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de Duchenne
Babi Ramesh Reddy Nallamilli, 1 Arunkanth Ankala, 1 y Madhuri Hegde 1
RESUMEN
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un trastorno neuromuscular hereditaria ligada al cromosoma X causado por
mutaciones en el gen de la distrofina ( DMD; locus Xp21.2). El espectro de mutaciones de DMD es único en que el 65% de las
mutaciones causales son deleciones intragénicas, con duplicaciones intragenic y mutaciones puntuales (junto con otras
variantes de secuencia) representa el 6% a 10% y 30% a 35%, respectivamente. La estrategia para las pruebas de diagnóstico
molecular para la DMD implica el cribado inicial para deleciones / duplicaciones utilizando microarrays de base hibridación
genómica comparada (CGH-array) seguido de análisis fullsequence de DMD para variantes de secuencia. análisis de genes
Recientemente, secuenciación de próxima generación (NGS) basado dirigida se ha convertido en clínicamente disponibles
para la detección de mutaciones puntuales y otras variantes de secuencia (pequeñas inserciones, deleciones y indeles). Esta
unidad analiza inicialmente el algoritmo estratégico para establecer un diagnóstico molecular de DMD y más tarde proporciona
protocolos detallados de los métodos de diagnóstico molecular actuales para DMD, incluyendo CGH-array, secuenciación de
Sanger basado en la PCR, y ensayo de secuenciación basada en NGS.
Curr. Protoc. Tararear. Gineta. 83: 9.25.1-9.25.29 do © 2014 por John Wiley & Sons, Inc.
Palabras clave: distrofia muscular de Duchenne diagnóstico molecular hibridación genómica comparada
DMD
INTRODUCCIÓN
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es el trastorno neuromuscular más común, afectando 1 de cada 3.500 varones
nacidos vivos (Mehler, 2000). La distrofia muscular de Becker (BMD) es alélica para la DMD y se presenta con
características clínicas más leves y una menor tasa de progresión de la enfermedad. DMD se presenta típicamente antes
de los 5 años de edad con retraso motor generalizadas y andar di fi cultades. Tanto DMD y BMD son trastornos ligados al
cromosoma X causadas por mutaciones en el gen de la distrofina, que es el gen más grande en el genoma humano, que
consta de 79 exones que abarcan de 2,2 Mb en el cromosoma X. La expresión reducida o completa ausencia de la
proteína distrofina conduce a la necrosis de las células musculares; lo que resulta en debilidad muscular. supresiones
Intragenic son las mutaciones más comunes en el gen de la distrofina, lo que representa> 65% de los casos de DMD.
Estas supresiones y puntos de corte correspondientes se distribuyen a lo largo de la longitud del gen sin hotspots o puntos
de interrupción recurrentes. 6% a 10% de DMD mutaciones. El 30% al 35% restante de mutaciones incluye mutaciones
puntuales, pequeñas deleciones e inserciones. Las mutaciones puntuales y pequeñas deleciones están dispersos por toda
la longitud de la DMD gen sin regiones de punto de acceso obvias.
Los individuos afectados con sospecha de DMD a causa de la creatina quinasa elevada (CK) niveles, o la falta de
distrofina tinción de proteínas en la biopsia muscular y la presencia de rasgos característicos, son considerados para
molecular con fi rmación de diagnóstico. Diagnóstico molecular de la DMD se consigue mediante identificación de
mutaciones patógenas en el DMD
gen, tales como deleciones, duplicaciones, y mutaciones puntuales. estrategias de ensayo de diagnóstico molecular actuales de
DMD incluyen diferentes enfoques, tales como catión multiplex PCR ampli fi, análisis de transferencia Southern, la ligadura de
múltiplex sonda dependiente ampli fi cación (MLPA), secuenciación de Sanger basado en PCR, hibridación genómica
comparativa basada en micromatriz Genética Molecular
clínicos
Current Protocols in Human Genetics 9.25.1-9.25.29, Octubre 2014 Publicado en línea de octubre de 2014 en 9.25.1
Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002 / 0471142905.hg0925s83 Derechos de Autor do
suplemento 83
© 2014 John Wiley & Sons, Inc.
la sospecha clínica de la DMD
deleciones o deleciones o
duplicaciones duplicaciones no
patógenos detectado
detectados
Figura 9.25.1 Algoritmo para el diagnóstico molecular DMD. La estrategia aquí representada se basa en el espectro de mutación DMD y
los rendimientos clínicas de los métodos de diagnóstico clínicamente disponibles para DMD. Se centra en los tres protocolos principales;
CGH-array (ver protocolo básico 1), la secuenciación PCRbased Sanger (ver protocolo básico 2), y ensayo de secuenciación basada en
NGS (ver protocolo básico 3). Como se indica aquí, el diagnóstico molecular para la DMD debe comenzar con el análisis de deleción /
duplicación por CGH-array, seguido por la secuenciación de genes (exón centrado) para mutaciones puntuales u otras variantes de la
secuencia. Los negativos para estos mencionada assaysmay ser referidos para cariotipo o G-bandas para la interrogación de posibles
translocaciones (equilibradas) que implican Xp21.2 ( DMD)
lugar.
(Array-CGH), y la secuenciación de próxima generación dirigida. Algunos de los enfoques tienen limitaciones en la
detección de duplicaciones y mutaciones puntuales. Desde deleciones son el tipo más común de mutaciones en el DMD
gen, una pantalla inicial que detecta las deleciones se debe considerar como el primer paso en el diagnóstico
molecular de la DMD (Fig. 9.25.1).
diagnóstico molecular Integral de mutaciones en el DMD gen es un reto debido a la variedad de tipos de mutación y gran
tamaño del gen. Tres estrategias diagnósticas moleculares importantes se describen en esta unidad para detectar la DMD gen
para todos los tipos de mutaciones copia número variación. Protocolo básico 1 describe de alta resolución CGH-array para la
detección de deleciones y duplicaciones en el DMD gene. Protocolo Básico 2 describe la secuenciación de Sanger PCRbased
de toda la región de codificación de la DMD gen para la detección de mutaciones puntuales y pequeñas deleciones. Protocolo
Básico 3 describe la secuenciación de próxima generación dirigido (NGS) de la DMD gen como parte de un panel de genes
utilizando la biblioteca de sondas de bloqueo disponible comercialmente xGen (disponible de Integrated DNA Technologies).
Sin embargo, es de notar que, mientras que el protocolo basado en NGS tiene el potencial de convertirse en el uno para
todos (para la detección de todos los tipos de variantes) de prueba, en la actualidad debido a los costos involucrados, la
infraestructura requerida y retos analíticos, el protocolo no se utiliza ampliamente.
Molecular
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
9.25.2
materiales
muestra de ADN de individuo afectado sospecha que tienen muestra de ADN de control de DMD de individuo
sano (paciente y controles deben ser iguales
género)
Espiga-ins (BlueGnome)
CytoSure Labeling Kit (OGT) que contiene:
Random primers dCTP mezcla de
marcaje de tampón de Cy5-dCTP
Cy3-dCTP Reacción Klenow de la
polimerasa 1 × Tris-EDTA (Fisher)
Cot-1 humano DNA (Invitrogen)
tubos de microcentrífuga de 1 ml
MultiScreen HTS PCR placas de 96 pocillos (Millipore) mezclador MultiScreen colector de vacío (Millipore)
de la placa 65 ° C horno de hibridación y personalizada de los rotadores horno HD-CGH Microarray 8 × 60K
diapositivas (tecnologías OGT o Agilent) kit de hibridación junta de deslizamiento (100) -8-plex (Agilent
Technologies / OGT) cámara de hibridación (Agilent SureHyb) 37 ° baño de agua titular tarros Slide-tinción
de cristal-slide C
9.25.3
concentración de ADN 1. Medida utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Diluir la muestra de ADN para obtener una
concentración final de 30 ng / μ l.
Preparar tanto paciente DMD y controlar soluciones de trabajo de ADN (30 ng / μ l) en tubos separados. Comience con ADN
de buena calidad (A 260/280 relación debe ser> 1,8).
2. Someter a ultrasonidos tanto DMD pacientes y de control de muestras de ADN en tubos separados mediante el uso de los siguientes
Tratamiento: 30 sec
Si un Branson Soni fi er 450 no está disponible, asegúrese de establecer los ajustes apropiados en cualquier sonicador disponible para
obtener fragmentos de ADN de 200 pb.
3. Antes de etiquetado, incubar cada paciente DNAsamplewith específico espiga-en la forma siguiente. Preparar ADN y espiga-en
mezcla de muestra en tiras de tubos de PCR mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción de muestra:
Cada espiga-en es una combinación de tres de ADN diferente amplicón cada una representando una secuencia cromosómica fi
específico diferente no tiene relevancia clínica conocida. Por ejemplo, uno específico espiga-en contiene amplicones de ADN que
representan 5q14.2, 6q14.3, y 8q23.3 loci. Del mismo modo, varios de tales combinaciones (pico-ins) están disponibles
comercialmente. Cada una de las muestras de los pacientes individuales que se están cargando en una sola diapositiva array se
enriquecerán con una espiga-en único. Básicamente, Spike-ins ayudan a detectar cualquier contaminación cruzada entre las
muestras de los pacientes durante la hibridación y etiquetado pasos-presencia de cualquier amplicón aparte de los tres esperado
de la espiga-en añadirse a la muestra indica la posible contaminación cruzada de esa muestra con una muestra diferente.
Espiga-ins no necesitan ser añadidos para controlar muestras de ADN. Añadir 10 μ l de cebador aleatorio y 10 μ l de tampón de
reacción a 18 μ l de cizallado muestra de ADN de control.
4. tiras de tubos Place de PCR en un termociclador e incubar 20 min a 99 ° C. Después del tratamiento térmico, las muestras se enfríe
5. Preparar la mezcla maestra de etiquetado en un tubo de microcentrífuga de 1-ml separado mediante la combinación de la fl debido para
cada reacción:
muestras de pacientes y controles deben ser etiquetados con diferentes colorantes; el colorante Cy3 se puede utilizar para muestras
de pacientes y el tinte Cy5 para muestras de control. Desde tintes Cy son ligeras, muestras de ADN de etiquetas sensibles y hibridan
diapositivas protegidas de la luz.
6. Transferencia 12 μ l de Cy3 mezcla maestra de etiquetado para tubo de muestra de ADN del paciente y 12 μ l
7. Colocar ambos tubos pacientes y de control de muestras en el termociclador y realizar las siguientes
Molecular incubaciones: 2 hr a 37 ° C y 10 min a 65 ° DO.
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
9.25.4
8. Cargar el volumen total de cada producto marcado en cada pocillo de una MultiScreen HTS
placa de PCR.
9. Coloque el MultiScreen cargado HTS placa de PCR en la parte superior del vacío MultiScreen
colector.
10. Aplicar vacío a 25 pulg. De Hg durante 5 minutos o hasta que todo el líquido ha filtra fi.
12. muestras mezclar completamente en un mezclador de placas durante 10 min. Recuperar los productos etiquetados final purificado en tiras
de tubos de PCR.
13. Evaluar la incorporación de colorante de muestras marcadas mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop.
Asegúrese de que se obtienen lecturas de colorante de incorporación similar para ambas muestras de los pacientes y de control. Las
muestras de paciente deben lograr una incorporación de tinte Cy3 de 14 pmol / μ l y de control de muestras deben lograr una
incorporación de tinte Cy5 de 13 pmol / μ l.
14. Antes de proceder a la etapa de pre-bloqueo, combine tanto para el paciente y las correspondientes muestras de control fi cadas
puri.
Mientras que la mezcla de las muestras de pacientes y de control, garantizar que ambas muestras pertenecen al mismo género.
15. Preparar pre-bloqueo de mezcla mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción en tiras de tubos de PCR: 5 μ l
Cot-1 DNA (1 mg / ml) 11 μ l 10 × tampón de bloqueo 55 μ tampón de hibridación l 44 μ l de ADN combinado paciente y
control (marcado y purificado).
18. Coloque una diapositiva junta limpio en la base de la cámara Agilent SureHyb con la etiqueta junta hacia arriba y
alineado con la sección rectangular de la base de la cámara.
19. dispensar suavemente 105 μ l de pre-bloqueado muestra sobre el portaobjetos junta que está descansando
en la cámara de deslizamiento.
Evitar burbujas de aire por la dispensación de muestra muy cuidadosamente sobre el portaobjetos junta. Las burbujas de aire afectará
negativamente a la calidad de hibridación y matriz.
20. Coloque suavemente el portaobjetos microarray sobre el portaobjetos junta con el número de código de barras hacia arriba.
microarrays diapositivas deben caer planas en la diapositiva junta con la solución de la muestra. Se ve como un sándwich formado por los
microarrays de diapositivas en la parte superior, tobogán junta en la parte inferior, y la muestra en el medio. colocación inadecuada de los
microarrays de diapositivas puede conducir a fugas de la solución de muestra, en última instancia, causando la contaminación cruzada entre
muestras múltiples.
Genética Molecular
clínicos
9.25.5
una muestra de paciente DMD macho indica por el aumento de cambio por encima de cero.
21. fijar la porción superior de la cámara Agilent SureHyb y apriete cuidadosamente el tornillo.
22. Inspeccionar cuidadosamente la cámara de deslizamiento mediante la rotación y asegúrese de que el líquido de muestra se fl debido
26. Relleno frasco de tinción de portaobjetos con tampón de lavado 1 y también colocar un soporte de vidrio de diapositiva en el mismo frasco
de tinción de portaobjetos.
Molecular 27. Quitar cámara de deslizamiento del horno de hibridación y desmonte la cámara de deslizamiento.
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
9.25.6
28. Colocar todos los sándwiches deslizable junta en el frasco de tinción de portaobjetos que contiene tampón de lavado 1 y microarrays
Trate de evitar los arañazos en las diapositivas mediante la celebración de las diapositivas en sólo la parte de código de barras de las diapositivas.
29. Transferencia todos desliza a lo largo con el soporte de diapositivas en un nuevo frasco de tinción de portaobjetos con tampón de lavado 1.
Colocar una barra de agitación magnética dentro de la jarra y encender la placa de agitación para mezclar muy suavemente durante 5
30. Llenar un nuevo frasco de tinción de portaobjetos situado en una campana de humos con pre-calentado tampón de lavado 2. Colocar una
31. Transferencia de todas las diapositivas a la jarra de tinción de portaobjetos con tampón de lavado 2 y Incubar los portaobjetos durante 1 min
32. Incubar los portaobjetos en diapositiva cubeta de tinción que contiene acetonitrilo durante 1 min con agitación suave.
33. Colocar los portaobjetos en tinción de diapositivas frasco llenan con la estabilización y la solución de secado. Mezclar suavemente la
34. suavemente y poco a poco eliminar diapositivas junto con la parrilla corrediza para minimizar cualquier gotitas en las diapositivas. Genética Molecular
clínicos
9.25.7
de señal.
36. Antes de iniciar la exploración, gire en el escáner de micromatrices de alta resolución (en general, un escáner requiere 15
min para inicializar su programa).
Siga las instrucciones del fabricante para los detalles operativos completos para el escáner de micromatrices de alta
resolución de Agilent.
37. Después de escanear la diapositiva array, una característica extrajo fi l se genera para el análisis utilizando CytoSure Interpretar
software. Siga las instrucciones del software CytoSure Interpretar V4.1.9 del fabricante para obtener más información por
etapas sobre cómo utilizar el software para análisis de datos y la detección de la CNV.
38. La intensidad de la hibridación relativa es proporcional al número de copias relativo de las regiones de destino. Estas
intensidades de hibridación relativas se miden y normalizado para determinar las variaciones del número de copias en la
muestra del paciente. Disminución de la intensidad se considera generalmente como la supresión y aumento de la
intensidad se considera como la duplicación en el genoma del paciente. Una duplicación de copia única se indica
mediante una sonda / sondas que tienen una relación log2 de> 0,3, mientras que una copia única deleción tiene una
relación de log2 de> -0.6. El software CytoSure Interpretar se aproximará el número de copias por dividir el cambio ratios
de registro por el umbral adecuado. Ver Figuras 9.25.2 y 9.25.3.
Protocolo SANGER secuenciación de todo DMD Región que codifica para detectar mutaciones POINT
básico 2
DMD, que se extiende 2200 Kb, es el mayor gen identi fi ed en el genoma humano y se compone de 79 exones. secuenciación
Sanger de productos amplificado por objetivos de PCR convencionales los 79 exones junto con límites intrón-exón para las
mutaciones en sitios de empalme. cebadores Exonspeci fi c se utilizan para amplificar cada uno de los 79 exones. También
dirigidos son la fi c región promotora musclespeci y mutaciones intrónicas conocidos. Tabla 9.25.2 enumera un conjunto
completo de cebadores que han sido clínicamente validados y optimizados para el rendimiento. Para facilitar el uso de
cebadores universales para la secuenciación de ciclo, M13 hacia delante y M13 inverso etiquetas de secuencia se añaden a
cada cebador directo e inverso, respectivamente.
materiales
DMD exón-específico cebador directo (5 μ M) (requerida para los 79 exones) DMD fi cebador c
inverso exón-específico (5 μ M) (requerida para los 79 exones) de ADN de paciente DMD (25 ng / μ l)
10 × tampón de PCR con MgCl 2 ( Roche) mM dNTPs 10 (Roche) Faststart Taq ADN polimerasa
(Roche) 2% de gel de agarosa
BigDye Terminator kit de secuenciación de ciclo v3.1 (Life Technologies) que contiene:
5 × El tampón de secuenciación
9.25.8
1. Preparar 5 μ soluciones de trabajo Mprimer para cada uno de los cebadores directo e inverso.
Todo DMD exón-específico, conocido variantes especí intrónicas fi c, y musculares cebadores promotor específico c se enumeran
en la Tabla 9.25.2.
2. Antes de comenzar PCR, medir la concentración de ADN con un espectrofotómetro Nanodrop. Diluir la muestra
de ADN para obtener una concentración final de 25 ng / μ l.
3. Preparar la mezcla de PCR maestro combinando los siguientes para cada reacción (preparar suficiente mezcla maestra para
4. Dispensar 46 μ l de mezcla maestra de PCR a cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR.
6. Colocar la placa de PCR en el termociclador y llevar a cabo el siguiente programa de ciclo de ampli fi cación PCR:
1 minuto 64 ° C (recocido)
75 sec 72 ° C (extensión)
1 ciclo de: 10 minutos 72 ° C (extensión).
8. Transferir el volumen total de cada producto de la reacción de PCR en cada pocillo de una MultiScreen HTS PCR
puri fi placa de cationes utilizando una pipeta multicanal.
9. Coloque el MultiScreen cargado HTS placa de PCR en la parte superior del vacío MultiScreen
colector.
10. Aplicar vacío a 25 pulg. De Hg durante 5 minutos o hasta que todo el líquido ha filtra fi.
11. Retirar la placa de colector y reconstituir la muestra purificó mediante la adición de 50 μ l de agua destilada
a cada pocillo.
12. muestras mezclar completamente en un mezclador de placas durante 10 min. La transferencia de los productos final purificado de PCR en
13. Comprobar todas purifica la calidad del producto de PCR y tamaño mediante la ejecución de 5 μ l de cada muestra en Genética Molecular
clínicos
un gel de agarosa al 2%.
9.25.9
14. Preparar ciclo de secuenciación mezcla maestra de PCR mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción (preparar una mezcla
maestra de PCR su fi ciente para la secuenciación de todos los productos de PCR obtenidos):
15. Pipetear 8 μ l de la secuenciación del ciclo de mezcla maestra a cada pocillo de la placa de 96 pocillos PCR.
16. Añadir 2 μ l de cada purificado producto de PCR en cada reacción de PCR bien en el de 96 pocillos
placa de PCR. Sellar la placa PCR herméticamente y girar 30 seg para recoger todos los contenidos en la parte inferior del pozo.
17. Coloque la placa de PCR en el termociclador y realizar el siguiente programa de ciclo de ampli fi cación
PCR:
24 ciclos: 10 sec 96 ° do
5 sec 50 ° do
4 min 60 ° DO.
Antes de cargar las muestras en el secuenciador capilar, el exceso de cebadores y dNTPs se deben retirar de la reacción de
secuenciación mediante el uso de Edge de PCR de 96 pocillos Performa Versión placas fi cación 3 puri.
18. Transferencia 10 μ l de cada reacción de secuenciación a cada pocillo de la Edge PCR de 96 pocillos
Performa Versión placas fi cación 3 de Puri.
Cargar la muestra en el centro del pozo sin tocar los pocillos con las puntas de pipeta.
19. Colocar una placa de 96 pocillos de purificación cargado sobre una nueva placa de recolección y colocar las placas intercaladas en
20. Añadir 40 μ l de solución de melatonina para cada fi ed muestra de secuenciación de ciclo puri.
21. Cubrir los pocillos con un tabique. Vórtice brevemente y de girar todo el contenido 30 seg.
22. Ejecutar las reacciones de secuenciación en un secuenciador ABI 3730, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Analizar datos
23. Importar secuencia de muestras fi les (formato ABI) y una secuencia de referencia fi le, DMD.NM_004006.2
(GBK fi l de NCBI), y se alinean las secuencias utilizando el software Mutación Surveyor. Después de análisis
de datos, crear un informe mutación que contiene las variantes detectadas (Fig. 9.25.4).
Consulte el manual del fabricante para obtener detalles completos de análisis de datos (http: // www
. softgenetics.com/MutationSurveyor_UsersManual.pdf).
Molecular
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
09.25.10
APUNTADO PRÓXIMA GENERACIÓN DE SECUENCIACIÓN DMD Utilizando sondas LOCKDOWN IDT Protocolo básico
xGen 3
Desde su introducción hace casi una década, NGS tiene revolutionizedmolecular diagnóstico de trastornos genéticos. En
contraste con la secuenciación de amplicón individual por el método de Sanger, NGS permite la secuenciación paralela de
múltiples amplicones de interés. La tecnología en constante avance de enriquecimiento de destino y la química de secuenciación
proporciona aumento de la sensibilidad para la detección de la variante y la disminución de coste al permitir el interrogatorio
paralelo de no uno, sino varios genes. la secuenciación simultánea de múltiples genes, todos los cuales están asociados con un
único trastorno genéticamente heterogéneo se conoce como prueba de panel. Este protocolo describe la detección de
mutaciones puntuales en el DMD gen usando sondas de encierro Xgen, una biblioteca de enriquecimiento de diseño
personalizado por y comprado de Tecnologías de ADN integrado (IDT). Xgen sondas de encierro para la secuenciación de
próxima generación específica se sintetizan individualmente oligonucleótidos que son complementarios a la región genómica de
interés. Las sondas se biotina etiquetados para permitir la captura por estreptavidina perlas después de la hibridación. Las sondas
para los genes especí fi cos de interés pueden ser diseñados y adquiridos directamente de IDT. La biblioteca de enriquecimiento
de destino utilizado aquí se orienta al 50 genes de enfermedades neuromusculares incluyendo DMD. Se seleccionaron estos
genes basado en la revisión exhaustiva de las pruebas para la asociación con una enfermedad neuromuscular. Sobre la base de
requisición de prueba, ya sea un solo gen (tal como DMD) o un conjunto de genes se puede analizar usando este protocolo.
Actualmente, el ensayo basado en NGS para el diagnóstico DMD es aplicable para la detección de mutaciones puntuales o
variantes de la secuencia (SVS) solo.
materiales
muestras de ADN
Genética Molecular
escalera de ADN
clínicos
BIOO Cientí adaptadores fi c y el cebador kit Mix contiene:
09.25.11
Espectrofotómetro (NanoDrop)
Covaris E serie de ultrasonidos (Covaris) conectada a un ordenador con SonoLab
software
Covaris microtubos y soporte de tubo (Covaris)
tubos LoBind de 1,5 ml (Eppendorf)
Microcentrífuga
chips de alta sensibilidad Bioanalyzer (Agilent) 2100
Bioanalyzer (Agilent)
SPRI-TE Acid Extractor nucleico (Beckman Coulter) SPRIworks Card
Método Illumina (Beckman Coulter) SPRIworks 2,0 ml tubos (Beckman
Coulter) SPRIworks Reactivo cartucho (Beckman Coulter) SPRIworks
tubos adaptadores (Beckman Coulter) SPRIworks puntas de
perforación (Beckman Coulter) SPRIworks 1 consejos -ML (Beckman
Coulter) dynamag soporte magnético (Life Technologies) placas
HardShell PCR tapas (Biorad) Snap (Biorad) centrífuga con rotor placa
cicladores térmicos (Biorad T-100) qubit fl uorometer (Life
Technologies) Vacufuge Papel de aluminio Vortexer 47 ° C incubadora
(SciGene, Fisher) HiSeq2500 (Illumina)
Molecular
Diagnosis de
Distrofia NextGENe v2.3.4 software (SoftGenetics LLC)
muscular de
Duchenne
09.25.12
Por conveniencia en general, siempre que sea aplicable, preparación de la muestra puede ser reunidos en grupos de nueve
muestras. Dos lotes de (9 + 9) Las muestras se pueden preparar de forma simultánea, como 18 muestras se llenar celular ow uno fl
de la HiSeq2500.
2. Encienda la serie de ultrasonidos Covaris E y el ordenador conectado. Llenar el depósito de agua con agua
desionizada.
3. Encienda el botón de desgasificación y allowwater para desgasificar durante 45 minutos. Establecer la temperatura más fría unido a 1.5 ° DO.
4. Colocar los tubos micro Covaris en la estación de carga y suavemente transferir cada 50- μ l
muestra de ADN en micro tubos Covaris separadas.
5. Colocar cada tubo micro cargado en el soporte del tubo y cizallar el DNAwith los siguientes ajustes en el software
SonoLab (el pico de destino para el tamaño de par base es 170 a 275 pb):
9. Colocar el chip preparada en el 2100 Bioanalyzer y ejecutar dentro de 5 min después de la preparación para comprobar el
tamaño de fragmentos de ADN cizallados.
preparar la biblioteca
Cuatro importantes pasos de preparación de la biblioteca, como la reparación final, la adición de Como, ligadura de
adaptador y selección del tamaño se pueden realizar mediante el uso de SPRIworks robot de Beckman Coulter. Usando el
robot SPRIworks (SPRI-TENucleicAcidExtractor) es muy conveniente y elimina varios pasos de procesamiento manual en la
preparación de la biblioteca. El SPRIworks Card Método Illumina se requiere para operar el robot SPRIworks.
12. Preparar tubos de adaptador mediante la adición de lo siguiente en un nuevo tubo adaptador SPRIworks marcados: 2 μ l BIOO la
09.25.13
13. Encienda SPRIworks de ácido nucleico Extractor y asegúrese de que la tarjeta Método Illumina SPRIworks está en
la máquina.
14. Retire el soporte del cartucho de reactivo y el tubo y la cremallera punta de la máquina SPRIworks y el lugar en la
mesa de trabajo.
15. Añadir cartuchos de reactivos SPRIworks al soporte de cartucho. Colocar el tubo de la muestra correspondiente en el
cartucho de reactivo SPRIworks.
Presiona hacia abajo el cartucho de reactivos SPRIworks para eliminar cualquier burbuja de aire en las soluciones. Cada tubo de
muestra debe contener un volumen total de 150 μ l esquilada de ADN.
16. Añadir consejos y tubos en el siguiente orden en el bastidor tubo SPRIworks y la punta. Fila 1: SPRIworks puntas de
perforación Fila 2: SPRIworks 1 ml Recomendaciones Fila 3: SPRIworks consejos de fila 1 ml 4: Tubos SPRIworks
adaptador
Fila 5: tubos etiquetados SPRIworks vacíos 2,0 ml para recoger salida nal fi.
Asegúrese de que la orden de tubo de muestra en el cartucho de reactivos coincide con los tubos de salida nal fi en la fila 5 de tubo y la
cremallera punta.
17. Coloque el soporte del cartucho de reactivo SPRIworks y bastidor de tubo y la punta en la máquina SPRIworks.
Cierre la puerta y encender el botón de inicio.
La máquina ahora realizar la reparación final, la adición de una bases, la ligadura de adaptador, y selección de tamaño en 5 hr.
18. Después de la terminación de la carrera, retire los tubos fi de salida final de la fila 5 de tubo y la punta de cremallera y coloque
sobre el soporte magnético Dynamag. Permitir que repose durante 5 min en el soporte magnético y transferir la solución de
muestra clara en nuevos tubos LoBind 1,5 ml etiquetados. Descarte cualquier perlas residuales que quedan en el fondo de
los tubos de salida de la final.
Amplificar la biblioteca
19. Preparar mezcla maestra mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción. 8 μ l de agua
de calidad de HPLC 25 μ l 2 × KAPA HiFi HotStart ReadyMix 2 μ l BIOO la Ciencia Primer Mix.
placa 21. Place PCR en un ciclador térmico y realizar el siguiente programa de ciclos ampli catión PCR fi:
30 segundos 60 ° C (recocido)
30 segundos 72 ° C (extensión)
1 ciclo de: 60 sec 72 ° C (extensión).
Molecular
Diagnosis de
Purificar ampli fi muestra biblioteca ed
Distrofia
muscular de 22. Mezclar suavemente la botella Cuentas Ampure y añadir 90 μ l de los granos del Ampure a cada
Duchenne
ampli muestra biblioteca fi ed bien en la placa de PCR.
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24. Colocar los tubos de muestra sobre la placa magnética y esperar a 2 min. Retirar y desechar la solución de
aclarado a partir de perlas.
25. Añadir 200 μ l recién preparada 70% de etanol a cada muestra de cordón e incubar 30 sec
a temperatura ambiente. Retirar y desechar el etanol. Repetir el lavado con etanol una vez adicional.
26. perlas secas de 5 min a temperatura ambiente (perlas deben pasar de un aspecto brillante a un aspecto
mate).
27. Quitar los tubos de la placa magnética y añadir 32 μ l bajo TE tampón. Mezclar con la pipeta
arriba y hacia abajo y se incuba durante 3 min a temperatura ambiente.
placa 28. Resto en la placa magnética durante 1 min y transferir cada 30 μ solución de muestra clara l
a un nuevo tubo de 1 ml.
30. Preparar chip de Bioanalyzer de alta sensibilidad con 1 μ l de muestra diluida y DNA
escalera.
31. Place el chip preparada en el 2100 Bioanalyzer y ejecutar dentro de 5 min después de la preparación.
Asegúrese de usar la muestra diluida anteriormente para el paso fi cación en la cuanti fi urometer Qubit.
realizar la hibridación
33. Piscina un total de nueve amplificadores muestras biblioteca fi ed juntos en un nuevo tubo de LoBind 1,5-ml. Mientras que la
agrupación de las nueve muestras, asegúrese de incluir 222 ng de cada muestra de ADN.
A partir de este paso, el proceso de todo agruparon (nueve) muestras como una única muestra en un tubo.
35. Ajustar el volumen final de la muestra a 100 μ l con agua de grado HPLC y mezclar suavemente
los contenidos.
38. Mezclar suavemente el contenido y el tubo de centrifugado brevemente. Incubar la muestra 10 min a temperatura ambiente. Genética Molecular
clínicos
09.25.15
39. Transferencia de las muestras a una placa de PCR rígido y Cubrir la placa con una tapa a presión.
41. girar rápidamente hacia abajo la placa de PCR y la transferencia de la placa a otra ciclador térmico a 47 ° C. Ajuste la
temperatura tapa en 57 ° DO.
42. Agregar 4 μ l xGen mezcla de sondas de bloqueo y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo.
Evitar burbujas de aire mientras se mezcla.
43. Cierre la placa de PCR con los casquillos de resorte frescos y cubrir con papel de aluminio para evitar la evaporación.
45. AllowDynabeads M-270 Streptavidin se equilibren a temperatura ambiente durante 30 min antes de usar.
En alrededor de al menos 2 h antes de los extremos etapa de hibridación de 24 horas, comenzar preparingDynabeads.
46. Mezclar suavemente las perlas mediante agitación en vórtex y dispensar 100 μ l de Dynabeads M-270
Estreptavidina a un nuevo tubo LoBind 1,5-ml.
47. Colocar el tubo en un soporte magnético Dynamag y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire
suavemente y descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el
tubo.
48. Añadir 200 μ l de 1 × Bead tampón de lavado y se mezcla suavemente la solución de perlas.
Nimblegen proporciona un 2,5 × BeadWash Buffer, que debe ser diluido a 1 × con agua HPLCgrade. Preparar un total de
300 μ l de 1 × tampón de lavado de talón que se requiere para el lavado de perlas.
49. Colocar el tubo en un soporte magnético Dynamag y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire
suavemente y descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el
tubo.
50. Repetir esta etapa de lavado una vez adicional. Añadir 100 μ l de 1 × Bead tampón de lavado y
resuspender las perlas completamente.
51. Transferencia 100 μ l de perlas resuspendidas en un nuevo tubo de 1,5 ml LoBind para cada
reacción.
52. Colocar el tubo en un soporte magnético Dynamag y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire
suavemente y descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el
tubo.
53. Transferencia de la muestra de hibridación de la placa rígida al tubo que contiene preparado DynabeadsM-270
estreptavidina. Mezclar completamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
El volumen de la muestra de hibridación debe ser 17 μ l. Si este volumen reduce significativamente debido a la evaporación,
la hibridación e fi ciencia puede verse comprometida.
54. Incubar el tubo 45 min en un 47 ° C incubadora (SciGene) para unir el ADN completamente a
Molecular
las perlas. Suavemente tubo de vórtice durante 3 segundos cada 15 minutos durante la incubación.
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
09.25.16
56. Colocar el tubo en un soporte magnético y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire suavemente
y descartar la solución sobrenadante claro, asegurando que todos los granos permanecen en el tubo.
57. Añadir 200 μ l de 1 × Tampón de lavado astringente y mezclar suavemente. Incubar tubo 5 min a
47 ° DO.
58. Colocar el tubo en un soporte magnético y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire suavemente y
descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el tubo.
59. Repetir un lavado adicional con 1 × Tampón de lavado astringente y desechar la clara
solución sobrenadante.
60. Añadir 200 μ l de temperatura ambiente 1 × Tampón de lavado I y suavemente de vórtice durante 2 min.
61. Colocar el tubo en un soporte magnético y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire suavemente y
descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el tubo.
62. Añadir 200 μ l de temperatura ambiente 1 × Tampón de lavado II y suavemente vórtice 1 min.
63. Colocar el tubo en un soporte magnético y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire suavemente y
descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el tubo.
64. Añadir 200 μ l de temperatura ambiente 1 × Tampón de lavado III y suavemente vórtice 30 seg.
65. Colocar el tubo en un soporte magnético y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire suavemente y
descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el tubo.
66. Retire el tubo de soporte magnético y añadir 50 μ l de NaOH 0,125 N. pipetear hacia arriba
y abajo para mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente. vórtice suavemente cada 2 min para mantener las
perlas en la solución.
67. Colocar el tubo en un soporte magnético durante 1 min. Permitir que los granos se separen del sobrenadante.
Transferir el sobrenadante claro a un nuevo tubo que contiene 50 μ l de 1 M Tris · Cl, pH 8,8, para neutralizar la
solución.
68. Añadir 150 μ l de los granos del Ampure a muestra. Mezclar la muestra completamente la pipeta hacia arriba
y abajo diez veces. Dejar que la muestra mixta a reposar por 5 min a temperatura ambiente.
69. Coloque los tubos de muestra sobre el soporte magnético y esperar 2 minutos. Retirar y desechar la solución de aclarado a partir de
perlas.
70. Añadir 1 ml de etanol recién preparada 70% a cada muestra de perlas y se incuba 30 segundos a temperatura
ambiente. Retire y deseche el etanol. Repetir el lavado con etanol una vez adicional.
71. Se secan las perlas de 5 min a temperatura ambiente y eliminar tubos placa frommagnetic y añadir 32 μ l de tampón de baja
TE. Mezclar suavemente y se incuba 3 min a temperatura ambiente.
Genética Molecular
clínicos
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73. Preparar mezcla maestra mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción: 5 μ agua de
grado HPLC l 25 μ l KAPA HiFi Mix HotStart Ready
74. Añadir 35 μ l de mezcla maestra y 15 μ l de muestra capturada a la nueva placa de PCR rígido
y sellar la placa con los casquillos de SNAP.
75. Colocar la placa de PCR en el termociclador y realizar el siguiente programa de amplificación fi PCR:
30 segundos 60 ° C (recocido)
30 segundos 72 ° C (extensión)
1 ciclo de: 60 sec 72 ° C (extensión).
76. Añadir 75 μ l de los granos del Ampure a la muestra bien en la placa de PCR. Mezclar bien la muestra
pipeteando arriba y abajo diez veces. Dejar que la muestra mixta a reposar por 5 min a temperatura ambiente.
77. Colocar los tubos de muestra a la placa magnética y esperar 2 min. Retirar y desechar la solución de aclarado a partir
de perlas.
78. Añadir 200 μ l de recién preparada de etanol al 70% a cada muestra de perlas e incubar
30 seg a temperatura ambiente. Retire y deseche el etanol. Repetir el lavado con etanol una vez
adicional.
79. Secar las perlas durante 5 min a temperatura ambiente. Retire la placa frommagnetic tubos y añadir 22 μ l de 1 × tampón
TE. Mezclar suavemente y se incuba durante 3 min.
80. Resto de la placa en una placa magnética para 1 min y transferencia 20 μ solución de muestra clara l
a un nuevo tubo.
82. Preparar chip de Bioanalyzer de alta sensibilidad con 1 μ l de muestra diluida y DNA
escalera.
83. Place el chip preparada en el 2100 Bioanalyzer y ejecutar dentro de 5 min después de la preparación.
Molecular 84. Medir la concentración de cada muestra usando un fl uorometer Qubit. Asegúrese de utilizar la misma muestra
Diagnosis de
diluida como anteriormente para la cuanti fi cación de cada muestra en la fi urometer Qubit. Diluir la muestra
Distrofia
muscular de para obtener una concentración final de 10 nM con agua grado HPLC.
Duchenne
09.25.18
85. dos lotes de muestras combinadas (9 + 9, total de 18 muestras) se puede secuenciar juntos en una celda de
flujo de la HiSeq2500.
86. Agregar la siguiente en un nuevo tubo etiquetado para obtener 2 nM de muestra agrupada: 10 μ l 10 nM diluyó
la muestra de un lote agrupado (9 muestras combinadas) 10 μ l 10 nM diluyó la muestra de segundo lote
agrupado (9 muestras combinadas) 80 μ l de agua de grado HPLC.
88. Añadir 980 μ l de tampón HT1 frío para detener la reacción de desnaturalización. Guarde este 20 pM
muestra en hielo.
89. Añadir 375 μ l de 20 pM muestra combinada y 615 μ l de tampón HT1 a una nueva etiqueta
tubo para obtener 19:05 fi muestra combinada nal.
90. Añadir 10 μ l de 20:00 solución de control Illumina PhiX a la fi muestra combinada nal a
obtener el volumen final de 1000 μ l. Vortex y centrifugado brevemente.
El control PhiX es una biblioteca de adaptador se ligó usado como control para los funcionamientos de secuenciación. Se utiliza como un
Genética Molecular
control de la hora de solucionar los problemas de alineación y problemas de generación de clúster.
clínicos
09.25.19
92. Después de calentar y etapa de enfriamiento, cargar inmediatamente la fi muestra biblioteca nal en la máquina
HiSeq2500 e inicio de la secuenciación.
93. Siga las instrucciones del fabricante para las pautas de funcionamiento de la máquina HiSeq2500.
Analizar datos
94. Obtención de archivos RAW desde el secuenciador y procesarlos para eliminar las lecturas duplicadas.
95. Uso NextGENe v2.3.4 software para alinear la secuencia lee en contra de la secuencia de referencia.
96. Usando el software NextGENe, crear un informe mutación que contiene las variantes detectadas (Fig. 9.25.5).
Reactivos y soluciones
Use agua desionizada, destilada en todas las recetas y los pasos de protocolo. Para soluciones madre comunes, consulte
2D APÉNDICE ; Para proveedores, consulte PROVEEDORES APÉNDICE .
tampón de bloqueo, 10 ×
Información de Antecedentes
09.25.20
09.25.21
Tabla 9.25.1 Log2 ratios esperados para la interpretación de los resultados CGH-array
Duplicación heterocigóticos 1
Duplicación homocigotos 1
Molecular
Diagnosis de Ninguna femenino normal 0
Distrofia
muscular de una deleciones hemizygous en los machos y deleciones homocigóticas en las hembras tienen una relación de log2 resultante de infinito en el lado negativo. Esto se debe a
Duchenne
log2 (0) es el infinito.
09.25.22
continuado
09.25.23
continuado
09.25.24
continuado
09.25.25
continuado
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una Primer secuencias fueron proporcionados por Emory Laboratorio de Genética de la Universidad de Emory, Atlanta, Georgia. Cebadores incluyen etiquetas M13 para la comodidad de la secuenciación de los productos
de ampli fi cados. secuencia de M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT; secuencia M13R: CAGGAAACAGCTATGACC. Muscle específica
DMD promotor y ciertas regiones intrónicas (para detectar variantes intrónicas conocidos) también se analizan como parte de la prueba secuenciación fi c gen-específico.
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pueden ser detectados por CGH-array y necesitan cariotipo o análisis de 14: 116.
bandeo G. En raras ocasiones, debido tomisbehaving o sondas no óptima Beggs, AH, Koenig, M., Boyce, FM, y Kunkel,
de hibridación, se pueden observar falsos positivos hallazgos de la CNV. De LM 1990. La detección de 98% de DMD / BMD deleciones de genes
por reacción en cadena de la polimerasa.
las diferentes variantes de secuencia o mutaciones puntuales detectado por
Tararear. Gineta. 86: 45-48. Chin, EL, da Silva, C., y Hegde,
secuenciación de Sanger y dirigido ensayo basado en NGS, mutaciones sin
Molecular M. 2013. As-
sentido comprenden la mayoría, mientras que otras mutaciones que truncan
Diagnosis de sessment de sensibilidad analítica clínica y la especificidad de la
Distrofia como frameshift causando inserciones, deleciones, o indeles vienen a
secuenciación de próxima generación para de- tección de
muscular de continuación. Los hombres con una copia de la X cromo- translocaciones mutaciones simples y complejos. BMC Genet. 14: 6.
Duchenne
cromosómicas no pueden ser detectados por CGH-array y necesitan cariotipo o análisis de bandeo G. En raras ocasiones, debido tomisbehaving o sondas no óptima de hibridación, se pueden observa
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