Bacteriología Dr.

César Cevallos Columbus

UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BASADRE GROHMANN” –TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS: E.P DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA
CURSO: BACTERIOLOGÍA
PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 02

VALIDACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS DE REFERENCIA

INTRODUCCIÓN

El desarrollo y realización de análisis de control microbiológico (Bacteriológico) es una herramienta que tiene una
repercusión decisiva en el ámbito del diagnóstico clínico, de la salud pública, la tecnología alimentaria y el medio
ambiente.

Por ello, el propósito del laboratorio de microbiología es dar con rapidez y exactitud la información correcta
referente al microorganismo específico causal de la enfermedad.

OBJETIVO

Conocer y valorar los diferentes criterios para la validación de medios de cultivo y cepas de referencia en el
laboratorio de bacteriología clínica.

VALIDACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los laboratorios que realizan análisis microbiológicos (bacteriológicos) trabajan en un entorno de creciente
exigencia y responsabilidad, tanto legal como social, que reclama un nivel de calidad y de confianza
extraordinarios. Por ello, tanto los métodos de ensayo como los laboratorios que realizan los análisis deben
asegurar, al máximo nivel permitido por el desarrollo científico y técnico, la fiabilidad de los resultados. La
fiabilidad de los resultados obedece a criterios de acreditación que deben presentar los laboratorios de
diagnóstico, estos deben estar correctamente validadas.

La validación no es más que la confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de datos que respaldan
la existencia o veracidad de algo, estos pueden obtenerse por medio de la observación, medición, ensayo/prueba
u otros medios que han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (NCISO
9000:2005).

En el campo de las mediciones microbiológicas con la idea de asegurar la calidad (salud, medio ambiente y de
los alimentos) de los resultados y la comparabilidad entre laboratorios se utilizan los cultivos microbianos como
Cultivos Microbianos de Referencia (CMR) cuando provienen de una colección de cultivo reconocida. Estos son
importantes en el aseguramiento de calidad de los ensayos que el laboratorio realiza cotidianamente y le permite
obtener resultados altamente confiables.

Contar con un material de referencia de esta naturaleza permite asegurar la validación de ensayos
microbiológicos, el monitoreo y el control de los equipos críticos y los involucrados en los procesos de
esterilización y descontaminación, el control interno y externo de los ensayos o mediciones, el entrenamiento y
evaluación de la competencia técnica del personal. Es imprescindible, en consecuencia, que estas mediciones
sean confiables y comparables. Todo esto se traduce como calidad, y la calidad está ligada a numerosos
aspectos de nuestra vida tales como el cuidado de la salud, del medio ambiente y de los alimentos.

CALIDAD. Conjunto de propiedades y características de un producto, proceso o servicio que le confieren su

aptitud para satisfacer las necesidades establecidas o implícitas. Para asegurar la calidad es necesario que los
laboratorios de diagnóstico realicen pruebas de verificación que certifiquen el perfecto estado de los equipos,
materiales, y reactivos que se usan a la hora de ejecutar los análisis comprometidos.

Control de medios de cultivo con empleo de cepas bacterianas

La preparación de los medios de cultivo es un aspecto vital en el laboratorio de Bacteriología, ya que su calidad
constituye una garantía para la obtención de resultados confiables en los ensayos realizados.

El control de la calidad en la preparación y evaluación de los medios de cultivo es considerado como una
esencial y buena práctica de laboratorio, necesaria para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica
microbiológica. Este es un proceso continuo que se extiende desde las materias primas, a través del productor
hasta el producto final utilizado en la meseta. El control de la calidad constituye uno de los puntos críticos de
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control en el análisis microbiológico, del cual depende la seguridad de los resultados que emiten los laboratorios
de ensayo.

Figura 1. Set de medios de cultivo para aislados de diferentes bacterias.

Figura 2. Preparación de un medio de cultivo.

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Figura 3. Medios de cultivo en placa Petri: Agar Nutritivo, Agar EMB, Agar McConkey, Agar Chocolate y Agar
sangre.

DETERMINACIÓN DE LA PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Es necesario definir primero lo que significa Productividad y Selectividad de los medios de cultivo en el análisis
de laboratorio de diagnóstico.

PRODUCTIVIDAD

Se define como el rendimiento, recuperación, crecimiento de un microorganismo que se espera que desarrolle en
el medio de cultivo. Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de referencia target para evaluar la
productividad

Ejemplo: si el medio de cultivo es no selectivo como el PCA se evalúa el adecuado desarrollo de las cepas target
o blanco. En este caso se usan cepas de la ATCC: E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC
663.

SELECTIVIDAD

Se define como la supresión del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido en el medio de
cultivo. En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo Caldo Lauril Sulfato (LST) se evalúa el desarrollo de
las cepas target y no target. Las cepas target que se usan son: E. coli ATCC 25922, C. freundii ATCC 43864 y las
cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212. Evalúa reacciones características: gas y turbidez.

EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Para evaluar los medios de cultivo se consideran tres Métodos: el Método de Miles-Misra (Cuantitativo), el
Método Ecométrico (Semicuantitativo) y el Método de Estrías (Semicuantitativo).

En nuestra modelo de práctica resaltamos el Método de Ecométrico (semicuantitativo) porque, este tiene la
ventaja de favorecer la observación del aspecto de las colonias, pues produce rápida extinción del cultivo; en
cambio, el Método de Miles-Misra es más costoso y no permite realizar una lectura de las colonias, pero su valor
es cuantitativo. En el caso del Método Ecométrico es fácil y rápido, pero dificultoso para establecer el Índice de
Crecimiento Absoluto o ICA.
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Método Ecométrico (semicuantitativo).

Establece la eficiencia con la cual un medio de cultivo sirve para recuperar una cepa, mediante la comparación
que se realiza entre el medio a evaluar y un medio control. Esta técnica evalúa tanto la sensibilidad de los medios
a la colonización por los microorganismos buscados (productividad) como también la resistencia a la colonización
por las cepas que interfieren (selectividad).

Un parámetro útil para interpretar los resultados ecométricos es el Índice de Crecimiento Absoluto (ICA). Éste
denota el último sector de la placa en el cual ha habido un crecimiento significativo. Otro parámetro es el Índice
de Crecimiento Relativo (ICR) que relaciona los valores de ICA del medio a evaluar con el ICA del medio control
(Mossel, 2003).

Para llevar a cabo la Prueba de Control de Calidad de medios de cultivo (Método Ecométrico), se usa como
medio de referencia, el medio de cultivo cuya composición sea muy completa y favorezca el crecimiento de un
gran número de microrganismos; tales medios pueden ser: Agar tripticasa de soya, Agar BHI, Agar McConkey,
Agar EMB, Agar nutritivo, Agar Standard Plate Count.

PROCEDIMIENTO.
Cepas Referentes (Deseada) Cepas Interferentes
Cepas de trabajo:
Staphylococcus aureus Escherichia coli

Lo recomendable es tener las cepas de referencia. Ejemplo: Staphylococcus aureus ATCC6538

El microorganismo referente, que desea evaluar su selectividad y productividad en el medio de cultivo deseado y
del interferente, debe estar en fase estacionaria (Caldo Cerebro corazón o CCC).

1. Siembre en placas de agar nutritivo por separado cada una de las cepas e incube a 35°C durante 24 horas.

2. Seleccione 04 placas de Petri: 02 que contienen el medio selectivo a evaluar (agar EMB o agar Mac Conkey)
y 02 placas de Petri que contiene el medio de referencia (agar nutritivo).

3. Sembrar por separado una colonia aislada de cada una de las cepas de reserva (sembradas en agar nutritivo)
a 02 tubos que contienen 10 ml de Caldo infusión Cerebro Corazón (CCC o BHI) previamente rotulados con el
nombre o código de las cepas referentes o deseadas y de las cepas interferentes.

4. Mezclar homogéneamente los tubos e incubar 18 horas a 35-37°C.

5. Seleccionar 04 placas de Petri: 02 placas de Petri que contienen el medio selectivo a evaluar y 02 placas de
Petri que contiene el medio de referencia.

6. Divida cada una de las placas de Petri por la parte posterior de la base marcándolas en 4 cuadrantes.

7. Trace en cada cuadrante, por la base de la placa, cinco líneas de mayor a menor como se demuestra en el
primer cuadrante (C1); y luego, en el punto de intersección de los cuadrantes, trace una línea (Ver figura 8).

8. Tomar con un asa calibrada un 1 µl de cada uno de los tubos de la suspensión bacteriana e inocular las 6
cajas de Petri que contienen el medio a evaluar y otras 6 que contienen el medio de referencia.

9. De las 04 cajas de Petri elegidas proceder de la siguiente manera: 2 que contengan el medio a evaluar y 2
con el medio de referencia para inocular las cepas deseadas. Trace sobre la superficie del medio cinco estrías
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paralelas en cada cuadrante y una estría central, de forma progresiva, sin recargar ni flamear el asa, tal como
se demuestra en la figura 4.

Figura 4. Esquema de la placa de Petri dividida en 4 cuadrantes. Fuente propia.

Figura 5. Representación gráfica de marcaje y siembra en método ecométrico. Fuente propia.

10. Proceder hacer lo mismo con el medio de referencia

11. Incubar las placas en posición invertida a 37°C por 24 a 48 horas.

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Figura 6. Muestra modelo donde se puede apreciar los microorganismos interferente y referente en la evaluación
del medio de cultivo (Productividad y selectividad) deseado y de recuperación. Fuente.

DETERMINACIÓN DEL ICA Y DEL ICR

12. A cada estría se le asigna un valor de 0,2 unidades y a la estría central un valor de 1.

13. El cálculo del ICA se determina multiplicando 0,2 por el número de estrías en cada cuadrante donde se
observa crecimiento. Si hay crecimiento en las cinco estrías de los cuatro cuadrantes y la estría central
(valor 1), el ICA es igual a 5.

Tabla 02. Criterio de evaluación del ICA y del ICR

Prueba de productividad Prueba de selectividad Prueba de recuperación
ICA Productividad ICA Selectividad
4,5 - 5 Alta 4,5 – 5 No hay ICA (Prueba)
2,5 – 4,5 Media SELECTIVIDAD ICR = --------------------
< 2,5 Poca 2,5 – 4,5 Baja ICA (Control)
0 No < 2,5 Media
Productivos 0 Alta

Para el criterio de evaluación de la propiedad se mide teniendo en cuenta que las cepas esperadas en un medio
selectivo deben dar un ICA no menor de 2.5 - 3.

RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN

Medio de cultivo evaluado: agar EMB

Cuadro 01. Determinación del Índice de Crecimiento Absoluto (ICA)

Cuadrante Valor Índice Crecimiento Absoluto
1 0,2 por cada estría 0,2 x N° de estrías con crecimiento
2 0,2 por cada estría
3 0,2 por cada estría
4 0,2 por cada estría
Intersección 1 línea central
Promedio

Cuadrante Valor Índice Crecimiento Absoluto

1 0,2 por cada estría 0,2 x N° de estrías con crecimiento
2 0,2 por cada estría
3 0,2 por cada estría
4 0,2 por cada estría
Intersección 1 línea central
Promedio
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Prueba de Productividad
ICA PRODUCTIVIDAD
4,5 - 5 Alta
2,5 – 4,5 Media
< 2,5 Poca
0 No
Productivos

CUESTIONARIO

1. ¿En qué se diferencia un medio definido de un medio complejo?

2. ¿Cuáles son los requerimientos energéticos de un microorganismo?
3. ¿Cuáles son los requerimientos no energéticos?
4. ¿Qué condiciones ha de cumplir un medio de cultivo?
5. ¿Cuáles son las clases de medios de cultivo según proporción de agua? Ejemplos de cada uno.
6. ¿Qué es una cepa de referencia, de reserva y de trabajo?
7. ¿Por qué es importante la utilización de una cepa de referencia en un cultivo?

Tacna, setiembre - 2018