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Detección de proteínas expresadas a través Emisión: 01/01/2000

de Western blotting Actualización: 01/01/2000

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Sección Biotecnología IT-752-00.000

1. OBJETIVO

Detectar la presencia de proteínas específicas, de interés, en una muestra determinada mediante el uso
de anticuerpos.

2. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

2.1 Materiales
2.1.1 Membrana de PDFV.
2.1.2 Cámara de electroforesis PAGE.
2.1.3 Micropipetas de uso para Cultivo celular y/o de ELISA de 20, 200 y 1000 µL.
2.1.4 Puntas estériles de 20, 200 y 1000 µL.
2.1.5 Casatte de transferencia.
2.1.6 Pinzas.
2.1.7 Esponjas.
2.1.8 Papel filtro.

2.2 Insumos
2.2.1 Tris-base.
2.2.2 Glicina.
2.2.3 SDS.
2.2.4 Metanol 99.9%.
2.2.5 PBS 1X (PBS = Buffer Fosfato Salino).
2.2.6 Tween 20.
2.2.7 Leche descremada en polvo.
2.2.8 Buffer de transferencia (1 Litro): Tris-base 5.82 g + 2.94 g Glicina + 7.5 mL SDS 10% + 200 mL
Metanol 99.9% + aforar a 1 L con agua destilada y desionizada. Almacenar a 4°C.
2.2.9 Solución de lavado: PBS 1X + Tween 20 al 0,1%. Almacenar a 4°C.
2.2.10 Solución de bloqueo: PBS 1X + Leche al 5% + Tween 20 al 0.1%. Almacenar a 4°C.
2.2.11 Solución con anticuerpos: anticuerpo primario o secundario + PBS 1X + Leche al 3% + Tween
20 al 0.1%. Almacenar a 4°C.
2.2.12 Rojo Ponceau. Almacenar a T° ambiente, envuelto en papel aluminio (para evitar la luz).

2.3 Equipos
2.3.1 Cámara de transferencia o de electroforesis.
2.3.2 Fuente de poder.

3. DESARROLLO

Antes de comenzar con el procedimiento, limpiar y desinfectar con etanol 70% superficies de mesones y
equipos en el cual va a operar.

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3.1 Se realizará una electroforesis en gel SDS-PAGE.

3.2 Activar la membrana de PDFV sumergiéndola en Metanol 99.9% por 20 segundos, luego retirar la
membrana del metanol y sumergirla en Agua destilada-desionizada (purificada) por 2 minutos, luego
retirar la membrana del agua y sumergirla en Buffer de transferencia por 3 minutos.
3.3 Una vez terminadas las electroforesis, las proteínas de los geles SDS-PAGE serán transferidas a
membranas de PDFV, mediante el uso del cassette de transferencia y la cámara de transferencia, en
buffer de transferencia durante 1 hora a una intensidad de corriente constante de 200 mA.
3.4 Posterior a la transferencia, la membrana PDFV puede ser sumergida en Rojo Ponceau por 5 - 10
minutos para detectar una correcta transferencia de proteínas. En caso de realizar este paso, se
debe retirar el Rojo Ponceau (reutilizable) y lavar la membrana PDFV con agua destilada hasta
visualizar las proteínas.
3.5 Posteriormente la membrana PDFV será bloqueada con solución de bloqueo (PBS 1X + Leche 5% +
Tween 20 0.1%) durante toda la noche a 4°C.
3.6 Al día siguiente, se realizarán 4 lavados de la membrana de PDFV transferida y bloqueada con
solución de lavado (PBX 1X + Tween 20 0.1%) durante 15 minutos en agitación.
3.7 Luego se incubará la membrana PDFV con el anticuerpo primario (ver anexo para más detalles) con
solución PBS 1X-Leche 3%-Tween 20 0.1% durante 2 horas a temperatura ambiente con leve
agitación.
3.8 Transcurrido el tiempo de incubación del anticuerpo primario, se deberán realizar 4 lavados de la
membrana de PDFV con solución de lavado (PBX 1X + Tween 20 0.1%) durante 15 minutos en
agitación.
3.9 Luego se incubará la membrana PDFV con el anticuerpo secundario (ver anexo para más detalles)
con solución PBS 1X-Leche 3%-Tween 20 0.1% durante 1 hora a temperatura ambiente con leve
agitación.
3.10 Transcurrido el tiempo de incubación del anticuerpo secundario, se deberán realizar 6 lavados de la
membrana de PDFV con solución de lavado (PBX 1X + Tween 20 0.1%) durante 15 minutos en
agitación.
3.11 Luego se realizará un lavado final de la membrana PDFV con PBS 1X durante 15 minutos en
agitación.
3.12 Finalmente se aplicará la solución de revelado “Novex ECL, HRP Chemiluminescent kit”, la cual
consiste en generar una solución con 1 mL del reactivo A (del kit citado) y 1 mL del reactivo B (del kit
citado), homogenizar y luego se aplicará esta solución sobre la membrana PDFV en la oscuridad.
3.13 Llevar al fotodocumentar para revelar la imagen, digitalizar la imagen revelada.

Anexo

1) Si el anticuerpo primario corresponde al anticuerpo policlonal Anti-SIP generado desde el suero de

conejo, debe ser disuelto en la solución de anticuerpo en una concentración de 1:1000.
2) Si el anticuerpo primario corresponde al anticuerpo monoclonal Anti-HIS generado desde ratón, debe
ser disuelto en la solución de anticuerpo en una concentración de 1:5000.
3) Si se utilizará un anticuerpo primario generado de suero de conejo, se deberá utilizar un anticuerpo
secundario “Anti-rabbit” conjugado con la enzima HRP, disuelto en una solución de anticuerpo en una

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concentración 1:5000. En el caso de utilizar un anticuerpo secundario generado de suero de ratón,

se deberá utilizar un anticuerpo secundario “Anti-mouse” conjugado con la enzima HRP, disuelto en
solución de anticuerpo en una concentración de 1:5000.

4. CONTROL DE REGISTRO

Almacenamiento Nivel de criticidad

Confidencialida Integrida
Identificació Tiempo Medio
Lugar / Disposició d d
Disponibilida Protecció
n de de n d n
Recuperación Responsabl (Reservada / (Alta /
retenció soport (Alta /
e Uso Interno / Media /
n e Media / Baja)
Publica) Baja)

5. CONTROL DE CAMBIOS

Versión modificada
Fecha de modificación
Numeral modificado Descripción general de cambios

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