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Intro : Les blots en général se sont des techniques de transfert

d'ADN, d'ARN et de protéines sur un support de sorte qu'ils peuvent


être séparé

Par exemple : southern blot

La définition
Southern blot un méthode de biologie moléculaire a été
initialement décrite par E.M. Southern en 1975. Elle consiste à
détecter spécifiquement des fragments d'ADN transférés sur
filtre par leur hybridation à des séquences complémentaires
marquées par un radioisotope
Le but de southern blot :
permet de localiser une séquence d’ADN parmi les fragments
ayant migrés, grâce à une sonde marquée.
Elle permet de détecter une séquence d'ADN génomique dite
unique

le principe 1
Nous partons des fragments d'ADN obtenus par les enzymes
de restriction. On va appliquer la technique du transfert de
Southern pour fixer les sondes aux fragments leur
correspondant ; une sonde étant un fragment d'ADN auquel on
a marqué une base grâce à des composés radioactifs,
fluorescents ou un anticorps qui sert à localiser une séquence
de l'ADN qui nous intéresse. Le transfert de Southern sert donc
à repérer des fragments d'ADN. D'une façon plus générale, ces
fragments obtenus vont présenter des polymorphismes de
restriction. Un polymorphisme de restriction est une variation
individuelle de la séquence des bases du génome des
eucaryotes modifiant un ou plusieurs sites de restriction. Donc,
ces polymorphismes de restriction (mutations) vont, dans les
faits, être intéressants pour déterminer des variations géniques,
des tests de paternité par exemple.

Le principe 2 :
La clé de ce procédé est l'hybridation. Hybridation: Il est le
processus de formation d'une molécule d'ADN double brin
entre une sonde d'ADN simple brin et un ADN cible simple
brin.
Le protocole :
Extraction de l’ ADN
Restriction de l’ADN
l’électrophorése Transfert
Hybridation
Autoradiographi
Méthode :
ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme de
restriction appropriée
· Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur
gel d’agarose,
· L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude,
· L’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par capillarité sur
un support solide (filtre de nitrocellulose ou nylon). Les
membranes de nylon sont les plus utilisées car par un
traitement au UV (254 nm), on forme des liaisons covalentes
entre le DNA et le nylon de sorte que le support peut être
utilisé plusieurs fois avec d’autres sondes.
· Le support solide est hybridé avec une sonde mono-brin
marquée à faible stringence puis lavé
· Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par
la technique de l’autoradiographie

Résultat : La sonde va révéler la position sur la


membrane des fragments d'ADN recherchés. Plusieurs
situations peuvent se présenter :
 Les fragments d'ADN sont semblables au lieu
d'hybridation de la sonde et à proximité de celui-ci et
les fragments sont de même taille : il n'y a pas de
polymorphisme.
 Un site de restriction au voisinage de la sonde n'est
présent que chez l'un des deux individus ; les
fragments n'ont pas la même taille et ne sont donc
pas à la même hauteur sur le gel : il y a
polymorphisme de sites de restriction.
 Les sites de restriction sont identiques, mais une
séquence supplémentaire est présente chez l'un des
deux fragments. Les vitesses de migration des
fragments et donc leur position sur le gel sont donc, ici
aussi, différentes : il y a polymorphisme
d'insertion/délétion

Les champs de utilisation :


 Pour identifier l'ADN spécifique dans un échantillon
d'ADN
 Pour isoler l'ADN désiré pour la construction d'ADNr
 Identifier les mutations, délétions et des réarrangements
de gènes
 Utilisé dans le pronostic du cancer
 Le diagnostic de VIH-1 et les maladies infectieuses