Vous êtes sur la page 1sur 66

POPULATION D ’ADN COMPLEXE

- ADN génomique
ou
- copie d ’ARNm = CDNA

Amplification spécifique Détection spécifique

Clonage dans Amplification in vitro


Hybridation moléculaire
des vecteurs PCR

- vecteur - polymérase - Sonde ADN ou ARN


- lier le fragment thermostable marquée
d ’ADN au vecteur -information sur la
- transfert dans séquence permettant
l’hôte de générer des amorces
d’amplification
LE CLONAGE
I - Propriétés des vecteurs de clonage
•capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée
(origine de réplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique)

•possèdent un polylinker ou site multiple de clonage


Molecular Cell Biology

Molecular Cell Biology


•Possèdent des propriétés permettant la sélection de la cellule hôte (résistance ATB)
•supportent l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand
II – Principes généraux d’utilisation d’un vecteur

- Préparation du vecteur

- Préparation de l’ADN à insérer

- Réalisation d’un recombinant

- Incorporation à l’hôte
Obtention de l’ADN recombinant

+ traitement
PAL

An Introduction to Genetic Analysis


La ligation (ligature...)

Une enzyme, la ligase,


est capable
de lier de façon
covalente
deux molécules d’ADN
en une.
Molecular Cell Biology
Différents vecteurs de clonage
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut
être cloné dans chaque vecteur

Type de vecteur ADN cloné en kb


Plasmide 10
Phage lambda 25
Cosmide 45
Phage P1 100
BAC(bacterial artificial chromosome) 300
YA C (yeast artificial chromosome) 1000
Les plasmides comme vecteurs de clonage (1)
Molécule d’ADN de taille réduite, d'origine bactérienne
Molécule d’ADN circulaire – taille 2kb à 5kb
Peut accepter jusqu’à 10kb d’ADN exogène
Peut être considérée comme un minichromosome capable de
réplication autonome
Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques=
sélection

Molecular Cell Biology


Les plasmides comme vecteur de clonage (2)
II – Principes généraux d’utilisation d’un vecteur

Définition
- Préparation du vecteur
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides
- Préparation le composant.
de l’ADN à insérer
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
- Réalisation
laboratoires d’un recombinant
de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
- Incorporation à l’hôte
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes
De type procaryotique
(bactéries):
Cas d’un vecteur plasmidique:
l’ADN est introduit dans les
bactéries traitées spécialement
le plus souvent par choc
thermique ou par choc électroporateur
électrique.
Identification des clones intéressants
Dans ce cas les bactéries transformées avec le vecteur ne
possédant pas ou possédant l’insert sont sélectionnées --> un
criblage est nécessaire

Molecular Cell Biology


pBR322

Criblage des
clones
intéressants (3)

AmpR AmpR
TetR TetS
Clone intéressant
Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Criblage -screening- des clones intéressants (2)
Test blanc-bleu (α−complémentation)

An Introduction to Genetic Analysis


III - Différents vecteurs de
clonage
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut
être cloné dans chaque vecteur

Type de vecteur ADN cloné en kb


Plasmide 10
Phage lambda 25
Cosmide 45
Phage P1 100
BAC(bacterial artificial chromosome) 300
YA C (yeast artificial chromosome) 1000
Chromosomes artificiels
Fragments de 400 kb
Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
Cosmides
succession des nucléotides le composant. Fragments de 40 kb
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Plasmides
Fragments
Cette technique utilise les connaissances qui ont été de 4 kb
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN. Séquençage
• Les différents vecteurs de clonage :
Définition
– Plasmide bactérien ( 3-4 kb )
– Le séquençage
Phage λ ( 9-22 dekbl’ADN,
) est la détermination de la
– Cosmide
succession( ≈des
45 nucléotides
kb ) le composant.
– PAC
C’est: aujourd'hui
P1-deriveduneArtificial
techniqueChromosome ( 75-95
de routine pour les kb )
– BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350 kb )
laboratoires de biologie.
– YAC : Yeast Artificial Chromosome ( 300-500 kb )
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Préparation pour le séquençage : exemple de
l’organisation des BAC en contigs
Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
les BAC sont ordonnés par les
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
STSs
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Définition BAC
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
Bacterial
C’est Artificial
aujourd'hui Chromosome
une technique :capacité
de routine pour les de
laboratoires de biologie.clonage 100 kb
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
• Structure du BAC :
– oriS : origine de réplication
Clonage de séquences
– repE : maintien du nombre de
plasmides à 1 ou 2 par
cellule.
Définition
– parA, parB : stabilité du
plasmide, incompatibilité
Le séquençage de l’ADN,avecest la détermination de la
les autres facteurs F.
– CMR : gène
succession des denucléotides
résistance au le composant.
chloramphénicol.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
– Site de clonage
laboratoires dans le gène
de biologie.
LacZ.
Cette
– T7technique utilise lesforts
et SP6 : promoteurs connaissances qui ont été
de bactériophage.
acquises
– NotI, depuis
HindIII,une
BamHItrentaine
: site d'années sur les
de reconnaissance des
mécanismes de la réplication de l'ADN.
endonucléases.
Clonage de séquences

Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
• Digestion du vecteur et de l’ADN à cloner par HindIII.
•acquises depuis
Sélection une >150kb
de l’ADN trentaine d'années
par sur les
électrophorèse.
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Empreinte des BAC pour les
Définition
organiser en contigs
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
Electrophorèse avec 242 dépôts.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
Pour chacun des 192 BACs, digérés par le même
laboratoires de biologie.
enzyme de restriction, profil unique pour chaque
Cette
BACtechnique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Les phages comme vecteurs de clonage

Phage = virus de bactéries

Molecular Cell Biology


Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes

De type procaryotique:
Cas d’un vecteur phagique
Les cosmides comme vecteurs de clonage

Molecular Cell Biology


Les YACs comme vecteurs de clonage
YAC : Yeast Artificial
chromosome
Criblage d’une banque phagique

Hybridation
avec uns sonde
spécifique...
Prochain cours!

An Introduction to Genetic Analysis


IV - APPLICATIONS DES VECTEURS

- Clonage et amplification d’une séquence d’ADN

- Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc

- Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou


des organismes(animaux transgéniques)

- Production d’ARN

- Production de protéines codées par les gènes insérés


Banques d’ADN

-Banques d’ADN génomique

- Banques de cDNA
Banque (librairie) d’ADN génomique

Molecular Cell Biology


Comment définir si une banque est
suffisamment grande pour espérer trouver un
fragment d’intérêt?
Calcul afin de définir la probabilité de trouver une séquence donnée
dans une banque.
N=ln(1-P)/ln(1-f)
N: nombre de recombinants
P: probabilité désirée
f: proportion de génome dans un seul recombinant
Ex: 99% de probabilité d’avoir une séquence représentée dans une
banque de fragments de 17kb d’un génome eucaryote (3.109pb)
N= ln(1-0.99)/ln(1-(1,7.104/ 3.109))=8,1.105 colonies
Banque d’ADNc

Le problème ici est


l’obtention de clone dit
« full length ».
Obtention de l’ADN de l’organisme donneur

A partir de l’ARN:
Principe de la "reverse
transcription":

An Introduction to Genetic Analysis


APPLICATIONS DES VECTEURS

Définition
- Clonage et amplification d’une séquence d’ADN
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
- Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc
succession des nucléotides le composant.
- Production de protéines
C’est aujourd'hui codées par
une technique deles gènespour
routine insérés
les
laboratoires de biologie.
-Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou
des organismes(animaux transgéniques)
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Production de protéines
Utilisation de vecteur d’expression

Molecular Cell Biology


Production de protéines humaines à but thérapeutique

- Facteur VIII de la coagulation dans l’hémophilie A

- Hormone de croissance

- Insuline
Exemple de
l’insuline
CELLULES HÔTES

-Bactéries : E. Coli
premier hôte utilisé
nombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisables
Définition
culture en masse dans les fermenteurs
taux d’expression
Le séquençage de l’ADN,élevés
est la (plusieurs g dede
détermination protéine/litre)
la
succession
MAIS des nucléotides
secrètent le composant.
mal les protéines : éclatement des bactéries
C’est pas de modifications
aujourd'hui post-traductionnelles
une technique de routine pour les
-Levure saccharomyces
laboratoires de biologie. cerevisiae
modifications
Cette technique utilisepost traductionnelles
les connaissances qui ont été
MAIS pas de secrétion, moins bon rendement
acquises depuis une trentaine d'années sur les
-Cellules CHO
mécanismes de(chinese hamster
la réplication ovary)
de l'ADN.
culture de masse en bioréacteurs, protéines complexes
MAIS cher et rendement plus faible
Autres exemples
Levures et bactéries utilisées comme usines:
production d'antibiotiques -pénicilline, tétracycline-,
d'enzymes comme lipases -lessives-...

Vaccins : fraction de protéines virales


nécessaire à la production d’AC

Bioréactifs – Enzymes de restriction


diminution du coût
Création de plantes transgéniques

An Introduction to Genetic Analysis


Création d’animaux transgéniques
La transfection des cellules eucaryotes

Définition et Principe
Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule
Définition
= protéine exogène
Transfection ≠ Infection (méthode virale)
Le séquençage
Surexpression de l’ADN,
de cette protéine grâce est la détermination
à la machinerie cellulaire de la
(transcription/traduction)
succession des nucléotides le composant.
C’est
ADN aujourd'hui une technique de routine pour les
(1) Etude à partir de
lysat protéique
laboratoires de biologie. protéine (activité enzymatique)
exogène
Cette technique utilise
ARN les connaissances qui ont été
(2) Etude
in situ
acquises depuis une trentaine d'années sur les
ribosomes
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Une cellule eucaryote
Techniques

Réactifs chimiques
- Calcium phosphate
- DEAE-dextran
Définition
- Liposomes artificiels
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
Méthodes physiques
succession des nucléotides
- Microinjection directe (dans lale composant.
cellule ou le noyau) :
animaux transgéniques
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
- Electroporation (perturbation de la membrane par un choc électrique)
laboratoires dedebiologie.
- Propulsion microprojectiles contenant de l’ADN (in vivo) :
plantes
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
Utilisation de
acquises particules
depuis unevirales
trentaine d'années sur les
- Rétrovirus
mécanismes
- Adénovirusde la réplication de l'ADN.
- Particules virales non infectieuses
Réactifs chimiques

DEAE-dextran
Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
1965 par Vaheri et Pagano
succession des nucléotides le composant.
Technique classique, in vitro
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
DEAE-dextran = polymère cationique
laboratoires de biologie.
Association avec les acides nucléiques chargés négativement
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
Endocytose cytoplasme noyau
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Réactifs chimiques

Calcium phosphate
Définition

1973Le
parséquençage de Eb
Graham et van der l’ADN, est la détermination de la
succession
Technique classiquedes nucléotides
et bon le
marché, in vitro composant.

MiseC’est aujourd'hui
en contact unedutechnique
de l’ADN avec de routine
chlorure de calcium pour
dans un lesphosphate
tampon

laboratoires de précipité
Formation d’un biologie.entre le calcium et l’ADN

Cette technique
Précipitéutilise
dans lales connaissances
cellule par endocytose ouqui ont été
phagocytose

acquises depuis une trentaine d'années sur les


mécanismes de la réplication de l'ADN.
Réactifs chimiques

Liposomes artificiels

Définition
1980 par Fraley et co.
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
Efficacité de transfection , fragments d’ADN , types cellulaires ,
succession
in vitro et in vivodes nucléotides le composant.

C’est aujourd'hui
Liposomes une technique
= lipides cationiques de routine pour les
(+ lipides neutres)

laboratoires deavec
Réaction biologie.
les acides nucléiques chargés négativement

Cette technique utilise les


Compaction connaissances
de l’ADN qui ont été
= complexe liposomes-ADN

acquises depuis une Endocytose


trentaine d'années sur les
cytoplasme noyau

mécanismes de la réplication de l'ADN.


Applications (in vitro)

1. Surexpression de protéines absentes dans un type cellulaire donné :


1.1. - sa fonction
- sa localisation in situ Promoteur du vecteur ADNc codant pour la protéine

Définition
- son interaction avec d’autres protéines de la cellule ou une autre
protéine transfectée (co-transfection avec 2 plasmides)
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des
1.2. - Etude de nucléotides
l’activité le composant.
d’un promoteur et sa régulation in situ

C’est aujourd'hui une technique de


Promoteur à étudier
routine pour les
Gène rapporteur

laboratoires
1.3. - Elaborer de
une biologie.
lignée cellulaire immortelle
protéine exogène = Antigène T du virus SV40
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises
-… depuis une
Promoteur trentaineADNc
du vecteur d'années
codant poursur
l’Ag T les

mécanismes de la réplication de l'ADN.


2. Modifier un gène existant / inhiber l’expression d’un gène existant
Surexpression de protéines : Mise en évidence

ADN
protéine
Définition exogène
ARN Etude
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
in situ
succession des nucléotides le composant.
ribosomes
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
• Transfection d’un ADNc codant pour une protéine non modifiée
laboratoires de biologie.
- Détection par immunocytochimie ou par Western blot
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
• Transfection d’une construction possédant l’ADNc d’intérêt et une étiquette (« tag »)
= Protéine
acquises de fusion
depuis une trentaine d'années sur les
- GFP (Green Fluorescent Protein) ADNc tag
mécanismes de …
- HA, flag, c-myc la (anticorps)
réplication de l'ADN. protéine
de fusion
Etude de l’activité d’un promoteur : Mise en évidence

promoteur gène rapporteur galactosidase

ADN lysat protéique


Définition
protéine activité enzymatique β galactosidase
Le séquençage de exogène
l’ADN, est la détermination de la
ARN Mesure quantitative
succession des nucléotides le composant.
in situ galactosidase
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
ribosomes
laboratoires (spectrophotomètre)
β-galactosidase de biologie. Luciférase (luminescence)
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
• Effet de facteurs endogènes (facteurs de transcription)

acquises depuis
• Effet de facteurs une trentaine
exogènes d'années
sur l’activité du promoteur sur les
- facteurs de croissance ajoutés dans le milieu de culture
mécanismes de la réplication de l'ADN.
- transfection avec une 2ème construction codant pour une protéine pouvant
réguler le promoteur étudié = co-transfection
Préparation de l’ADN à transfecter
• Réalisation de constructions plasmidiques :
vecteur + ADNc/promoteur-gène rapporteur
Définition
• ETUDE catégorie de vecteurs à utiliser
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises
Vecteur depuis
commum une trentaine d'années sur les
Plasmide GFPtag Plasmide activité promotrice
d’expression
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Vecteur commum d’expression

Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Promega
Plasmide GFPtag ou étiquette GFP

Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Promega
Plasmide permettant d’étudier l’activité
d’un site spécifique d’un promoteur

Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Clontech
Deux approches

Transfection transitoire Transfection stable


Définition -Transfection à long terme
- Analyse de la transfection
à 24-72 h
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
- L’ADN est généralement intégré au
-Perte du plasmide en quelques niveau chromosomique
succession des nucléotides le composant.
jours
C’est aujourd'hui une technique de-dilutions
Isolation des clones cellulaires par
routinelimites
pour(clonage
les cellulaire)
laboratoires de biologie. -Criblage par résistance à un
antibiotique des clones possédant
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
l’ADN transfecté (néomycine,
hygromycine, …)
acquises depuis une trentaine d'années sur les
- 3-4 semaines
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Transfecter des cellules COS avec des constructions
plasmidiques contenant différents ADNc

Technique des liposomes


Définition
LePlasmide 1
séquençage Plasmide
de l’ADN, est 2
la détermination de la Plasmide 3
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
Protéine X-GFP de
laboratoires biologie. Protéine Z-HA β galactosidase

Cette technique utilise les connaissances qui ont été


acquises depuis une trentaine d'années sur les Réaction enzymatique
Fluorescence directe Immunocytofluorescence
colorimétrique
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Plasmide 1

Définition
ADN
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
Protéine X-GFP
X-GFP *
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Fluorescence directeutilise
Cette technique (vert) les connaissances qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Immunocytofluorescence
Plasmide 2

Définition
ADN
* (2)
Z-HA
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
(1)
succession des nucléotides le composant.
Protéine Z-HA

C’est aujourd'hui une technique de routine pour les


(1) Anticorps de souris anti-protéine HA
laboratoires de biologie. (anticorps primaire)
Immunocytofluorescence
Cette technique utilise les (2)
connaissances quianti-IgG
ont été
Anticorps de chèvre de souris
conjugué
acquises depuis une trentaine à la rhodamine
d'années sur les (TRITC) *
(anticorps secondaire)
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Avantages

Plasmide 3 (1) Mise en évidence facile et rapide

(2) Mesure quantitative (in situ) :


Définition nombre de cellules bleues / population totale

Le séquençage de l’ADN, est(3)la Mesure


détermination de la
qualitative (dosage colorimétrique :
β Galactosidase Luciférase)
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique
Rôlede routine
de ce type depour les
construction

laboratoires de biologie.
Réaction enzymatique (1) Vérifier que le type cellulaire utilisé peut
colorimétrique être transfecté
Cette technique
(cellules bleues) utilise les connaissances qui ont été
(2) Mesurer une efficacité de transfection
acquises depuis
Substrat de l’enzyme une trentaine d'années sur les
= X-gal

mécanismes de la réplication de l'ADN.


Plasmide 1 + 2

Définition
Protéine Z - HA
Le séquençage de l’ADN, est+ la détermination de la
Protéine X - GFP
succession des nucléotides le composant.
C’est aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Localisation de 2 protéines
Cette technique utilise lesd’une
au niveau connaissances
même cellule qui ont été
acquises depuis une trentaine d'années sur les
Besoin de 2 fluorochomes
mécanismes de la réplication de l'ADN.
Mise en évidence de la présence d’une cellule

Marqueurs généraux
Définition =
Le séquençage de entière
La cellule en l’ADN, est la détermination
ou des de la
structures particulières
succession des nucléotides le composant.
•C’est
Noyaux (PI: iodure
aujourd'hui unedetechnique
propidium,
deDAPI, YOYO,
routine …)
pour les

•laboratoires de biologie.
Filaments d’actine, cytosquelette (rhodamine-phalloïdine)
Cette technique utilise les connaissances qui ont été
• Marqueurs spécifiques du réticulum endoplasmique
acquises depuis une trentaine d'années sur les
•mécanismes
Marqueurs membranaires
de la réplication de l'ADN.