UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

QUÍMICA ANALÍTICA
INSTRUMENTAL
“CURVA DE RINGBOWN. DETERMINACIÓN DE LA
ZONA DE TRABAJO. DETERMINACIÓN DE LA
CONCENTRACIÓN ÓPTIMA”

PROFESORA:
Mg. Norma Carlos Casas
INTEGRANTES:
1
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10

LIMA-PERÚ
2010
OBJETIVOS

Aprender a graficar la curva de Ringbom.

Conocer la concentración óptima de un compuesto para que cumpla con la

Ley de Lambert – Beer a través de la curva de Ringbom.

Conocer las limitaciones de la ley de Lambert – Beer.

 INTRODUCCIÓN
En la primera práctica aprendimos la constitución, el manejo y el cuidado del
espectrofotómetro UV-vis y la importancia que tenía dicho instrumento para el
reconocimiento de una sustancia.

Para reconocer una sustancia hallamos su curva espectral la cual después era comparada
con la curva espectral de una sustancia patrón, otra manera es que debe de cumplir con
la Ley de Lambert – Beer pero debemos de saber que esta ley tiene sus limitaciones y que
una de las limitaciones tiene que ver con la concentración del analito.

En esta práctica se aprenderá a hallar la concentración óptima para una mejor lectura en
el espectrofotómetro UV-vis y para que el analito cumpla con la Ley de Lambert - Beer,
esto lo lograremos con el uso de la Curva de Ringbom.

La curva de Ringbom relaciona la absortancia con la concentración del analito.

Mediremos la absorbancia de diferentes concentraciones de un analito, hallaremos el
porcentaje de transmitancia y con esto la absortancia, luego la relacionaremos sus
concentraciones y de acuerdo a la curva reconoceremos la concentración óptima en la
cual se cumpla con la Ley de Lambert – Beer.
 FUNDAMENTO TEÓRICO

LEY DE LAMBERT Y BEER

Ocurre cuando en el caso de la radiación monocrómatica, la absorbancia es directamente

proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de un medio y la concentración c de
la especie absorbente. Ésta relación se representa con la siguiente fórmula:

A= abc
a : constante de proporcionalidad llamada absortividad
b : longitud (cm)
c : concentración (g/L)

Cuando la concentración de la ecuación se expresa en moles por litro y el largo de la

celda está en centímetros, la absortividad se llama absortividad molar, y se representa
con el símbolo especial Ɛ. Por tanto, cuando b está en centímetros y c en moles por litro
se tiene:

A = Ɛbc

Se han encontrado pocas excepciones a la generalización de que la absorbancia está

relacionada en forma lineal con la longitud de la trayectoria. Por otra parte, se ha
encontrado desviaciones frecuentes de la proporcionalidad directa entre la absorbancia
medida y la concentración cuando b es constante. Para que no ocurran errores durante
nuestro análisis y hacerlo demanera adecuada hacemos uso de la curva de ringbown.

GRÁFICA DE RINGBOW

Cuando se realiza un análisis espectroscópico se debe trabajar, en lo posible, se debe

trabajar, en lo posible, con concentraciones que permitan que se cumpla la ley de Beer,
con el fin de obtener una curva de calibración que tenga una relación lineal.

Para obtener el intervalo óptimo de concentraciones primero se construye la curva de

Ringbom, que consiste en construir una gráfica de absorbancia (100- %T) vs. lg
Concentración. Los datos se obtienen preparando una serie de soluciones patrón del
analito, que cubran una variación de por lo menos dos órdenes de magnitud de
concentración de este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de
onda analítica escogida. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbown
corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el
intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal
entre absorbancia y concentración. En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la
intermedia), con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor
para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente.
A partir de esta gráfica podemos obtener otros datos como:

Límite de detección mínimo: Es la cantidad o concentración mínima de sustancia que

puede ser detectada con fiabilidad por un método analítico determinado. Intuitivamente
sería la concentración mínima obtenida a partir de la medida de una muestra (que
contiene el analito) que seríamos capaces de discriminar de la concentración obtenida a
partir de la medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito presente.

Sería la cantidad o concentración más pequeña del analito que produce una señal XL
significativamente diferente de la señal del ruido de fondo Xb.

El criterio utilizado para que la concentración mínima detectable sea distinguible con
certeza del ruido de fondo es que la diferencia entre la señal del analito, de
concentración muy baja, y la señal de los blancos sea igual a tres veces la desviación
estándar de la señal de los blancos, utilizados para medir el ruido de fondo. Es decir que:

En donde XL es la señal límite, obtenida para la concentración mínima detectable de

analito, Xb es la señal promedio de los blancos, y sb es la desviación estándar de las
lecturas del blanco.

Límite de detección máximo:

Vendría a ser la máxima concentración de un analito que se puede analizar. Esto se debe
a que las soluciones se hacen tan concentradas, que en el caso de los métodos
espectrofotométricos, toda la luz es atrapada por el analito y tenemos una situación
equivalente al ajuste del 0 % de transmitancia. En este caso, el detector no diferencia dos
soluciones de concentraciones altas.La determinación queda limitada a concentraciones
menores del valor de límite de detección máximo, pero en este caso, a diferencia del
límite de detección mínimo, el problema se soluciona fácilmente mediante una dilución
adecuada. En el caso del límite de detección mínimo, las soluciones deben concentrar la
muestra o usar otra técnica con límite de detección menor.

El límite de detección máximo, se puede obtener de la parte superior de la curva de

Ringbown.

TRANSICIONES ELECTRÓNICAS EN MOLÉCULAS ORGÁNICAS

Clasificación:

Las bandas de absorción en las regiones Ultravioleta y Visible que presentan los
compuestos orgánicos se asocian con transiciones electrónicas en la capa de valencia. Los
electrones involucrados en dichas transiciones corresponden a aquellos mas débilmente
atraídos por el conjunto de núcleos atómicos que componen la molécula y cuyos estados
pueden ser descritos a través de orbitales moleculares que se expresan como
combinaciones lineales de orbitales atómicos de la capa de valencia. Las transiciones
electrónicas a orbitales moleculares más externos dan lugar a las denominadas
transiciones Rydberg presentes en el Ultravioleta de Vacío. Por otra parte las transiciones
electrónicas que involucran a los electrones de las capas internas son muy energéticas y
se presentan en la región de los rayos X del espectro electromagnético. Nuestro análisis
se reducirá a las transiciones electrónicas en la capa de valencia. A estos efectos resulta
conveniente recordar la clasificación convencional de los orbitales moleculares en la capa
de valencia de los compuestos orgánicos.

Orbitales σ y σ*. Son orbitales moleculares localizados a lo largo del eje de unión de los
átomos. Los orbitales σ generan una densidad electrónica elevada en la región
internuclear teniendo un carácter fuertemente enlazante.

Los orbitales σ*, como todos los orbitales antienlazantes, presentan un plano nodal
perpendicular al eje del enlace en la región internuclear y tienen un acentuado carácter
antienlazante.

Orbitales π y π*. Estos orbitales se emplean en la descripción de los enlaces múltiples. Las
regiones de mayor densidad electrónica correspondiente a los mismos son aquellas
colaterales al eje del enlace. El carácter enlazante o antienlazante de estos orbitales es
menos acentuado que el de los orbitales σ.

Orbitales n. Estos orbitales moleculares tienen un acentuado carácter local y describen

pares electrónicos libres asociados con heteroátomos (O, S, N, Hal). Energéticamente
tienen carácter no-enlazante.
Figura.1 se representan esquemáticamente la distribución energética de los orbitales
moleculares antes tratados.

Las principales transiciones electrónicas que se consideran para muchas especies

moleculares son:    , n   *,   *, n   *.
A continuación se presentan algunas de las transiciones más importantes en moléculas
orgánicas:
a. La transición    es la que requiere mayor energía para que se lleve a cabo,
este tipo de transiciones generalmente ocurre en el ultravioleta al vacío en
longitudes de onda menores que 150 nm. Entre los enlaces típicos que presentan
esta transición se encuentran C-H con absorción cercana a 125 nm y el enlace C-C
con absorción cercana a 135 nm. Así, compuestos orgánicos como los
hidrocarburos saturados y cadenas saturadas - enlaces sigma- presentarán
absorción solamente en el ultravioleta lejano y por tanto son transparentes en el
UV cercano.

b. La transición n   generalmente requiere menos energía que la transición s ® s

* Estas transiciones generalmente se presentan entre 150 y 220 nm. Muchas de
estas transiciones se observan en moléculas orgánicas que contienen un
heteroátomo: N,O,S,Cl,Br,I, como haluros de alquilo, aminas, éteres, tioles, etc.
Por ejemplo el CH3OH presenta una banda n * en 180 nm con e = 315 M-1cm-
1. Se considera para este tipo de transición que un electrón que se encuentra en
el orbital p del heteroátomo - u orbital n de la molécula – es excitado al orbital s
de la molécula.

c. Las transiciones    implican que el cromofóro debe poseer al menos una

insaturación para proveer el orbital molecular pi antienlazante  *, moléculas con
dobles o triples enlaces frecuentemente presentan absorción entre 160 y 220 nm
para cromóforos aislados es decir separados por más de un enlace sencillo. En el
 caso de moléculas con grupos cromofóros que entren en conjugación como
dienos, enonas, o con anillos aromáticos la absorción se encuentra generalmente
entre 200 y 360 nm, en el UV cercano y puede presentarse en el visible 360-700 si
el sistema conjugado es grande.Las transiciones    * presentan coeficientes de
absortividad e altos que oscilan entre 1000 y 15000 M-1cm-1

Las bandas atribuidas a las transiciones    * de sistemas conjugados como el

butadieno polienos, enonas, el benceno o moléculas aromáticas que poseen
sustituyentes que a su vez son cromóforos (como el estireno, benzaldehido, o
acetofenona) se denominan bandas K (del alemán konjugierte).

Estas transiciones p ® p *, bandas K, se caracterizan por absortividades molares

altas e máx >104 y sufren desplazamiento batocromico cuando hay aumento en la
polaridad del solvente.

d. Las transiciones n   implican que el cromofóro debe poseer una insaturación

(para proveer el orbital molecular  *) con un heteroátomo que contenga un par
de electrones no compartido, electrones n, por ejemplo cromóforos como C = O, N
= N, NO, NO2, entre otros, presentan absorción entre 200 y 350nm para
cromóforos aislados. Se considera que uno de los electrones del orbital molecular
no enlazante, n, ( o que uno de los electrones de un orbital átomico no enlazante
del heteroátomo ) es excitado al orbital antienlazante * asociado con el doble o
triple enlace.

Las transiciones n   *presentan coeficientes de absortividad e bajos, que oscilan entre

10 y 102 M-1cm-1, son prohibidas y estos valores permiten distinguirlas de las transiciones 
  *.

Las transiciones n   *también son llamadas bandas R (del alemán radikalartig). Se

caracterizan además de sus bajos coeficientes de absortividad por el efecto hipsocrómico
que se observa con el incremento en la polaridad del solvente.

CÁLCULO DE ERRORES: ERROR ABSOLUTO, ERROR RELATIVO

Bien sea una medida directa (la que da el aparato) o indirecta (utilizando una fórmula)
existe un tratamiento de los errores de medida. Podemos distinguir dos tipos de errores
que se utilizan en los cálculos:

Error absoluto. Es la diferencia entre el valor de la medida y el valor tomado como

exacta. Puede ser positivo o negativo, según si la medida es superior al valor real o
inferior (la resta sale positiva o negativa). Tiene unidades, las mismas que las de la
medida.

Error relativo. Es el cociente (la división) entre el error absoluto y el valor exacto. Si se
multiplica por 100 se obtiene el tanto por ciento (%) de error. Al igual que el error
absoluto puede ser positivo o negativo (según lo sea el error absoluto) porque puede ser
por exceso o por defecto. No tiene unidades.
Parte Experimental

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Equipo:
- UV-2100 Spectrophotometer
Materiales:
- Matraz Aforado (100, 50, 25 y 10ml)
- Pipeta volumétrica (15,10,5,2,1)
- Matraz simple (250, 100ml)
- Tubos de ensayo
- Vaso precipitado (250, 100 ml)
Reactivos:
- Aseptil Rojo (Azosulfamida 5%)
- Permanganato de potasio
- Anaranjado de metilo
- Agua destilada
Espectrofotometría: Absorbancia y %T entre una sustancia
inorgánica y una orgánica

Tomaremos a continuación los datos leídos en el espectrofotómetro. Lo que buscamos es

determinar la longitud óptima analítica y comparar la naturaleza de dos sustancias
diferentes: Una es orgánica (heliantina) y la otra, inorgánica (permanganato de potasio).

Las curvas espectrales -Absorbancia vs Longitud de onda y %T vs Longitud de onda- serán

graficadas al final del presente informe.

𝑷𝒆𝒓𝒎𝒂𝒏𝒈𝒂𝒏𝒂𝒕𝒐 𝒅𝒆 𝒑𝒐𝒕𝒂𝒔𝒊𝒐 (𝑲𝑴𝒏𝑶𝟒 ) 𝑨𝒏𝒂𝒓𝒂𝒏𝒋𝒂𝒅𝒐 𝒅𝒆 𝒎𝒆𝒕𝒊𝒍𝒐 (𝑯𝒆𝒍𝒊𝒂𝒏𝒕𝒊𝒏𝒂)

𝝀 (𝒏𝒎) %𝑻 𝑨 𝝀 (𝒏𝒎) %𝑻 𝑨
400 83.9 0.0762
400 42.1 0.3757
410 85.2 0.0695
420 85.5 0.0680 410 37.9 0.4213
430 85.7 0.0670 420 34.8 0.4584
440 85.4 0.0685
430 32.2 0.4921
450 84.9 0.0660
460 83.7 0.0773 440 30.2 0.5199
470 81.7 0.0873 450 28.3 0.5482
480 78.7 0.1040
460 27.9 0.5543
490 75.1 0.1243
500 70.4 0.1524 470 29.3 0.5331
510 68.2 0.1662 480 32.7 0.4854
520 64.1 0.1931
490 38.7 0.4122
530 65.1 0.1864
540 65.9 0.1837 500 47.6 0.3223
550 67.7 0.1694 510 58.2 0.2350
560 75.6 0.1214
520 80.2 0.0958
570 77.4 0.1112
580 85.7 0.0670 530 87.7 0.0570
590 90.2 0.0447 540 87.7 0.0570
600 91.5 0.0385
550 92.4 0.0343
610 92.1 0.0357
620 92.6 0.0333 560 93.3 0.0301
630 92.9 0.0319
640 93.4 0.0296
 Procedimiento
Lectura del espectrofotómetro: Longitud óptima de la onda y %
Transmitancia

Longitud Óptima de
Azosulfamida:
530 nm
Longitud óptima de
Realizamos dos tipos de análisis: Anaranjado de metilo: 460
1. Determinación de la longitud óptima nm
de onda para poder graficar las curvas Longitud óptima de
espectrales –Absorbancia vs Longitud Permanganato:
de onda– respectivas del 520 nm
permanganato y la heliantina
(Inorgánica vs Orgánica)
2. Determinación de la concentración Lectura del espectrofotómetro: % Transmitancia
óptima de la muestra (verificar del
mismo modo la zona de trabajo).
Permite graficar la curva de
Ringbown.

1°Para poder comparar la forma de las curvas espectrales entre

dos sustancias de naturaleza distinta: Inorgánica vs Orgánica. El
procedimiento a seguir fue el desarrollado en la primera práctica:
La sustancia es colocada, junto a un patrón –Agua–; en el
espectrofotómetro medimos la transmitancia conforme
aumentamos la longitud de onda. El punto en el cual la
transmitancia sea la más baja posible será nuestra absorbancia
más alta, es decir: La longitud óptima de la onda nos otorga la
absorbancia más alta posible de la sustancia problema.
2° Si deseamos graficar la curva de Ringbown (la que nos permite
formar nuestra curva de calibración) primero debemos realizar las
disolución. Prepararemos soluciones de una concentración (C)
desde 0.1 ug/ml, 0.2 ug/ml, 1 ug/ml, 2 ug/ml, 5 ug/ml, 10 ug/ml,
15 ug/ml, 20 ug/ml, 30 ug/ml, 200 ug/ml hasta 500 ug/ml a partir
de la solución estándar de aseptil rojo (Azosulfamida 5%).
Con las diluciones ya hechas, procedemos a realizar las lecturas
en el espectrofotómetro. Las lecturas serán del % Transmitancia,
 nuestra labor consiste en determinar la absortancia:
𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 = 𝟏𝟎𝟎 − %𝑻. Para luego graficar nuestra curva
Absortancia vs Log (C).

Preparamos cada concentración a partir de la

muestra estándar de aseptil rojo. La forma en
cómo se procedió con las diluciones está
explicada en el presente informe.

Una vez que ya tenemos nuestras diluciones preparadas, podemos comenzar con las lecturas de la transmitancia.
La longitud de onda a utilizar será: La longitud óptima de cada sustancia, 530nm para la azosulfamida y 460nm
para la heliantina. Iremos añadiendo en las cubetas del espectrofotómetro cada dilución unitariamente. El análisis
de la transmitancia será llevado a cabo en la longitud óptima. Nuestros datos serán acoplados en las posteriores
tablas.

A partir de la transmitancia leída estaremos en la facultad de poder graficar la Curva de Ringbown (Absortancia vs
Log [C]).
 Curva de Ringbown: Absortancia vs Concentración ~
Azosulfamida y Heliantina

En esta parte desarrollaremos la curva de Ringbown, la cual nos permite encontrar la

zona de trabajo y lo más importante: La concentración óptima de la muestra.

*Cabe resaltar que nuestro grupo trabajó con las diluciones de la azosulfamida

𝑨𝒛𝒐𝒔𝒖𝒍𝒇𝒂𝒎𝒊𝒅𝒂
[𝜇𝑔⁄𝑚𝑙] %𝑇 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
0.1 98.6 1.4
0.2 97.8 2.2 𝐴𝑛𝑎𝑟𝑎𝑛𝑗𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑡𝑖𝑙𝑜
0.4 96.7 3.3 [𝜇𝑔⁄𝑚𝑙] %𝑇 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
0.6 96.0 4.0
0.8 94.4 5.6 0.2 74.4 25.6
1.0 93.0 7.0 0.3 95.7 4.3
1.5 84.7 15.3
0.6 69.7 30.3
2.0 85.1 14.9
2.5 84.2 15.8 0.8 69.7 30.3
3.0 78.8 21.2 1.5 90.8 9.2
3.5 75.1 24.6
4.0 75.6 24.4 3.0 35.4 64.6
5.0 71.9 28.1 3.5 30.7 60.3
6.0 66.1 33.9
4 12.2 87.8
8.0 57.7 42.3
10.0 50.7 49.3 5 5.5 94.5
15 38.7 61.3 6 3.1 96.9
20 27.5 72.5
30 11.5 88.5 10 0.0 100
40 6.4 93.6 15 0 100
60 0.1 99.9
20 0 100
80 0.0 100
100 0.0 100
200 0.0 100
 Azosulfamida: Sustancia estudiada
1. Tabla completa: Absortancia, Log C y % Transmitancia.

Azosulfamida

µg/mL mg/mL log C %T Absortancia

0.1 100 2 98.6 1.4
0.2 200 2.30103 97.8 2.2
0.1 100 2 96.7 3.3
0.6 600 2.7781513 96 4
0.8 800 2.90309 94.4 5.6
1 1000 3 93 7
1.5 1500 3.1760913 88.3 11.7
2 2000 3.30103 85.1 14.9
2.5 2500 3.39794 84.2 15.8
3.5 3500 3.544068 75.5 24.5
4 4000 3.60206 75.6 24.4
5 5000 3.69897 71.9 28.1
6 6000 3.7781513 66.1 33.9
8 8000 3.90309 57.7 42.3
10 10000 4 50.7 49.3
15 15000 4.1760913 38.7 61.3
20 20000 4.30103 27.5 72.5
30 30000 4.4771213 11.5 88.5
40 40000 4.60206 6.4 93.6
60 60000 4.7781513 0.001 99.999
DISCUSIÓN DE RESULTADOS

CURVA DE RINGBOWN: AZOSULFAMIDA

120

100

80
Absortancia

60
Series1
40

20

0
0 1 2 3 4 5 6
log C

Para obtener el intervalo óptimo y adecuado de concentraciones con el menor error por
lectura primero se construye la curva de Ringbown que consiste en construir una gráfica
de absortancia (100%-T) vs la concentración.

La zona lineal corresponde al intervalo de concentraciones de mínimo error, C/C, por

lectura y el punto de inflexión corresponde al valor de:

100%-%T= 49.3; T=50.7; que corresponde al valor de mínimo error.

Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma
de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones
óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y
concentración.

En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la
parte alta, pueden servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y
máximo, respectivamente.

En la curva de Ringboom para la azosulfamida resulto como concentración optima el

valor de 6.4565 µg/mL así como la concentración mínima cuantificada a 3.715 µg/mL y la
concentración máxima cuantificada a 11.2 µg/mL.
CURVA DE RINGBOWN: ANARANJADO DE METILO

La curva de Ringbom del Anaranjado de Metilo presenta una zona de trabajo de concentraciones
1 a 5 ug/ml con las absortancias respectivas de 26.8 y 94.5 respectivamente. Además la
concentración óptima es de 2.2 ug/ml. No pudiendo comparar estos datos debido a que no
encontramos información bibliográfica sobre el tema.
BIBLIOGRAFIA

 Skoog Douglas, Principios de análisis instrumental. 6ta edición. 2007

 Química analítica instrumental I Precisión en espectrofotometría. 2007. URL:

http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/Documento_de_Apoyo:_Precisi
on_en_espectrofotometria_2598.pdf

 Universidad Nacional de Colombia. Establecimiento de un método

espectrofotométrico.URL:http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/200
1184/lecciones/Cap10/01_01_01.htm