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COPROLOGIE PARASITAIRE

Diagnostic
des microsporidioses intestinales
Isabelle Accoceberrya,*, Mahussi d’Almeida-Fourqueta

RÉSUMÉ SUMMARY
Les microsporidies sont des parasites intracellulaires obligatoires, récem-
Diagnosis of intestinal microsporidia
ment reclassées parmi les champignons. C’est avec la pandémie de sida
Microsporidia are spore forming obligate intracellu-
qu’ont émergé les cas de microsporidioses humaines causés par des
lar parasites, recently reclassified from protozoa to
espèces jusqu’alors inconnues. Enterocytozoon bieneusi et Encephalitozoon
fungi. Human microsporidiosis have emerged with
intestinalis, responsables des microsporidioses intestinales, sont de loin
the HIV/AIDS pandemic. Enterocytozoon bieneusi
les plus prévalentes. Actuellement, elles sont identifiées de plus en plus
and Encephalitozoon intestinalis, which causes gas-
fréquemment chez des patients présentant d’autres formes d’immuno-
trointestinal diseases, are the most prevalent agents.
suppression, essentiellement les transplantés d’organes solides mais
Currently, they are increasingly diagnosed in othe-
également les enfants, les voyageurs et les personnes âgées. Le principal
rwise immunocompromised patients, including organ
symptôme clinique est la diarrhée, chronique chez l’immunodéprimé ou
transplant recipients, but also in children, travelers
le plus souvent spontanément résolutive chez l’immunocompétent. Pour
and the ederly. Chronic or self-limiting diarrhoea is
le diagnostic de routine, la détection directe des spores (1-3 μm) des
the most common symptoms in immunodeficient or
parasites dans les selles, après coloration trichromique de Weber modi-
immunocompetent individuals. Direct examination
fiée et/ou par les fluorochromes (Uvitex 2B, Calcofluor White 2MR), est
of the stools stained by chemofluorescent agents
sensible et surtout non invasive. L’identification de l’espèce en cause est
stains (UVITEX 2B, calcofluor white M2R) and/or
indispensable pour orienter le traitement. Elle peut être réalisée par PCR
Weber’s modified trichrome stain is a sensitive, no-
ciblant notamment le gène codant pour la petite sous-unité ribosomale de
ninvasive test which can be successfully implemented
l’ARN (ARNr 16S) ou immunomarquage à l’aide d’anticorps monoclonaux
in a clinical laboratory. Species identification, which
dirigés contre la paroi des spores. Les dernières techniques de PCR déve-
is absolutely necessary to start the relevant treat-
loppées, quantitatives pour évaluer la charge parasitaire et la réponse au
ment, can be achieved by PCR targeting the small
traitement, multiplex pour la détection simultanée des 2 espèces, sont des
subunit rRNA or indirect immunofluorescence using
outils très performants. L’albendazole est le traitement de choix pour E.
monoclonal antibodies directed against spore wall.
intestinalis, alors que seule la fumagilline permet d’éradiquer E. bieneusi.
The newly described PCR methods, quantitative for
assessing spore shedding intensity and treatment
Microsporidies intestinales – immunodépression – diagnostic –
efficiency, multiplex for the simultaneous detection
selles – spores (1-3 μm) – microscopie optique – PCR – anticorps monoclonaux.
of the 2 species, are very powerful tools. Infections
caused by E. intestinalis were treated with albenda-
zole, while only fumagillin has been shown effective
for eradicating E. bieneusi.
1. Rappels
Intestinal microsporidiosis – immunodepression –
(définition et généralités) diagnosis – stools – spores (1-3 μm) – light microscopy
– PCR – monoclonal antibodies.
Les microsporidies sont des eucaryotes unicellulaires,
très répandus dans le monde animal (protozoaires, inver-
tébrés et vertébrés). Ce sont des parasites intracellulaires dont 14 infectent l’homme. Le nom de microsporidies
obligatoires. Le Phylum des Microspora (Sprague, 1969) (Microsporidium) a été proposé par Balbiani (professeur
comprend environ 150 genres et près de 1 300 espèces au Collège de France) en 1882, en raison des très petites
dimensions de leurs spores (quelques μm) qui assurent la
dissémination. Il est actuellement admis que les microspo-
a Laboratoire de parasitologie-mycologie ridies s’apparentent aux champignons avec lesquels elles
Centre hospitalier universitaire de Bordeaux – Hôpital Saint-André partagent diverses particularités (modalités de la division
1, rue Jean-Burguet nucléaire, stades diplocaryotiques, paroi des spores riche
33075 Bordeaux cedex en chitine, homologie des séquences de gènes codant pour
certaines protéines) [1]. Jusqu’en 1985, seuls quelques cas
* Correspondance isolés de microsporidioses ont été rapportés chez l’homme.
isabelle.accoceberry@chu-bordeaux.fr
C’est avec la pandémie de sida qu’ont émergé les cas
article reçu le 30 octobre, accepté le 28 novembre 2011 de microsporidioses humaines causés par des espèces
© 2012 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés. jusqu’alors inconnues dont Enterocytozoon bieneusi

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décrite par Desportes et al. en 1985 [2] et Encephalitozoon Des cas d’infections à E. bieneusi et E. intestinalis sont
(Septata) intestinalis par Cali et al. en 1993 |3], agents des également rapportés chez des patients immunocom-
microsporidioses intestinales de loin les plus prévalentes. pétents, voyageant ou séjournant en zone tropicale ou
Très rapidement, l’association microsporidiose intestinale, subtropicale (Caraïbes, Afrique, Asie, Moyen-Orient) et
diarrhée chronique, malabsorption et perte de poids sévère plus exceptionnellement chez des patients sédentaires
a été clairement établie chez les patients infectés par le |5, 6]. Chez l’immunocompétent, la symptomatologie
virus de l’immunodéficience humaine (VIH) avec un taux de se limite le plus souvent à une diarrhée spontanément
lymphocytes CD4 inférieur à 100 cellules par mm3. Ainsi, résolutive.
selon les études réalisées entre 1989 et 1998, la préva- La pathogénie d’E. bieneusi et d’E. intestinalis est proba-
lence d’E. bieneusi pouvait atteindre 30 à 50 % chez ces blement sous-estimée chez les patients non infectés par
patients. Encephalitozoon intestinalis venait au second rang le VIH, immunodéprimés ou non, du fait que ce diagnostic
dans l’étiologie, impliquée dans environ 10 % des cas [4]. est rarement évoqué par les cliniciens chez ces patients.
Dans les pays où les polythérapies anti-rétrovirales sont Une seule étude publiée en 2003 a révélé la présence dans
disponibles, la prévalence des microsporidioses a consi- les selles de patients portugais souffrant de diarrhées, 22
dérablement diminué, de même que celles des autres infectés par le VIH et 3 non infectés par le VIH, de spores
parasitoses intestinales opportunistes (cryptosporidiose, d’une troisième espèce [7]. L’analyse génomique a mon-
cyclosporose, isosporose). Actuellement, les microspo- tré qu’elle était très proche de Vittaforma corneae (96 %
ridies sont surtout détectées dans la population infectée d’homologie) responsable de kératites et d’infection
par le VIH en Inde, en Thaïlande, en Turquie, en Afrique, disséminée.
au Brésil et au Pérou |5, 6]. Plusieurs modes de contamination sont possibles : contami-
Les microsporidioses intestinales sont diagnostiquées de nation féco-orale, contamination par ingestion ou inhalation
plus en plus fréquemment chez les patients présentant de spores, contamination par les aérosols [8]. La transmis-
d’autres formes d’immunosuppression, essentiellement sion directe de personne à personne a été évoquée dans
les transplantés d’organes solides (foie, cœur-poumons, plusieurs études. Par ailleurs, le portage asymptomatique
reins), notamment après le renforcement du traitement est possible quel que soit le statut immunitaire de l’hôte.
immunosuppresseur pour éviter un rejet. La malnutri- Une étude sérologique indique des taux relativement impor-
tion et le vieillissement constitueraient également des tants de prévalence d’anticorps anti-E. intestinalis chez
facteurs de risque selon des enquêtes réalisées dans des donneurs de sang néerlandais (8 %) et des femmes
une maison de retraite et des orphelinats en Espagne. enceintes françaises (5 %) [9].
La détection d’ADN d’E. bieneusi et d’E. intestinalis dans
des eaux de surface, des eaux d’égouts ou des eaux uti-
lisées pour la consommation humaine suggère également
Figure 1 – Organisation typique
la possibilité de contamination à partir de sources envi-
d’une spore de microsporidie.
ronnementales [8]. Les deux espèces ont été identifiées
dans les échantillons de selles d’animaux d’élevage et
de compagnie. Enterocytozoon bieneusi est également
présente chez des mammifères sauvages ainsi que chez
des oiseaux (poulets d’élevage industriel et pigeons en
zone urbaine). La mise en évidence par analyse phylogé-
nétique de génotypes identiques chez l’homme et certaines
espèces animales atteste également d’une transmission
zoonotique [10].

2. Agents pathogènes
Le cycle évolutif des microsporidies se déroule en deux
phases, une phase proliférative (mérogonie) suivie d’une
phase de sporulation (sporogonie) qui se succèdent à
l’intérieur de la cellule hôte. Les stades de développe-
ment générés au cours de la mérogonie sont appelés
des mérontes alors que les sporontes, les sporoblastes
et les spores sont successivement produits au cours de
la sporogonie. Les spores sont excrétées dans le milieu
extérieur avec les selles, les urines et les sécrétions res-
piratoires des patients infectés.
La spore (figure 1) est la forme de développement la plus
caractéristique du cycle évolutif. Sa paroi est constituée
par une double enveloppe composée d’une exospore
protéique et d’une endospore plus épaisse, essentielle-
ment faite de chitine. L’endospore recouvre la membrane

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plasmique délimitant le sporoplasme, élément infectieux Figure 2 – Le tube polaire (flèche) décharge son contenu
formé par le cytoplasme et un ou deux noyaux. La spore dans une invagination de la membrane plasmique (*) de la
possède une structure caractéristique, le filament (ou cellule hôte apparemment formée à son contact (x 30 000).
tube) polaire qui, rigide à la partie antérieure, s’enroule
en un nombre variable de spires occupant les 2/3 posté-
rieurs de la spore. Un système de membranes formant un
empilement de saccules aplatis et désigné par le terme de
polaroplaste, entoure la portion rectiligne (manubrium) du
filament polaire qui s’insère au disque d’ancrage plaqué
sous la paroi à l’extrémité antérieure de la spore. Une
vacuole est visible à la partie postérieure de la spore.
Le processus d’infestation est spécifique des microspori-
dies. L’extrusion du filament polaire, induit par l’augmenta-
tion brutale de la pression intrasporale, entraîne l’expulsion
du sporoplasme infectieux qui est directement inoculé dans
le cytoplasme de la cellule hôte (figure 2) [11].
Les spores matures d’E. bieneusi sont oviformes, mesurant
1,0 à 1,6 μm sur 0,6 à 0,9 mm, avec à l’intérieur le filament
polaire, formant 4 à 5 ou 6 à 7 tours de spires disposés sur
deux rangs, autour d’un noyau unique. Les entérocytes de
l’intestin grêle (duodénum, jéjunum) sont le site privilégié D’après A. Magaud.
de l’infection (figure 3). L’extension aux cellules épithé-
liales nasales, bronchiques et de l’arbre biliaire est parfois
observée. Le développement s’effectue directement dans Figure 3 – Spores (flèches) d’E. bieneusi
le cytoplasme de la cellule hôte et les stades parasitaires dans un entérocyte altéré de la muqueuse jéjunale
se localisent au pôle apical de la cellule, entre la bordure d’un patient infecté par le VIH
en brosse et le noyau. et souffrant de diarrhée chronique.
Les spores d’E. intestinalis plus grandes mesurent 1,5
à 2,0 μm sur 1,0 à 1,2 μm et ne possèdent qu’un seul
noyau. Le filament polaire forme 4 à 7 tours de spires
disposés en une seule rangée. Les étapes du cycle se
déroulent à l’intérieur d’une vacuole parasitophore, pro-
venant vraisemblablement de la membrane de la cellule
hôte. Encephalitozoon intestinalis se développe dans les
entérocytes, comme dans les macrophages, les fibroblastes
et les cellules endothéliales du chorion ce qui explique
la dissémination de l’infection à d’autres organes, le rein
notamment.
Les spores de Vittaforma spp. mesurent entre 1,8 à 3,6 μm
sur 1,0 à 1,4 mm. Tous les stades de développement sont
diplocaryotiques et entourés par le réticulum endoplas-
mique de la cellule hôte.

3. Diagnostic
La localisation intracellulaire des stades de développement,
la taille très réduite (1 à 4 μm) des spores émises dans
les selles et leurs propriétés tinctoriales particulières ren-
dent difficile la détection des microsporidies intestinales.
Ainsi, les premiers diagnostics reposaient uniquement sur Photo I. Desportes-Livage.
l’analyse ultrastructurale et histologique de biopsies de NCH = noyau cellule hôte.

l’intestin grêle. Depuis, un panel de techniques réalisables


en routine ont été développées permettant la recherche loppement du parasite, le mode de division et l’interface
des microsoporidies par microscopie optique, immuno- hôte-parasite.
détection et PCR dans différents échantillons biologiques. Comme pour d’autres infections opportunistes décrites au
cours du sida, telles que la pneumocystose et la cryptos-
3.1. Microscopie électronique poridiose, l’analyse ultrastructurale de toutes les biopsies
L’examen en microscopie électronique des tissus permet le réalisées a révélé l’existence de sites jusqu’alors inconnus
diagnostic et l’identification de l’espèce en cause d’après de l’infection.
la configuration nucléaire, la morphologie des spores et L’examen en microscopie électronique d’échantillons de
du tube polaire, les caractéristiques des phases de déve- selles ou de liquides biologiques est possible mais il ne

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permet d’observer que l’ultrastructure des spores. Sa sen- • Coloration trichromique de Weber
sibilité est faible car seul un faible volume de l’échantillon et techniques dérivées
peut être observé. Cette technique utilise un colorant dérivé du trichrome
Même si la microscopie électronique reste une méthode classique de Wheatley, le chromotrope 2R, à une concen-
de référence, la lourdeur de sa réalisation exclut son uti- tration 10 fois supérieure à celle utilisée habituellement
lisation en routine. pour la coloration des amibes et des flagellés, en raison
de la pénétration plus difficile du colorant à l’intérieur
3.2. Histologie des spores de microsporidies [17]. Les spores appa-
L’examen histologique des biopsies intestinales (duodé- raissent en rose-brillant sur un fond verdâtre très pâle.
num, jéjunum) conserve une place dans le diagnostic, La coloration au niveau de la spore est inhomogène et
notamment lorsque l’examen parasitologique des selles apparaît plus intense à l’intérieur de la spore donnant
est négatif. Il permet surtout l’étude des aspects physio- un aspect de spore barrée ou d’un T à l’intérieur de la
pathologiques et des modifications architecturales de la spore. La vacuole postérieure transparente est nettement
muqueuse intestinale liée à l’infection. discernable. Quelques bactéries fécales, notamment
Les microsporidies ne sont pas facilement identifiables les cocci de taille voisine, et les levures peuvent aussi
avec les colorations classiques comme la coloration au se colorer en rouge, mais leur forme et leur profil de
Gram ou à l’hématoxyline-éosine [12]. Les colorations coloration évitent la confusion.
par le Giemsa, le bleu de toluidine O, le Gram modifié, le Plusieurs équipes ont alors apporté des modifications à
Warthin-Starry ou le trichrome sont plus performantes. Les cette technique de coloration proposée par Weber. La tech-
parasites sont détectés grâce à leur localisation carac- nique publiée par Kokoskin est significativement meilleure
téristique intraentérocytaire en position supranucléaire. que l’originale [18]. Les spores de microsporidies apparais-
Les techniques de fluorescence directe par marquage par
sent plus intensément colorées, sur un fond plus clair, mais
un fluorochrome sont sensibles, rapides et faciles à réali-
surtout le temps de coloration est réduit de 80 minutes.
ser tant sur les appositions que sur les coupes de tissus
En 1995, dans le laboratoire de parasitologie du CHU
inclus en paraffine.
de la Pitié-Salpêtrière, nous avons optimisé la technique
proposée par Koskokin [14]. Les résultats obtenus à partir
3.3. Microscopie optique d’échantillons de selles contenant de nombreuses spores
Les seuls stades de développement extracellulaires sont
de petite taille de type E. bieneusi ou de grande taille de
les spores que l’on peut rechercher dans divers liquides
type E. intestinalis sont présentés figures 4 et 5.
biologiques.

3.3.1. Examen direct des selles


Le moyen de diagnostic le plus aisé est la détection directe Optimisation de la coloration trichromique de Weber
modifiée par Kokoskin
des spores de microsporidies dans les selles car il n’est
pas invasif. Cependant, leurs dimensions très réduites ne Solution préconisée :
permettent pas de les distinguer des bactéries fécales si la - chromotrope 2R 6g
méthode de détection n’est pas appropriée. De nouvelles - fast green 0,6 g
méthodes de coloration ou de marquage par un fluoro- - acide phosphotungstique 1,4 g
chrome ont donc été proposées et validées. Ajouter à la solution 3 ml d’acide acétique glacial, laisser
reposer 30 minutes à l’abri de la lumière et ajouter enfin
progressivement 100 ml d’eau distillée. L’eau peut être
3.3.1.1. Techniques de concentration ajoutée en premier, mais il faut alors déposer la préparation
Certains auteurs constatent que l’examen direct des selles sur agitateur magnétique pendant 15 minutes.
est d’un rendement supérieur à celui des techniques de La solution colorante est chauffée à 50 °C à l’étuve et doit être
concentration qui entraînent une perte importante de maintenue à cette température pendant toute la coloration.
spores, et parfois des résultats faussement négatifs [13]. - Plonger les lames 10 minutes dans le colorant.
D’autres techniques de concentration comme la sédi- - Rincer rapidement à l’eau.
mentation à l’éther ou la centrifugation des échantillons - Différencier 10 s dans l’alcool acétique en agitant
à différentes vitesses semblent améliorer la récupération légèrement.
des spores |14, 15]. - Rincer rapidement à l’éthanol à 95°, le jeter et plonger les
lames 5 minutes dans l’éthanol à 95°.
3.3.1.2. Méthodes de coloration - Laisser sécher les lames et observer à l’objectif x 100 à
• Colorations au Giemsa et au Gram l’immersion.
Le Giemsa est la première utilisée (1990), le cytoplasme Enfin, une technique combinant la coloration par une solu-
des spores apparaît coloré en bleu-gris, et parfois on peut tion de carbofuschine, la décoloration alcoolo-acide et la
voir le noyau violet caractéristique. La présence de trop coloration trichromique modifiée permettrait de détecter sur
nombreuses bactéries et levures dans les selles rend la une même lame les oocystes de Cryptosporidium spp. et
lecture particulièrement difficile et n’est pas adaptée au les spores de microsporidies [19].
dépistage en routine. Le Gram pose les mêmes difficultés Cependant, quelle que soit la technique, la lecture est fas-
de lecture puisqu’il n’y a pas de contraste entre les spores tidieuse et requiert un « œil expérimenté » surtout si les
spores sont rares dans l’échantillon.
de microsporidies et le fond de la préparation [16].

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Figure 4 – Spores d’E. bieneusi Figure 5 – Spores d’E. intestinalis


dans les selles d’un patient infecté par le VIH. dans les selles d’un patient infecté par le VIH.
Coloration trichromique modifiée (x 1 000). Coloration trichromique modifiée (x 1 000).

• Coloration par les fluorochromes 3.3.2. Examen direct d’autres liquides biologiques
Les fluorochromes (Uvitex 2B, Calcofluor White 2MR et Fun- Les spores d’E. bieneusi et d’E. intestinalis peuvent être
gifluor) se fixent électivement sur la chitine présente dans la également recherchées dans les liquides d’aspiration
paroi des spores de microsporidies et lui confère un aspect duodénale, la bile, les urines, les lavages bronchioloalvéo-
bleu brillant sous lumière ultra-violette. Van Gool et al. ont laires, le jetage nasal, les ponctions sinusales. Le nombre
proposé une technique de fluorescence directe utilisant l’Uvitex de spores excrétées dans ces prélèvements pouvant être
2B, pour la recherche des microsporidies dans les selles [20]. très faible, une centrifugation préalable à grande vitesse
La lecture est effectuée sur un microscope à fluorescence, (minimum 1 500 x g) est indispensable pour les concentrer
équipé d’un couple de filtres particuliers, permettant une dans le culot de centrifugation.
excitation entre 355 et 425 nm et une émission à 460 nm.
Les spores présentent une fluorescence bleue très pronon- 3.4. Immunodiagnostic
cée au niveau de la périphérie, sur fond noir (figure 6). Cette La mise au point des premières techniques d’immu-
coloration de réalisation rapide, de lecture facile, apporte nofluorescence indirecte (IFI) utilisant des anticorps
encore un plus pour le diagnostic. Cependant, elle s’avère polyclonaux a montré l’existence de communautés
moins spécifique si les selles contiennent d’autres éléments antigéniques entre plusieurs espèces de microsporidies.
riches en chitine. En effet, les fongiques apparaissent aussi
bleu-fluorescent. Si la taille permet d’écarter les levures, il
n’en est pas toujours de même de certaines spores de cham-
Figure 6 – Spores d’E. bieneusi dans les selles d’un patient
pignons filamenteux. Des débris d’origine végétale peuvent
infecté par le VIH. Coloration à l’Uvitex 2B (x 1 000).
également être marqués.

Technique de coloration de Van Gool


Réactifs
- Uvitex 2B : préparer une solution à 1 % dans du tampon
PBS (pH = 7.4) à conserver à l’abri de la lumière.
- Solution de Bleu Evans à 1 % dans du tampon PBS.
L’étalement des selles est fait sur lame à spot de 1,3 cm
de diamètre.
Toute la coloration doit être effectuée à l’abri de la lumière.
- Recouvrir l’étalement de la solution d’Uvitex 2B à 1 % et
laisser agir 15 minutes.
- Rincer à l’eau distillée.
- Recouvrir l’étalement de la solution de Bleu Evans à 1 %
pendant 5 minutes.
- Rincer à l’eau distillée et laisser sécher.
La lecture se fait à l’objectif x 100 à l’immersion au micros-
cope à fluorescence.

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aux techniques classiques de coloration (trichrome
Figure 7 – Marquage en IFI par l’IG2a
de la paroi des spores d’E. bieneusi dans les selles modifié et Uvitex 2B) et à la PCR, de façon prospec-
d’un enfant de 7 ans transplanté rénal (x 1 000). tive aux CHU de Bordeaux et de la Pitié-Salpêtrière
(> 600 prélèvements de selles) et dans 2 enquêtes réa-
lisées en Afrique chez des patients infectés ou non par
le VIH [23, 24]. Elle s’est avérée plus sensible que les
techniques de coloration et aussi performante que la
PCR utilisant des amorces spécifiques des 2 espèces,
encore réservée aux laboratoires spécialisés.
L’IgG2a anti-exospore d’E. bieneusi et l’IgG1 anti-endos-
pore d’E. intestinalis sont commercialisés par Bordier
Affinity Products SA (www. bordier.ch).

3.5. Diagnostic moléculaire


Le séquençage de différents gènes chez plusieurs
espèces de microsporidies infestant l’homme a permis
l’application de la PCR au diagnostic et au génotypage
de ces parasites. Des techniques ciblant essentiel-
lement les séquences du gène codant pour la petite
sous-unité ribosomale de l’ARN (ARNr 16S) et plus
rarement des séquences de la région intergénique non
transcrite (ITS) ou du gène codant pour la grande sous-
Figure 8 – Marquage en IFI par l’IG1 unité ribosomale de l’ARN (ARNr 23S) ont été mises
de la paroi des spores d’E. intestinalis dans les selles au point. Les amorces décrites sont soit spécifiques
d’un patient infecté par le VIH (X 1000). d’une seule espèce, notamment d’E. bieneusi ou d’E.
intestinalis, soit spécifiques du genre Encephalitozoon,
soit universelles et amplifient l’ADN de la plupart des
microsporidies humaines.
Dans ce dernier cas, plusieurs méthodes peuvent être
mises en œuvre pour identifier spécifiquement l’espèce
de microsporidie détectée. Elles incluent le séquen-
çage du fragment d’ADN amplifié et la comparaison à
des séquences connues, l’analyse des amplicons par
hybridation à l’aide de sondes nucléiques spécifiques
de différentes espèces (Southern-blot) ou bien la diges-
tion par des enzymes de restriction (RFLP, restriction
fragments lenght polymorphism).
Les méthodes de préparation des échantillons pour le
diagnostic moléculaire des microsporidies sont détaillées
dans la revue de Weiss et Vossbrinck [25]. La technique
utilisée peut significativement affecter la sensibilité de la
technique de PCR mise en œuvre. Les acides nucléiques
peuvent être extraits des différents échantillons cliniques
aussi bien par des méthodes standards comme la diges-
Photo M. Thellier.
tion par la protéinase K suivie d’une extraction par le
chloroforme et d’une précipitation par l’éthanol ou à
Des anticorps polyclonaux produits contre les différentes l’aide de kits commerciaux (e.g. QIAmp DNA stool mini
espèces du genre Encephalitozoon ont ainsi permis de kit, Qiagen) ou encore par des méthodes automatisées
détecter des spores d’E. bieneusi et d’E. intestinalis (e. g. MagNA Pure LC, Roche).
dans des échantillons cliniques [21]. Du fait de leur L’extraction peut parfois être réalisée à partir des coupes
réactivité croisée, la détection spécifique d’une espèce en paraffine utilisées en histopathologie (kits commer-
donnée est difficile. ciaux spécifiques DexPat) et des lames de selles fixées
Deux anticorps monoclonaux spécifiques de la classe et colorées par le trichrome modifié ou le Giemsa. Un
des IgG dirigés respectivement contre la paroi des spores autre procédé utilisant des flitres FTA® imprégnés (solu-
d’E. bieneusi [15] et d’E. intestinalis [22] ont été produits tion chimique brevetée, Whatman) permet la lyse des
et appliqués à la détection des parasites par IFI dans membranes cellulaires et la dénaturation des protéines
les selles de patients infectés. Le marquage franc de la lors du dépôt de l’échantillon. Les acides nucléiques
paroi des spores matures permet de les visualiser à un alors immobilisés et stabilisés peuvent être stockés à
faible grossissement, ce qui facilite le diagnostic même température ambiante.
pour un observateur non expérimenté (figures 7 et 8). La Cependant l’extraction et l’amplification de l’ADN à
technique a été évaluée et validée par comparaison partir des prélèvements de selles reste difficile néces-

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sitant souvent le recours à une rupture mécanique de variable des anticorps chez les patients immunodé-
la paroi des spores et/ou un prétraitement des échan- primés, de l’impossibilité de différencier une infection
tillons avant l’extraction. La pulvérisation des spores à aigue d’une infection ancienne, de la prévalence éle-
l’aide de billes de verre associée à la digestion par la vée des anticorps dans la population immunocom-
protéinase K, la lyticase ou la chitinase semblent effi- pétente et de l’existence de réactions croisées entre
caces. Les selles peuvent contenir des inhibiteurs de les différentes espèces. Toutefois, les analyses séro-
PCR dont la présence peut être bloquée par l’emploi logiques pourraient s’avérer utiles pour dépister les
d’hypochlorite de sodium 0,5 %, de thiocyanate de infections subcliniques chez des patients qui sont
guanidine, d’hydroxyde de potassium, de dithiothretol, susceptibles de les transmettre à des patients à risque
d’hexadecyltrimethylammonium bromide ou inactivée (e.g. transplantés d’organes solides) ou chez ceux qui
par chauffage des échantillons. Une dilution des échan- pourraient réactiver l’infection dans des conditions
tillons est parfois nécessaire. d’immunodépression.
La PCR est une technique sensible, spécifique et repro-
ductible qui permet un diagnostic d’espèce. La limite de 3.7. Approches diagnostique
détection de 102 spores/g de selles est beaucoup plus et thérapeutique
faible que pour l’examen en microscopie optique des À l’heure actuelle, pour établir le diagnostic de micros-
selles qui est de l’ordre de 104 à 106/g [26]. poridiose intestinale chez un patient, il semble justifié
Plusieurs techniques de PCR en temps réel ont été de pratiquer, dans un premier temps, la recherche de
publiées. Cette technologie détecte les amplicons au spores dans les selles avant tout examen invasif. Cet
fur et à mesure qu’ils s’accumulent via l’interaction avec examen parasitologique des selles permet un bon ren-
des agents intercalants ou des sondes fluorescentes dement diagnostique dans la majorité des cas et est au
dont l’émission est directement proportionnelle à la moins aussi sensible (sinon plus) que l’examen histolo-
quantité d’amplicons générés. De plus, elle utilise des gique des biopsies intestinales, en raison de la distribu-
systèmes en tubes fermés et dispense des manipulations tion en foyers des microsporidies, de la petite taille de
post-amplification ce qui permet d’augmenter le débit tissu prélevé et de la difficulté pour les endoscopistes
et de réduire les risques de contamination inhérents à à sélectionner les zones à biopsier.
la PCR. Un contrôle interne peut permettre de détecter En pratique, pour le diagnostic de routine, les deux
l’inhibition de l’amplification par les contaminants fécaux. techniques de colorations classiques, chromotrope 2R et
La technique publiée par Menotti et al. en 2003 qui utilise Uvitex 2B, sont réalisées simultanément pour accroître la
des amorces spécifiques de l’ARNr 16S d’E. intestinalis fiabilité du diagnostic. L’emploi d’une coloration chimio-
pour rechercher le pathogène dans différents échantillons fluorescente, comme l’Uvitex 2B de Van Gool, garantit
cliniques s’avère être extrêmement sensible avec une une excellente sensibilité et son association avec une
limite de détection estimée à 20 spores/mL [27]. Elle a coloration au trichrome de Weber, qui se caractérise
ainsi permis de montrer la dissémination de l’infection par une bonne spécificité, permet un dépistage para-
par voie hématogène, en détectant l’ADN dans le sang de sitologique satisfaisant. Même si cette approche dia-
certains patients. Le tropisme tissulaire d’E. intestinalis gnostique apparaît simple et d’un coût peu élevé, elle
pour certains organes s’est traduit par la présence de requiert une grande expertise et surtout ne permet pas
fortes charges parasitaires dans des selles, des urines le diagnostic d’espèce.
ou des prélèvements broncho-pulmonaires. Si les sujets immunocompétents peuvent guérir spon-
Enfin, les PCR multiplex en temps réel permettant la tanément, un traitement efficace est indispensable pour
détection simultanée d’E. bieneusi et d’E. intestinalis [28] les patients immunodéprimés présentant une diarrhée
voire celle d’autres pathogènes intestinaux (Cyclospora chronique pouvant grever leur pronostic vital [5, 32].
cayetanensis, Isospora belli) [29] dans les selles des L’identification de l’espèce en cause, par PCR ou
patients infectés, se développent. immunomarquage à l’aide d’anticorps monoclonaux,
Les séquences de la plupart des amorces utilisées pour reste indispensable pour orienter le traitement. Pour E.
l’amplification des microsporidies humaines, ainsi que les intestinalis, l’administration d’albendazole à la dose de
températures d’hybridation recommandées et la taille atten- 400 mg deux fois par jour pendant 3 semaines, conduit
due des amplicons (pour les techniques de PCR conven- à une amélioration clinique franche, à la négativation
tionnelles) sont compilées dans la revue de Ghosh et al. [30]. de l’ensemble des prélèvements aussi bien digestifs
La PCR est applicable au diagnostic et à l’identification qu’urinaires. Pour E. bieneusi, à l’heure actuelle, seule
d’E. bieneusi et d’E. intestinalis avec une sensibilité et la fumagilline permet d’éradiquer le parasite, à la fois
une spécificité de 100 % dans certaines conditions. Par dans les selles et dans les biopsies. La dose curative
ailleurs, beaucoup d’infections chez des patients modé- efficace est de 60 mg/jour pendant 14 jours. L’analyse par
rément immunodéprimés ou immunocompétents qui PCR en temps réel d’échantillons de selles de 6 patients
excrètent de faible quantité de spores dans les selles ne traités par fumagilline au cours de l’essai thérapeutique
sont pas diagnostiquées par les techniques classiques. ANRS 090 a permis de montrer une réduction moyenne
de 4,7 log de l’ADN d’E. bieneusi dans les selles après
3.6. Tests sérologiques 2 semaines de traitement [33].
Les tests sérologiques, ELISA, IFI, western blot, aggluti-
nation directe [31], ne sont pas recommandés à l’heure Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de
actuelle pour le diagnostic en raison de l’expression conflits d’intérêts en relation avec cet article.

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2012 - N°440 // 33


Références [19] Ignatius R, Lehmann M, Miksits K, et al. À new acid-fast tri-
chrome stain for simultaneous detection of Cryptosporidium par-
vum and microsporidial species in stool specimens. J Clin Microbiol
[1] Keeling P. Five questions about microsporidia. PLoS Pathog
1997;35(2):446-9.
2009;5(9):e1000489.
[20] Van Gool T, Snijders F, Reiss P, et al. Diagnosis of intestinal and
[2] Desportes I, Le Charpentier Y, Galian A, et al. Occurrence of a new
disseminated microsporidia infections in patients with HIV by a new
microsporidian: Enterocytozoon bieneusi n.g., n.sp., in the enterocytes
rapid fluorescence technique. J Clin Pathol 1993;46:694-9.
of a human patient with AIDS. J Protozool 1985;32:250-4.
[21] Aldras AM, Orenstein JM, Kotler DP, et al. Detection of microspori-
[3] Cali A, Kotler DP, Orenstein JM. Septata intestinalis n.g., n.sp., an
dia by indirect immunofluorescence antibody test using polyclonal and
intestinal microsporidian associated with chronic diarrhea and dissemi-
monoclonal antibodies. J Clin Microbiol 1994;32:608-12.
nation in AIDS patients. J Protozool 1993;40:101-12.
[4] Molina JM, Sarfati C, Beauvais B, et al. Intestinal microsporidiosis [22] Thellier M, Biligui S, Desportes-Livage I, et al. Monoclonal antibody
in human immunodeficiency virus-infected patients with chronic and enabling the diagnosis of Encephalitozoon intestinalis in fecal speci-
unexplained diarrhea: prevalence and clinical and biologic features. J mens: importance of the mode of selection of hybridomas. J Eukaryot
Infect Dis 1993;167:217-21. Microbiol. 2001;Suppl:71S-2S.
[5] Anane S, Attouchi H. Microsporidiosis: epidemiology, clinical data [23] Alfa Cisse O, Ouattara A, Thellier M, et al. Evaluation of an immuno-
and therapy. Gastroenterol Clin Biol 2010;34(8-9):450-64. fluorescent-antibody test using monoclonal antibodies directed against
[6] Didier ES, Weiss LM. Microsporidiosis: not just in AIDS patients. Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon intestinalis for diagno-
Curr Opin Infect Dis 2011;24(5):490-5. sis of intestinal microsporidiosis in Bamako (Mali). J Clin Microbiol
2002;40(5):1715-8.
[7] Sulaiman IM, Matos O, Lobo ML, et al. Identification of a new micros-
poridian parasite related to Vittaforma corneae in HIV-positive and [24] Breton J, Bart-Delabesse E, Biligui S, et al. New highly divergent
HIV-negative patient from Portugal. J Eukaryot Microbiol 2003;50(sup- rRNA sequence among biodiverse genotypes of Enterocytozoon bie-
pl):586-90. neusi strains isolated from humans in Gabon and Cameroon. J Clin
Microbiol. 2007;45(8):2580-9.
[8] Didier ES, Stovall ME, Green LC, et al. Epidemiology of microspori-
diosis: sources and modes of transmission. Vet Parasitol 2004;126(1-2): [25] Weiss LM, Vossbrinck CR. Molecular biology, molecular phylo-
145-66. geny and molecular diagnosis approaches to the microsporidia, in the
[9] Van Gool T, Vetter JCM, Weinmayr B, et al. High seroprevalence of Microsporidia and Microsporidiosis, Wittner M, Weiss LM, Eds., pp.
Encephalitozoon species in immunocompetent subjects. J Infect Dis 129-171, American society for microbiology, Washington, DC, USA,
1997;175:1020-4. 1999.
[10] Didier ES. Microsporidiosis: An emerging and opportunistic infec- [26] Franzen C, Müller A, Molecular techniques for detection, spe-
tion in humans and animals. Acta Tropica 2005;94:61-76. cies differentiation and phylogenetic analysis of microsporidia. Clin
[11] Magaud A, Achbarou A, Desportes-Livage I. Cell invasion by Microbiol Rev 1999;12:243-5.
the microsporidian Encephalitozoon intestinalis. J Eukaryot Microbiol [27] Menotti J, Cassinat B, Sarfati C, et al. Development of a real-time
1997;44:81S. PCR assay for quantitative detection of Encephalitozoon intestinalis
[12] Orenstein JM, Dieterich DT, Lew EA, et al. Biopsy diagnosis of DNA. J Clin Microbiol 2003;41(4):1410-3.
intestinal microsporidiosis. AIDS 1993;7(3):S49-S54. [28] Verweij JJ, Ten Hove R, Brienen EA, et al. Multiplex detection of
[13] Carter PL, McPherson DW, McKenzie RA. Modified techniques to Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon spp. in fecal samples
recover microsporidian spores in sodium acetate-acetic acid-formalin- using real-time PCR. Diagn Microbiol Infect Dis 2007;57(2):163-7.
fixed fecal samples by light microscopy and correlation with transmis- [29] Taniuchi M, Verweij JJ, Sethabutr O, et al. Multiplex polymerase
sion electron microscopy. J Clin Microbiol 1996;34:2670-3. chain reaction method to detect Cyclospora, Cystoisospora, and
[14] Datry A, Biligui S, Aoun K, et al. Les microsporidioses intesti- Microsporidia in stool samples. Diagn Microbiol Infect Dis 2011;Oct 6
nales: nouvelles stratégies diagnostiques. Communication orale 1995. [Epub ahead of print].
Société française de parasitologie, Angers. [30] Ghosh K, Weiss LM. Molecular diagnostic tests for microsporidia.
[15] Accoceberry I, Thellier M, Desportes-Livage I, et al. Production Interdisciplinary perspectives on infectiuos diseases 2009;Article ID
of monoclonal antibodies directed against the microsporidium 926521.
Enterocytozoon bieneusi. J Clin Microbiol 1999;37(12):4107-12. [31] Didier ES, Kotler DP, Dieterich DT, et al. Serological studies in
[16] Conteas CN, Donovan J, Berlin OGW, et al. Comparison of fluo- human microsporidiosis. AIDS 1993;7(3):S8-S11.
rescent and standard light microscopy for diagnosis of microsporidia in [32] Conteas CN, Berlin OG, Ash LR, et al. Therapy for human gas-
stools of patients with AIDS and chronic diarrhoea. AIDS 1997;11:386-7. trointestinal microsporidiosis. Am J Trop Med Hyg 2000;63(3-4):121-7.
[17] Weber R, Bryan RT, Owen RL, et al. Improved light-microscopical [33] Menotti J, Cassinat B, Porcher R, et al. Development of a real-
detection of microsporidia spores in stool and duodenal aspirates. N time polymerase-chain-reaction assay for quantitative detection of
Engl J Med 1992;326:161-6. Enterocytozoon bieneusi in stool specimens from immunocompromi-
[18] Kokoskin E, Gyorkos TW, Camus A, et al. Modified technique for sed patients with intestinal microsporidiosis. J Infect Dis 2003;187(9):
efficient detection of microsporidia. J Clin Microbiol 1994;32:1974-5. 1469-74.

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