CULTIVO IN VITRO DE MATERIAL

VEGETAL

OBJETIVOS

- Utilizar métodos básicos de cultivo in vitro y sus características.

FUNDAMENTO TEÓRICO
El cultivo in vitro el desarrollo y crecimiento de plantas o partes de plantas en
condiciones especiales, dentro de recipiente de vidrio. En estas condiciones se
le debe suministra a la planta todo lo que necesita para su desarrollo: agua,
nutriente, luz y agua. El agua y los nutrientes se aportan con el medio y la luz
la reciben a través de las paredes de vidrio.
Es vital importancia que el medio, los frascos, los aparatos y las semillas se
mantengan desinfectadas desde el principio del proceso de germinación.
Cualquier bacteria u hongo que se introduzca en los frascos crecerá más
rápido que las semillas y pronto ocupará su espacio hasta matarla.
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MATERIAL

Material de Laboratorio  Placas Petri y Frascos de cristal con tapa tipo colados.

 Olla a presión

 Guantes quirúrgicos 30 pares

 Mascarillas desechables 30 unidades

 Espátulas 15 unidades

 Bisturí 10 unidades

 Mechero de gas y Alcohol 10 unidades

 Soporte y rejillas para mecheros 1 para cada mechero

 Varillas de vidrio 5 unidades

 Pinzas metálicas 10 unidades

 Trapo Grande o Toalla vieja

 Rollo de plástico Film 2 unidades

 Gasa estéril 2 paquetes

 Tijeras 10 unidades

 Cinta adhesiva 3M 2 rollos

 1 balanza digital

 Probeta de 1 litro

 2 vasos precipitados de 500 cc

 Alcohol al 70%

 Alcohol gel.

 Cloro gel
  Microondas

 Embudo de vidrio 2 unidades

Reactivos  Lejía

 Ácido Clorhídrico.

 Hidróxido Sódico

 Lava lozas

 Para Realizar el Medio de Cultivo necesitamos:

3 plátanos.

10 g. de agar agar

1 taza de azúcar

3 litros de agua destilada

12tabletas de Tiamina Clorhidrato de 10 mg

Material Biológico  10 Ají verdes o rojos grandes

 5 zanahorias.
MÉTODO
Preparación de los frascos.
Se lavan bien las placas y tapas con jabón y lejía.
Preparación y esterilización del medio de cultivo.
1. Poner en un recipiente los 900 ml de agua destilada, 100g de plátano maduro
hecho puré o licuado, 15 g de azúcar y 0.24 g Tiamina. Una vez disuelto se añaden
10 g de agar agar y se hierve el medio. (lo ideal es hacerlo en el microondas o en
un hornillo con agitación continua para que el agar no se estropee).
2. Mide el pH y ajústalo (usa HCL para disminuirlo y NaOH para incrementarlo).
Debe de quedar entre 5.5 y 6.
3. Distribuye el medio de cultivo en las placas, para ello utiliza un embudo de vidrio.
4. Vierte en cada frasco en el fondo una cantidad de preparado de más o menos 1
centímetro (45 a 50 ml). Por cada litro de preparado podemos llenar más o menos
20 frascos.

Esterilización del medio de cultivo

Las placas se esterilizan en una olla a presión, la cual se puede considerar como
una pequeña autoclave. Nos sirve para esterilizar medios o material
sometiéndolos a temperatura y presión elevadas.
Los pasos para la esterilización son los siguientes:
Se pone un pedazo de tela en el fondo de la olla (un trapo cualquiera) para
impedir así que los frascos toquen el fondo de la olla y se revienten con el calor.
Se añaden dos o tres centímetros de agua.
Colocamos los frascos (con el medio) tapados, pero sin cerrar del todo, la
tapadera debe quedar suelta o de lo contrario los botes acumularán presión y
estallarán.
Cerrar y calentar en un fogón a fuego fuerte hasta que la pesa comience a
moverse y liberar vapor o el medidor marque 15 PSI.
Dejar a 15 PSI unos 20 o 30 minutos a fuego suave.
Apagar una vez trascurrido el tiempo y esperar a que la olla baje y esté
totalmente enfriada. No se debe abrir la olla antes porque la diferencia de presión
o temperatura hará que entre aire “no estéril” a los frascos, creando un peligro de
contaminación.
Se dejan enfriar hasta que el medio gelifique (se solidifique) por acción del agar.
Con guantes desinfectados con alcohol, se terminan de cerrar los botes para evitar
la entrada de aire no estéril.

Preparación de las semillas de AJI

Primero lavaremos cuidadosamente los ajís y los rociamos con alcohol para
proceder a flamearlos con el mechero lo cortamos con un cuchillo o bisturí estéril y
procedemos a obtener las semillas.

Las semillas se esterilizan de la siguiente forma:

-Prepara dos recipientes con agua (a la mitad de su capacidad). y uno vacío y se

cubren con tapas dobles de aluminio.
Los botes se esterilizan en el microondas (5-10 min) pero en este caso los frascos
se tapan con papel film. Dejar enfriar antes de usarlo para la esterilización de las
semillas.
-Las semillas se envuelven en una gasa y se sumergen en una solución 0,5% de
hipoclorito de sodio con unas gotas de lavavajillas.
- El tiempo que deben estar en esta solución es de 15 minutos.
 Pasa las semillas por los dos botes de agua estéril, 5 minutos mínimo en cada
bote, para eliminar la lejía de su superficie. Este paso debe hacerse en
condiciones de esterilidad ambiental, trabajando cerca de la llama del mechero
para evitar la caída de esporas en las semillas o en el medio y lo contamine. Las
pinzas metálicas deben ser flameadas antes de su uso.

Cultivo del material vegetal en condiciones asépticas.

Limpia la superficie de trabajo con lejía. Sí tienes el pelo largo recógelo y, si es

posible, ponte una mascarilla para que este todo prefecto. Hay que trabajar con
mucho cuidado y muchísima limpieza. Los frascos muy fácilmente se contaminan
con hongos.
En todo momento trabajaremos cerca del mechero. Las semillas se pasan del
recipiente con agua a los botes con el medio con una pinza que previamente
hemos flameado con etanol para esterilizarla
Abre cuidadosamente un poco el bote, sin destapar el bote del todo, y coloca las
semillas sobre el medio de cultivo. Este paso debe hacerse cerca de la llama del
mechero. Cierra rápidamente la tapa para que no entre ningún microrganismo.
Una vez se han puesto de 4 o 5 semillas por bote. Se cierran los frascos
herméticamente cerca del mechero y se sellan con cinta adhesiva o film de
parafina. Etiqueta los botes con la fecha y tipo de semilla cultivado, también
puedes anotar los nombres de los componentes del grupo.
Estos botes se mantienen en oscuridad hasta que se observe la germinación de la
semilla, que puede tardar de uno a diez días.

Preparación Explantes de Zanahoria

1. Esterilización de la superficie de la zanahoria.

En un azulejo bien limpio, cortar con un cuchillo un pedazo de zanahoria de 3 a 6
cm, descartando ambas extremidades de la raíz.
Raspar para retirar la epidermis y marcar con algún corte la extremidad inferior de
la raíz.

Desinfectar durante 15 minutos en agua sanitaria (hipoclorito de sodio) diluida al y

con una gota de detergente.
Lavar 2 veces en agua estéril durante 5 minutos, teniendo la precaución de limpiar
previamente el frasco y la tapa con alcohol.
Agitar suavemente durante todo el procedimiento.

2. Obtención de los explantes

Siempre en condiciones asépticas, transferir el trozo de zanahoria a una placa de
Petri con un cuchillo o bisturí estéril.
Transferir nuevamente el trozo de zanahoria a una segunda placa de Petri con
papel de filtro estéril y cortar una rodaja fina de 1 a 2 mm de espesor.
Separar el cilindro vascular y cortarlo en 4 partes, como se indica a seguir.

3. Establecimiento del cultivo

En condiciones asépticas, sembrar los cuatro explantes manteniendo la polaridad,
en los frascos con medio nutritivo.

4. Incubación
A 25º C, en la oscuridad