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Análisis cualitativo por espectrofotometría UV de fármacos de abuso en

plasma

Article · January 1988

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Jesús Simal-Lozano
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 espectrofotometría UV

Análisis cualitativo por

Espectrofotometría UV de fármacos
de abuso en plasma.

Cepeda, A.; Paseiro, P. y Simal, J.

Palabras clave: Sep Pak C18, espectroscopía UV, barbitúricos, ácido salicílico, cafeína, teofilina.

Se propone un método rápido y sencillo para la determinación cualitativa en plasma de barbitúricos

(amobarbital, aprobarbital, barbital, butabarbital, butalbital, dial, fenobarbital, pentobarbital y seco-
barbital), ácido salicílico, cafeína y teofilina, basado en un proceso de purificación de la muestra me-
diante la utilización de las minocolumnas Sep PakR C18 y el examen del residuo al UV.

A quick and simple method is proposed for the qualitative determination of sorne Barbiturates in plas- ·
ma (Aprobarbitone, Amylobarbitone, Barbitone, Dial, Pentobarbitone, Phenobarbitone, Qinalbarbito-
ne, Secbutotabarbitone and Talbutal), Salicylic acid, Cafeine and Theophylline. This method is based
on the purification process of the example by the use of the cartridge Sep Pak™ C18 and the exa-
mination of the purified at the spectroscopy UV.

Introducción 1974-1980. Otros fármacos, como los salicilatos, han

El incesante incremento del uso de medicamen-
tos ha hecho que a parte de los beneficios obteni-
dos por su utilización se produzcan envenenamien-
tos e intoxicaciones, siendo los barbitúricos los fár-
macos más frecuentemente implicados en sobredo-
sis agudas tal y como lo demuestran Frati y colabs.
(1983) en un estudio en España durante los años
Departamento de Química Analitica, Nutrición y
Bromatología.
Universidad de Santiago de Compostela.
sido causantes de intoxicaciones accidentales prin-
cipalmente en niños menores de 5 años (Levine,
1982).
La necesidad de procedimientos analíticos rá-
pidos para la identificación de fármacos a niveles
tóxicos ha hecho que se apliquen numerosas técni-
cas analíticas en el campo de la Toxicología Foren-
se, entre ellas, la espectrofotometría UV, descrita am-
pliamente en la bibliografía. Clarke (1969); Corner
(Fiorey, 1972); Jain y Cravey (1974) la aplican para
determinar barbitúricos en materiales biológicos me-
diante el desplazamiento del máximo de absorción
a diferentes valores de pH . Gupta y Lundberg (1973)
determinan teofilina en sangre en presencia y ausen-

38 técnicas de LABORATORIO • no 141

• 1
 espectrofotometría UV

cía de. barbitúricos. Routh (Sunshine, 1983) analiza

cafeína en suero midiendo la absorbancia a 273 nm.
Así mismo, los procesos de purificación del plas- 0,7
ma son muy variados, White y Graves (1974) extraen
con cloroformo y reextraen con hidróxido sódico para
separar fármacos áci9os y neutros. Otros autores uti-
lizan columnas de purificación basadas en principios
cromatográficos como son las resinas XAD-2 (Eia-
hi, 1980); columnas Extrelut (Breiter y colabs, 1976)
y las más recientes como son las minicolumnas de
fase «reversa» Sep Pak C18 (AIIan y colabs, 1980).
Para la realización de este trabajo hemos com-
binado la purificación de la muestra con minicolum-
nas Sep Pak C18 y la determinación cualitativa en
plasma de varios fármacos de abuso mediante es-
pectrofotometría UV.

Parte experimental

Material y aparatos

- Minicolumnas de fase «reversa•• Sep Pak C18.

(Watters, art. 51910)
- Jeringa de vidrio de capacidad 5 mi con aguja hi-
podérmica de 8.5 cm de longitud y 0,5 mm de diá-
metro interno.
-Centrífuga que alcance 4000 rpm.
- Baño María.
-Tubos de centrífugas de fondo conico graduados
de 10 mi.
- Bomba de vacío.
-Balanza analítica que aprecie hasta 0,1 mg.
-Indicador de pH universal Merck art. 9535.
- Espectrofotómetro UV Hitachi modelo 100-60 y re-
gistrador Hitachi de doble canal modelo 561 .
-Cubetas apareadas de cuarzo de 1 cm. de
espesor.
- Material de uso común en el laboratorio.

Reactivos

Los reactivos utilizados son de calidad analítica

y todos los fármacos empleados cumplen las nor-
mas USP XIX/BP proporcionados por Analar (ácido
salicílico); Serva (teofilina); Merck (cafeína); Sandoz
(butalbital); Barcia (barbital, aprobarbital, butabarbi-
tal, secobarbital, pentobarbital, dial, amobarbital, 190 220 250 280 310 340
fenobarbital).
- Soluciones patrón concentradas de cada fárma- nm
co en hidróxido sódico 0,1N.- Se preparan de
manera que cada mi contenga el nivel tóxico del Figura 1. Espectro de absorción al UV de un "blanco de
fármaco correspondiente para 2,5 mi de plasma plasma».

técnicas de LABORATORIO • n• 141 39

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1

espectrofotometría UV

0,7 0,,1
0,6 _____ ,p H= 1 0,6- ------ pH= 1
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190 220 250 2 80 310 340 190 220 250 280 310 34 0
nm nm

Figura 2. Espectro de absorción al UV del grupo de Jos barbitúricos obtenido de muestras de plasma sobrecar-
gadas con 125 p.g comparado con su espectro patrón para cada componente.

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40 técnicas de LABORATORIO • n° 141

1
 espectrofotometría UV

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190 220 250 2 8 0 310 340 190 220 250 280 310 340
; .
nm nm

Figura 3. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 37,5 p.g de cafeína comparado
con su espectro patrón.

técnicas de LABORATORIO • n° 141 41

 espectrofotometría UV

0,7 0,7 1
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190 220 250 280 310 340
nm
190 220 250 280 310 340
nm
1
Figura 4. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 50 pg de teofilina comparado
con su espectro patrón.
f
(Stead y Moffat, 1983). y ajustadas a pH 10.
1
i
barbitúricos .................................. 125 ¡.¡g/ml
cafeína . .... . .... .... ...... ...... . ..... ...... .. .. 37,5 ¡.¡g/mi
salicílico, ácido .... ...... ..... ............. 500 ¡.¡g/mi
-Metano!
-Etanol
-Hidróxido sódico 0,1N y 0,01N.
t
teofilina ... .. ..................... ...... ..... ... 50 ¡.¡g/mi - Plasma humano fresco congelado de donante
- Soluciones patrón de trabajo de cada fármaco.- único proporcionado por el Hospital General de:
Se preparan por dilución 1 a 10 de las anteriores Galicia. El plasma se descongela en baño de

42 técnicas de LABORATORIO • n° 141

 O • -1 i
.... 0.7
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-pH= 10
0,6 ____ pH=

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190 220 250 280 310 340 190 220 250 280 310 340
nm nm

Figura 5. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 500 pg de ácido salicílico com-
parado con su espectro patrón.

agua a 30 °C. agua acidulada a pH 3 con ácido clorhídrico.

- Preparación de las muestras de plasma tipo.-
Para cada fármaco se añade 1 mi de solución pa-
trón concentrada a 2,5 mi de plasma y se diluye
hasta 5 mi con agua destilada.
Procedimiento
Con la muestra de plasma.
-Acondicionamiento de las minicolumnas de fa-
se «reserva» Sep Pak C18:
Se pasa a través de la minicolumna 5 mi de me-
tano! seguidos de 5 mi de agua destilada y 5 mi de
-Purificación con las minicolumnas Sep Pak
C18.
La solución de plasma se acidifica con 4-5 go-
tas de ácido clorhídrico 1N hasta pH aproximada-
mente de 3, se centrifuga a 4000 rpm durante 5 min ,
se recoge el sobrenadante con la jeringa, se lava el
tubo con 5 mi de agua acidulada a pH 3. La mues-
tra y las aguas de lavado se pasan a través de la
minicolumna Sep Pak C18 a razón de 2 ml/min. ·Al
objeto de eliminar el agua contenida en el volumen
muerto de la minicolumna se realiza una pequeña
succión a vacío. Posteriormente se eluye con 2 mi

técnicas de LABORATORIO - n• 141 43

 espectrofotometría UV
de etanol y la solución alcohólica se evapora a se-
quedad en un Baño María. El residuo obtenido se
disuelve en 0,1 mi de hidróxido sódico 0,01N y se di-
luye a 10 mi ajustando el valor de pH a 10.
-Obtención de los espectros.
Con la solución anterior se consiguen los espec-
tros a pH 10 y a pH 1 (acidificando con ácido clorhí-
drico 1N) entre 340 y 190 nm.
Con los patrones.
Se obtienen directamente los espectros a pH 10
y pH 1 con las soluciones patrón de trabajo.
Por último se comparan los espectros obtenidos
para la muestra con los patrones respectivos.
Resultados
Las Figuras -1 a 5- representan los espectros
de absorción al UV obtenidos a pH=10 (línea conti-
nua) y pH=1 (línea punteada).
En la Figura -1- se recogen los correspondien-
tes a un ··blanco de plasma ... En las Figuras restan-
tes se recogen los espectros obtenidos de las solu-
ciones patrón diluidas de cada uno de los fármacos
estudiados así como los espectros de absorción a
que han dado lugar las muestras de plasma tipo.
Discusión
El ccblanco de plasma" da lugar a una interferen-
cia plasmática con un máximo de absorción a 273
nm que no depende del pH del medio.
En los barbitúricos, se observa que en los pa-
trones desaparecen el máximo de absorción al cam-
biar la solución de pH 10 a pH 1, este mismo efecto
se produce en las muestras de plasma tipo.
La cafeína y teofilina presentan máximos de ab-
sorción en la zona en la que absorbe la interferen-
cia plasmática. Se puede detectar la presencia de
estas sustancias (a sus niveles tóxicos) por el incre-
mento cuantitativo que se produce en los valores de
absorbancia con relación al ccblanco de plasma...
Además en el caso de la teofilina se produce un des-
plazamiento del máximo de absorción de 274 nm (pH
10) a 270 nm (pH 1).
El ácido salicílico da un máximo de absorción
a 300 nm a pH 10 y pH 1, lo que hace posible su
detección, sin embargo no se ha observado el má-
ximo de absorción a 235 nm a pH ácido como apa-
rece en el patrón, debido a la presencia de fondo
interferente plasmático.
A la vista de los resultados obtenidos, concluí-
44
View publication stats
mas que la utilización de las minicolumnas Sep Pak
C18 dan lugar a una purificación satisfactoria de las
muestras de plasma, lo que permite detectar de una
manera rápida y sencilla los componentes estu-
diados.
Agradecimientos ·
Nuestro reconocimiento al Hospital General de
Galicia por habernos facilitado de forma gratuita el
plasma para realizar las muestras; así mismo, agra-
decemos a la firma comercial Sandoz por suminis-
trarnos también de forma gratuita el fármaco butal-
bital.
Bibliografía
1.- Allan, R.s.; Goodman, H.T. (1980&: ccTwo HPLC de-
terminations for Mebendazole and its metabolites in
human plasma using a rápid Sep Pak C18 extrac-
tion••, J. chromat., 183, 311-319.
2.- Breiter, J.; Helger, R.; Lang, H (1976): ccEvaluation of
column extraction: A new procedure for analysis of
drugs in blody fluids», J. Forensic Sci., 7, 131-140.
3.- Clarke, E. (1969): cclsolation and identification of
drugs", Ed, The Pharmaceutical Press, London, pá-
ginas 98-100.
4.- Corner, l. (1972): ccSecobarbital sódiCO», en Analiti-
cal Profiles of Drugs Sustances. Ed. K. Florey (Aca-
demic Press, USA), Páginas 343-345.
5.- Elahi, N. (1980): ccEncapsulated XAD-2 extraction pro-
cedure technique for a rápid screening of drugs of
abuse in urine», J. Anal. Toxico!., 4, 26-30.
6.- Frati, M.E.; Marruecos, L.; Porta, M.; Martin, M.L.;
Laporte, J.R. (1983): ccAcute severe poisoning in
Spain: Clinical outcome related to implicated drugs»,
Human Toxico!., 2, 625-632.
7.- Gupta, R.N. y Lundberg, D.C. (1973): ccQuantitative
determination of Theophylline in blood by dipheren-
tial spectrophotometry.. , Anal. Chem., 45, (14),
2403-2405.
8.- Jain, N.C.; Cravey, R. H. (1974): «The identification of
barbiturates from biological specimens», J. of Chro-
mat, Sci., 12, 228-231.
9.- Levine, R. (1982): .. Farmacología: acciones y reac-
ciones medicamentosas», Ed. Salva!, Barcelona, pá-
gina 323.
10.- Routh, J. (1983): ccCaffeíne.. , en Methodology for
Analytical Toxicology. Ed. 1, Sunshine (CRC Press,
Florida), páginas 57-60.
11.- Stead, A. H. y Moffat, A.C. (1983): ceA collection of
therapeutic toxic and fatal blood drugs concentration
in man .. , Human Toxico!., 3, 437-464.
12.- White, J. y Graves, M.H. (1976) ccThe detection of se-
dative/hypnotics drugs in the impaired driver», J. of
Chromat. Sci., 12, 219-224.
técnicas de LABORATORIO • no 141