Vous êtes sur la page 1sur 7

Annales de pathologie (2016) 36, 268—274

Disponible en ligne sur

ScienceDirect
www.sciencedirect.com

ARTICLE ORIGINAL

Habilitation des pathologistes pour


l’évaluation du pourcentage de cellules
tumorales lors du contrôle morphologique
avant extraction d’acides nucléiques
Authorization of pathologists for the estimation of the tumor cell percentage
on tissue sample for molecular analysis purpose

Alexandra Luquain a, Francine Arbez-Gindre a,


Isabelle Bedgedjian a, Sophie Felix a,
Jean-Marie Harimenshi a, Ionela-Marcela Mihai a,
Franck Monnien a, Cristina Singeorzan a,
Séverine Valmary-Degano a,∗,b

a
Service d’anatomie et cytologie pathologiques et de biologie cellulaire et moléculaire,
CHRU, 2, boulevard Fleming, 25000 Besançon, France
b
EA 3181, FED 4234, université de Franche-Comté, Les Hauts du Chazal, 19, rue
Ambroise-Paré, 25000 Besançon, France

Accepté pour publication le 15 juin 2016


Disponible sur Internet le 26 juillet 2016

MOTS CLÉS Résumé Avant toute analyse moléculaire, un contrôle morphologique avec estimation du
Habilitation ; pourcentage de cellules tumorales (%CT) est nécessaire pour s’affranchir du risque de faux-
Norme NF EN ISO négatifs. Le contexte d’accréditation selon la norme NF EN ISO 15189 impose une habilitation
15189 ; du personnel par une évaluation de ses compétences. L’objectif de ce travail était donc de
Pourcentage de valider l’habilitation des pathologistes du service à estimer un %CT sur prélèvement tissulaire
cellules tumorales ; avant extraction d’ADN pour analyse moléculaire. Les guides techniques d’accréditation des
Accréditation méthodes en biologie médicale et en anatomie et cytologie pathologiques ont été nos réfé-
rences. Le %CT correspondait à la proportion de noyaux de cellules tumorales sur l’ensemble
des noyaux des cellules présentes dans la zone sélectionnée pour l’extraction de l’ADN. Les
notes des évaluations externes de qualité ont été utilisées pour évaluer l’exactitude. Pour la
fidélité intermédiaire, 35 estimations de 4 cas (biopsie/ponction transpariétale/pièce opéra-
toire, fixé/congelé) ont été réalisées par 7 pathologistes sur 15 jours. Trois autres cas avec
interférences (inflammation, mucus, nécrose) ont été évalués. Un résultat était satisfaisant
s’il était à ±20 % du pourcentage attendu obtenu en faisant la moyenne des 35 estimations.
Les performances étaient satisfaisantes puisqu’aucune estimation n’a été rendue supérieure

∗ Auteur correspondant.
Adresse e-mail : svalmary@univ-fcomte.fr (S. Valmary-Degano).

http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2016.06.004
0242-6498/© 2016 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Habilitation des pathologistes pour l’estimation du pourcentage des cellules tumorales 269

à 20 % du pourcentage attendu. Une faible reproductibilité interpathologistes est rapportée


dans la littérature. Elle n’a de répercussion que pour les cas à faible %CT, autour des seuils
de sensibilité analytique des techniques moléculaires. Ce travail est un exemple de dossier
d’habilitation et une étape dans la démarche d’accréditation, véritable enjeu pour l’activité
future des pathologistes.
© 2016 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

KEYWORDS Summary Before molecular analysis is performed, morphological control with an estimation
Authorization; of the tumour cell percentage (%TC) could have a major impact on mutation detection. Accre-
NF EN ISO 15189 ditation according to NF EN ISO 15189 commands an authorization through evaluation of skills.
standard; The objective of this work was to validate the empowerment of pathologists to estimate %TC
Tumor cells in tissue sample prior to molecular analysis. The accreditation technical guidance methods in
percentage; Medical biology and histopathology were taken as references. %TC was the ratio of tumour
Accreditation cell nuclei on all nuclei within the area selected for the DNA extraction. External evaluations
quality scores were used for accuracy. In order to assess the intermediate precision, 35 %TC
estimation were performed 15 days apart in 4 samples (biopsies, transparietal biopsies or sur-
gical specimen, either fixed or frozen) by 7 pathologists. Three other cases with interference
(inflammation, mucus, necrosis) were evaluated. A result was satisfactory if %TC were within
±20 % of expected percentage obtained by the average of 35 estimates. The performances
were satisfactory since no estimate was made more than 20 % of the expected percentage.
Low interpathologists reproducibility has been reported in the literature and can have a conse-
quence on molecular analysis in samples with low %TC, where the value reach the analytical
sensitivity thresholds of molecular techniques. The current report is an example of a step of
the accreditation process, which is a challenge for pathologists’ activity in the future.
© 2016 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Introduction norme un « guide technique d’accréditation de vérification


(portée A)/validation (portée B) des méthodes en biolo-
L’accréditation est une procédure selon laquelle un orga- gie médicale : SH GTA 04 révision 00—avril 2011 » [6] et
nisme tierce partie faisant autorité (Cofrac : Comité français dernièrement un guide plus adapté à notre spécialité, le
d’accréditation) fournit une reconnaissance formelle de « guide technique d’accréditation en anatomie et cyto-
l’aptitude et de la compétence d’une personne ou d’une logie pathologiques SH GTA 03 révision 00 » [7] ont été
structure à réaliser des activités spécifiques de manière rédigés. Les recommandations qui y sont présentées sont
conforme [1,2]. Cette démarche est obligatoire en 2016 pour celles reconnues comme étant les plus appropriées par le
les laboratoires de biologie médicale et pour le moment Cofrac. Cependant, toute autre démarche argumentée et
volontaire pour les structures d’anatomie et cytologie documentée est acceptable si elle satisfait aux exigences
pathologiques (ACP) réalisant des actes à l’aide de tech- de la norme.
niques relevant de la biologie médicale [3]. En effet, la date Selon la norme NF EN ISO 15189, toutes méthodes et
ultime d’obligation d’accréditation pour les services d’ACP a procédures réalisées au sein d’un laboratoire doivent être
été remise en question par la loi no 2013-442 du 30 mai 2013 évaluées et donner des résultats satisfaisants avant d’être
qui précise que la biologie et l’ACP sont deux spécialités dif- utilisées pour les analyses médicales [5]. Cependant, le dia-
férentes ne permettant pas de les soumettre à des règles gnostic en tant que jugement médical n’est pas soumis à
d’organisations identiques. Pour autant, l’article L6221-1 la norme [7]. En parallèle, toute personne réalisant une
modifié par la loi no 2013-442 du 30 mai 2013 stipule dans tâche doit être habilitée à la pratiquer, c’est-à-dire obtienne
l’article 4 que l’accréditation d’un laboratoire de biologie une autorisation après évaluation de ses compétences [5].
médicale « porte également, lorsque le laboratoire réalise Selon la norme, chaque structure définit les critères perti-
ces activités, sur les examens d’anatomie et de cytologie nents et adaptés qu’elle souhaite appliquer à son processus
pathologiques figurant soit à la nomenclature des actes de d’habilitation, après avoir bien définit la mission à évaluer.
biologie médicale, soit à la nomenclature générale des actes Le pathologiste, à partir d’un prélèvement cytologique
professionnels » [4]. Pour les CHU, la question est donc de ou histologique, choisit d’effectuer un certain nombre de
définir si le laboratoire d’ACP fait partie ou non du labora- techniques (colorations standards ou spéciales, immunohis-
toire de biologie médicale. tochimie, hybridation in situ, biologie moléculaire). C’est la
La volonté d’un service d’ACP de se faire accréditer synthèse des différentes données morphologiques, immuno-
lui rend opposable des exigences en termes de ges- histochimiques ou de biologie moléculaire — intégrées dans
tion et d’exigences techniques, définies dans la norme son compte-rendu — qui permet au pathologiste de porter un
NF EN ISO 15189 [5]. Pour répondre aux exigences de cette diagnostic, préciser un pronostic ou apporter des arguments
270 A. Luquain et al.

pour le choix d’une thérapeutique. Nous nous sommes inté- charge au CHRU. Les tissus étaient soit fixés dans du formal-
ressés à l’estimation du pourcentage de cellules tumorales déhyde 10 % et inclus en paraffine, soit congelés dans l’azote
(%CT) qui est une étape critique lors de l’analyse molécu- liquide, puis conservés à −80 ◦ C dans la tumorothèque régio-
laire effectuée sur un fragment tissulaire ou cellulaire. Le nale de Franche-Comté. Nous avons réalisé 35 lectures par
pathologiste, qui suspecte ou porte un diagnostic nécessi- cas : 7 pathologistes ont effectué 5 lectures à des jours diffé-
tant des analyses de biologie moléculaire, va sélectionner, rents. L’étude de la fidélité intermédiaire a été réalisée sur
par un contrôle morphologique microscopique, un échan- une période de 15 jours commencée à j0. Les lectures ont
tillon riche en matériel tumoral [8] à partir duquel sera été programmées à j4, j7, j12 et j15. L’une des 5 lectures
effectué l’extraction de l’ADN. La richesse en cellules tumo- a été réalisée sur un microscope différent de celui utilisé
rales, estimée en pourcentage, a un impact sur la validité habituellement par le pathologiste. La moyenne de toutes
du résultat de l’analyse moléculaire, puisque le taux de les lectures, arrondie pour correspondre à l’échelle des
détection des mutations est fonction de la sensibilité ana- résultats rendus, a été considérée comme le pourcentage
lytique de la technique qui est étroitement liée au %CT. Le attendu. Nous avons aussi calculé le coefficient de variation
contrôle morphologique et l’estimation du %CT permettent (CV), comme préconisé dans le guide SH GTA 04 [6], selon
de diminuer les risques de faux-négatifs. L’estimation de la formule suivante : CV = (écart type/moyenne) × 100. Un
ce pourcentage, en tant qu’interprétation morphologique, coefficient kappa de Fleiss, plus adapté pour évaluer notre
n’est pas soumise à une validation de méthode mais unique- pratique, a été calculé sur les 35 lectures. Nous l’avons
ment à l’habilitation des personnes qui la réalisent dans un interprété selon Landis et Koch [10] :
contexte d’accréditation. • < 0 = pauvre concordance ;
Notre objectif était donc de formaliser l’habilitation des • 0,01—0,20 = faible concordance ;
pathologistes du service d’ACP du centre hospitalier régional • 0,21—0,40 = légère concordance ;
universitaire (CHRU) de Besançon à une activité déjà mise en • 0,41—0,6 = concordance moyenne ;
place et effectuée en routine, consistant à estimer un %CT • 0,61—0,80 = concordance importante ;
sur prélèvement tissulaire en vue d’une analyse moléculaire, • 0,81—1 = concordance presque parfaite.
dans le cadre de la démarche d’accréditation selon la norme
NF EN ISO 15189. Puis, nous avons créé 6 catégories :
• catégorie 0 : estimation égale au pourcentage attendu ;
• catégorie 1 : estimation à 10 % du pourcentage attendu ;
Méthodes • catégorie 2 : estimation à 20 % du pourcentage attendu ;
• catégorie 3 : estimation à 30 % du pourcentage attendu ;
L’estimation du %CT correspond à l’estimation de la pro- • catégorie 4 : estimation à 40 % du pourcentage attendu ;
portion de cellules (noyaux) tumorales sur l’ensemble des • catégorie 5 : estimation à 50 % du pourcentage attendu.
cellules (noyaux) présentes sur la coupe ou la zone du pré-
lèvement sélectionnée [8]. Il faut donc tenir compte, d’une Un résultat a été considéré satisfaisant s’il était compris
part, des cellules épithéliales tumorales, et d’autre part, à ±20 % de la valeur attendue. Les interférences que nous
de tous les autres éléments cellulaires : cellules épithé- avons prises en compte pour l’estimation du pourcentage
liales non tumorales, cellules du stroma tumoral — dont de cellules tumorales étaient la nécrose, la réaction inflam-
les lymphocytes qui sont parfois très nombreux —, cel- matoire et la présence de plages de mucus. Pour le choix
lules endothéliales, cellules conjonctives, tout en évitant les des échantillons, le critère d’interférence devait être pré-
zones de nécrose (ADN dégradé). Des recommandations pour sent sans notion de quantité mais relativement significatif.
une juste estimation de ce %CT ont été éditées par l’AFAQAP Une estimation du pourcentage de cellules tumorales a
[9]. L’évaluation du %CT n’est pas à réaliser à l’unité près et été évaluée par tous les pathologistes, sur chaque type
nous nous sommes appuyés sur l’échelle de grandeur utili- d’interférence avec le calcul de la moyenne, du coefficient
sée en routine dans le service, avec 2 catégories en dessous de variation et une analyse en fonction des catégories selon
de 10 % (0—4 % et 5—9 %), puis 10 % et de 10 en 10 jusqu’à l’écart au pourcentage attendu.
100 %. Par ailleurs, cette méthode est applicable à tous les
types morphologiques de cellules d’intérêt.
Pour évaluer les compétences des pathologistes, nous Résultats
avons choisi d’extrapoler les paramètres de performance
utilisés pour la validation de méthode lorsqu’ils étaient Concernant l’exactitude, les notes des pathologistes ayant
adaptés au processus d’habilitation. Les critères choisis participés à différents EEQ ont été jugées satisfaisantes :
étaient : l’exactitude, la fidélité intermédiaire (reproducti- EEQ colon 2013 GT130006 : score d’estimation de la cel-
bilité) et les interférences. En l’absence de contrôle interne lularité = 9/10 ; EEQ poumon 2013 GTE130006 : score
de qualité (CIQ), nous avons utilisé les évaluations externes d’estimation de la cellularité = 8/10 ; EEQ colon 2014
de qualité (EEQ) 2013, 2014 et le test AfAQap 2012 pour GTE140006 : note sur l’estimation de la cellularité = 4,75/5 ;
se rapprocher d’une évaluation de l’exactitude. La fidé- Test AfAQap 2012 : 15/20 (médiane des participants 14,8).
lité intermédiaire ou reproductibilité correspond pour cette Les résultats de fidélité intermédiaire des estimations du
méthode à la capacité à reproduire l’estimation du %CT en %CT sont présentés dans les Tableaux 1 et 2. Le pourcentage
faisant varier au moins un paramètre (le pathologiste, la attendu du cas no 1 était 5—9 %, le cas no 2 20 %, le cas no 3
date, le lieu. . .). Le guide SH GTA 04 recommande une éva- 70 % et le cas no 4 80 %. Le coefficient kappa de Fleiss a
luation sur 30 tests concernant au moins 2 niveaux (soit été calculé à 0,3 correspondant à une légère concordance.
2 échantillons : un avec un faible pourcentage de cellules Malgré une faible concordance, les résultats sont satisfai-
tumorales et un avec un fort pourcentage) [6]. Nous avons sants car aucune estimation n’a été rendue à plus de 20 %
sélectionné 4 cas : 2 biopsies et 2 pièces opératoires (Fig. 1). du pourcentage attendu (Tableau 1).
Les prélèvements tissulaires analysés ont concerné des can- Il en est de même pour les 3 cas évaluant les interférences
cers coliques ou pulmonaires provenant de patients pris en (Tableau 3).
Habilitation des pathologistes pour l’estimation du pourcentage des cellules tumorales 271

Figure 1. A. Échantillon no 1 : biopsie de bronche infiltrée par de rares cellules tumorales d’un adénocarcinome peu différencié (HE × 25)
avec un %CT attendu entre 5 et 9 %. B. Échantillon no 2 : ponction transpariétale d’un adénocarcinome pulmonaire du lobe inférieur droit
(HE × 15) avec un %CT attendu à 20 %. C. Échantillon no 3 : prélèvement provenant d’une pièce opératoire d’un adénocarcinome rectal bien
différencié (HE × 5) avec un %CT attendu à 70 %. D. Échantillon no 4 : prélèvement congelé provenant d’une masse ganglionnaire cervicale
droite envahie par un carcinome peu différencié (HE × 25) avec un %CT attendu à 80 %.
A. Sample no. 1: bronchial biopsy infiltrated by very few cells of a poorly differentiated adenocarcinoma (HE × 25). B. Sample no. 2:
transparietal biopsy of a pulmonary adenocarcinoma in the lung right lower lobe (HE × 15). C. Sample no. 3: sampling from a specimen as
part of a rectal well differentiated adenocarcinoma (HE × 5). D. sample no. 4: frozen specimen from a right cervical node mass invaded
by a poorly differentiated carcinoma (HE × 25).

Discussion l’estimation du pourcentage tumoral entrerait dans la phase


analytique.
Ce travail formalise l’habilitation des pathologistes du ser- L’estimation du %CT dépend d’une appréciation visuelle,
vice à estimer un %CT sur prélèvement tissulaire, en vue non automatisée, par conséquent, certains paramètres de
d’analyses de biologie moléculaire. performance proposés par le SH GTA 04 ne sont pas appli-
Cette étape peut être considérée comme la phase cables. Il est important de noter que la structure d’ACP est
préanalytique d’une analyse de biologie moléculaire. libre de choisir les critères d’évaluation pour l’habilitation
Cependant, Washetine et al. rapportent qu’un auditeur de son personnel, cependant, ces critères doivent être per-
technique avait suggéré, pendant leur accréditation, de tinents et adaptés. La spécificité analytique a été jugée
considérer que la phase préanalytique ne concernait non appropriée car l’estimation d’un pourcentage de cel-
que les étapes se déroulant en amont du laboratoire lules tumorales ne dépend pas de l’estimation sur le cas
avant l’enregistrement des prélèvements [11]. Ainsi, précédent. La répétabilité correspondant à la capacité à
272 A. Luquain et al.

Dans l’étude de la fidélité intermédiaire, chaque labo-


Tableau 1 Tableau de performance de la méthode :
résultats de l’évaluation de la fidélité intermédiaire. ratoire apprécie le nombre d’échantillons à traiter dans le
Performance table of the method: results of the evaluation of cadre d’une vérification/validation de méthode et peut utili-
intermediate precision. ser des données accumulées lorsque cette méthode est déjà
appliquée en routine à la condition qu’il n’y ait pas eu de
Échantillons Nombre Moyenne CV (%) modification de celle-ci et que ces données soient appro-
Échantillon niveau 1 35 5 (5—9) 54,7 priées. Nous avons repris l’échelle utilisée dans le service
Échantillon niveau 2 35 18 (20) 50,1 mais il en existe d’autre. L’AfAQap préconisait dans son test
Échantillon niveau 3 35 68 (70) 11,7 2012 des catégories de 5 % entre 1 et 30 %, puis des catégo-
Échantillon niveau 4 35 82 (80) 13,4 ries de 10 % entre 31 et 100 %. Actuellement, elle préconise
< 1 %, 1 à 4 %, puis des catégories de 5 % entre 5 et 29 % et
Nombre : nombre d’estimations effectuées ; moyenne : moyenne pour les pourcentages élevés une simplification en 4 catégo-
des estimations. Le chiffre entre parenthèse est la moyenne des ries 30, 50, 80 et 100 %. Pour l’évaluation de la fidélité inter-
estimations arrondie à l’échelle de lecture et est défini comme médiaire et des interférences, nous n’avons pas pu comparer
étant le « pourcentage attendu » ; CV : coefficient de variation. nos coefficients de variation étant donné que cette méthode
n’a pas été validée par un fournisseur. Le coefficient kappa
de Fleiss était plus adapté. Les autres études ayant évalué
reproduire un résultat dans les mêmes conditions, au même la concordance entre les pathologistes illustrent la difficulté
moment, ce critère n’était pas non plus approprié à une d’obtenir une reproductibilité pour quantifier visuelle-
activité humaine. Les intervalles de mesures, la limite de ment de manière absolue le nombre de cellules tumorales
quantification, la limite supérieure de linéarité et les tests [10,12,13]. Il peut exister une différence significative entre
de contamination inter-échantillon sont des paramètres qui les observateurs même avec une marge d’erreur tolérée à
s’appliquent à des mesures par automates et n’ont pas été 20 % [14]. Une étude prospective sur plusieurs sites a testé
évalués [6]. Dans ce dossier d’habilitation, c’est l’estimation la concordance interpathologistes sur l’estimation de ce
du %CT qui est évaluée et non pas la réalisation de la coupe pourcentage [15]. Les résultats indiquent une faible repro-
correspondant à l’échantillon. ductibilité inter-laboratoire mais l’estimation moyenne

Tableau 2 Analyse des estimations du pourcentage de cellules tumorales en fonction des catégories d’écart au pour-
centage attendu pour l’évaluation de la fidélité intermédiaire. Catégorie 0 : estimation égale au pourcentage attendu,
catégorie 1 : estimation à 10 % du pourcentage attendu, catégorie 2 : estimation à 20 %, catégorie 3 : estimation à 30 %,
catégorie 4 : estimation à 40 %, catégorie 5 : estimation à 50 %. Le pourcentage attendu est la moyenne des 35 estimations.
Analysis of estimates of the percentage of tumour cells according to the categories of the expected percentage difference for the
evaluation of intermediate precision. Category 0: equal to the percentage estimate expected; category 1: estimated 10 % of the
expected percentage; category 2: 20 % rating; category 3: 30 % rating; category 4: 40 % estimate; category 5: estimation 50 %. The
expected percentage is the average of 35 estimates.
Catégories

Satisfaisantes Non satisfaisantes


0 1 2 3 4 5
Nombre d’estimations Cas 1 21 14 0 0 0 0
Cas 2 15 17 3 0 0 0
Cas 3 15 19 1 0 0 0
Cas 4 11 18 6 0 0 0
Total 62 68 10 0 0 0

Tableau 3 Analyse des estimations du pourcentage de cellules tumorales en fonction des catégories d’écart au pour-
centage attendu pour l’évaluation des interférences. Cas 1 : inflammation ; cas 2 : mucus ; cas 3 : nécrose. Catégorie 0 :
estimation égale au pourcentage attendu, catégorie 1 : estimation à 10 % du pourcentage attendu ; catégorie 2 : esti-
mation à 20 % ; catégorie 3 : estimation à 30 % ; catégorie 4 : estimation à 40 % ; catégorie 5 : estimation à 50 %. Le
pourcentage attendu est la moyenne des 35 estimations.
Analysis of the estimates of the percentage of tumor cells based on the difference with the expected percentage categories for
evaluating interference. Case 1: inflammation; case 2: mucus; case 3: necrosis. Category 0: equal to the percentage estimate expected;
category 1: estimated 10 % of the expected percentage; category 2: 20 % rating; category 3: 30 % rating; category 4: 40 % estimate;
category 5: estimation 50 %. The expected percentage is the average of 35 estimates.
Catégories
Satisfaisantes Non satisfaisantes

0 1 2 3 4 5
Nombre d’estimations Cas 1 2 3 2 0 0 0
Cas 2 1 5 1 0 0 0
Cas 3 3 3 1 0 0 0
Total 6 11 4 0 0 0
Habilitation des pathologistes pour l’estimation du pourcentage des cellules tumorales 273

était assez précise. En effet, l’estimation moyenne du pour- les pathologistes ont répondu entre 0 et 10 %, donc il n’y
centage était 8 fois sur 10 à plus ou moins 10 % de la valeur aurait pas eu de risque de faux-négatif car l’interprétation
attendue. De plus, la régression linéaire montrait une cor- du test moléculaire aurait tenu compte du faible %CT. Par
rélation statistiquement significative entre la moyenne des contre, pour le cas no 2 avec un pourcentage attendu de
estimations et la valeur attendue. Les erreurs de surestima- 20 %, 3 estimations (effectuées par un même pathologiste)
tion de plus de 20 % étaient considérées comme ayant un sur 35 donnent un %CT à 20 % du pourcentage attendu. Si
impact potentiel sur le patient. Au total, 5 cas sur 10 mon- la sensibilité analytique de la technique était de 20 %, un
traient plus de 10 % de réponses surestimant et conduisant risque de faux-négatif aurait pu exister. Concernant les cas
à un test faussement négatif [15]. Le seuil d’acceptabilité avec interférences, nous n’avons pas observé de différence
de 20 % est également utilisé par le test AfAQap 2012 (pour plus élevée par rapport aux autres cas. Ces bons résul-
les résultats supérieurs à 20 % de cellules tumorales), avec tats peuvent en partie être expliqués par la mise en place
une note de 8/10 lorsque le résultat donné était sur ou préalable d’une réunion réunissant tous les pathologistes,
sous-estimé de 10 % et une note de 5/10 au seuil de 20 %. rappelant la méthode d’évaluation du %CT et les différents
Les difficultés d’obtenir une concordance parfaite entre pièges dont il fallait tenir compte.
les pathologistes pourraient être minimisées par un comp- La norme NF EN ISO 15189 demande de conserver les
tage manuel du nombre total de noyaux dans la zone enregistrements de l’habilitation du personnel, à minima
sélectionnée mais cela n’est pas envisageable en routine car durant toute la période de leur activité, puis 18 mois après,
extrêmement chronophage. Il est donc admis que ce comp- afin d’assurer une traçabilité [5]. De plus, elle impose
tage correspond actuellement à une estimation visuelle le maintien de cette habilitation au travers d’un suivi
[16—18]. Certains auteurs comme Smits et al. proposent d’indicateurs ou d’EEQ. Ainsi, une mise à jour continue
de faciliter le comptage en utilisant une immunohistochi- est nécessaire. Une procédure spécifique concernant la ges-
mie, mais évoquent un risque de surestimation [14]. Viray tion de la portée flexible (ou maîtrise des changements de
et al. ont tenté de développer un programme informatique méthodes) est aussi à formaliser par le service.
capable de déterminer avec précision le %CT sur une image Ce travail a eu l’intérêt de faire partager les expériences
scannée provenant d’une lame colorée à l’hématoxyline- au microscope multi-têtes et a contribué à l’harmonisation
éosine-safran. L’un des différents programmes testés a des pratiques des pathologistes au sein du service. Nous
retenu leur préférence mais doit cependant être validé par pourrons utiliser ce support pour habiliter les futurs patho-
d’autres études [19]. logistes du service et élargir les évaluations d’habilitation
Une des limites de ce travail pourrait porter sur le choix à d’autres tâches telle l’analyse (semi)-quantitative en
du pourcentage attendu à partir de la moyenne des résul- immunohistochimie.
tats. Le pourcentage attendu serait plus exact en étant L’accréditation est un véritable enjeu futur pour les
calculé à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, à partir pathologistes, qui peuvent s’appuyer sur l’AfAQap pour
de la surface de tissu sélectionnée sur lame numérisée. mettre en place une démarche d’accréditation et dévelop-
Une autre solution pourrait être de choisir les lames numé- per l’assurance qualité dans leurs services [21]. L’organisme
risées proposées par l’AfAQap dans ses tests. Cependant, accrédité doit démontrer sa capacité à appliquer des
l’exactitude des estimations de nos pathologistes a été sou- connaissances et savoir-faire [22] et satisfaire aux exi-
mise à des EEQ et au test AfAQap, par conséquent, il semble gences pour être conforme à un référentiel : la norme
acceptable d’utiliser les estimations de pathologistes consi- NF EN ISO 15189 [5]. Dans ce contexte, le travail présenté
dérés comme référents dans le service. ici a contribué à formaliser l’habilitation des pathologistes
Rappelons que le résultat de l’analyse moléculaire peut du CHRU de Besançon à qualifier les échantillons tissu-
apporter des arguments diagnostiques ou pronostiques, laires tumoraux lors d’analyses moléculaires et constitue
influence le choix de certaines thérapeutiques et que la une étape parmi d’autres dans la mise en place de la
fiabilité de ce résultat est conditionnée par l’évaluation démarche d’accréditation du service [23—25].
du %CT. En effet, au-dessous d’un certain seuil de %CT, la
quantité d’ADN non tumoral dilue fortement la quantité
d’ADN tumoral après PCR et rend plus difficile la détec- Remerciements
tion et l’analyse de la présence d’une mutation, phénomène
accentué par la possibilité d’une hétérogénéité tumorale L’échantillon congelé testé est issu de la tumorothèque
et donc moléculaire. Ainsi, une surestimation de ce pour- régionale de Franche Comté (BB-0033-00024).
centage peut conduire à un test faussement négatif si le
juste %CT est en dessous de la sensibilité analytique de la
technique (seuil entre 5 et 10 %, voire 20 % en fonction de
la technique) [10]. En dessous du seuil de sensibilité de la
Déclaration de liens d’intérêts
technique, les résultats doivent être rendus non contribu-
Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts.
tifs si négatifs et une nouvelle analyse est recommandée
à partir d’un autre prélèvement. Le risque d’obtenir des
résultats faussement négatifs diminue fortement si le pour-
centage de cellules tumorales est supérieur à 60 % [20]. Pour Références
enrichir le prélèvement en cellules tumorales, il est recom-
mandé de réaliser une macrodissection manuelle lorsque le [1] Afnor. Norme NF EN ISO/CEI 17000; 2005.
[2] Afnor. Norme NF EN ISO/CEI 17011; 2005.
prélèvement contient moins de 50 % de cellules cancéreuses
[3] Ordonnance no 2010-49 du 13 janvier 2010 relative à la biologie
[10]. Les pathologistes ont plus tendance à surestimer qu’à médicale. [Internet]. www.legifrance.gouv.fr.
sous-estimer le pourcentage de cellules tumorales [15]. Une [4] Loi no 2013-442 portant sur la réforme de la biologie médicale
étude montrait 38 % d’erreur de surestimation pour des — 30 mai 2013. Journal Officiel de la République française. p.
échantillons présentant moins de 20 % de cellules tumo- 1—140.
rales [14]. Pour le cas no 1 avec un %CT de 5—9 %, tous [5] Afnor. Norme NF EN ISO 15189; 2012.
274 A. Luquain et al.

[6] Cofrac. Guide technique d’accréditation de vérification (por- [16] Bellon E, Ligtenberg MJL, Tejpar S, Cox K, de Hertogh G, de
tée A)/validation (portée B) des méthodes en biologie médicale Stricker K, et al. External quality assessment for KRAS tes-
- SH GTA 04 - Révision#00; 2011. ting is needed: setup of a European program and report of the
[7] Cofrac. Guide technique d’accréditation en anatomie et cyto- first joined regional quality assessment rounds. The Oncologist
logie pathologiques SH GTA 03 Révision 00; 2014. 2011;16:467—78.
[8] INCa. Bonnes pratiques pour la recherche à visée théra- [17] Lamy A, Blanchard F, Le Pessot F, Sesboüé R, Di Fiore F, Bossut J,
nostique de mutations somatiques dans les tumeurs solides; et al. Metastatic colorectal cancer KRAS genotyping in routine
2010. practice: results and pitfalls. Mod Pathol 2011;24:1090—100.
[9] AfAQap [Internet]. [cité 18 mai 2015]. Disponible sur : https:// [18] Angulo B, García-García E, Martínez R, Suárez-Gauthier A,
www.afaqap.fr/. Conde E, Hidalgo M, et al. A commercial real-time PCR kit
[10] Warth A, Penzel R, Brandt R, Sers C, Fischer JR, Thomas M, provides greater sensitivity than direct sequencing to detect
et al. Optimized algorithm for Sanger sequencing-based EGFR KRAS mutations: a morphology-based approach in colorectal
mutation analyses in NSCLC biopsies. Virchows Arch Int J Pathol carcinoma. J Mol Diagn 2010;12:292—9.
2012;460:407—14. [19] Viray H, Coulter M, Li K, Lane K, Madan A, Mitchell K, et al.
[11] Washetine K, Long E, Hofman V, Lassalle S, Ilie M, Lespi- Automated objective determination of percentage of mali-
net V, et al. [The accreditation of a surgical pathology and gnant nuclei for mutation testing. Appl Immunohistochem Mol
somatic genetic laboratory (LPCE, CHU of Nice) according Morphol 2014;22:363—71.
to the ISO 15189 norm: sharing of experience]. Ann Pathol [20] Hofman V, Ilie M, Gavric-Tanga V, Lespinet V, Mari M, Las-
2013;33(6):386—97. salle S, et al. Rôle du laboratoire d’anatomie pathologique de
[12] Dequeker E, Ligtenberg MJL, Vander Borght S, van Krieken l’approche préanalytique des examens de biologie moléculaire
JHJM. Mutation analysis of KRAS prior to targeted therapy in réalisés en pathologie tumorale. Ann Pathol 2010;30:85—93.
colorectal cancer: development and evaluation of quality by a [21] Bellocq JP, Michiels JF. La 15189 en anatomie et cytologie
European external quality assessment scheme. Virchows Arch pathologiques : 1515, 1789 or 14-18 ? Informations et pro-
Int J Pathol 2011;459:155—60. positions pour avancer sans se prendre la tête. Ann Pathol
[13] Thunnissen E, Bovée JVMG, Bruinsma H, van den Brule AJC, Din- 2012;32:S80—1.
jens W, Heideman DAM, et al. EGFR and KRAS quality assurance [22] Afnor. Norme ISO 9000 — octobre 2005.
schemes in pathology: generating normative data for molecu- [23] Bellocq JP, Grizeau B, Anger E, Chenard MP, Fléjou JF, Guiu M,
lar predictive marker analysis in targeted therapy. J Clin Pathol et al. Accréditation et anatomie et cytologie pathologiques.
2011;64:884—92. Ann Pathol 2010;30:97—9.
[14] Smits AJJ, Kummer JA, de Bruin PC, Bol M, van den Tweel [24] Long E, Hofman V, Ilie M, Washetine K, Lespinet V, Bonnetaud
JG, Seldenrijk KA, et al. The estimation of tumor cell percen- C, et al. Accréditation de l’activité de pathologie moléculaire
tage for molecular testing by pathologists is not accurate. Mod selon la norme ISO 15189. Principales étapes à respecter et
Pathol 2014;27:168—74. principaux écueils possibles. Ann Pathol 2013;33:12—23.
[15] Viray H, Li K, Long TA, Vasalos P, Bridge JA, Jennings LJ, et al. [25] Long E, Hofman V, Ilie M, Lespinet V, Bonnetaud C, Bordone
A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine O, et al. Mise en place d’un secteur de pathologie moléculaire
pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant en oncologie au sein d’un laboratoire d’anatomie pathologique
cells. Arch Pathol Lab Med 2013;137:1545—9. (LPCE, CHU de Nice). Ann Pathol 2013;33:24—37.