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BIOCHIMIE STRUCTURALE

4 - ENZYMES
Licence STE – 1ère année (UE2-1)
(2008-2009)
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INTRODUCTION ................................................................................................................................ 2


1 - STEREOSPECIFICITE DES ENZYMES ............................................................................................ 3


2 - CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE ..................................................................................... 3


3 - COFACTEURS ET COENZYMES ................................................................................................... 4


4 - MODE D'ACTION DES ENZYMES................................................................................................ 5



4. 1 - Réaction non catalysée..................................................................................................... 5

4. 2 - Réaction catalysée par une enzyme ............................................................................... 5


5 - CATALYSE ENZYMATIQUE ......................................................................................................... 6



5. 1 - Cinétique enzymatique ................................................................................................... 7

5. 2 - Equation de Michaelis-Menten....................................................................................... 8

5. 3 - Détermination expérimentale de Vmax et de Km ....................................................... 9


6 - ENZYMES ALLOSTERIQUES ........................................................................................................ 9


7 - ACTIVITE ENZYMATIQUE - ACTIVITE SPECIFIQUE ................................................................. 10


8 - REGULATION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE ........................................................................ 12



8. 1 - Biosynthèse sous forme de précurseur ....................................................................... 12

8. 2 - Phosphorylation ............................................................................................................. 12

8. 3 - Inhibition enzymatique ................................................................................................. 13

8. 4 - Effet du pH...................................................................................................................... 14


9 - INACTIVATION DES ENZYMES ................................................................................................. 15



4. Enzymes - page 2 -

INTRODUCTION
Les enzymes sont des catalyseurs hautement spécifiques. À chaque réaction
biochimique se déroulant dans la cellule est attachée une enzyme particulière qui catalyse
une réaction, selon un mécanisme bien défini, à laquelle prennent part des composés
(réactifs ou substrats), eux-mêmes bien définis. Les enzymes sont les catalyseurs
protéiques qui ont un pouvoir catalytique souvent supérieur de beaucoup aux catalyseurs
synthétiques. Grâce aux enzymes, les réactions biochimiques sont caractérisées par :
➬ une vitesse élevée,
➬ des conditions physiologiques (modérées) de température, de pression et de pH,
➬ une double spécificité, spécificité réactionnelle et spécificité vis-à-vis de son
substrat,
➬ un système de régulation, cette dernière caractéristique étant indispensable pour
l'intégration métabolique d'un organisme.

TABLEAU 6.6: Exemples de pathologies liées à la perte ou au dysfonctionnement d'une protéine ou d'une enzyme
Pathologie Effets physiologiques Enzyme ou protéine impliquée
Mucoviscidose Sécrétion anormale pulmonaire, pancréatique Canal chlorure
et des glandes sudoripares. Maladie chronique
conduisant généralement à la mort dans
l'enfance ou chez l'adulte jeune
Syndrome de Déficits neurologiques, automutilation, retard Hypoxanthine-guanine
Lesch-Nyhan mental phosphoribosyl transférase
Immunodéficience Perte sévère de la réponse immune Purine nucléotide
phosphorylase
Immunodéficience Perte sévère de la réponse immune. Les enfants Adénosine désaminase
ne peuvent vivre que dans des bulles stériles
Maladie de Gaucher Érosion des os, de l'articulation de la hanche. Glucocérébrosidase
Quelquefois, lésions cérébrales
Goutte primaire Surproduction d'acide urique conduisant à des phosphoribosyl
attaques récurrentes d'arthrite aiguë pyrophosphate synthétase
Rachitisme Petite taille, convulsions 25-Hydroxycholécalciférol
vitamine D-dépendant -1-hydroxylase
Hypercholestérolémie Athérosclérose due à des concentrations élevées Récepteur des LDL
familiale de cholestérol dans le sang. Parfois, mort par
lésion cardiaque
Maladie de Tay-Sachs Déficit moteur, détérioration mentale, mort à Hexosaminidase A
l'âge de 3 ans
Anémie falciforme Douleur, gonflement des mains et des pieds. Hémoglobine
(drépanocytose) Peut conduire à des douleurs sévères, brutales
des os et des articulations et à la mort

Les enzymes sont une des clés permettant de comprendre comment les cellules
survivent et prolifèrent. Certaines pathologies, en particulier les maladies génétiques
héréditaires, sont dues au dysfonctionnement ou à l'absence de une ou plusieurs enzymes
(TABLEAU 6.6). Des désordres peuvent aussi être dus à l'activité excessive d'une enzyme.
4. Enzymes - page 3 -

1 - STEREOSPECIFICITE DES ENZYMES


Les enzymes ont, comme toutes les autres protéines, des masses moléculaires
s'échelonnant d'environ 12 000 à plus de 1 million et peuvent être formées de 1 ou de
plusieurs sous-unités.
La caractéristique la plus marquante d’une enzyme est sa double spécificité.
➬ Spécificité réactionnelle. Une enzyme ne catalyse qu’un seul type de réaction,
par exemple une hydrolyse ou bien le transfert d’un certain groupe d’atomes.
➬ Spécificité vis-à-vis de son substrat. Parmi les substances, parfois nombreuses,
susceptibles de subir cette réaction, l’enzyme n’est active, en règle générale, qu’à l’égard
d’une seule substance (ou d’une classe de substances ayant en commun certains éléments
bien définis d’architecture moléculaire) qui est alors appelée substrat. Par exemple, la
β-galactosidase cata lyse l’hydrolyse des β-galactosides mais pas des β-glucosides qui
pourtant ne diffèrent que par l’inversion d’un hydroxyle en C4. Cette stéréospécificité des
enzymes est particulièrement évidente dans le cas des énantiomères. L’enzyme ne
reconnaîtra (et donc ne modifiera) qu’un seul des 2 isomères optiques.
Cette spécificité des enzymes résulte d’une reconnaissance discriminative liée à la
conformation de l'enzyme et plus précisément de son centre actif (organisation spatiale,
disposition des charges…) qui la rend spécifique d'un nombre limité de substrats.

2 - CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE
À l’exception des «vieilles enzymes» (trypsine, papaïne…), la plupart des enzymes sont
nommées et classées selon la réaction qu’elles catalysent. On rajoute le suffixe "-ase" au
nom de leur substrat ou à un nom décrivant la réaction catalysée.
Exemple : l'uréase catalyse l'hydrolyse de l'urée, l'ADN polymérase catalyse la synthèse
d'ADN.

TABLEAU 9.1: Classification des enzymes en fonction du type de réaction catalysée


Classe Type de réaction Exemples
1. Oxydoréductases Réactions d'oxydation-réduction L-lactate:NAD oxydoréductase
(ou L-lactate déshydrogénase)
(oxydases, péroxydases, réductases)
2. Transférases Transfert de groupes fonctionnels Carbamylphosphate:L-aspartate
carbamyltransférase
(inclut les kinases)
3. Hydrolases Réactions d'hydrolyse Glycérol ester hydrase (ou lipase)
4. Lyases Élimination de groupes pour former Fructose diphosphate aldolase
des doubles liaisons (synthases)
5. Isomérases Isomérisation Triose phosphate isomérase
6. Ligases Formation de liaison couplée avec Acétyl-CoA synthétase
l'hydrolyse d'ATP (synthétases)
4. Enzymes - page 4 -

Cela conduit parfois a des aberrations. La même enzyme peut ainsi avoir deux ou
plusieurs noms, ou bien deux enzymes différentes ont le même nom. Pour éviter de telles
ambiguïtés, il a été nécessaire d'adopter un système pour nommer et classer les enzymes :
le système de nomenclature IUB (International Union of Biochemistry). Dans ce système,
toutes les enzymes sont réparties dans une des six classes basées sur le type de réaction
catalysée (TABLEAU 9.1). Ces classes sont elles-mêmes subdivisées en sous-classes
permettant de mieux définir la fonction de chaque enzyme.
La classification de l’IUB assigne de plus à chaque enzyme un numéro de code à quatre
nombres et un nom systématique qui identifie la réaction catalysée.
Exemple : l'enzyme catalysant la réaction ATP + D-glucose → ADP + D-glucose-6-phosphate
est appelée ATP:glucose phosphotransférase, ce qui indique qu'elle catalyse le transfert
d'un groupe phosphate de l'ATP sur le glucose. Son numéro de code est 2.7.1.1. Le 1er
chiffre (2) indique la classe (transférase), le second (7) la sous-classe (phosphotransférase),
le 3ème et le 4ème donnent des informations supplémentaires sur le type de groupement et
sur la molécule accepteurs du phosphate. Quand le nom systématique est long ou
incommode, on utilise souvent un nom commun (ici hexokinase, c'est-à-dire enzyme
phosphorylant les hexoses).

3 - COFACTEURS ET COENZYMES
Certaines enzymes ne nécessitent pour leur activité aucun groupe chimique autre que
ceux de leurs acides aminés. D'autres nécessitent, au contraire, un composant chimique
additionnel, le cofacteur. L'apoenzyme additionné de son cofacteur forment
l'holoenzyme. Les cofacteurs peuvent être des ions (Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+) ou des
molécules plus complexes, organiques ou métallo-organiques, appelées coenzymes. Les
réactions des classes 1, 2, 5 et 6 nécessitent des coenzymes. De nombreuses vitamines
(vitamine = amine vitale), composés qui ne peuvent pas être synthétisés par les animaux
et doivent être apportés par l’alimentation, sont des précurseurs de coenzymes. Beaucoup
furent découvertes, et leur rôle défini, à l'occasion de l'étude des troubles métaboliques
résultant de leur carence.
Exemple : la thiamine (vitamine B1) dont la carence est responsable du béribéri :
affection du système nerveux avec asthénie (fatigue).
Les coenzymes fonctionnent comme des porteurs transitoires de groupes fonctionnels
spécifiques. Dans certains cas, le coenzyme peut être considéré comme un cosubstrat. En
effet, la modification chimique qu'il subit contrebalance exactement celle du substrat.
Exemple: dans les réactions d'oxydo-réduction catalysées par les déshydrogénases, la
molécule de substrat est oxydée (déshydrogénée) et une molécule de coenzyme est réduite
(hydrogénée). Le coenzyme oxydé est régénéré par la suite.
XH2 + FAD → X + FADH2
4. Enzymes - page 5 -

4 - MODE D'ACTION DES ENZYMES


La catalyse enzymatique est essentielle à tout organisme vivant. Dans les conditions
physiologiques, les réactions non catalysées tendent à être très lentes ou carrément
impossibles comme celles nécessaires pour envoyer un stimulus nerveux ou contracter un
muscle. Cette lenteur est essentiellement due à la stabilité des biomolécules.

4. 1 - Réaction non catalysée


Dans le cas d'une réaction spontanée S P, le diagramme énergétique aura le profil
montré dans la FIGURE 8.3. Dans sa forme normale (stable) ou état initial, toute molécule
(telle que S ou P) contient une quantité caractéristique d'énergie libre. L'équilibre entre S
et P reflète la différence d'énergie libre de leurs états initiaux. Dans l'exemple de la
FIGURE 8.3, l'énergie libre de l'état initial de P est plus faible que celle de S, de telle sorte
que ΔG' de la réaction est négative et que l'équilibre est en faveur de P. Cet équilibre n'est
modifié par aucun catalyseur.
Toutefois, un équilibre favorable ne signifie pas que la réaction soit rapide. La vitesse
d'une réaction dépend d'un tout autre paramètre. Il existe une barrière énergétique entre S
et P qui représente l'énergie nécessaire à l'alignement des groupes réactionnels, à la
formation de charges transitoires instables, au réarrangement des liaisons et aux autres
transformations nécessaires pour que la réaction ait lieu dans un sens ou dans l'autre. Ceci
est illustré par la courbe d'énergie en cloche. Pour que la réaction ait lieu, les molécules
doivent surmonter cette barrière, ce qui signifie que leur niveau d'énergie doit être
augmenté. Au sommet de la courbe, il existe un point d'où la descente vers S ou vers P est
également probable : l'état de transition.
L'état de transition n'est pas une espèce chimique avec une stabilité propre et ne doit
pas être confondu avec un intermédiaire réactionnel. La différence entre les niveaux
d'énergie de l'état initial et de l'état de transition est appelée énergie d'activation. La
vitesse d'une réaction reflète cette énergie d'activation : plus l'énergie d'activation est
élevée, plus la réaction est lente. Les vitesses de réaction peuvent être accélérées en
élevant la température, ce qui augmente le nombre de molécules avec une énergie
suffisante pour franchir la barrière énergétique. La barrière énergétique peut au contraire
être abaissée en ajoutant un catalyseur.

En résumé, les catalyseurs (et par conséquent les enzymes) ne modifient pas
l'équilibre d'une réaction. Ils modifient uniquement sa vitesse en abaissant son énergie
d'activation.

4. 2 - Réaction catalysée par une enzyme


Une enzyme contourne les problèmes de stabilité des molécules dans les conditions
physiologiques en fournissant un environnement spécifique dans lequel une réaction
4. Enzymes - page 6 -

donnée est énergétiquement favorable. La caractéristique distinctive d'une réaction


catalysée par une enzyme est qu'elle a lieu dans un espace confiné de l'enzyme appelé site
actif (FIGURE 8.6).
Une réaction enzymatique comporte 2 étapes. La première consiste en la formation
d’un complexe stéréospécifique entre l’enzyme et son substrat. Ce complexe a 2 fonctions :
le choix exclusif du substrat, déterminé par la structure stérique de ce dernier, et la
présentation du substrat selon une orientation précise par rapport à l’enzyme. La seconde
est l’activation catalytique de la réaction au sein du complexe. Cette réaction est orientée
et spécifiée par la structure du complexe et conduit à la transformation du substrat en
produit.
Les enzymes se comportent comme tous les catalyseurs. Toute enzyme catalysant la
réaction S → P catalyse aussi la réaction P → S. Le seul rôle de l'enzyme est d'accélérer
l'interconversion entre S et P. On atteint donc le même état d'équilibre que la réaction soit
catalysée ou non. La seule différence est qu’en présence de l'enzyme appropriée l'équilibre
est atteint beaucoup plus vite parce que la vitesse de réaction est augmentée.
Ce principe général peut être illustré par la réaction, qui à partir de glucose et d'O2
forme du CO2 et de l'H2O. La ΔG0' de cette réaction est très importante. Pourtant, le
glucose est un composé stable et peut être mélangé dans un récipient à de l'eau et de
l'oxygène presque indéfiniment sans réagir. Sa stabilité reflète l'importante énergie
d'activation de la réaction. Dans les cellules, le glucose est scindé en présence d'O2 en CO2
et H2O au cours d'une série de réactions catalysées par des enzymes. Ces enzymes non
seulement accélèrent ces réactions, mais les organisent et les contrôlent de telle sorte que
l'énergie libérée du cours de ce processus est récupérée sous d'autres formes de manière à
pouvoir être utilisée par la cellule pour d'autres besoins.
Quand la réaction S P est catalysée par une enzyme, la réaction peut s'écrire:
E + S ES EP E + P
où E, S et P représentent l'enzyme, le substrat et le produit.
ES et EP représentent les intermédiaires de réaction (des espèces chimiques
transitoires). Ils occupent les creux sur le diagramme d'activation (FIGURE 8.4). Quand
une réaction comporte plusieurs étapes, la vitesse globale est déterminée par l'étape qui a
la plus haute énergie d'activation = étape limitante.

5 - CATALYSE ENZYMATIQUE
En se basant sur le profil des représentations graphiques des cinétiques enzymatiques,
Victor HENRI a proposé en 1903 qu’une enzyme s’associe avec son substrat pour former
un complexe ES nécessaire à la catalyse enzymatique. Cette idée a été reprise et
développée en 1913, par Leonor MICHAELIS et sa collaboratrice Maud MENTEN dans une
théorie générale de l’action enzymatique compatible avec les résultats expérimentaux.
4. Enzymes - page 7 -

5. 1 - Cinétique enzymatique
Une expérience de cinétique enzymatique consiste mesurer les variations de vitesse de
la réaction enzymatique, c'est-à-dire la quantité de substrat disparu ou la quantité de
produit formé par unité de temps. Cela est fait en faisant varier un seul des paramètres
([S], [E], [effecteurs], température).
Considérons une réaction simple :
Enzyme
S P
{début}On se place dans des conditions de température constante avec des
concentrations connues en substrat [S] et en effecteurs et on rajoute l’enzyme pour
démarrer la réaction. On porte sur un diagramme le nombre de moles de produit
accumulé par unité de volume [P] en fonction du temps, à partir de l’instant initial t0 où
l’on rajoute l’enzyme.
Pendant un temps assez bref, l’accumulation du produit en fonction du temps est
linéaire, ce qui signifie que la vitesse de la réaction est constante pendant la période
initiale où [S] est très supérieure à [P]. Par la suite, la réaction ralentit (épuisement graduel
de S), puis s’arrête (équilibre avec la réaction inverse P → S).

Dans les études de cinétique enzymatique classique, on se limite délibérément à la


vitesse initiale, v0, c’est-à-dire la vitesse au début de la réaction (tangente Δ[P]/Δt de la
courbe). On répète l’expérience en faisant varier la concentration en substrat ([S]) sans
toucher aux autres paramètres afin de déterminer la v0 pour chacune des [S].
Lorsque l'on reporte sur un graphe la vitesse initiale, v 0, en fonction de la [S], on
obtient une hyperbole rectangulaire qui tend asymptotiquement vers une vitesse initiale
maximum (Vmax) qui est atteint pour une concentration dite saturante de substrat. Ce
caractère de saturation est un caractère essentiel des réactions enzymatiques. {FIN}
4. Enzymes - page 8 -

5. 2 - Equation de Michaelis-Menten
La conversion d’un substrat en produit catalysée par une enzyme passe par la
formation d’un complexe transitoire enzyme-substrat. La réaction peut donc s’écrire sous
la forme de deux réactions élémentaires dont la seconde est supposée irréversible car [P]
négligeable tout au début de la réaction (on ne mesure que les vitesses initiales) :

k1 kcat
E + S ES → E + P
k-1
Les constantes de vitesse k1 et k-1 gouvernent les vitesses d’association de E et S et de
dissociation de ES respectivement. La constante de vitesse de la seconde étape, kcat, est la
constante catalytique et détermine la vitesse de la réaction enzymatique.
La forme de la courbe vitesse initiale en fonction de la [S] s’explique aisément. A faible
concentration en substrat, une fraction seulement des centres catalytiques de l’enzyme est
engagée dans la formation d’un complexe enzyme-substrat ES, ce qui explique la faible
vitesse initiale de la réaction. Lorsque la concentration du substrat augmente, le nombre
de complexes enzyme-substrat augmente lui aussi selon une relation hyperbolique et la
vitesse initiale de réaction augmente donc de même. Lorsque tous les centres catalytiques
sont engagés simultanément, c’est-à-dire lorsque l’enzyme est saturée, la vitesse initiale ne
peut plus augmenter, d’où l’asymptote. Enfin, lorsque le substrat est en concentration
toujours saturante, la vitesse de réaction ne peut être que proportionnelle à la
concentration du complexe ES, c’est-à-dire à celle de l’enzyme lui-même, ce que traduit la
droite observée lorsque l’on trace v0 en fonction de [E].

Cette hyperbole est définie par l'équation de MICHAELIS-MENTEN.


V max[S]
v0 =
Km + [S]
k−1 + k 2
où Vmax = kcat [E]t ([E]T= [E] totale) et la constante de Michaelis, Km = .
k1

Vmax et Km sont 2 constantes caractéristiques d’un système enzymatique.
V max
On peut remarquer que lorsque la [S] = Km, on a v0 = . €
2

Signification physique de Km

Km est donc la concentration en substrat pour laquelle la vitesse de la réaction est égale
à la moitié de Vmax. Dans la majorité des systèmes enzymatiques, Km est une mesure de
la force de liaison du complexe ES et donc de l’affinité du substrat pour l’enzyme. Un Km
faible indique que k1 est plus grand que k-1 et donc que le substrat se lie fortement à
l’enzyme, autrement dit qu’il a une forte affinité pour l’enzyme.
La valeur de Km est propre à chaque enzyme et à la nature du substrat. Les valeurs se
situent entre 10-1 et 10-7. Km est par ailleurs fonction de la température et du pH.
4. Enzymes - page 9 -

Signification physique de kcat

Dans la phase initiale de la réaction, la vitesse de la réaction est proportionnelle à [ES].


v0 = kcat [ES]
A concentration saturante en substrat, où v0 = Vmax, tout l’enzyme est sous forme de
complexe ES, c’est-à-dire [ES] = [E]T, d’où :
Vmax = kcat [E]T
La constante de vitesse kcat est le nombre de molécules de substrat converti en produit
par molécule d’enzyme et par unité de temps (généralement la seconde) lorsque l’enzyme
est totalement saturée par le substrat. kcat est aussi dénommé nombre de turnover. kcat est
donc une mesure directe de l’activité catalytique d’une enzyme. Plus kcat est grand, plus
les évènements catalytiques au sein du complexe ES sont rapides.
kcat s’exprime en s-1 et l’inverse de kcat a la dimension d’un temps : c’est le temps requis
par une molécule d’enzyme pour transformer une molécule de substrat. Les nombres de
turnover de la plupart des enzymes se situent entre 1 et 10-4 s-1.

5. 3 - Détermination expérimentale de Vmax et de Km


Pour des valeurs très élevées en substrat, v0 est asymptotiquement proche de Vmax. Il
est toutefois malaisé de déterminer précisément la valeur de Vmax (et donc de Km) à
partir de ce type de graphe. Si l'on veut déterminer les paramètres Vmax et Km avec
précision, il est pour cela nécessaire d'utiliser des méthodes graphiques à partir de
transformations de l'équation de MICHAELIS-MENTEN.

La plus couramment utilisée est la représentation en double inverse de LINEWEAVER et


BURK. Dans cette relation, 1/v0 est linéaire en 1/[S]. L’intersection de la droite avec
l’abscisse détermine -1/Km et son intersection avec l’ordonnée 1/Vmax.

6 - ENZYMES ALLOSTERIQUES
Dans la plupart, sinon toutes les voies métaboliques, un certain nombre d’enzymes en
position clé ont leur activité gouvernée par la concentration de leurs substrats selon une
cinétique différente de la cinétique michaelienne. La courbe donnant la variation de v0 en
fonction de [S] n’est pas de type hyperbolique, mais de type sigmoïde.
4. Enzymes - page 10 -

vi Hyperbole
Vmax
Sigmoïde
1
1 Enzyme michaelienne
2
2 Enzyme allostérique

[S]

De telles courbes traduisent un phénomène coopératif entre plusieurs récepteurs, la


fixation d’une molécule de substrat sur une molécule de récepteur modifiant l’affinité des
autres pour ce même substrat.
Une caractéristique fondamentale de enzymes allostériques est que leur activité est
gouvernée, non seulement par la [S], mais aussi par celle d’autres métabolites qui sont
souvent des produits plus ou moins lointains de la voie métabolique à laquelle elles
participent. De plus, presque toutes ces enzymes aussi être activées, la aussi souvent par
des composés apparentés à la voie métabolique impliquée.
vi
Vmax
+ADP ou
AMP +ATP

[F6P]

Ces observations ont conduit à la conclusion que les effets activateurs et inhibiteurs
dont ces enzymes sont l’objet, sont dus à des interactions indirectes entre récepteurs
stéréospécifiques distincts portés par la même molécule. Les enzymes allostériques sont
donc nécessairement des protéines constituées de plusieurs sous-unités possédant
plusieurs types de récepteurs. En clair, une enzyme allostérique est formée de plusieurs
sous-unités catalytiques (avec parfois des sous-unités régulatrices) et présente souvent des
éléments (axes, plans) de symétrie.
La liaison coopérative des enymes allostériques avec leur substrat est due à des
interactions homotropiques entre sites catalytiques identiques portés par des sous-unités
différentes. Cela conduit à une régulation dont la conséquence est une très faible activité
enzymatique en deça d’un certain seuil de concentration en substrat et une très forte
activité au-delà. Les substrat peuvent donc s’accumuler dans la cellule tant que leur
concentration resteinférieure au seuil d’activité de l’enzyme. Dès que ce seuil est atteint,
ils sont rapidement métabolisés.

7 - ACTIVITE ENZYMATIQUE - ACTIVITE SPECIFIQUE


Pour une enzyme donnée, plus on aura une grande quantité d'enzyme, plus la vitesse
de la réaction catalysée sera élevée.
4. Enzymes - page 11 -

Par conséquent, la quantité d'une enzyme peut être suivie par son activité catalytique,
c'est-à-dire l'augmentation du taux auquel son substrat est converti en produit de la
réaction quand l'enzyme est présente. Par convention, une unité enzymatique est définie
comme la quantité d'enzyme entrainant la transformation de 1 µmole de substrat/min à
25°C dans les conditions optimales d'action. Le terme d'activité se réfère au nombre total
d'unités enzymatiques dans la solution.
Exemple: une solution de trypsine à 20 unités enzymatiques/ml signifie que chaque
ml de cette solution contient une quantité d'enzyme capable de transformer 20 µmoles de
substrat/min dans les conditions optimales.
L'activité enzymatique est une mesure de quantité. On peut par conséquent la traiter et la
manipuler comme une masse ou un nombre de moles. On peut par exemple prélever 1 ml
d'une solution à 20 unités/ml (c’est-à-dire 20 unités enzymatiques) et les placer dans un
volume 10 fois supérieur (dilution au 1/10). On obtiendra donc une solution qui aura une
activité de 2 unités/ml, mais qui dans sa globalité contiendra les 20 unités.
L'activité spécifique est le nombre d'unités enzymatiques/mg de protéine. Ne
s'agissant pas d'une quantité, il est impossible de prélever ou de diluer une activité spécifique.
Pour reprendre l'exemple ci-dessus, si l'on prélève une solution contenant 20 unités
enzymatiques/mg de protéine et qu'on la place dans un volume 10 fois supérieur, on
obtiendra une solution diluée 10 fois en termes d'activité, mais qui sera toujours à 20 unités
enzymatiques/mg de protéine puisque l'on aura également dilué 10 fois les protéines. La
seule façon de «diluer» une activité spécifique serait de rajouter des protéines dans la
solution.
La différence entre activité et activité spécifique peut être illustrée en considérant deux
béchers de billes. Les béchers contiennent le même nombre de billes rouges (5 dans notre
exemple) représentant l’enzyme qui nous intéresse. Mais dans le 1er on a un grand
nombre de billes d'autres couleurs représentant les autres protéines, alors que le second
n'en contient que peu.

Donc, si les billes représentent les protéines, les deux béchers contiennent la même
activité, représentée par les 5 billes rouges. Cependant, le second bécher a l'activité
spécifique la plus élevée, puisqu'ici les billes rouges représentent une fraction plus
4. Enzymes - page 12 -

importante du total.
L'activité spécifique est une mesure de la pureté de l'enzyme. Elle augmente pendant la
purification pour atteindre un maximum qui n'évolue plus lorsque l'enzyme est pure
(TABLEAU 6.4).

TABLEAU 6.4: Tableau de purification d'une enzyme hypothétique


Volume de la fraction Protéine totale Activité Activité spécifique
(ml) (mg) (unités) (unités/mg)

Extrait cellulaire brut 1 400 10 000 100 000 10


Précipitation 280 3 000 96 000 32
Chromatographie sur
échangeur d'ions 90 400 80 000 200
Chromatographie par
tamisage moléculaire 80 100 60 000 600
Chromatographie
d'affinité 6 3 45 000 15 000

8 - REGULATION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE


Dans une cellule donnée, il se déroule à un instant t, un très grand nombre de réactions
chimiques dues au métabolisme intermédiaire, à la division cellulaire, à des réponses
hormonales… Le bon fonctionnement d'une cellule implique une intégration de tous ces
processus et, par voie de conséquence, la régulation des réactions se déroulant en son sein.
Un des intérêts des enzymes en tant que catalyseurs est la possibilité de régulation de leur
activité.

8. 1 - Biosynthèse sous forme de précurseur


Certaines enzymes sont synthétisées sous forme d’un précurseur inactif, appelé
zymogène, qui peut être activé lorsque les circonstances physiologiques sont appropriées.
C’est par exemple le cas d’enzymes de dégradation, telles la trypsine ou de la pepsine,
qui qui sont sécrétées sous forme de zymogènes dans le tube digestif avant d’y être
activées par protéolyse d’une partie de leur chaine peptidique.
C’est aussi le cas de la cascade enzymatique qui conduit à la formation d’un caillot
sanguin, la forme activée d’un facteur de coagulation catalyse l’activation du suivant.

8. 2 - Phosphorylation
Le moyen le plus couramment utilisé est la phosphorylation que nous avons vu dans le
cas du métabolisme du glycogène.
4. Enzymes - page 13 -

déphosphorylation
P
protéine protéine— P
(inactive) (active)
P
phosphorylation

La phosphorylation d'une protéine peut avoir pour effet d'activer sa fonction, mais
aussi, dans certains cas, de l'inactiver. Reprenons l'exemple du glycogène qui est dégradé
par la glycogène phosphorylase et synthétisé par la glycogène synthétase. L'activité de ces
deux enzymes est régulée par phosphorylation/déphosphorylation. Nous avons vu que le
glucagon et l'adrénaline entrainaient la dégradation du glycogène. Ces hormones agissent
en augmentant le taux de phosphorylation des deux enzymes par une kinase. La
phosphorylation de la phosphorylase conduit à une forme active, tandis que la
phosphorylation de la synthétase a pour effet de l'inactiver. Le résultat global après action
du glucagon sera donc l'activation de la phosphorylase et l'inactivation de la synthétase et
par conséquent, la dégradation du glycogène.
Une phosphatase (enzyme enlevant le groupe phosphate) permet par la suite de
déphosphoryler les 2 enzymes et donc le retour à l'état actif pour l'une et à l'état inactif
pour l'autre. Ce système permet une régulation très fine de la synthèse et de la
dégradation du glycogène en fonction des besoins en glucose de l'organisme. Le système
phosphorylation/déphosphorylation est très utilisé par la cellule pour réguler la fonction
d'un grand nombre de protéines, qu'il s'agisse d'enzymes, de récepteurs ou autres.

Contrôle coordonné de la glycogénolyse et de la glycogénogenèse hépatique

8. 3 - Inhibition enzymatique
Un autre moyen est l'utilisation d'inhibiteurs enzymatiques qui réduisent l'activité en se
liant à l'enzyme de telle façon que sa liaison au substrat et/ou son taux de renouvellement
soit modifié.
La cellule utilise souvent ce moyen pour la régulation des enzymes, mais la plupart des
inhibiteurs connus sont utilisés comme agents thérapeutiques. Ils sont souvent extraits de
végétaux, comme l'acide acétylsalicylique, le principe actif de l’aspirine (écorce du saule)
qui inhibe l'enzyme qui catalyse la première étape de la synthèse des prostaglandines,
impliquées entre autres dans la sensation de douleur. De même, la médecine
traditionnelle chinoise utilise les vertus anti-goutteuses d'extraits d'une cyathéacée
4. Enzymes - page 14 -

(Alsophila spinulosa) qui contiennent de l'acide caféique, un inhibiteur de la xanthine


oxydase impliquée dans la production d'acide urique dont l'accumulation est responsable
de la goutte.

L'inhibition enzymatique peut avoir lieu par différents mécanismes (FIGURE 8.15):
- Inhibition compétitive. L'inhibiteur (I) se fixe au niveau du site actif de l'enzyme
et empêche donc la fixation du substrat (S). Les inhibiteurs compétitifs sont souvent des
composés qui ressemblent beaucoup au substrat, mais qui ne peuvent pas être modifiés
par l'enzyme. On a donc une compétition entre S et I pour la fixation à l'enzyme :
l’augmentation de la [S] tend à annuler l’effet de l’inhibiteur. Par conséquent, les
inhibiteurs compétitifs ne modifient pas le Vmax. Par contre, le Km est augmenté.
- Inhibition non compétitive. L'inhibiteur et le substrat se fixent sur des sites
distincts sans que la fixation de l’un ne modifie la fixation de l’autre. On n'a donc pas
compétition : l’inhibition n’est pas levée par l’addition de substrat. La fixation de
l'inhibiteur inactive l'enzyme que le substrat soit également fixé ou non. L'inhibiteur non
compétitif diminue donc la concentration en enzyme active et donc le Vmax (Vmax =
kcat [E]t), mais il n'a pas d'effet sur le Km.

- Inhibition incompétitive. L'inhibiteur se fixe de façon réversible exclusivement au


complexe ES. L’inhibition n’est pas levée par l’addition de substrat. L'inhibiteur
incompétitif diminue à la fois le Vmax (Vmax = kcat [E]t) et le Km.

8. 4 - Effet du pH
L’activité de tous les enzymes varie en fonction de la concentration en ions H+. La
plupart des enzymes ne sont actives que dans un intervalle étroit de pH (généralement
entre pH 6 et 8). La vitesse instantanée de la réaction en fonction du pH donne des
courbes en cloche dont le sommet indique le pH optimal, caractéristique de chaque
enzyme pour un substrat défini.
1,6 7,8
Vmax

pepsine glucose-6-phosphatase

2 4 6 8 10 pH
4. Enzymes - page 15 -

Par exemple, la pepsine, qui hydrolyse certaines liaisons peptidiques des protéines au
cours de la digestion gastrique, a un pH optimal de 1,6 (le pH du suc gastrique est situé
entre 1 et 2). La glucose-6-phosphatase, responsable de la libération du glucose dans le
sang a, elle, un pH optimal de 7,8 qui est adapté au pH normal du cytosol des cellules
hépatiques (pH = 7,2).
L'activité catalytique des enzymes peut être ainsi régulée par des modifications du pH
de leur environnement. L’influence du pH sur la vitesse des réactions enzymatiques
s’explique par la présence de résidus d’acides aminés ionisables au sein du site actif de
l’enzyme. Ces résidus interviennent dans la formation du complexe ES ou dans l’activité
catalytique et leur état d’ionisation qui est dépendant du pH va influencer leur
fonctionnement. De plus, le substrat (ou le produit) peuvent aussi posséder des groupes
ionisables sensibles au pH, ce qui va influencer l’équilibre de la réaction.

9 - INACTIVATION DES ENZYMES


Les enzymes peuvent se combiner à des substances avec lesquelles ils forment des
liaisons covalentes. Si cette combinaison se fait au niveau du site actif, il en résulte une
perte, le plus souvent irréversible, de l’activité enzymatique, appelée inactivation. Ces
substances, naturelles ou de synthèse, peuvent être des toxiques puissants.
Les ions cyanure CN- se complexent avec les ions métalliques de certaines enzymes et
les inactivent. Le diisopropyl fluorophosphate (DFP) et les gaz de combat qui en dérivent,
tel le sarin, réagissent très rapidement et de façon très difficilement réversible, avec les
OH des résidus sérine. Ces composés inactivent les sérine protéases et les sérine estérases
comme la cholinestérase (sérine estérase) qui joue un rôle essentiel dans la conduction de
l’influs nerveux, avec pour conséquence une paralysie des fonctions vitales.