PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE Yarrowia

lipolytica UTILIZANDO GLICEROL RESIDUAL DA PRODUÇÃO DO

BIODIESEL COMO SUBSTRATO

CAROLINA BITTENCOURT BARBOSA - 89830

GABRIELE MARQUES - 82195
LAÍS PAULO DOS SANTOS SILVA - 118894
MARIANA FERREIRA MICHEL – 87068
PAULO GUSTAVO ROSSI - 54373

RIO GRANDE, 2018

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RESUMO

No presente trabalho, abordaremos a produção industrial de ácido cítrico,

commodity amplamente usada em produtos alimentícios, farmacêuticos,
cosméticos e em outros produtos industriais devido às suas propriedades como
acidulante, conservante, ajustador de pH e antioxidante. No processo
convencional, a produção é realizada com inóculo de cepas do fungo filamentoso
Aspergillus niger, embora já seja possível obter o produto por cultivo submerso,
utilizando a levedura Yarrowia lipolytica e o glicerol, subproduto da produção de
biodiesel, como fonte de carbono em escala laboratorial. A levedura possui
algumas vantagens em relação ao fungo filamentoso como: tolerância a altas
concentrações de substrato, maiores taxas de conversão e produtividade, melhor
controle do processo; já o glicerol possui baixo custo, grande disponibilidade e
grau de redução mais elevado que açúcares, fornecendo assim, maior rendimento
de ácido cítrico. Desta forma, o objetivo do projeto é a ampliação de escala deste
processo, fazendo um estudo comparativo entre a produção em larga escala,
utilizando A. niger, com os atuais experimentos descritos na literatura da produção
de ácido cítrico a partir de Y. lipolytica; analisando a temperatura, o pH, a
concentração de nutrientes, a agitação e a aeração no scale-up; visando a
diminuição dos custos de produção e aumento do rendimento, para obter assim
um processo biotecnológico com potencial de aplicação, além de reduzir a geração
de poluentes e excedentes na produção do biodiesel.

Palavras-chave: ácido cítrico, levedura, Yarrowia lipolytica, scale-up, fermentação

submersa, glicerol, biodiesel.

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1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA

1. 1 Produção do biodiesel e aproveitamento do glicerol residual

O desenvolvimento de energias alternativas de fontes renováveis é essencial para
o crescimento econômico sustentável da sociedade moderna, em razão das limitações
oriundas das fontes de energia fósseis (ZHOU et al., 2008). Dentre os combustíveis
renováveis mais promissores está o biodiesel (produzido a partir de biomassa) que tem se
mostrado como alternativa de complementação ou substituição do combustível fóssil
diesel por ser biodegradável, atóxico e apresentar baixos níveis de emissões de poluentes
(MA; HANNAH, 1999).
O Brasil se destaca no panorama mundial do biodiesel, devido à sua grande
diversidade em grãos, de onde é extraído o óleo vegetal, e à sua destacável criação de
animais bovinos, que fornecem gordura animal e sebo (POUSA et al., 2007). Este fator,
aliado às estratégias traçadas pelo Governo Federal ̶ dentre elas, destaca-se a criação do
Programa Brasileiro de Desenvolvimento Tecnológico do Biodiesel (PROBIODIESEL),
que visa à gradual substituição do diesel proveniente do petróleo pelo biodiesel ̶
colocam o Brasil como segundo maior produtor e consumidor deste biocombustível no
ranking internacional (POUSA et al., 2007; MME, 2017).
Vale acrescentar a possibilidade de elevação da adição de biodiesel em até 15%
(B15) prevista para janeiro de 2019, tal como estabelecido na Portaria MME, n°80. O
cronograma inclui ainda a expectativa de comercialização do B100 (MME, 2017). Desta
forma, observa-se que a crescente adição de biodiesel ao diesel fóssil aumenta a produção
daquele biocombustível, o que alerta para a viabilidade do processo, visto a geração de
subprodutos.
De acordo com Mota, Silva e Gonçalves (2009), o óleo ou gordura usada na
produção é um triglicerídeo que sob a ação de um catalisador básico, hidróxido de sódio
(NaOH) ou hidróxido de potássio (KOH), na presença de álcool (metanol ou etanol) sofre
transesterificação, formando três moléculas de ésteres metílicos ou etílicos de ácidos
graxos (biodiesel) e liberando uma molécula de glicerol. Este é rico em impurezas como
água, sais orgânicos e inorgânicos, ácidos graxos, traços de ésteres, álcool e triglicerídeos
(ABAD; TURON, 2012; HÁJEK, et al.,2010). Assim, o glicerol bruto deve ser purificado
para ampla utilização, o que inclui filtração, destilação à vácuo, descoloração e troca de
íons pra a remoção, principalmente, de íons K+ e Na+ utilizados como catalisadores. Estes

3
processos são altamente custosos, o que implica na necessidade de pesquisas, com
objetivo de aproveitamento direto do glicerol bruto (RIVALDI, et al., 2007).
Considerando a oferta crescente de glicerol residual, o alto custo dos processos de
purificação e a necessidade de reaproveitar coprodutos do processo, promovendo uma
economia sustentável, a conversão deste substrato em produtos de maior valor agregado,
como biomassa e moléculas bioativas, por meio de tecnologia microbiana, é uma
oportunidade significativa para a biotecnologia industrial atual, além de viabilizar
economicamente o aumento da produção de biodiesel. Neste sentido, muitas pesquisas
têm demonstrado a bioconversão do glicerol bruto, mediante fermentação microbiana, em
ácido cítrico. Dedicaremos o tópico seguinte à abordagem do produto de interesse obtido
no bioprocesso.
1.2 Ácido cítrico
O ácido cítrico (AC), de fórmula química C6H8O7, é um dos principais
constituintes dos frutos cítricos. Apresenta como principais características: baixo ponto
de fusão, biodegradabilidade, solubilidade em água, atoxicidade e é um ácido orgânico
fraco. É encontrado sob o estado sólido em temperatura ambiente, possui cor branca ou
transparente, é inodoro, de sabor azedo e não inflamável (MATTEY, 1992).
Atualmente o principal meio de obtenção do AC é por fermentação,
principalmente por processo submerso, a partir de melaços de cana-de-açúcar e de
beterraba, empregando o fungo filamentoso Aspergillus niger (LEONEL; CE-REDA
1995). Quanto à aplicação, aproximadamente 70 % do ácido cítrico produzido é utilizado
na indústria alimentícia e de bebidas, 12 % na farmacêutica e 18 % é destinado a outros
usos industriais (LEONEL; CEREDA 1995). Sua ampla aplicação justifica a escolha
deste produto para a realização deste projeto, sendo que as respectivas funções do AC em
cada setor industrial estão citadas abaixo:
 Bebidas: ajuste de pH, estimulante de sabor, acidulante.
 Farmacêutico: anticoagulante, efervescente.
 Agricultura: aumenta a disponibilidade de fosforo na planta.
 Alimentos: ajuste de pH, conservante, acidulante, emulsificante,
antioxidante, estabilizante.
 Cosméticos: antioxidante, agente tamponante.

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 1.3 A levedura Yarrowia lipolytica
Devido à complexidade e prejuízo ecológico causado pelos métodos tradicionais
de produção de ácido cítrico a partir do melaço, pesquisas têm investigado o uso de fontes
de carbono, tais como resíduos e subprodutos agroindustriais (PAZOUKI et al., 2000;
PEKSEL; KUBICEK, 2003; DHILLON et al., 2011). O que também justifica o
desenvolvimento de estudos com microrganismos alternativos para o cultivo. Dentre eles,
dá- se destaque para Yarrowia lipolytica.
Algumas vantagens do uso da Yarrowia lipolytica são: (1) ampla utilização de
substratos, incluindo alcanos, ácidos graxos e orgânicos, proteínas e alguns açúcares,
devido à complexidade e multiplicidade de seus genes (KURTZMAN; FELL, 1988); (2)
taxa de respiração não é afetada por altas concentrações de substrato, isso porque por ser
aeróbia estrita, a respiração em presença de oxigênio é essencial para a obtenção do
produto de interesse (FLORES et al., 2000); (3) possuem alta taxa de conversão; (4) é
possível uso de substrato bruto (sem tratamento prévio), reduzindo problemas resultantes
de pré-tratamento (como abordado anteriormente); (5) permite um maior controle do
cultivo por serem as leveduras, seres unicelulares (MATTEY, 1992; MILSON, 1988); (6)
facilidade em se conseguir um melhoramento genético desses micro-organismos,
aumentando assim a sua produtividade e também sua resistência a longas e contínuas
operações numa alta velocidade de conversão sob elevadas condições aeróbias (SHAH et
al., 1993).
A Y. lipolytica é um microrganismo eucarioto, pertencente ao reino Fungi, classe
dos Ascomicetos e subclasse dos Hemiascomicetos (TSUGAWA et al., 1969). Devido a
sua capacidade de produzir vários intermediários metabólicos de interesse
biotecnológico, como proteases, lipases, proteínas, fosfatases e ácidos orgânicos, tem sido
estudada sua utilização em processos industriais (FICKERS, et al., 2004).Porém um
problema enfrentado no cultivo por leveduras é a produção simultânea de ácido isocítrico
em quantidades significativas (DHILLON et al., 2011), que pode ser controlado por
condições limitantes de nutrientes (KAMZOLOVA, et al., 2003; LEVINSON;
KURTZMAN; KUO, 2007). Esse ácido não é interessante ao processo, pois possui
capacidade tamponante e quelante inferior ao ácido cítrico, o que dificulta a cristalização
desse durante a etapa de purificação, quando se apresenta em níveis acima de 5% no meio
de cultivo (FORSTER et al., 2007).

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 1.4 Processo de produção do ácido cítrico – cultivo submerso
A escolha do processo submerso foi feita analisando a sua utilização para
produção em larga escala. É possível destacar, como vantagens, as altas taxas de produção
alcançadas, a necessidade de menos mão-de-obra e espaço para operação, uso de uma
faixa maior de concentração de substrato, um melhor controle do cultivo e baixo consumo
de energia (MATTEY, 1992; MILSON, 1988). Podem ser utilizados reatores agitados,
fermentadores em torre ou airlift. Geralmente as indústrias utilizam-se do processo em
batelada alimentada (ROHR; KUBICEK; KOMINEK., 1983).

1.5 Batelada alimentada

É selecionado o processo descontínuo alimentado em que a vazão de alimentação

é fixa. Periodicamente, retira-se um determinado volume de meio fermentado da dorna
(o qual será destinado a separação do produto fermentado), sendo recomposto até seu
valor máximo através da adição de mosto com vazão de alimentação conveniente. O
cultivo só será interrompido se cair a produtividade e /ou rendimento do sistema, que
podem ocorrer, por exemplo, se houver contaminação. Entre os motivos de se utilizar
batelada alimentada, temos (AQUARONE et al., 2001):

 Minimização dos efeitos de controle do metabolismo celular

 Prevenção da inibição por substrato

Minimização da formação de produtos de metabolismo tóxicos

1.6 Bioquímica do processo

A bioquímica do processo envolve basicamente as vias catabólicas da glicólise,
do ciclo de Krebs e da glicogênese, sendo estes a base do desenvolvimento do processo
dependendo de condições de operação e da ação de algumas enzimas (MOO-YOUNG et
al., 2011).
Segundo Kubicek et al. (1986), grandes quantidades de ácido cítrico são
produzidas pelo microrganismo produtor durante a fase estacionária e quantidades
menores durante a fase log ou fase de crescimento celular (biomassa) (MOO-YOUNG et
al., 2011). Primeiramente, tem-se a glicogênese onde o glicerol residual será convertido
em glicose no citoplasma da célula.
Depois tem-se a glicólise, que é o processo de degradação da glicose (sequência
de reações bioquímicas catalisadas por enzimas) e também ocorre no citoplasma da

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célula. No final desse tem-se a produção de energia (ATP) e elementos para biossínteses
celulares (metabólitos), como o piruvato ou ácido pirúvico (YOKOYA, 1992; PANDEY
et al., 2001; AQUARONE et al., 2001).
Na terceira parte de processo temos o ciclo de Krebs (ou ciclo do ácido
tricarboxílico, ou ciclo do ácido cítrico), onde ocorre a formação de citrato a partir do
piruvato sendo catalisada por duas enzimas, sendo o isocitrato (subproduto indesejado) é
formado pela ação da enzima aconitase sobre o citrato. Ocorre na matriz da mitocôndria
dos eucariontes, como no caso da Y. lipolytica (MOO-YOUNG et al., 2011;
NELSON,2014).
O mecanismo de acúmulo de ácido cítrico é feito baseando-se na inibição da
enzima aconitase, favorecendo assim a formação do citrato e desfavorecendo a do
isocitrato. Estratégias para esse fim serão explicadas nas seções posteriores (KAPOOR;
CHAUDARY; TAURO, 1982; ROHR; KUBICEK; KOMINEK, 1983; ESTOPIER.;
GUILOUET, 2014).
Outro ponto a ser ressaltado é o mecanismo de transporte do ácido dentro da
célula. Este começa com uma proteína localizada na camada externa da mitocôndria,
proteína de transporte de citrato (CTP), que faz o translado do ácido cítrico para o
citoplasma. Após isso a enzima citrato permease (CT) faz o transporte do citrato para o
exterior da célula. Logo o ácido cítrico é um produto extracelular resultante do
metabolismo natural de sobrevivência da célula (MOO-YOUNG et al., 2011,
NELSON,2014).
A engenharia genética tem como intenção melhorar os microrganismos a fim de
tornar seu metabolismo mais favorável quanto à produção de AC, sendo que mutações
são feitas para tentar alcançar esses objetivos (MOO-YOUNG et al., 2011).

1.7 Scale up
O aumento de escala, do inglês scale up, implica em reproduzir em um
equipamento de maiores dimensões os resultados obtidos com sucesso em uma escala
menor, o que resulta no aumento de produção de um determinado produto. O scale up
consiste em três etapas básicas: análise laboratorial, projeto piloto e escala industrial
(SMITH,2009).
Na análise laboratorial temos o estudo de caso e obtenção dos parâmetros do
processo (temperatura, o pH, a aeração, a agitação, a composição do meio de cultivo, a
concentração do substrato e do produto). O projeto piloto é uma planta laboratorial de

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larga escala e tem como objetivo fazer uma otimização e adaptação do processo com base
nos parâmetros, escolher o tipo de ampliação desejada para propagação e alguns dos
equipamentos que serão usados posteriormente, estimar os processos de downstream e ter
uma base de custo material e energético do processo .Por fim ocorre a passagem para a
escala industrial. Nessa etapa, é visado a perspectiva econômica do processo, ou seja, uma
produção comercial; além disso procura-se operar o biorreator nas mesmas condições que
o do projeto piloto, permitindo assim a obtenção de um desempenho adequado e
consequentemente de um processo mais eficiente (VOGEL; TODARO, 1997,
ARMILIATO,2004).
A viabilidade da produção do bioproduto dependerá do controle e monitoramento
dos parâmetros de processo. Sendo assim, quaisquer variações realizadas podem gerar
perda de produtividade, contaminações, degradação do bioproduto ou morte do
microrganismo produtor. Um processo bem definido deve gerar um produto que atende a
especificação em todas as etapas e não falhar nos testes de qualidade (NAJAFPOUR,
2007).

2. OBJETIVOS
2.2 Objetivos gerais
Este projeto tem por objetivo geral, a produção de ácido cítrico em escala
comercial, a partir do glicerol residual oriundo da produção de biodiesel de uma empresa
localizada em Canoas-RS.

2.3 Objetivos específicos

Como objetivos específicos deste projeto apresentam-se:

 Viabilidade de uma economia sustentável, ao passo que o

aproveitamento do glicerol bruto, oriundo da planta da empresa escolhida,
agrega valor à produção do biodiesel, além de viabilizar o aumento da sua
produção;
 Produzir ácido cítrico, em escala comercial, mediante
utilização da levedura Y. lipolytica;
 Verificar a influência da taxa de aeração com o uso de um
biorreator do tipo airlift
 Minimizar a produção simultânea de ácido isocítrico
através da otimização das condições de cultivo e operacionais, da

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 tecnologia de fermentação e estudar a cinética de crescimento e produção
de ácido cítrico pela Y. lipolytica em escala industrial;
 Atender a uma fatia da demanda mundial de ácido cítrico,
sobretudo no Brasil.
 Contribuir pra a biotecnologia industrial, inserindo um
processo viável comercialmente, que só há registros de experimentos em
escalas laboratorial e de bancada.
3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
3.2 Preparo do inóculo
 Ativação do microrganismo

Para a seleção das melhores condições para a obtenção do produto de interesse,

será realizado um levantamento de dados disponíveis em artigos e dissertações sobre o
tema abordado. Segundo a literatura, condições ótimas de cultivo foram obtidas a partir
de células conservadas a 4°C e um meio de YPD ágar (“Yeast Extract, Peptone, Dextrose
agar”) por no máximo duas semanas. O meio YPD ágar era composto por: 20 g/L de
peptona, 20g/L de ágar, 20g/L de glicose, 10g/L de extrato de levedura (FERREIRA et
al., 2015). Sendo assim, as células contidas nos tubos de ensaio com o meio YPD terão
um crescimento inicial a uma temperatura de 28°C por 24 h (SILVA, 2010).

 Obtenção do inóculo

A partir dos tubos contendo as células preservadas em meio sólido YPD serão
inoculadas, de forma estéril com uma alça de platina, 200 mL de meio de cultivo YPD
em Erlenmeyer de 500 ml (FERREIRA et al., 2015) que será incubado em um agitador
rotatório a 28°C, 160 rpm de agitação por 72 h. Após este período, uma alíquota será
retirada da amostra e será centrifugada a 3000 rpm durante 5 min, sendo o sobrenadante
congelado (-4°C) para posterior análise da produção de ácidos cítrico e isocítrico ,
determinação do pH (SILVA, 2010) e demais experimentos. O volume centrifugado desse
pré-inóculo deve ser suficiente para se obter uma concentração inicial de 1 g de células/L
de mosto (SILVA, 2014).

 Seleção da cepa de Y. lipolytica

Buscou-se na literatura vários experimentos realizados com diversas cepas de Y.

lipolytica com a finalidade de produzir ácido cítrico a partir de glicerol residual. O quadro
1 ilustra a concentração máxima de ácido cítrico obtido a partir de diferentes cepas de Y.
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 lipolytica e com glicerol bruto como substrato, variando conforme temperatura e pH. O
rendimento foi usado calculado e também se encontra na tabela para efeito comparativo.

Quadro 1. Comparativo quanto a produção de ácido e as diferentes cepas de levedura.

Cepa Concentração Concentração Temperatura pH Rendimento
final de Máxima de do controlado (%)
glicerol Ácido Cítrico Cultivo(°C) do Cultivo
residual (g/L) (g/L)

W29 20 10.3 27 5 51.5

(FERREIRA
et al., 2015)

CBS 2073 20 9.4 27 5 47

(FERREIRA
et al., 2015)

NRRL YB- 40 21.6 28.5 5.5 54

423
(LEVINSON
et al., 2007)

Wratislavia 200 126 30 5.5 63

1.31
(RYWIŃSKA
et al., 2011)

Wratislavia 200 113.5 30 5.5 56.75

AWG-7
(RYWIŃSKA
et al., 2011)

IMUFRJ 30 9.05 28 5 30.17

50682
(SILVA,
2010)

Fonte: Os autores.

Observa-se maior produção de ácido cítrico pela cepa Wratislavia 1.31, com
rendimento de 63%. Sendo assim, baseado na bibliografia estudada para elaboração deste,
a cepa adotada na produção de AC é a Wratislavia 1.31.

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 3.3 Propagação de cultura e acompanhamento do cultivo

Após a verificação laboratorial de que era viável produzir ácido cítrico com Y.
lipolytica ocorrerá a propagação do inóculo. Nesta etapa será refeito o experimento
laboratorial, porém ocorrerão transferências de volume durante a fase logarítmica. Elas
têm como objetivo aumentar o volume total de microrganismo. O último cultivo servirá
como inóculo da etapa seguinte, o pré-reator, e ocorrerá em uma proporção de 10% do
volume útil do mesmo. Sendo assim, o número de vezes em que ocorrerá esse processo
de transferência dependerá do volume útil do pré-reator. A cada etapa o microrganismo
tende a se adaptar mais aos parâmetros do processo. Após a adaptação, transfere-se uma
quantidade de cerca de 10% do volume útil do pré-reator para o reator airlift, o qual
contém condições semelhantes ao anterior (REGULY, 2000).
O cultivo será acompanhado através de análises de amostras retiradas do
biorreator a cada 24h. Essas amostras serão levadas para o laboratório e lá serão
quantificadas as concentrações de AC e ácido isocítrico, quantidade de biomassa gerada,
quantidade de glicerol consumido.

3.4 Meio de cultivo

A composição do meio de cultivo interfere no metabolismo de Y. lipolytica, que

pode excretar ácido cítrico sob condições de excesso de carbono e deficiência de
nitrogênio, sais minerais e tiamina no meio de cultivo (razão C/N deve ser alta)
(ROBLES-RODRIGUEZ, 2017; FORSTER et al., 2007). Diferentes níveis de minerais e
vitaminas também podem influenciar a produção (SILVA, 2014).
O processo foi realizado em batelada alimentada, sendo assim o meio de cultivo
consiste em 80g/L de glicerol residual inicial, 1 g/L de sulfato de amônio, 1 g/L de MgSO4
· 7H2O, 0.2 g/L de KH2PO4, 3 g/L de Na2HPO4. Sendo o glicerol residual a principal
fonte de carbono, e o sulfato de amônio a fonte de nitrogênio (RYWIŃSKA et al., 2011).
Outros componentes podem integrar ao meio com o objetivo de aumentar o rendimento
de bioproduto (KIMURA; YAMAOKA; KAMISAKA, 2004). Sendo assim, serão
acrescentadas também, substâncias que aumentem a razão ácido cítrico: ácido isocítrico
(potássio) e reduzidas aquelas que abaixem essa razão (nitrogênio, zinco, manganês). Um
dos pontos principais foi a decisão de usar o fluoracetato como inibidor da enzima
aconitase e assim promover um acúmulo de citrato no meio (KAPOOR et al., 1982,
KANZOLOVA et al., 1996). Para obter melhores resultados mais pesquisas serão
realizadas para verificar a influência do meio na cepa escolhida e determinar as
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quantidades ideias das substâncias citadas acima. Além disso estudos de picnometria
serão feitos para determinar a massa específica do glicerol residual.
O tempo de duração estimado do processo é de 120 h, sendo assim o cultivo será
alimentado com o substrato (glicerol residual) duas vezes, uma após as 24 primeiras
horas, e outra após as 48 primeiras horas até que chegasse na concentração final de 200g/L
de glicerol residual. O pH foi mantido na faixa de 5.5 com o uso de uma solução de NaOH
40% (m/v). (RYWIŃSKA et al., 2011).

3.5 Equipamentos do processo

Vários equipamentos são utilizados em escala comercial dentre eles podemos

citar: misturadores, válvulas, bombas, o biorreator airlift, o pré reator, compressores de
ar, filtros, esterilizadores, colunas com resinas de troca iônica, centrífuga, cristalizador,
secador e tanque. Sensores e controladores são usados para monitorar os parâmetros de
processo e modificá-los caso seja necessário, devem estar presentes em toda a planta,
principalmente no biorreator.
Por ser um cultivo submerso aeróbio, necessita-se a entrada de ar, esse deve ser
esterilizado com o uso de calor e/ou filtros. Além disso, o meio de cultivo também deve
ser esterilizado com o uso de calor. Demais processos que contenham impurezas podem
ser esterilizados com filtros (VOGEL et al, 1997, REGULY, 2000).

3.6 Recuperação e purificação do bioproduto

Um dos principais problemas existentes nessa fase são os vários estágios de

filtração, precipitação, cristalização e secagem que tornam o processo complicado e
custoso, além disso é responsável pela disposição de uma enorme quantidade de gesso,
gerando problemas ambientais (SOCCOL et al., 2006).
O procedimento mais utilizado e implementado em escala comercial na
recuperação do ácido cítrico é através da precipitação do meio fermentativo pela adição
com carbonato de cálcio. O downstream se iniciará com a filtração do caldo fermentado
contendo o ácido cítrico para remoção do micélio ou células e outras impurezas em
suspensão. Em seguida será adicionado carbonato de cálcio ao caldo que depois será
aquecido. O ácido cítrico precipita como citrato de cálcio, o qual é separado por filtração
e os resíduos removidos com água. O precipitado será tratado com ácido sulfúrico
(H2SO4) seguido de remoção de sulfato de cálcio (gesso) por filtração (PAZOUKI et al,
200-).

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 A solução contendo ácido cítrico será tratada com carvão ativado e passará através
de uma coluna de troca iônica, para desmineralização. Posteriormente a cristalização será
realizada em cristalizadores a vácuo a 20-25º C para obtenção de cristais de ácido cítrico
monohidratados; e a 36,5 ºC para o produto anidro. Por fim ocorrerá uma centrifugação
para separação de AC da solução e uma secagem a 40 ºC para retirar a água residual do
ácido cítrico purificado. O mesmo será armazenado em tanques para ser empacotado e
vendido em outras ocasiões (GREWAL; KALRA, 1995; SOCCOL et al., 2006).

4. RESULTADOS E IMPACTOS ESPERADOS

Através do delineamento experimental e dos equipamentos utilizados é possível
montar o fluxograma esperado do processo, visto na figura em anexo, pode ser notado na
parte superior o preparo do meio de cultivo, o pré-reator e a análise laboratorial, no meio
o cultivo industrial e embaixo os processos de separação e purificação.
Segundo FERREIRA et al. (2015) e RYWIŃSKA et al. (2011) o tempo de cultivo
para fabricação de AC por Yarrowia lipolytica dura 5 dias. Baseando-se no site da
fabricante Cargill foi possível obter que o cultivo com Aspergillus niger leva 7 dias.
Considerando que a taxa de produção do AC é determinada pela capacidade de produção
do biodiesel da empresa escolhida, cuja qual corresponde a 324 milhões de litros por ano
e que o glicerol equivale a aproximadamente 10% do volume total de biodiesel produzido
(DASARI et al., 2005), a taxa de entrada desse substrato será de 3,24 milhões de litros
por ano, como mostra a equação 1 abaixo.
𝐿 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑑𝑖𝑠𝑒𝑙 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙
324. 106 ∗ 0,1 = 3,24. 106 (𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 1)
𝑎𝑛𝑜 𝐿 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑑𝑖𝑠𝑒𝑙 𝑎𝑛𝑜

A equipe do projeto decidiu consider 35 dias de parada para as cargas e descargas

e para o período de manutenção das dornas, o que reduzirá o cronograma de trabalho para
330 dias/ ano. A escolha do biorreator airlift foi feita baseada na alta taxa de aeração
oferecida por este equipamento. Além disso o ar que entra no equipamento promove a
agitação do meio, o que é benéfico para o microrganismo já que evita a geração de calor
como no caso do uso da agitação mecânica, convencionalmente usada (REGULY, 2000).
Logo foi convencionado que o biorreator escolhido tem 10000 litros de capacidade,
porém definiu-se por conveniência e segurança que desse total somente 80% do volume
é considerado útil, isso foi feito pois assim os bioreatores não ficariam completamente
cheios e teria espaço para o gás carbônico gerado se expandir com segurança, além disso
teria espaço para uma agitação e aeração mais eficiente. Assim tem-se:

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 𝑑𝑖𝑎𝑠 1 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠
330 ∗ = 66
𝑎𝑛𝑜 5 𝑑𝑖𝑎𝑠 𝑎𝑛𝑜

𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 1 𝑎𝑛𝑜 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙

3,24. 106 ∗ = 4,91. 104
𝑎𝑛𝑜 66 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜

Adotando-se uma densidade do glicerol residual a 20°C de aproximadamente

1260 g de glicerol/L de glicerol e uma concentração de alimentação total de 200 g de
glicerol/ L de mosto, temos:

𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 1 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙

200 ∗ = 0,15873
𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜 1260 𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜

𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙

(0,80). 104 ∗ 0,15873 = 1269,84
𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑟 𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑟

𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 1 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑟𝑒𝑠

4,91. 104 ∗ ≃ 39
𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 1269,84 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜

Considerando que a concentração final do ácido cítrico produzido pela cepa

Wratislavia 1.31, estudada por RYWIŃSKA et al (2011), é de 126g de AC/L de mosto, a
quantidade de AC, em quilogramas, produzido por cultivo será de:
𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 1 𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜 𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜
4,91. 104 ∗ = 3,09. 105
𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 0,15873 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜

𝑔 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑐í𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜 𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜 𝐾𝑔 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑐í𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜

126 ∗ 3,09. 105 = 38975,62
𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑠𝑡𝑜 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜

Após o estudo das cinéticas de crescimento, foi verificado que a fase de

crescimento exponencial ocorre após uma fase lag de poucas horas e termina com o
esgotamento do nitrogênio do meio (BRIFFAUD; ENGASSER, 1979). Logo podemos
ver a Figura 1 que mostra as concentrações de AC e ácido isocítrico formados em g/L, a
quantidade de glicerol consumida e a quantidade de biomassa gerada ao longo do
processo de cultivo da levedura selecionada. Um ponto a ser ressaltado é a curva de
consumo de glicerol que representa uma queda acentuada (consumo do substrato) e
posteriormente uma ascensão (alimentação do substrato ao biorreator), característica de
processos em batelada alimentada. Como foi citado no delineamento experimental
podemos ver os pontos de alimentação em 24 h e 48 h após o início do cultivo; ambas as
alimentações foram feitas na fase logarítmica como se pode ver na curva de biomassa ,

14
depois das 48 h a curva de biomassa entra na fase estacionária , de produção de AC, e a
alimentação é cessada.
Figura 1. Variação de concentrações do processo ao longo do período de cultivo

Fonte: RYWIŃSKA et al. (2011)

Sabe-se que produção de ácido cítrico é estimulada por um aumento na aeração

em fermentação submersa (ROHR; KUBICEK; KOMINEK, 1983). Em fermentação em
batelada alimentada observou-se um consumo maior de oxigênio durante a fase de
crescimento e uma diminuição para um valor constante na fase de produção inicial de
ácido cítrico. O ácido isocítrico aparentemente não sofre nenhuma alteração devido à
mudança na concentração de oxigênio. Pesquisas comprovaram que um aumento na
concentração de oxigênio dissolvido, de 20 para 80% de saturação, provoca um aumento
no valor da produtividade volumétrica e também em um aumento na relação ácido cítrico:
isocítrico, a qual deve possuir valores altos (RANE; SIMS, 1995).
Foi verificado em muitas pesquisas que, para uma mesma cepa de levedura, o uso
de glicerol residual como substrato apresentava um rendimento um pouco menor do que
o uso do glicerol purificado. Como por exemplo em um processo onde a produtividade
de AC em glicerol proveniente da produção do biodiesel foi de 1,7g/L.h e em glicerol
puro foi de 2 g/L.h. Essa diferença era tão pequena que pode ser considerada desprezível,
porém sabe-se que o glicerol residual gera um menor rendimento pois suas impurezas,
como a presença de traços de etanol e sulfatos, interferem ligeiramente no processo.
Como os custos de purificação do glicerol são demasiadamente grandes, pode-se perceber

15
que não é economicamente viável realizá-lo, sendo assim mais uma vez o glicerol residual
se mostrou uma ótima matéria prima (SILVA, 2010)
Os processos de separação constituem uma gama de operações unitárias que tem
como objetivo separar e purificar o produto. Sendo assim, dependendo do fim ao qual o
AC se destinará poderemos encontrar ácido cítrico anidro e ácido cítrico seco, ambos em
forma de pó ou pastilhas; o produto desejado afetará os processos finais de purificação.
Por ser um produto extracelular, escolhemos o processo de separação convencional já
usado nas indústrias produtoras de ácido cítrico. Esse fato fará com que as empresas
tenham menos gastos caso resolvam mudar seu processo para o de produção de ácido
cítrico com Yarrowia lipolytica usando o glicerol como substrato.
Em 2016, foram gerados 341,9 mil m3 de glicerina como subproduto da produção
de biodiesel (B100), porém, o consumo interno do país, gira em torno de 40 mil toneladas
anuais (ABIQUIM, 2008). Para agravar este cenário, estima-se que no mundo cerca de
700 mil toneladas de glicerol por ano já sejam consideradas excedente de mercado
(BIODIESELBR, 2008). Em 2020, é esperado o dobro da geração de glicerol bruto
produzido, atingindo uma produção global de 2,6 bilhões de kg (VALERIO et al., 2015),
este aumento é devido a uma produção maior de biodiesel e ocasiona em uma pressão no
mercado em que o glicerol já é considerado em excesso. Devido a isso seu preço diminuiu
drasticamente de $400 por tonelada em 2001 para menos de $100 por tonelada em 2011,
fato que ressalta o baixo custo da matéria prima de nossa indústria (VALERIO et al.,
2015).
Este sobressalto se torna preocupante, já que o glicerol gerado pelo processo de
biodiesel é altamente poluente. Segundo Biodieselbr (2008), este coproduto por ser
insolúvel, quando em contato com rios e lagos, se precipita na água e dificulta a
oxigenação dos animais aquáticos, e se for queimado pode resultar em emissão de
acroleina, um composto químico bastante tóxico e cancerígeno (CÉSAR; BATALHA,
2007).
Nosso novo método de produção diminuirá a quantidade de glicerol residual
excedente e consequentemente os impactos ambientais e ainda poderá ser utilizado em
muitos processos industriais o que consequentemente gerará empregos e beneficiará a
economia da região em que a indústria for implementada. Outro ponto benéfico será o
incentivo da livre concorrência, pois atualmente no Brasil existem poucas industrias
produtoras de ácido cítrico. Sendo assim, com o novo processo ocorrerá uma expansão
do número de empresas produtoras, aumentando a qualidade, a competitividade e a

16
diversidade dos produtos. Além disso representará uma inovação tecnológica a qual
incentivará novas pesquisas na área, fazendo com que os parâmetros de processo sejam
refinados.

5. CRONOGRAMA
O cronograma com a realização das atividades em um período de um ano (48
semanas) está descrito no quadro 2. A duração das atividades foi dada nos respectivos
meses em que serão realizadas, pois prazos curtos não permitem o gerenciamento das
tarefas e prazos maiores tendem a perder clareza na informação da atividade a ser
detalhada.
Quadro 2. Cronograma de atividades do projeto.
Atividade Tempo

Revisão bibliográfica. Janeiro-Junho

Análise do processo. Março-Julho
Escolha da cepa produtora Abril
Preparação do inóculo. Agosto-Outubro
Propagação do inóculo. Agosto-Outubro
Preparo do meio de cultivo. Setembro
Definição da capacidade produtiva e regime de Junho-Julho
operação
Seleção e montagem dos equipamentos. Maio-Agosto
Desenvolvimento do design da planta química. Maio-Julho
Cultivo da levedura em escala piloto Setembro-Novembro
Cultivo com a levedura em escala industrial Setembro-Novembro
Recuperação do bioproduto. Novembro
Elaboração de relatório mensal de atividades Janeiro-Dezembro
Fonte: Os autores

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