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I.

INTRODUCCION:

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos se requiere de un


microscopio óptico ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripción
morfológica de estos. El microscopio de uso más común es el microscopio de campo
claro, en el que la observación de células vivas es limitada debido a que las células son
incoloras y permiten el paso de gran cantidad de luz.
La utilización de frotis teñidos es más recomendable, el frotis se prepara haciendo
una extensión de los microorganismos en una superficie transparente donde se fijan
y tiñen.
Podemos tener tinciones: Simple, diferencial, negativa y selectiva.
Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos cagados
conocidos como cromóforos por ejemplo:
Cloruro de azul de metileno.
Si el cromóforo es un ion positivo del colorante es de tipo básico y si la carga es
negativa es de tipo acido.

II. Marco teórico


Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio
para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado al
diagnóstico de enfermedades infecciosas y en la caracterización de nuevas especies. Existe una
gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes
agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La tinción de Gram se
considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras que la
tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el campo de
la parasitología.

Existen técnicas de tinción específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que se
utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis, o la
tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los componentes estructurales de los
hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental
para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa.

La observación microscópica puede efectuarse mediante el examen en fresco de una suspensión


microbiana, lo que permite visualizar microorganismos vivos y reconocer sus movimientos,
apreciar sus distintas formas, tamaños y agrupaciones, o mediante un extendido o frotis
coloreado, lo que posibilita según la técnica utilizada, diferencias microorganismos, observar
su morfología, tamaño y agrupación o la observación de ciertos elementos facultativos como
flagelos, capsula ó endosporas.

Los colorantes utilizados en microbiología son sales, las cuales tienen un ion cargado
positivamente y otro negativamente, de los cuales uno está coloreado. Cuando el ion está
coloreado es el cargado negativamente, el colorante se clasifica como aniónico o acido, por
ejemplo, el eosinato de sodio, el cual se ioniza como sodio+ y eosinato+. Cuando el ión coloreado
es el cargado positivamente, el colorante se clasifica como catiónico o básico, por ejemplo el azul
de metileno, el cual se ioniza como cloruro- y azul de metileno.

Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante ocurre un intercambio de iones entre
el colorante y los sitios activos de las superficies o el interior de la célula. Los iones teñidos del
colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, así, por ejemplo, el catión azul de
metileno+ reemplaza al catión Na+ de las células dándoles color.
Según la estructura que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en :
coloraciones simples, en las que sólo se emplea un colorante para el proceso, ejemplo azul de
metileno; coloraciones compuestas y diferenciales, en las cuáles se usa más de un colorante y con
la misma coloración , las células se tiñen de manera diferente, ejemplo Gram, Ziehl Neelsen, y
coloraciones especiales que permiten la observación de estructuras especiales de la bacteria como
endosporas, glicocaliz, capsulas, flagelos.

En la práctica de Tinciones los estudiantes realizarán técnicas simples como la tinción con azul
de metileno y Diferenciales como la Tinción de Gram para diferenciar las bacterias en Gram (+) y
Gram (-) Teniendo en cuenta la composición química de su pared celular (peptidoglucano). Una
coloración negativa para tinción de cápsulas bacterianas, tinción de Ziehl Neelsen para
identificación de bacterias acido alcohol resistente y la tinción de Shaeffer Fulton para la tinción
de endosporas.

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones
diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de
24 horas en bacterias Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram se basa
en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias

III. OBJETIVO
 El alumno aprenderá las técnicas de preparación de frotis, fijación y
coloración más utilizadas en el estudio de microorganismos de cultivo
bacteriano obtenidos en medios sólidos y líquidos.
 Identificara las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones
simples en la caracterización morfológica de estos microorganismos.
 Realizar diferentes técnicas de tinción para la visualización de estructuras celulares
de bacterias.
 Adquirir destreza en el montaje y observación de preparados microbiológicos
empleando técnicas de tinción simple y diferencial.
 Comprender los principios teóricos en los cuales se basan las técnicas de tinción
en microbiología.
Comprender la importancia De las Buenas Prácticas de Laboratorio

IV. MATERIALES:
 Mechero.
 Asa de siembra
 Porta objetos
 Piceta con agua destilada
 Microscopio compuesto de campo claro
 Azul de metileno
 Aceite de inmersión
 PROCEDIMIENTO
 FROTIS
 1 probeta graduada
V. Metodología.

Caracterización macroscópica:
A partir de los cultivos de bacterias en medio sólido, describir las características que observa,
teniendo en cuenta el color, aspecto y consistencia de las colonias de los microorganismos en
el medio de cultivo.
Realización de frotis:
 A partir de medio líquido: Cargue el asa bacteriológica con una gota de cultivo y deposítela
en un portaobjetos limpio realizando una extensión en forma circular de la muestra hasta
conseguir una capa fina (frotis).
 A partir de un medio sólido: Ponga una gota de solución salina fisiológica (NaCl 0,9%)
estéril en el portaobjetos. A continuación cargue el asa con una pequeña cantidad de
bacterias de una colonia del cultivo y re suspéndala en la gota hasta homogeneizar. Hágalo
de forma circular.
Fijación al Calor:
 La preparación se deja secar al aire libre, cerca al mechero.
 Una vez seca, se procede a la fijación, haciendo pasar la preparación 3-4 veces por la llama
del mechero (la llama debe tocar la parte posterior del portaobjetos).
 A partir de este momento la preparación está lista para teñir y el procedimiento a seguir
depende del tipo de tinción
Tinciones a realizar:
Coloración de azul de metileno (Tinción simple)
Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los
eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos
metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.
Procedimiento:
 Tome una muestra de los cultivos de Escherichia coli y Bacillus spp.
 Fije al calor la muestra.
 Cubrir con azul de metileno la preparación y esperar 2 minutos.
 Lavar con agua.
 Secar al aire y pasar por el mechero tres veces.
 Observar al microscopio hasta llegar al objetivo de 100x utilizando aceite de inmersión.
VI. RESULTADOS:

No en todos los frotis se logro observar con claridad, pues en algunos fue fallida la técnica,
pero como opción preventiva se realizaron 6 frotis, para que se lograra observar por lo menos
1.
De lo observado, se logro observar poco debido a que no tomo debidamente la coloración.
VII. DISCUSIÓN:

La clave de la realización de la tinción simple en seco, está en que al momento de la fijación,


esta debe de ser cuidadosamente, pues se corre el riesgo de que se queme la muestra; por otro
lado también al momento de retirar el exceso de azul de metileno con agua, debe ser de una
manera lenta y cuidadosa, pues se corre el riesgo de que se vaya con todo y muestra.

VIII. CONCLUSIONES:

La observación de bacterias mediante esta técnica no es muy precisa pero se logran algunas
buenas observaciones con el lente 100X.

IX. Bibliografía
 López L et al. Artículo de revisión: Las tinciones básicas en el laboratorio de
microbiología [edición online]. 2014; Vol 3, No. 1 [9 páginas]. Accesible en
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 Negroni M. El diagnóstico en clínica estomatológica. 2ª Edición. Buenos Aires. Editorial
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 Escobar de Rico M. Prácticas de laboratorio: fundamentos de microbiología. Santafé de
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 Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología médica. 26ª Edición. Editorial Mc Graw Hill.
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 Brock et al. Biología de los microorganismos. 12ª Edición. Madrid. Pearson: Adisson
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 Fijación al calor. Accesible en URL:
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