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Techniques et procédures de laboratoires

Techniques Bactériologiques
Coloration de Ziehl
Antoine Pierson (BiolTrop)

Principe
Mise en évidence des :
 Des bacilles Acido-Alcoolo Résistants (BAAR) : Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
leprae, autres mycobactéries.
 Des bactéries comme Nocardia.
 Des micro-organismes comme Cyclospora cayetanensis.
 Effectué à partir d'un prélèvement de crachat qui est ensuite étalé sur lame.

Matériel
 Lames
 Coton
 Alcool 95°
 Pince en bois
 Pince en métal
 Porte lames
 Colorants
 Masque et lunette

Mode opératoire
1. Poser la lame sur son support, la recouvrir de fuschine phéniquée.
2. Prendre un coton imbibé d'alcool avec la pince en métal, l'enflammer et chauffer la
lame par le dessous jusqu'à émission de vapeurs par le colorant mais sans aller
jusqu'à l'ébullition.
3. Recommencer encore deux fois l'opération, le tout en une dizaine de minutes.
4. Remettre de la fuschine si besoin, la lame doit rester couverte.
5. Laver à l'eau.
6. Recouvrir d'acide sulfurique dilué au quart dans l'eau pendant 2 min, la coloration
devient jaunâtre.
7. Laver à l'eau.
8. Recouvrir d'alcool à 95 ° pendant 3 min, la coloration devient rose pale.
9. Laver à l'eau.
10. Recouvrir de bleu de méthylène phéniqué pendant 30 secondes.
11. Laver à l'eau, essuyer la face inférieure et laisser sécher.

Lecture : Observer à l'objectif X100 à immersion pendant au moins 10 min.

Version 1.0 : 1 novembre 2008 1/3


Les BAAR apparaissent en rouge sur un fond bleu On compte systématiquement le nombre de
BAAR dans chaque champ. Les BAAR vont apparaître en rouge sur fond bleu comme de fins
bâtonnets rouges légèrement incurvés et plus ou moins granuleux, isolés ou groupés.
Faire la lecture en suivant la longueur du frottis. Si la longueur du frottis est de 2 cm, elle compte
environ 100 champs microscopiques.
Lire au plus 100 champs avant de rendre un résultat, lorsqu'il s'agit d'un échantillon positif et au
moins 300 champs (trois longueurs) lorsqu'il s'agit d’un échantillon négatif.

Résultat
Les résultats sont interprétés suivant l’échelle qui suit :

0 BAAR dans 300 champs négatif

1 à 9 BAAR dans 100 champs positif faible ou « Rares BAAR »

10 à 99 BAAR dans 100 champs positif 1+

1 à 10 BAAR par champ sur 50 champs positif 2+

> à 10 BAAR par champ sur 20 champs positif 3+

Contrôle de qualité
Il existe un moyen très simple de vérifier la qualité de votre coloration. Il suffit de mélanger un peu
de vaccin BCG (même périmé) à votre propre crachat, puis de l'étaler comme les crachats à tester
et de colorer toutes vos lames en parallèle.
La lame contenant le BCG est remplie de petits bacilles rouges AAR.

Préparation des réactifs


Fuchsine phéniquée
 H2O distillée 2.000 ml
 Fuchsine basique 20 g
 Phénol aqueux 100 ml
 Alcool à 95°C 200 ml
Tenir à l'abri de la lumière et filtrer avant usage.
Bleu de méthylène
 H2O distillée 2.000 ml
 Bleu de méthylène médicinal 40 g
 Phénol aqueux 40 ml
 Alcool à 95°C 200 ml
Tenir à l'abri de la lumière et filtrer avant usage.
Acide
 H2O distillée 1.500 ml
 Acide sulfurique 500 ml
Alcool
 Alcool à 100° (éthanol absolu)

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Remarques importantes :
 Afin d'éviter toute contamination, il est conseillé d'observer toutes les règles d'hygiène et de
sécurité en vigueur.
 Il existe plusieurs « variantes » de cette méthode de coloration qui reste celle de référence :
méthode de Ziehl à froid, méthode de Tan Thiam Hock. Ces méthodes donnent de bons
résultats mais sont plus onéreuses. D'une manière générale, il faut observer les
recommandations des projets nationaux de lutte contre la tuberculose et autres
mycobactérioses.
 Variante appliquée à la recherche du bacille de Hansen : le BH se décolore plus facilement
que le BK et apparentés, on laissera donc la lame en contact de l'acide sulfurique pendant
1 minute et de l'alcool pendant 45 secondes.

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