TRANSFORMACIÓN GENETICA: METODOS.

La transformación genética es la introducción controlada de ácidos nucleicos en

un genoma receptor (Tacchini et al. 1987).
La transformación es la alteración genética de una célula resultante de la
absorción directa, incorporación y expresión del material genético exógeno (ADN
exógeno).
El ADN exógeno se encuentra en el ambiente y se introduce a través de la
membrana de la célula bacteriana. La transformación ocurre de forma natural en
algunas especies de bacterias, aunque también se puede efectuar por medios
artificiales. Para que ocurra la transformación, la bacteria debe estar en un
estado de competencia, lo que puede ocurrir como una respuesta limitada en el
tiempo a las condiciones ambientales, tales como la falta de nutrientes y una
densidad celular elevada. Una transformación es uno de los tres procesos por
los que el material genético exógeno se puede introducir en una célula
bacteriana. Los otros dos son la conjugación y la transducción.

METODOS DE MANIPULACIÓN DEL ADN Y TRANSFORMACIÓN DE

CÉLULAS VEGETALES

DIRECTA:
1. Biobalística.
2. Electroporación.
3. Sonicación.
4. Protoplastos.
5. Microinyección.
6. Transformación mediada por láser.

INDIRECTOS: Método Indirecto (Biológico), basado en un vector natural

1. Transformación con el Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.
2. Transformación con el Plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes
3. Vectores virales
4. Vectores Transposones.
5. Vectores Transposones.
 I. METODOS DIRECTOS.

1. Biobalística
También llamada bombardeo con microproyectiles, es el método alternativo más
importante para transferir DNA a plantas. Se basa en utilizar microproyectiles
recubiertos del DNA que se desea transferir, son disparados sobre los tejidos
vegetales a altas velocidades que atraviesan la pared y la membrana celular,
llevando al interior de la célula los genes de interés para que se integren en el
genoma vegetal. La técnica consiste en bañar partículas esféricas de oro o
tungsteno (0,4-1,2 micrómetros de diámetro) con DNA, el cual ha sido precipitado
con CaCl2, espermidina o polietilen glicol. Después las partículas bañadas con
DNA son aceleradas a altas velocidades (300-600 mt/sg) con un equipo especial
llamado Pistola de Partículas ó Pistola de Genes (Fig.3). El DNA una vez dentro
de la célula se separa de las partículas y se integra dentro del núcleo de las
plantas.
Hay algunas desventajas que se presentan, como:

a) Un porcentaje de éxito variable.

b) Silenciamiento génico.
c) Una introducción inestable del transgen.
d) Presencia de rearreglos en el DNA transferido.
e) Presencia de daños en los tejidos.
f) El sistema llega a ser muy costoso.

2. Electroporación.
Es la aplicación de pulsos eléctricos de alto voltaje en la membrana celular
causando de forma temporal poros que permiten la entrada de macromoléculas
al interior de la célula (Fig. 4). Lo que pasa es que las Membranas se
desestabilizan causando pérdida temporal de la permeabilidad y produciendo
poros reversibles, por lo que pasan macromoléculas, fuga de iones, escape de
metabolitos y como consecuencia se presenta una mayor absorción de DNA que
es lo que realmente nos interesa, y tras el tratamiento la membrana vuelve a su
estado normal, como si nada hubiera pasado. Se lleva a cabo en un aparato
llamado “Electroporador” que utiliza descargas de capacitores para producir
pulsos de alto voltaje, originando una corriente eléctrica que se hace pasar a
través de la suspensión que contiene las células.
Una de sus ventajas es que es casi diez veces más efectiva que la
transformación mediada por métodos químicos, es muy eficiente y fácil de
operar, relativamente simple y económico. Una de sus desventajas es la
necesidad de tener que usar Protoplastos (células sin pared), para que se pueda
llevar a cabo la permeabilización de la membrana celular.
 3. Sonicación

También llamada tratamiento con ultrasonidos o Sonoporación, es parecida a la

Electroporación, pero acá se emplea ultrasonido con frecuencias superiores a 20
KHz, para generar permeabilidad en las membranas (mediante la inducción de
poros transitorios) a través de los cuales el DNA foráneo ingresa a la célula. El
aparato usado para los pulsos ultrasónicos se llama Sonicador (Fig. 5), que
genera primeramente la formación de burbujas (poros transitorios) con la
consecuente generación de elevada presión y temperatura. Y en segundo lugar
las ondas ultrasónicas provocan la generación de corrientes alrededor de las
burbujas que las hace crecer con rapidez haciéndolas colapsar. Durante este
colapso, las burbujas producen ondas de choque muy fuertes, así como
pequeños chorros de líquido a altas velocidades, produciendo daños en la
superficie de objetos sólidos cercanos.
Entre sus ventajas está el hecho de ser bastante simple y rápida, así como su
bajo costo. Es un método de transferencia génica muy versátil que permite
introducir DNA exógeno desde protoplastos a células en suspensión y tejidos. El
único problema o desventaja, es que las ondas ultrasónicas pueden causar daño
a células a causa de la elevada temperatura que produce, lo que limitan el uso
de esta técnica.

4. Protoplastos

Este fue el primer método de transferencia génica que se demostró que

funcionaba en plantas. La técnica se basa en el principio de que la pared celular
es la principal barrera para la captación de DNA, así que esta puede ser
temporalmente extraída por enzimas de restricción y posteriormente se usan
otros métodos para la transferencia génica (Fig. 6).
La desventaja de esta técnica es que no es muy eficiente para la generación de
plantas a partir de cultivos de protoplastos. Pero como ventaja principal tenemos
que en ensayos de expresión transitoria permiten la transformación de un
número muy elevado de células individuales, facilitando ensayos cuantitativos
con buenos niveles de replicación.
 5. Microinyección

Es una de las técnicas más precisas para introducir DNA foráneo dentro de
compartimentos específicos de las células, por medio del uso de micro agujas
de vidrio para depositar el DNA foráneo en el interior de células vegetales.
Esta técnica ofrece la ventaja de que es uno de los dos métodos (junto con la
transformación mediada por láser) que permite la transferencia génica a una
célula concreta. La célula continuará su desarrollo y el transgén expresado lo
hará también en su descendencia. Pero el principal problema en plantas es la
pared celular, que hace a la técnica más dificultosa que en animales, ya que esta
hace necesario el uso de capilares mucho más gruesos para llevar a cabo la
microinyección, también dificulta mucho la visualización del núcleo provocando
que la microinyección suceda muchas veces en el citoplasma. Otro problema es
la presencia de grandes vacuolas en células vegetales, ya que si el DNA es
transportado a su interior, este será degradado antes de alcanzar el núcleo.

Pero entre sus ventajas tenemos:

a) Se puede optimizar la cantidad de DNA descargado.
b) Se puede escoger la célula a transformar.
c) La descarga del DNA foráneo es precisa y predecible.
d) El proceso se realiza bajo control visual.
e) Y se emplean cantidades micro.

6. Transformación mediada por láser

Se lleva a cabo mediante la utilización de un microláser enfocado en el sistema
de iluminación del microscopio, permitiendo abrir orificios o poros transitorios en
la pared celular y membrana plasmática de células vegetales, facilitando así la
entrada del DNA foráneo hacia el interior de la célula. Esta técnica resulta muy
útil para manipular componentes celulares y orgánulos, porque el rayo puede ser
dirigido directamente a esa área seleccionada, haciendo de esta técnica una
valiosa herramienta.
Su principal ventaja es la alta precisión del método, ya que el Láser es dirigido
con un microscopio se pueden ver y elegir exactamente las células que van a
ser tratadas. Y puede ser llevada a cabo en un gran número de células, aunque
la subsiguiente trasferencia de ADN esté mucho menos controlada. Su limitación
principal es el alto costo del equipo necesario para llevarla a cabo y la gran
habilidad necesaria para manejar el láser.
II. METODOS INDIRECTOS:
Son métodos basados en la utilizar de vectores biológicos (como plásmidos)
empleando sus característica naturales de patogenicidad para con las Plantas,
para la introducción de transgenes al genoma vegetal. Entre los Vectores más
utilizados y estables están el uso de las bacterias Agrobacterium tumefaciens y
Agrobacterium rhizogenes, el de los virus (de DNA o RNA) y el de los
Transposones.

1) Transformación con el Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.

Este se usa debido a su alta capacidad y eficiencia de infectar diversas plantas,

esta transformación mediada por Agrobacterium fue el primer sistema de
transferencia de genes en producir plantas modificadas genéticamente en
1983. Esta bacteria es Gram negativa, induce formación de tumores en la unión
del tallo con la raíz, principalmente en dicotiledóneas pero también en muy
pocas Monocotiledóneas y algunas gimnospermas. Esta bacteria infecta
dicotiledóneas como parte natural de su ciclo vital insertando genes foráneos
en ellas consiguiendo así que se expresen en forma de proteínas.
La infección por Agrobacterium en una planta es el resultado de un proceso de
evolución altamente especializado que ha tomado millones de años en su
perfeccionamiento, es por eso que su grado de eficiencia es muy alto y tiene un
bajo índice de error.
Algunas de las desventajas de este son:

a) El tejido a infectar debe presentar daño físico.

b) Los vectores están diseñado solo para infectar el núcleo.
c) Se requiere la eliminación de la bacteria de tejidos infectados usando
antibióticos.
d) El rango de hospederos está limitado a que estos sean susceptibles a la
infección.
2) Transformación con el Plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes
Esta bacteria pertenece también a la familia de plásmidos de Agrobacterium,
funciona de forma diferente provocando una proliferación de las raíces
denominada “Raíz en Cabellera” en la plantas infectadas por A. rhizogenes y se
llaman plásmidos Ri . Estas raíces infectadas, como el tejido de la agalla, crecen
rápidamente en un cultivo libre de bacterias. Al igual que los plásmidos Ti, los
Plásmidos Ri dan origen a células vegetales transformadas que pueden
regenerar plantas fértiles intactas y sanas.
Los procedimientos para usar este plásmido son similares a los de A.
tumefaciens por lo que sus ventajas y desventajas son relativamente similares,
en general esta técnica es muy eficiente.

3) Vectores virales
Esta técnica implica usar Virus que solo afectan a Plantas, se llaman Fitovirus y
depende si su genoma es basado en DNA o RNA. Son usados principalmente
para producir proteínas de interés debido a la expresión transitoria de genes
foráneos, mediante la replicación de los virus en las plantas. La técnica
consiste en modificar a los Virus para que sean capaces de transportar el
transgen de interés al interior de la célula vegetal.

Existen dos grupos de virus vegetales, los virus DNA y los que tienen RNA. Los
virus de RNA tienen su ciclo celular en el citoplasma mientras que los de DNA
deben tener su replicación en el núcleo. De esta manera, los virus de DNA
presentan mecanismos de regulación similares a los de la planta huésped,
mientras que los virus de RNA tienen mecanismos de regulación diferentes.
Los virus DNA constituyen aproximadamente el 2% de los virus vegetales que
se conocen y se dividen Caulimovirus y en Geminivirus. La mayoría de las
técnicas para vectores virales usan Virus de DNA ya que es más fácil trabajar
con ellos.
Estas son las principales ventajas que ofrecen:
a) Facilidad en la infección.
b) Rango de hospedadores más amplio.
c) Producción de altos niveles de proteína.
d) Los genes transmitidos no se limitan a una célula.
e) Mayor velocidad en la expresión.

Y entre sus desventajas podemos mencionar las siguientes:

a) El tamaño del gen de interés debe ser pequeño.

b) Pueden provocar síntomas específicos de enfermedad o ser letales.
c) Alta frecuencia de errores durante la síntesis de ARN.
d) El transgen no se integra en el genoma vegetal.
e) El transgen no se transfiere necesariamente a la descendencia.
4) Vectores Transposones.

Los Transposones (llamados también Genes Saltarines) son fragmentos de DNA

que realizan saltos de una zona del DNA a otra. Este descubrimiento condujo a
la posibilidad del uso de los Transposones como vectores de transferencia
génica. El caso más famoso es del Maíz, ya que los Transposones son los que
generan la variabilidad de colores en los granos cuando se presentan en un
mismo maíz.
Esta técnica se utiliza para clonar varios genes de plantas usando Transposones.
Se usa un gen mutado que porta un inserto transposón, este se aísla primero
usando un transposón previamente clonado como sonda para encontrar el DNA
flanqueante. Este DNA flanqueante se usa posteriormente como sonda para
aislar el gen desde la línea salvaje (Wild Type). Mas sin embargo, dicha técnica
usando Transposones como vectores no está del todo definida y su metodología
no está estandarizada todavía. Además presenta un amplio rango de variabilidad
en los resultados.
Para concluir, podemos mencionar que en general, las técnicas más usadas son
la del Agrobacterium y la de Biobalística, y debido a su alta eficiencia y
estabilidad se usan tanto para Investigación experimental como para
aplicaciones comerciales e industriales. La eficiencia de estas técnicas está
limitada a los métodos de cultivo de tejido que se empleen y a los modernos
avances que en esta área se tenga sobre el genotipo a transformar.