Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Western Blot
También es conocido como inmunoblot, Protein blotting, es una técnica analítica para
detectar proteínas especificas en una determinada muestra, mediante electroforesis en gen,
separando las proteínas dependiendo del criterio que se desee (peso molecular, estructura,
hidrofobicidad, etc.
Antes de la aparición del western blot, ya existían diversas técnicas que eran capaces de
detectar un antígeno determinado en una muestra (inmunoelectroforesis, inmunodifusión
doble de Ouchterlony, inmunoprecipitación)
L aparición de western blot fue posible hasta la aparición de las membranas. En 1975, Edwin
Southern demostró que la nitrocelulosa era capaz de capturar ácidos nucleicos separados
previamente por electroforesis, que permitía el análisis de una mezcla compleja de moléculas
de ADN, como un genoma tratado con enzimas de restricción.
Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que también era capaz de unirse a proteínas.
En 1986, Millopore desarrollo la primera membrana de PVDF diseñada para la transferencia
de proteínas, la membrana de transferencia Immobilon TM PVDF y después fue llamada
immobilon-PTM para diferenciarse de otras membranas.
Esta técnica permite transferir las proteínas de un gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato
(SDS) a una membrana absorbente, siendo las proteínas transferida a la membrana una copia
exacta del gel donde han sido separadas por electroforesis, esta transferencia de gel a
membrana es una gran herramienta para poder detectar y caracterizar proteínas,
especialmente las que están en baja abundancia.
INSPECCIÓN DE PRODUCTOS DE ORIGEN ANIMAL
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (-4°C) para evitar la desnaturalización
proteica
INSPECCIÓN DE PRODUCTOS DE ORIGEN ANIMAL
a. Preparación de la muestra
En la mayoría de los ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o
mecánicos, el cual dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización subcelular de
la proteína y de las condiciones óptimas que requiere el anticuerpo para reconocer el epítopo
proteico.
El gel y la membrana se
coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja, un cartucho aplica presión y mantiene
un estrecho contacto entre el gel y la membrana, se aplica voltaje en el tanque de transferencia
y las proteínas migran desde el gel o la membrana.
d. Hibridación del anticuerpo
La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con
ausencia de proteínas y evitar la unión no especifica de los anticuerpos. Se incuba con un
anticuerpo primario dirigido contra el epítopo especifico de la proteína diana. Tras varias
lavadas de la membrana, se adición un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma
específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de detección.
INSPECCIÓN DE PRODUCTOS DE ORIGEN ANIMAL
e. Detección de bandas
Después de un lavado de la
membrana para eliminar el anticuerpo
no unido, se procede a detectar la
localización de la banda en la
membrana. Para la detección de
quimioluminiscencia, se utiliza un
anticuerpo secundario conjugado con
la enzima peroxidasa (HRP), que
provoca una reacción enzimática que
da como resultado la emisión de luz,
que puede ser detectada en una película de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema
de captación de imágenes. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz
emitida por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario.
PCR