica más importante del adsorbente a usar es que debe un buen
separados de componentes de acuerdo a su polaridad así como la
imposibilidad de reaccionar con la muestra o el disolvente.
 Por los datos recopilados se intuye que un buen disolvente seria n-hexano y
acetato en proporciones de 5 a 1, debido a poseer una polaridad correcta que
permite una buena interacción.
 El componente de color amarillo resulta ser xantofila y el componente verde
resulta ser clorofila puede ser A o B.
 La cromatografía en columna es quizás uno de los más versátiles métodos,
utilizado para la separación a su vez para la purificación de diferentes
compuestos orgánicos que se encuentren en líquido.
 La estructura de los pigmentos vegetales los hace insolubles en agua, razón
por la cual se necesitó de disolventes orgánicos (hexano y acetona).
 La polaridad de los pigmentos varía significativamente en siendo los no
polares los carotenos, continuando con una mayor polaridad que los
carotenos y la xantofila, a continuación siendo los más polares la clorofila,
siendo el tipo b más polar que el a y se comprobó esto es los resultados en
el laboratorio ya que obtuvimos mayor cantidad de la clorofila a que es de
un color verde oscuro.

6. Cálculos
distancia recorrida por el compuesto
𝑅𝑓 =
distancia recorrida por el solvente

a) Para la relación de n-hexano puro

Componente(color) Desplazamiento (cm)
Amarillo 0.5
Solvente 5.5

0.5
Componente amarillo= 5.5 = 9.9 ∗ 10−2
 b) Para la relación de n-hexano con acetona de 5 a 1

Componente(color) Desplazamiento(cm)
Verde 0.5
Gris oscuro 1.4
Amarillo 4.5
Solvente 5.5

0.5
Componente verde=5.5 = 9.9 ∗ 10−2
1.4
Componente Gris oscuro =5.5 = 0.2545
4.5
Componente Amarillo =5.5 = 0.8181

c) Para la relación de n-hexano con diclorometano de 4 a 1

Componente(color) Desplazamiento(cm)
Verde pálido 1
Verde oscuro 1.5
Amarillo 5.5
Solvente 5.7

1
Componente verde=5.7 = 0.1754
1.5
Componente Gris oscuro = = 0.2631
5.7
5.5
Componente Amarillo = = 0.9649
5.7

7. Bibliografía

http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/FISQ/Ficheros/20
1a300/nspn0279.pdf

http://docs-europe.electrocomponents.com/webdocs/0d27/0900766b80d27aae.pdf

https://www.vix.com/es/imj/salud/2010/04/19/propiedades-y-beneficios-de-la-clorofila

https://www.botanical-online.com/clorofila.htm

https://permian.wordpress.com/2007/11/23/cromatografia-en-papel/