Evaluasi Fisik

1. Uji Penampilan/Organoleptik (Depkes RI, 1979)

Uji penampilan dilakukan dengan cara memeriksa kesesuaian warna, bau, tekstur dan
melihat pemisahan fase pada salep di mana sedapat mungkin sesuai dengan spesifikasi
sediaan yang telah ditentukan selama formulasi.
Spesifikasi salep yang harus dipenuhi adalah memilih bentuk setengah padat, warna harus
sesuai dengan spesifikasi pada saat pembuatan awal salep dan baunya tidak tengik.

2. Uji Homogenitas (Depkes RI, 1979)

Uji homogenitas dilakukan untuk menjamin distribusi bahan aktif yang homogen.
Prosedur uji homogenitas:
Sediaan salep dioleskan pada sekeping kaca atau bahan transparan lain yang cocok harus
menunjukkan susunan yang homogen. Salep yang homogen ditandai dengan tidak terdapatnya
gumpalan pada hasil pengolesan, struktur yang rata dan memiliki warna yang seragam dari
titik awal pengolesan sampai titik akhir pengolesan. Salep yang di uji diambil tiga tempat
yaitu bagian atas, tengah dan bawah dari wadah salep.

3. Viskositas dan Rheologi

Uji Viskositas dan Rheologi dilakukan untuk mengetahui dan mengukur konsistensi
sediaan.
Prosedur:
Sediaan salep sebanyak 100 gram, dimasukkan dalam cawan pengukur lalu diukur viskositasnya
menggunakan alat Rion Rotor Viskotester VT-04. Viskositas dilihat pada skala dalam alat
setelah tercapai kestabilan (Depkes RI., 1995).

4. Distribusi Ukuran Partikel

Uji distribusi ukuran partikel bertujuan untuk mengetahui ukuran partikel yang tersebar
didalam salep mata atau sediaan semisolid steril.
Prosedur:
a. Salep ditebar secara merata dalam bentuk lapisan tipis yang mengandung 10mg zat aktif
b. Lalu salep diamati dibawah mikroskop seluruh area sampel
c. Mengamati partikel kecil pada lapisan tipis dengan perbesaran kecil (misal 50x)
sedangkan partikel besar dengan perbesaran 200x - 500x.
d. Untuk setiap 10 mg zat aktif, tidak lebih dari 20 partikel memiliki dimensi maksimum
lebih besar dari 25 mm, dan tidak lebih dari 2 partikel memiliki dimensi maksimum lebih
besar dari 50 mm. Dan tidak ada dari partikel-partikel ini memiliki dimensi maksimum
lebih besar dari 90 mm (Lachman, 2008).
Nomor 5 gaada sis

6. Dilakukan uji percepatan dengan Agitasi atau sentrifugasi

(Lachman, Teori dan praktek Farmasi Ind), Hal 1081)
Prosedur :
sediaan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi (+30000 RPMO). Amati adanya pemisahan atau
tidak.

7.lSI MINIMUM <861>

Pengujian dan spesifikasi berikut digunakan untuk sediaan krim, gel, jeli, salep, pasta, serbuk
dan aerosol, termasuk semprot topikal bertekanan, dan tak bertekanan serta inhalasi dosis
terukur, yang dikemas dalam wadah dengan etiket yang mencantumkan bobot bersih tidak lebih
dari 150 g (Depkes RI, 1995).
Prosedur untuk sediaan bukan aerosol
Ambil contoh sebanyak 10 wadah berisi zat uji, hilangkan semua etiket yang dapat
mempengaruhi bobot pada waktu isi wadah dikeluarkan. Bersihkan dan keringkan dengan
sempurna bagian luar wadah dengan cara yang sesuai dan timbang satu per satu. Keluarkan isi
secara kuantitatif dari masing-masing wadah, potong ujung wadah. jika perlu cuci dengan pelarut
yang sesuai, hati-hati agar tutup dan bagian lain wadah tidak terpisah. Keringkan dan timbang
kembali masing-masing wadah ·kosong beserta bagian-bagiannya. Perbedaan antara kedua
penimbangan adalah bobot bersih isi wadah. Bobot bersih rata-rata isi dari 10 wadah tidak
kurang dari bobot yang tertera pada etiket, dan tidak satu wadahpun yang bobot bersih isinya
kurang dari 90% dari bobot yang tertera pada etiket untuk bobot 60 g atau kurang. Tidak kurang
dari 95% dari bobot yang tertera pada etiket untuk bobot lebih dari 60 g dan kurang dari 150 g.
Jika persyaratan ini tidak dipenuhi, tetapkan bobot bersih isi 20 wadah tambahan. Bobot bersih
rata-rata isi dari 30 wadah tidak kurang dari bobot yang tertera pada etiket, dan hanya satu wadah
yang bobot bersih isinya kurang dari 90% dari bobot yang tertera pada etiket untuk bobot 60 g
atau kurang, dan tidak kurang dari 95% dari bobot yang tertera pada etiket untuk bobot lebih dari
60 g dan kurang dari 150 g (Depkes RI, 1995).
Prosedur untuk aerosol
Ambil contoh sebanyak 10 wadah berisi zat uji, hiiangkan semua etiket yang dapat
mempengaruhi bobot, pada waktu isi wadah dikeluarkan. Bersihkan dan keringkan dengan
sempuma bagian luar wadah dengan cara yang sesuai, dan timbang satu per satu. Keluarkan isi
tiap wadah menggunakan cara yang aman, misalnya dengan pendinginan untuk mengurangi
tekanan dalam wadah, buka katup dan tuang. Keluarkan isi yang tertinggal dengan pelarut yang
sesuai, kemudian bilas dengan sejumlah kecil metanol. Panaskan wadah, katup, dan bagian lain
wadah pada suhu 100o selama 5 menit. Dinginkan dan timbang kembali tiap wadah beserta
bagiannya. Perbedaan antara penimbangan pertama dan penimbangan wadah kosong adalah
bobot bersih. Tentukan bobot bersih tiap wadah yang diuji. Persyaratan dipenuhi jika bobot
bersih isi kesepuluh wadah yang diuji tidak kurang dari yang tertera pada etiket (Depkes RI,
1995).

8.· Penentuan tipe-tipe emulsi dan ukuran partikel tetesan emulsi

Munurut farfis II (Martin .dkk, 1993 : 1144)
Emulsi terbagi menjadi 2 tipe:
● Bila fase minyak terdispersikan sebagai bola bola keseluruhan fase kontinyu air, dikenal
sebagaiSuatu emulsi minyak dalam air (O/W).
● Bila fase minyak bertindak sebagai fase kontinu emulsi dikenal sebagai produk emulsi
air dalam minyak (W/O).
● Ukuran partikel tetesan emulsi
Mikroemulsi mengandung tetesan minyak dalam air (o/w) atau tetesan air dalam minyak
(w/o) dengan diameter kira-kira 10-200 nmdan fraksi volum dari fase terdispersi
bervariasi dari 0,2-0,8.
Mekanisme kerja emulgator
Farmasi fisik II (Martin, dkk., 1993:1147)
Terbagi atas 3 yaitu:
1. Zat-zat yang aktif pada permukaan yang teradsorbsi pada antarmuka minyak/air
membentuk lapisan monomolekuler & mengurangi tegangan antarmuka
2. Koloida hidrofilik yang membentuk suatu lapisan multimolekular sekitar tetesan-
tetesan terdispers dari minyak dalam suatu emulsi o/w
3. Partikel-partikel padat yang terbaggi halus, yang diadsorbsi pada batas antarmuka
dua fase cair yang tidak bercampur & membentuk suatu lapisan partikel disekitar
bola-bla terdisper.

9. Penetapan pH <1071>
Harga pH adalah harga yang diberikan oleh alat potensiometrik (pH meter) yang sesuai, yang
telah dibakukan sebagaimana mestinya, yang mampu mengukur harga pH sampai 0,02 unit pH
menggunakan elektrode indikator yang peka terhadap aktivitas ion hidrogen, elektrode kaca, dan
elektrode pembanding yang sesuai seperti elektrode kalomel a tau elektrode perak-perak klorida
(Depkes RI,1995).
Alat harus mampu menunjukkan potensial dari pasangan elektrode dan untuk pembakuan pH
menggunakan potensial yang dapat diatur ke sirkuit dengan menggunakan "pembakuan", "nol",
"asimetri", atau "kalibrasi" dan harus ntampu mengontrol perubahan dalam milivolt per
perubahan unit pada pembacaan pH melalui kendali "suhu" dan/atau kemiringan. Pengukuran
dilakukan pada suhu 25"± 2", kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi. Skala
pH ditetapkan dengan persamaan sebagai berikut:
E dan E5 berturut-turut adalah potensial terukur dengan sel galvanik berisi larutan uji,
dinyatakan sebagai pH dan Larutan dapar untuk pembakuan yang tepat, dinyatakan sebagai pHs;
harga k adalah perubahan dalam potensial per perubahan unit dalam pH, dan secara tcoritis
sebesar {0,05916 + 0,000198 (t-25")) volt pada suhu t (Depkes RI,1995).
Perlu ditekankan disini bahwa definisi pH, skala pH, dan harga yang ditunjukkan oleh Larutan
dapar untuk pembakuan ditujukan untuk memperoleh sistem operasional yang praktis, sehingga
hasil dapat dibandingkan antar laboratorium. Harga pH yang diukur disini tidak persis sama
dengan yang diperoleh dengan definisi klasik, bahwa pH =-[log H+ (dalam air)). Jika pH larutan
yang diukur mempunyai komposisi yang cukup mirip dengan Iarutan dapar yang digunakan
untuk pembakuan, pH yang diukur mendekati pH teoritis. Meskipun tidak ditegaskan hubungan
p~ngukuran kesesuaian sistem untuk aktivitas atau kadar ion hidrogen, harga yang diperoleh
mendekati aktivitas ion hidrogen dalam larutan air (Depkes RI,1995).
Jika pH meter dibakukan menggunakan larutan dapar dalam air, kemudian digunakan untuk
mengukur "pH" larutan atau suspensi dalam pelarut bukan air, maka tetapan pengionan dari asam
atau.basa, tetapan dielektrik dari medium, potensial sambungan cairan (yang dapat memberikan
kesalahan lebih kurang 1 unit pH), dan respons ion hidrogen dari elektrode kaca, semua akan
berubah. Oleh karena itu harga yang diperoleh dengan larutan yang sifatnya hanya mengandung
sebagian air, dapat dianggap hanya scbagai harga pH. · Keasaman dapat diukur saksama
menggunakan elektrode dan instrurnen yang dibakukan (Depkes RI,1995).
Larutan Dapar untuk Pembakuan pH Meter
Larutan dapar untuk pembakuan
Buat menurut petunjuk sesuai Tabel. Simpan dalam wadah tahan bahan kimia, tertutup rapat,
sebaiknya dari kaca Tipe I. Larutan segar sebaiknya dibuat dengan interval tidak lebih dari 3
bulan. Tabel berikut menunjukkan pH dari iarutan dapar sebagai fungsi dari suhu. Petunjuk ini
digunakan untuk pcmbuatan larutan dapar dengan kadar molal sebagaimana disebutkan.Untuk
memudahkan, petunjuk diberikan dengan pengenceran hingga volume 1000 ml, bukan dengan
menyebutkan penggunaan 1000 g pelarut yang merupakan dasar sistem molalitas dari kadar
larutan. Jumlah yang disebutkan tidak dapat secara sederhana diperhitungkankan tanpa informasi
tambahan (Depkes RI,1995).
Harga pH Larutan Dapar untuk Pembakuan
(Depkes RI,1995).
Kalium tetraoksalat 0,05 m Larutkan 12,61 g KH3 (C2 O4 )2.2H2O dalam air hingga 1000 ml.
Kalium biftalat 0,05 m Larutkan 10,12 g KHC8 H4 04 , yang telah dikeringkan pada suhu 110o
selama 1 jam dalam air hingga 1000 ml.
Ekuimolal fosfat 0,05 m Larutkan 3,53 g Na2 HPO4 dan 3,39 g KH2 PO4, masing-masing telah
dikeringkan pada suhu 120o selama 2 jam, dalam air hingga 1000 ml.
Natrium tetraborat 0,01 m Larutkan 3,80 g Na2 B4 O7 .10H2 O dalam air hingga 1000 ml.
Lindungi dari penyerapan karbon dioksida.
Kalsium hidroksida jenuh pada suhu 25o Kocok kalsium hidroksida P berlebih dengan air dan
enaptuangkan pada suhu 25o sebelum digunakan. Lindungi dari penyerapan karbon dioksida.
Karena adanya variasi dalam sifat maupun cara kerja pH meter, tidak praktis untuk memberikan
petunjuk yang dapat diterapkan secara umum untuk penetapan pH secara potensiometrik. Prinsip
umum yang harus diikuti dalam melakukan petunjuk yang terdapat pada masing-masing alat oleh
pabrik akan diuraikan pada paragraf berikut. Sebelum digunakan, periksa elektrode, dan
jembatan garam jika ada. Jika perlu, isi lagi larutan jembatan garam dan perhatikan petunjuk lain
yang diberikan oleh pabrik alat atau pabrik elektrode. Untuk pembakuan pH meter, pilih 2
Larutan dapar untuk pembakuan yang mempunyai perbedaan pH tidak lebih dari 4 unit dan
sedemikian rupa sehingga pH larutan uji diharapkan terletak diantaranya. lsi sel dengan salah
satu Larutan dapar untuk pembakuan pada suhu yang larutan ujinya akan diukur. Pasang kendali
suhu pada suhu larutan, dan atur kontrol kalibrasi untuk membuat pH identik dengan yang
tercantum dalam Tabel. Bilas elektrode dan sel beberapa kali dengan Larutan dapar untuk
pembakuan yang kedua, kemudian isi sel dengan larutan tersebut pada suhu yang sama dengan
larutan uji. pH dari larutan dapar kedua ± 0,07 unit pH dari harga yang tertera dalam Tabel. Jika
penyimpangan terlihat lebih besar, periksa elektrode dan jika terdapat kesalahan, supaya diganti.
Atur "kemiringan" atau "suhu" hingga pH sesuai dengan yang tertera dalam Tabel. Ulangi
pembakuan hingga kedua Larutan dapar untuk pembakuan memberikan harga pH tidak lebih
0,02 unit pH dari harga yang tertera dalam Tabel, tanpa pengaturan lebih lanjut dari pengendali.
Jika sistem telah berfungsi dengan baik, bilas elektrode dan sel beberapa kali dengan larutan uji,
isi sel dengan sedikit larutan uji dan baca harga pH. Gunakan air bebas karbon dioksida P untuk
pelarutan atau pengenceran larutan uji. Jika hanya diperlukan harga pH perkiraan dapat
digunakan indikator dan kertas indicator (Depkes RI,1995).

10. Uji Pelepasan Bahan Aktif dari Sediaan

Waktu pengujian umumnya dinyatakan dalam interval waktu pemberian obat yang tertera pada
etiket, dinyatakan dalam jam. Cuplikan harus diambil dalam batas toleransi ± 15 menit atau 2%
dari waktu yang tertera, toleransi yang menghasilkan interval waktu paling pendek yang dipilih.
Prosedur yang dilakukan menyerupai prosedur disolusi obat, hanya saja digunakan cakram baja
tahan karat untuk menahan sediaan pada dasar labu dan alat disolusi dayung. Suhu dipertahankan
pada 32℃ ± 0,5℃. Alat yang dapat digunakan ,yaitu alat 5 dayung di atas cakram, alat 6
Silinder, dan alat 7 Cakram turun-naik. Media disolusi yang digunakan disesuaikan dengan
monografi zat aktif dari sediaan. Prosedur dilakukan dengan masukkan sejumlah volume media
disolusi ke dalam labu, pasang alat, biarkan media mencapai suhu 32℃ ± 0,5℃. Lekatkan
sediaan uji pada cakram, pastikan agar permukaan pelepasan sediaan serata mungkin. Apabila
digunakan membran untuk menyangga sediaan, tidak boleh terdapat gelembung udara antara
membran dengan permukaan pelepasan. Pasang alat yang akan digunakan sejajar dengan
permukaan pelepasan yang menghadap ke atas. Pada tiap interval waktu pengambilan cuplikan,
ambit cuplikan dari bagian tengah. Lakukan penetapan kadar tiap cuplikan seperti yang tertera
pada masing-masing monografi, lakukan koreksi terhadap kekurangan volume, jika diperlukan
(Depkes RI, 1995).

11. Uji Kebocoran Tube

Pilih 10 tube salep mata, dengan segel khusus jika disebutkan. Bersihkan dan keringkan baik-
baik permukaan luar tiap tube dengan kain penyerap. Letakkan tube pada posisi horizontal diatas
lembaran kertas penyerap dalam oven dengan suhu yang diatur 60+-3 selama 8 jam. Tidak boleh
terjadi kebocoran yang berarti selama atau setelah pengujian selesai. Jika terdpat kebocoran pada
satu tube tapi tidak lebih dari satu tube; ulangi pengujian dengan tambahan 20 tube salep.
Pengujian memenuhi syarat jika tidak ada satupun kebocoran diamati dari 10 tube uji pertama,
atau kebocoran yang diamati tidak lebih dari satu dari 30 tube yang diuji (Depkes RI, 1995).

Evaluasi Kimia
1.
2.

Evaluasi Biologi
1. Uji Efektivitas Pengawet Antimikroba (Depkes RI, 1995).
MIkorba uji gunakan biakan Candida albicans (ATCC No. 10231), Aspergillis
niger (ATCC No. 16404), Escherichia coli (ATCC No. 8739), Pseudomonas aeruginosa
(ATCC No. 9027) dan Staphylococcus aureus (ATCCNo. 6538).
Media menggunakan Soybean-Casein Digest Agar Medium sebagai biakan awal
mikroba uji
● Pembuatan Inokulasi
➔ Sebelum pengujian, dilakukan inokulasi permukaan media
agar bervolume yang sesuai dengan biakkan persediaan
segar mikroba yang akan digunakan
➔ Inkubasi biarkan bakteri pada suhu 30 hingga 35 selama 18
jam sampai 24 jam, biakkan Candida albicans pada suhu
20 hingga 25 selama 48 jam dan biarkan Aspergillus niger
pada suhu 20 hingga 25 selama 1 minggu
➔ Gunakan larutan natrium klorida P 0,9% steril untuk
memanenkan biakkan bakteri Candida albicans dan untuk
memanenkan bakteri biakkan Aspergillus niger
menggunakan natrium klorida yang mengandung polisorbat
80 P 0,05% dengan mencuci permukaan pertumbuhan dan
hasil cucian dimasukkan ke dalam wadah dan
 menambahkan larutan natrium klorida P 0,9% steril untuk
mengurangi angka mikroba hingga lebih kurang 100 juta
per ml
➔ Tetapkan jumlah satuan pembentuk koloni tiap ml dari
setiap suspensi. Jika suspensi yang telah dibakukan tidak
segera digunakan, pemantauan suspensi dilakukan secara
berkala dengan metode lempeng Angka Mikroba Aerob
Total.
● Prosedur
➔ Jika wadah sediaan dapat ditembus secara aseptik
menggunakan jarum suntik melalui sumbat karet: Lakukan
pengujuan pada 5 wadah asli sediaan
➔ Jika wadah sediaan tidak dapat ditembus secara aseptik:
Pindahkan 20 mg sampel ke dalam masing-masing 5
tabung bakteriologik bertutup
➔ Inokulasi masing-masing wadah atau tabung dengan salah
satu suspensi mikroba baku, menggunakan perbandingan
0,10 ml inokula setara dengan 20 mg sediaan dan campur
➔ Menambahkan jumlah mikroba uji dalam sediaan uji
setelah inokulasi adalah antara 100.000 dan 1.000.000 per
ml
➔ Tetapkan jumlah mikroba viabel di dalam tiap suspensi
inokula, dan hitung angka awal mikroba tiap ml sediaan
yang diuji dengan metode lempeng
➔ Inkubasi wadah atau tabung yang telah diinokulasi pada
suhu 20 atau 25.
➔ Amati wadah atau tabung pada hari ke-7, ke-14, ke-21 dan
ke-28 sesudah inokulasi
➔ Catat tiap perubahan yang terlihat dan tetapkan jumlah
mikroba viabel pada tiap selang waktu tersebut dengan
metode lempeng
➔ Lakukan perhitungan perubahan kadar dalam persen tiap
mikroba selama pengujian dengan menggunakan bilangan
teoritis mikroba pada awal pengujian.
1. UJI Sterilitas <71>
Prosedur berikut dapat digunakan untuk menetapkan apakah bahan Farmakope
yang harus steril memenuhi syarat berkenaan degan uji sterilitas seperti yang tertera pada
masing masing monografi (Untuk penggunaan prosedur uji sterilitas sebagai bagian dari
pengawasan mutu di pabrik, seperti yang tertera pada Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas
Bahan Kompendia <1371>). Mengingat kemungkinan hasil positif dapat disebabkan oleh
 teknik aseptic yang salah atau kontaminasi lingkungan pada waktu pengujian,
diberlakukan ketentuan pengujian 2 tahap seperti yang tertera pada Penafsiran Hasil Uji
Sterilitas.
Prosedur alternative dapat digunakan untuk menunjukan bahwa suatu bahan
adalah steril, asalkan hasil yang diperoleh sekurang-kurangnya setara keandalannya (lihat
Prosedur seperti yang tertera pada Uji dan Penetapan dalam Ketentuan Umum).
Seandainya timbul perbedaan, atau pertentangan, jika tanda adanya kontaminasi mikroba
diperoleh dengan menggunakan prosedur dalam farmakope ini, maka hasil yang
diperoleh menentukan bahwa bahan tersebut tidak memenuhi syarat. Sama halnya,
kegagalan menunjukan adanya kontaminasi mikroba dengan menggunakan prosedur
dalam farmakope ini membuktikan bahwa bahan tersebut memenuhi syarat. Untuk
informasi penafsiran tambahan seperti yang tertera pada Sterilitas dan Jaminan

Sterilitas Bahan Kompendia <1371>.

Media
Media untuk pengujian dapat dibuat seperti yang tertera dibawah ini, atau dapat
digunakan campuran kering yang menghasilkan formulasi sama, asalkan jika
direkonstitusi sesuai petunjuk pabrik atau distributor, mempunyai sifat merangsang
pertumbuhan yang sama atau lebih baik dari formula yang diberikan dibawah ini
I. Media Tioglikolat Cair
L – Sistin P 0,5 g
Natrium klorida P 2,5 g
Glukosa P (C6H12O. H2O) 5,5 g
Agar P, granul (kadar air tidak lebih dari 15%) 0,75 g
Ekstrak ragi P (larut dalam air) 5,0 g
Digesti pankreas kasein P 15,0 g
Natrium tioglikolat P atau 0,5 g
Asam tioglikolat P 0,3 ml
Larutan natrium resazurin P (1 dalam 1000) dibuat segar 1,0 ml
Air 1000 ml
Ph setelah disterilisasi 7,1 +0,2

Campur dan panaskan hingga larut, atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 + 0,2
menggunakan natrium hidroksida 1 N . jika perlu saring selagi panas menggunakan kertas
saring. tempatkan media dalam tabung yang sesuai, yang memberikan perbandingan
permukaan dengan kedalaman media sedemikian rupa sehingga tidak lebih dari setengah
bagian atas media yang mengalami perubahan warna sebagai indikasi masuknya oksigen
pada akhir masa inkubasi. Sterilisasi dalam otoklaf. Jika lebih dari sepertiga bagian atas
menjadi warna merah muda, media dapat diperbaiki satu kali dengan pemanasan diatas
tangas air atau dalam uap yang mengalir bebas hingga warna merah muda hilang. Media siap
digunakan jika tidak lebih dari sepersepuluh bagian atas media berwarna merah muda.
Gunakan media tioglikolat Cair untuk inkubasi dalam kondisi aerob.

II. Media Tioglikolat Alternatif

(untuk alat yang mempunyai lumen kecil)

L-Sistin P 0,5 g
Natrium klorida P 2,5 g
Glukosa P(C6H12O6H2O) 5,5 g
Ekstrak ragi P(Larut dalam air) 5,0 g
Digesti pankreas kasein 15,0 g
Natrium tioglikolat P atau 0,5 ml
Asam tioglikolat P 0,3 ml
Air 1000 ml
pH setelah sterilitasi 7,1 kurang lebih 0,2
Panaskan semua bahan dalam wadah yang sesuai hingga larut. Camper, dan jika perlu,
atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 kurang lebih 0,2 menggunakan natrium
hidroksida 1 N. Saring jika perlu, tempatkan dalam tabung yang sesuai dan sterilisasi dengan
uap air. Media dibuat segar atau dipanaskan di tangas uap dan didingnkan saat aka
digunakan. Tidak boleh dipanaskan kembali. Gunakan Media Tioglikolat Alternatif dengan
cara yang menjamin kondisi anaerob selama masa inkubasi.
III. Soybean – Casein Digest Medium
Digesti pancreas kasein P 17,0 g
Digesti papik tepung kedele 3,0 g
Natrium klorida P 5,0 g
Kalium fosfat dibasa P 2,5 g
Glukosa P(C6H12O6H2O) 1000 ml
pH setelah sterilisasi 7,3 kurang lebih 0,2
Larutkan semua bahan padat dalam air, hangatkan hingga larut. Dinginkan larutan hingga
suhu kamar, dan jika perlu atur pH larutan hingga setelha sterilisasi 7,3 kurang lebih 0,2
menggunakan natrium hidroksida 1 N. Saring jika perlu, dan bagikan dalam tabung yang
sesuai. Sterilisasi dengan uap air.
Gunakan Soybean – Casein Digest Medium untuk inkubasi dalam kondisi aerob.
Catatan Jika digunakan Media Tioglikolat Cair dan Soybean – Casein Degest Medium
dalam Prosedur Uji Inokulasi Langsung ke Dalam Media Uji untuk menetapkan specimen
yang mengandung antibiotic golongan penisilin atau sefalosporin, secara aseptic tambahkan
sejumlah penisilinase ke dalam tabung media untuk menginaktifkan atibiotik dalam spesimen
uji. Tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menggunakan sediaan penisilinase
yang sebelumnya telah diuji daya penginaktifkan penisilin atau sefalosporin. Atau tetapkan
jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menambahkannya kedala tabung Media
Tioglikolat Cair dab sejumlah antibiotic penisilin atau Sefalosporin setara jumlah antibiotic
dalam spesimen uji, inokulasi media dengan 1 ml pengenceran (1 dalam 1000) biakan 18 jam
sampai 24 jam Staphylococcus aureus (ATCC 29737) dalam Media Tioglikolat Cair, dan
inkubasi selama 24 jam pada suhu 30¬o sampai 35o : pada saat ini harus teramati
pertumbuhan mikroba yang spesifik. Lakukan uji konfirmasi di daerah yang benar-benar
terpisah dari tempat uji sterilitas.
Cairan Pengencer dan Pembilas
Cairan A Larutkan 1 g digesti peptic jaringan hewan P seperti yang tertera pada
Spesifikasi Pereaksi dalam Pereaksi hewan P seperti yang tertera pada Spesifikasi Pereaksi
dalam Pereaksi, lndikator da" l.Arut"" dalam air hingga lliter, saring atau sentrifus hingga
jernih, atur pH hingga pH 7,1 ± 0,2, bagikan ke dalam sejumlah wadah 100 ml dan sterilisasi
dengan uap air.
(Catalan ]ika Cairan A digunakan untuk uji sterilitas pada spesimen yang merzgandung
antibiotik golongan penisilin atau seftlwsporin, secara aseptik tnnzbahkan sejumlah
penisilinase steril Ice dalam Olirm1 A yang digunakan membilas membran untuk
menginaktifkar~ rcsidu antibiotika pada membran setelah larutan spesimen uji disarit.~g.J
 Cairan D Jika spesimen uji mengandung Iesitin atau minyak, atau untuk uji alc.t kesehatan
steril dengan lumen kecil menggunakan penyaring membran, gunakan Olirm1 A yang
ditambah 1 ml polisorbat 80 per L, atur pH hingga 7,1 ± 0,2, bagikan dalam Iabu dan
sterilisasi dengan uap air.
Cairan K
Digesti peptic jaringan hewan P 50 g
Ekstrak daging P 3,0 g
Polisorbat 10,0 g
Air 1000 ml
(Catalan Cairan steril tidak boleh bersifat antibakteri atau antijamur jika digunalam sebagai
pelt:rut, penger.cer, ataupun pembilas pada uji sterilitas.]

2. Penetapan Potensi Antibiotik Secara Mikrobiologi

Peralatan :
Semua peralatan harus disterilkan dengan cara pemanasan kerning atau dengan uap air
Media dan pengencer :
Media dibuat dalam 1L air dan digunakan NaOH 1N untuk mengaturan pH
Media 1 Pepton 5 gr
Pepton 6 gr Ekstrak ragi 1,5 gr
Digesti pankreatik 4 gr Ekstrak daging 1,5 gr
Ekstrak ragi 3 gr NaCl 3,5 gr
Ekstrak daging 1,5 gr Glukkosa 1 gr
Glukkosa 1 gr Kalium fosfat dibasa 3,68 gr
Agar 15 gr Kalium fosfat monobasa 1,32 gr
Air ad 1000ml Air ad 1000ml
Ph = 6,6 pH = 7
Media 2 Media 5
Pepton 6 gr Sama sepertu media 2 , pH = 7,9
Ekstrak ragi 3 gr Media 8
Ekstrak daging 1,5 gr Sama seperti media 2, pH 5,9
Agar 15 gr Media 9
Air 1000 ml Digesti pankreatik kasein 17 gr
Ph= 6,6 Digesti papaik kedel 3 gr
Media 3 NaCl 5 gr
Kalium fosfat dibasa 2,5 gr Air 1000ml
Glukosa 2,5 gr pH 6,1
Agar 20 gr Media 32
Air 1000 ml Sama sepeti Media 1, kecuali tambahkan
pH = 7,2 300 mg mangen sulfat
Media 10 Media 34
Sama sepeti media 9, kecuali menggunakan Gliserin 10 gr
agar P 12,0 g sebagai ganti 20,0 g, dan Pepton 10 gr
setelah pendidihan media untuk melarutkan Ekstrak daging 10 gr
agar, tambahkan 10 ml polisorbat 80 P. pH' NaCl 3 gr
setelah sterilisasi 7,2± 0,1. Air 1000 ml
Media 11 pH 7
Sama sepeti media 1 , ppH 8,3 Media 35
Media 13 Sama seperti Media 34 , kecuali
Glukosa 20 gr ditambahakan 17 g agar
Pepton 10 gr Media 36
Air 1000ml Digesti pankreatik kasein 15 gr
pH 5,6 Digesti papanik kedel 5gr
Media 19 NACl 5 gr
Pepton 9,4 gr Agar 15 gr
Ekstrak ragi 4,7gr Air 1000ml
Ekstrak daging 2,4gr pH 7,3
NaCl 10 gr Media 39
Glukosa 10 gr Sama sepeti media 3, kecuali pH setelah
Agar 23,5 gr sterilisasi 7,9

Dapar fosfat :
● Dapar nomor 1; 1%; pH 6,0 I.arutkan 2.0 g kalium fosfat dibasa P dan 8,0 g kalium fosfat
mono basa P dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 6,0 ± 0,05 dengan asam fosfat 18 N atau
ladium hidroksida 10 N.
● Dapar nomor 3; 0,1 M; pH 8,0 Larutkan 16,73 g kalium fosfat dibasa P dan 0,523 g
kalium fosfat monobasa P dalam air 1000 mi. Atur pH hingga 8,0 ± 0,1 dengan asam
fosfat 18 N atau kalium hidroksida 1.0 N
● Dapar nomor 4; 0,1 M; pH 4;s Larutkan 13,61 g kalium fosfat monobasa P dalam 1000
ml air. Atur pH hingga 4,5 ± 0,05 dengan asam fosfat 18 N atau natriua hidroksida 10 N.
● Dapar nomor 6; 10%; pH 6,0 Larutkan 20,0 g kalium fosfat dibasa P dan 80,0 g kalium
fosfat monobasa P dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 6,0 ± 0,05 dengan asam fosfat 18
N a tau natrium hidroksida 10 N.
 ● Dapar nomor 10; 0,2 M; pH 10,5 Larutkan 35,0 g kalium fosfat dibasa P dalam 1000 ml
air dan tambahkan 2 ml kalium hidroksida 10 N. Atur pH hingga -10,5 ± 0,1
menggunakan asam fosfat 18 N a tau kttlium hidroksida 10 N.
● Dapar nomor 16; 0,1 M; pH 7,0 Larutkan 13,6 g kalium fosfat dibasa P dan 4,0 g kalium
fosfat monobasa P dalam 1000 ml air. Atur pH hingga 7,0 ± 0,2 asam fosfat IS N a tau
kalium hidroksida 10 N.
● Larutan lain Gunakan bahan··bahan yang tertera pada Perealcsi, Jndikator dan Larutan.
Untuk air, gunakan Air Murni; untuk natrium klorida gunakan lnjelcsi Natrium Klorida;
formaldellida encer adalah Larutan Formaldehida yang diencerkan dengan air 1:3.
Unit dan baku Pembanding :
Potensi antibiotik dinyatakan dalam "unit"' atau "µ" aktivitas

Penyiapan Inokula
Metode :
1. Penetapan dengan lempeng silinder (lempeng)
Wadah :
- Cawan petri kaca/plastic (lebih kurang 20 mm x 100 mm) yang mempunyai tutup dari
bahan yang sesuai.
- Silinder besi tahan karat a tau parselen dengan toleransi ukuran masing-masing Iebih
kurang 0,1 mm: diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dan tinggi 10 mm
Pengujian :
● Tuang 21 rnl Media 2 dalam rnasingmasing dari sejumlah cawan yang diperlukan dan
biarkan memadat sebagai lapisan dasar yang licin dengan ketebalan seragam, kecuali
untuk AmfoterisinB, dan Nistatin, tidak digunakan lapisan dasar.
(Untuk Ampisilin, Klindarnisin, Eritromisin, Gentamisin, Linkomisin, Neomisin B, dan
Paromomisin gunakan Media 11. Untuk Bleomisin, gunakan 10 ml Media 35. Untuk
Dihidrostreptomisin, gunakan Media 5. Untuk Daktinomisin gunakan 10 ml Media 5. Untuk
Mitomisin dan Vankomisin gunakan 10 ml Media 8. Untuk Karbenisilin, Kolistin dan Polimiksin
B gunakan Media 9)
● Tambahkan 4,0 mllapisan inokula seperti tertera pada Tabel3, buat seperti yang tertera
pada rnasing-rnasing antibiotik, putarkan lempeng untuk menyebar-ratakan inokula pada
permukaan dan biarkan memadat.
● Jatuhkan 6 buah silinder pada permukaan yang telah diinokulasi dari ketinggian 12 mm,
menggunakan alat mekanik atau alat lain untuk menjarnin penempatannya pada radius
2,8 ern, kernudian tutup lernpeng untuk mencegah kontaminasi. Setelah ke 6 silinder
pada tiap cawan Petri diisi dengan pengenceran larutan antibiotik inkubasi lempeng pa a
suhu 32 sampai 35 selarna 16 jam sarnpai 18 jam.
● Ambil semua silinder, ukur dan catat diameter tiap hambatan pertumbuhan hingga
mendekati 0,1 mrn. Inkubasi lernpeng pada suhu 29- sarnpai 30 C
 ● Pada penetapan 1 aras dosis dengan kurva baku, buat pengenceran dengan 5 aras dosis
baku (51 sarnpai S ) dan satu aras dosis uji (U ) yang sesuai dengan kurva baku, seperti
yang terlera pada Penyiapan baku dan Petryiapan contoh uji . Untuk memperoleh kurva
baku, isi silinder selang-seling pada tiap 3Iempeng dengan dosis tengah baku (S ) dan
tiap silinder dari9 silinder sisanya dengan satu dari empat pengenceran larutan baku.
Lakukan hal yang sama untuk 3 pengenceran baku lainnya. Untuk tiap sediaan uji, isi
silinder selang-seling pada tiap Iernpeng dengan dosis tengah baku (S ) dan 9 silinder
sisa dengan enceran larutan uji yang sebanding (U3).

2. Penetapan dengan cara turbidimetri (tabung)

Wadah :
- tabung reaksi kaca atau plastik dengan misalnya 16 mm x 125 mm atau 18 mm x 150
mm yang panjang, diameter dan ketebalannya relatif seragam serta permukaanriya tidak
~acat dan tidak tergores.
Pengujian :
● siapkan dosis yangdiperlukan dengan mengencerkan larutan persediaan baku dan tiap
larutan uji seperti tertera pada Penyiapan baku dan Penyiapan contoh.
● Tambahkan 1 ml tiap dosis pada masing-masing 3 tabung reaksi yang telah disiapkan dan
tempatkan 3 replikat tabung dengan posisi secara acak pada rak tabung. Secara
bersamaan Ietakkan pada tiap rak 1 tabung atau 2 tabung kontrol yang berisi 1 ml
pengeitcer (lihat Tabel 3) tetapi tanpa antibiotik.
● Setelah selesai semua pengisian larutan (untuk KAndisidin dalam waktu 30·menit ketika
air ditambahkan pada larutan persediaan metilsulfoksidll), tambahkan 9,0 ml inokula ke
dalam tjap tabung pada rak dan setelah Iengkap pengisian rak segera ditempatkan dalam
inkubator atau tangas air dengan suhu yang dipertahankan pada 36 ° sampai 37,5 °
selama 2 jam sampai 4 jam, kecuali untuk Kandisidin (inkubasi pada suhu 27° sampai
29° selama 16 jam sampai 18 jam).
● Setelah inkubasi, tambahkan 0,5 mllarutan.formaldehida encer ke dalam tiap tabung,
satu rak dalam satu saat, dan ukur transmitans atau serapan pada 530 nm
● Pada penetapan 1 aras dosis dengan kurva baku, buat pengenceran hingga 5 aras dosis
larutan baku(S sampai S) dan satu aras dosis larutan uji (U) dari tiap sediaan sampai
dengan 20 sediaan uji yang sama dengan S3 baku. Buat juga satu S3 lain sebagai uji
pertumbunan. Tambahkan 1 ml masing-masing larutan uji pada 3 tabung dan 1 ml
pengencer bebas antibiotic pada 6 tabung sebagai kontrol. Letakkan secara acak satu set
lengkap, termasuk 2 tabung kontrol pada satu rak tabung. Tambahkan 9,0 ml inokula,
inkubasikan, tambahkan 0,5 ml formaldehida encer dan lanjutkan penetapan seperti di
atas. Tetapkan masa inkubasi yang pasti dengan mengamati pertumbuhan pada kadar
rujukan (dosis tengah) pengenceran baku (5).
Cara Perhitungan
Untuk menghitung potensi dari data yang diperoleh dengan metode lempeng silinder atau
turbidimetri lakukan seperti yang tertera pada Potensi hasil interpolasi dari kurva baku seperti
yang tertera pada Desain dan Analisis Penetapan Hayati <81>, menggunakan metode garis lurus
transformasi log dengan prosedur penyesuaian kuadrat terkecil dan uji linieritas. Bila sejumlah
penetapan dari bahan uji yang sama dilakukan menggunakan kurva baku yang sama, hitung
koefisien variasi dari hasil semua penetapan bahan uji. Bila lebih dari satu penetapan dilakukan
untuk bahan uji yang sama dengan kurva baku yang berbeda, buat rata-rata dari dua atau lebih
nilai potensi.

DAFTAR PUSTAKA
Depkes RI. 1979. Farmakope Indonesia, Edisi III. Jakarta: Departemen Kesehatan RI.
Departemen Kesehatan RI., 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV. Departemen Kesehatan
Republik Indonesia.
Lachman. 2008. Teori dan Praktek Farmasi Industri Edisi 3 halaman 1086. Jakarta: Universitas
Indonesia.