“Año del Diálogo y la Reconciliación Nacional”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

INFORME N°01

TECNICA PARA LA EXTRACCION DE SANGRE

EN HUMANO, AVE Y CONEJO
 Curso: Bioquímica

 Integrantes: Aguilar Rivera Larry Stewar

Chumacero Agramonte Alexandra Carolina
Espinoza Vinces José Ignacio
Pighi Mogollon Adriana Yvette

 Profesor:
Blgo. Henry Robles Cueva.

 Fecha: 24/10/2018
I. INTRDUCCION

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato

sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en
1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del
proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten,
desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el
comportamiento cinético de los enzimas (Granados, 2014).

Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (V0) y la

concentración inicial de sustrato ([S], Michaelis y Menten propusieron que las
reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa
se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato
da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre (Granados, 2014).

La ecuación de Michaelis-Menten es capaz de describir el cambio sufrido por

la velocidad de una reacción catalizada por una enzima al variar la concentración del
sustrato. La reacción que se establece entre la enzima y su sustrato va precedida de
la formación de un complejo, hipótesis que no pudo comprobarse experimentalmente
hasta cincuenta años después del establecimiento de la ecuación gracias a la
aplicación de las técnicas espectroscópicas (López & García, 2015).

La constante de Km de Michaelis es la concentración de sustrato a la cual

velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima (Vmax/2) alcanzable a una
concentración particular de enzima. De este modo, Km tiene las dimensiones de la
concentración de sustrato (Rodwell, Bender, Botham, Kennelly, & Weil, 2016).

La constante de Michaelis (Km) caracteriza la afinidad de la enzima por su

sustrato [A], a la cual v alcanza la mitad de la velocidad máxima. Una alta afinidad
de la encima por el sustrato significa que el valor de Km es bajo y a la inversa
(Koolman & Rohm, 2003).

Michaelis determinó la denominada constante de Michaelis (Km) que

establece la afinidad entre una enzima y su sustrato. Predijo y explicó la velocidad
de reacción, es decir la cantidad de sustrato que reacciona con la enzima por unidad
de tiempo, así como los factores que estimulan o inhiben dicha velocidad de reacción.
Demostró que las sucesivas adiciones de sustrato al medio de la reacción provocan
un abrupto incremento de la velocidad de reacción hasta un cierto punto en el que la
enzima se satura y la adición posterior de sustrato ya no afecta a la velocidad; es el
momento en el que se alcanza la velocidad máxima de reacción (Vmax).

El objetivo de la presenta práctica fue estudiar la influencia de la

concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática.
II. MATERIAL Y MÉTODO

a) Para la primera muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de

Reactivo de Trabajo para luego añadirle 10 ul de Glucosa con la ayuda de una
micropipeta, se incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó
al Espectrofotómetro para observar su absorbancia.

b) Para la segunda muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de

Reactivo de Trabajo para luego añadirle 20 ul de Glucosa con la ayuda de una
micropipeta, se incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó
al Espectrofotómetro para observar su absorbancia.

c) Para la tercera muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de

Reactivo de Trabajo para luego añadirle 30 ul de Glucosa con la ayuda de una
micropipeta, se incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó
al Espectrofotómetro para observar su absorbancia.

El filtro fue de 505 nm para la lectura del fotocolorímetro. Para el cálculo de

la concentración de la glucosa se realizó con la siguiente ecuación:

[𝐺] = 𝐹 × 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

Donde “F” equivale 200mg/dl.

Al Obtener los resultados se colocaron en un gráfico para obtener el Km por

medio de la siguiente ecuación:
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚 =
2

III. RESULTADO

a) Primer Tubo de Ensayo

Cálculo:
[𝐺] = 𝐹 × 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
𝑚𝑔
[𝐺] = 200 × 0,44
𝑑𝑙
[𝐺] = 88 𝑚𝑔/𝑑𝑙

b) Segundo Tubo de Ensayo

Cálculo:
[𝐺] = 𝐹 × 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
𝑚𝑔
[𝐺] = 200 × 0,52
𝑑𝑙
 [𝐺] = 104 𝑚𝑔/𝑑𝑙

c) Tercer Tubo de Ensayo

Cálculo:
[𝐺] = 𝐹 × 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
𝑚𝑔
[𝐺] = 200 × 0,57
𝑑𝑙
[𝐺] = 114 𝑚𝑔/𝑑𝑙
d) Cálculo de Km
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚 =
2
0,6
𝐾𝑚 =
2
𝐾𝑚 = 0,3

Fig. 1: Cálculo de Km.

IV. DISCUSIÓN

Según el autor Mathews (1992) nos expresa que el valor de un Km de una

enzima para un sustrato específico es la concentración del sustrato a la cual la
velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima y que la Vmax es la
velocidad teórica máxima de la reacción es catalizada por la enzima. A
concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la
velocidad máxima de la reacción, pero nunca se llega a ésta. Según Los valores de
Km y Vmax son característicos de una enzima, y se conocen como parámetros
cinéticos de la enzima. Aunque son constantes, dependen de las condiciones en las
que se lleva a cabo la reacción, ya que hay que recordar que la enzima es una proteína
cuya estructura y carga eléctrica se modifican cuando los componentes de la solución
cambian.
Según lo Observado y determinado en la práctica, un sustrato va a ser una
molécula sobre la cual va actuar una enzima. Mediante crezca la concentración de
sustrato, la velocidad de la reacción aumentará debido al aumento de la probabilidad
de formación de complejos enzima-sustrato. El km es la afinidad que tiene el enzima
por su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad ( donde predominan las
formas Enzima y Sustrato libres), cuanto menor es Km mayor es la afinidad
(predomina la forma Enzima - Sustrato). En cuanto a la velocidad máxima (Vmáx)
se va a estimar el número de centros activos del enzima es decir al aumentar la
concentración de sustrato, la actividad enzimática aumenta, hasta alcanzar la
velocidad máxima, punto donde la enzima se satura, debido a que las enzimas tienen
todos sus sitios activos ocupados
Según UNAM (2015) La velocidad inicial de una reacción es la velocidad
medida antes de que se haya formado suficiente producto para permitir que la
reacción inversa ocurra. Además, la velocidad inicial de una reacción enzimática es
siempre proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de
sustrato. La velocidad de transformación de los sustratos de una reacción en los
correspondientes productos, mediante una enzima y bajo condiciones de estado
estacionario, es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los
sustratos. Normalmente esa dependencia puede ser expresada matemáticamente por
la ecuación de Michaelis-Menten.
En esta práctica se observó, mediante una gráfica trazada con los datos
obtenidos, que la actividad catalítica de una enzima se determina midiendo la
velocidad inicial de la reacción, debido a que la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente es proporcional a la cantidad de enzima. Luego la reacción
transcurre linealmente y deja de ser lineal (curva) por lo tanto a concentración de
sustrato llega a su equilibrio.
V. CONCLUSIÓN

En el primer tubo de ensayo hubo una absorbancia de 0.44 y una

concentración de glucosa de 88 mg/dl, mientras que el segundo tuvo una absorbancia
de 0.52 y una concentración de 104 mg/dl y por último el tercero con una absorbancia
de 0.57 y una concentración de 114 mg/dl.
La reacción tuvo una velocidad máxima = 0.6 y un Km= 0.3.
De esto se obtiene que cuando la enzima se satura por el aumento del sustrato,
no se va a producir producto, llegando a su velocidad máxima.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Granados, J. (2014). Cinética Enzimática. Colombia: Universidad Nacional Abierta

y a Distancia.
Koolman, J., & Rohm, K. (2003). Bioquimica: Texto y Atlas. Madrid: Editorial
Medica Panamericana.
López , J., & García, F. (2015). Los Cuatro Mosqueteros de la Cinética Enzimática.
Eubacteria, 40.
Mathews, C. (1992). Bioquimica. McGraw-Hill.
Rodwell, V., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., & Weil, P. (2016). Bioquimica
Ilustrada. Mexico: McGraawHill.
UNAM. (2015). Efecto de la Concentración de una Enzima.
VII. ANEXOS

Fig. 2: Tubos de ensayo con Glucosa y Glucosa oxidasa.

Fig. 3: Absorbancia obtenida en el espectrofotómetro.