DNA: material genético

Dogma central da biologia molecular:

DNA – 2  RNA – 3  Proteína

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1 1 - Replicação
| 2 - Transcrição
DNA 3 - Tradução

Experiências com DNA:

1- Experiência de Griffiths – o princípio da transformação

Embora não permitissem descobrir que era o DNA o responsável para

informação genética, permitiram descobrir que havia algo que poderia ser
transmitida entre organismos diferentes:
Griffiths trabalhou com duas estirpes diferentes de estreptococus, uma
virulenta e outra não virulenta.
Quando infectava o ratinho com a estirpe não virulenta (R), o ratinho
sobrevivia. Quando infectava o ratinho com a estirpe virulenta (S) o ratinho
morria.
Quando experimentou pegar na estirpe virulenta (S), inactiva-la por calor
e injectá-la no ratinho, via que o ratinho não morria. Quando experimentou
misturar estirpe virulenta, inactivada por calor, com não virulenta, verificou que
o ratinho morria – alguma coisa é transferida da estirpe virulenta morta para a
não virulenta, que transforma a não virulenta em virulenta – é o principio da
transformação.
In vitro, muito mais tarde, conduziu-se uma experiência semelhante, em
que se experimentou misturar a estirpe não virulenta com apenas o DNA da
estirpe virulenta, o que levou á formação de colónias virulentas e não
virulentas.

2 – Experiência de Hershey e Chase – O DNA como material genético:

Utilizaram bactérias e bacteriofagos. Os bacteriofagos são constituídos

apenas por dois tipos de moléculas: possuem uma cápsula proteica no interior
da qual está o DNA. Já se sabia o que era o DNA mas não o que fazia.
O que foi feito foi a marcação radioactiva diferencial dos dois tipos de
moléculas do vírus: a cápsula porteica (S32) e o DNA (P32). Posteriormente
permitiram que os bacteriofagos infectassem as bactérias e foram ver onde se
encontrava a radioactividade.
Quando temos uma cultura de bactérias, se fizermos uma centrifugação
as bactérias ficam depositadas no fundo, com o sobrenadante, correspondente
ao meio de cultura, no cimo. O que se fez então foi a separação das bactérias
do sobrenadante e verificam que quando foram as proteínas virais as marcadas
radioactivamente, a radioactividade se encontrava no sobrenadante e não nas
bactérias. Quando marcaram radioactivamente o DNA viral verificaram que a

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radioactividade se encontrava nas bactérias e não no sobrenadante, o que
significa que o DNA entrou nas bactérias e que é o responsável pela
transformação das bactérias e transmissão da informação genética.

3 - Experiências com transgénicos:

Quando se transfere um gene que codifica para a hormona de

crescimento para um ovo fertilizado de ratinho, e este é implanatado no útero
de uma mãe, verifica-se que o ratinho quando nasce é maior que o normal. O
que significa que este gene deu alguma informação a mais àquele embrião,
que ele não possuía, e que permitiu que ele crescesse muito mais.

Estrutura do DNA

A unidade básica estrutural dos ácidos nucléicos é o nucleótido. O

núcleótido é constituido por um açucar, grupo fosfato e base azotada. Os
açucares podem ser riboses ou desoxirribose, ambos pentoses, com cinco
carbonos, mas com um grupo OH a menos no carbono 2 da desoxirribose. A
base azotada liga-se ao carbono 1 e o grupo fosfato ao carbono 5. Se ao
núcleótido for retirado o grupo fosfato e ficar apenas um açúcar mais base
azotada ficamos com um nucleósido.
Os nucleótidos ligam-se uns aos outros através do grupo fosfato ligado
ao carbono 5’ do nucleótido ao grupo OH do carbono 3’ do nucleótido seguinte,
através de uma ligação fosfodiéster.
A ligação entre o açucar e o azoto da base azotada designa-se N-
glicosidica.
No caso dos eucariotas, a molécula de DNA é linear, e há portanto duas
extremidades, a extremidade 5’ e a extremidade 3’, que se identificam pelo
grupo que estabelece a ligação fosfodiéster que está livre.
As bases azotadas podem ser purinas ou purimidinas. As purinas são
grandes e portanto a adenina e a guanina, as pirimidinas a timina, citosina e
uracilo.
As cadeias duplas estão unidas entre si por pontes de hidrogénio,
ligações fracas que podem ser facilmente quebradas, por exemplo por
aquecimento. No caso da Adenina e Timina estabelecem-se duas pontes de
hidrogénio, no caso da Citosina e Guanina são três pontes de hidrogénio.. A
temperatura de desnaturação é a temperatura para a qual metade da molécula
de DNA está desnaturada, embora hajam regiões que desnaturam mais
depressa do que outras, consoante o tipo de bases azotadas ligadas entre si.
Estas cadeias enroladas em hélice são igualmente anti-paralelas, em
que uma cadeia corre de 5’ para 3’ e outra de 3’ para 5’. O enrolamento das
cadeias em hélice deve-se à necessidade das bases ficarem muito próximas
umas das outras, por estarem ligadas por ligações muito fracas, o que faz com
que a hélice se torne mais forte.
O efeito de emparelhamento, interacções hidrofóbicas (no interior) e
interacções hidrofílicas (noexterior), estabilizam a estrutura do DNA. As
interacções electrostáticas destabilizam o DNA.
As purinas ligam-se sempre às pirimidinas, porque as purinas são mais
volumosas que as pirimidinas que são mais pequenas, o que permite que a
estrutura de DNA seja regular, porque a distância entre as bases se mantêm.

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 O DNA pode igualmente apresentar várias formas possíveis. A forma
presente nos sistemas vivos é a forma B, perpendicular, altamente regular, com
10 pares de bases por volta e que corresponde ao modelo de Watson-Crick.
Existem também as formas A (por desidratação, com 11 pares de bases, mais
obliqua). Ambas as formas B e A rodam para a direita. A forma Z (em zig-zag),
é altamente irregular e roda para a esquerda. Existe ainda a helicoidal tripla.

As nucleases hidrolizam as ligações fosfodiéster acima ou abaixo do

grupo fosfato. Podem ser endonucleases, se quebram ligações fosfodiéster no
interior da cadeia, ou exonucleases, se quebram a ligações fosfodiester a partir
de uma extremidade da cadeia.
As endonucleases de restrição são produzidas pelos procariotas como
sistema de defeza, porque reconhecem DNA estranho à bactéria e quebram-
no. São capazes de quebrar ligações fosfodiéster no interior da cadeia
reconhecendo sequências de bases específicas – sequências palindrónicas –
que são sequências repetitivas invertidas entre 6 a 8 pares de bases, e actuam
cortando a direito (blunt), mantendo as cadeias duplas, ou em zig-zag
(coesivas), em que há bases que ficam em cadeias simples, sendo mais
específicos.
Estas enzimas só não actuam sobre o seu próprio DNA porque as
sequências específicas que elas reconhecem nele está metilado, por adição de
grupos metil, o que faz com que não possa actuar sobre o seu próprio DNA e
lhes permitem ter a função de defesa contra DNA invasor. Este sistema de
defesa existe apenas nas bactérias, seres procariotas, não existem em
organismos eucariotas.

Complexidade do DNA cromossomal

1 – Desnaturação do DNA - O DNA pode ser facilmente desnaturado por

quebra das pontes de hidrogénio através do aquecimento, porque são ligações
fracas. Temperatura de desnaturação, é a temperatura para o qual metade da
cadeia dupla de DNA se encontra desnaturada; a sua representação é uma
curva hiperbólica e é específica para cada molécula de DNA, dependendo
essencialmente do conteúdo de G-C.
Uma concentração de sal baixa permite que o DNA se dissolva melhor,
estabilizando a sua estrutura, isto porque o NaCl em água fica na forma de iões
Na+ e Cl- que favorecem a estabilidade do DNA (só em baixas concentrações),
devido ao efeito electrólitico, já que estes iões em solução podem interactuar
com os grupos fosfato, que são responsáveis pelo efeito electrólitico no DNA,
favorecendo por isso a sua solubilidade. Se a concentração for muito alta, já vai
destabilizar o DNA, porque a probabilidade dos iões se encontrarem entre si é
maior do que encontrar o DNA, levando à precipitação e até à desnaturação do
DNA, aumentando a sua absorvância.

2 – Efeito hipercrómico - A absorvância é maior depois do DNA estar

desnaturado do que antes. Isto é, uma molécula de DNA quando está na forma
de cadeia dupla absorve menor quantidade de radiação do que uma que esteja
na cadeia simples, isto ocorre porque há uma maior exposição dos nucleótidos.
O comprimento de onda ideal são 260 nm.

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 A complexidade do DNA

O genoma humano é constituido por cerca de 75% de genes com uma

única cópia. Os outros 25% correspondem a sequências repetitivas, onde
podemos ter genes repetidos ou sequências não codificantes repetidas, ALU,
entre os genes (nos intrôes), ou dentro dos próprios genes. Se subdividirmos
estes 25%, 15% são sequências repetidas intercaladas com outras sequências
(como outros genes), e 10% são sequências satélite, em Tandem, seguidas
umas às outras, não sendo intercaladas. São cerca de 50.000 a 100.000
genes.
Os plasmideos existem na natureza em procariotas para conferir
resistência aos antibióticos.

A estrutura dos genes:

Um gene procariótico ou eucariótico possui sempre uma região que

antecede a região codificante – promotor – cuja função é regular o
funcionamento do gene. Esta região reguladora serve para assinalar o local
onde as RNA polimerases se devem ligar para poderem fazer a transcrição do
DNA a RNAm.
Existem ainda regiões codificantes – exões. Em eucariotas os exões
podem estar intercalados com intrões – regiões não codificantes, que não
estão presentes no RNAm após a sua transcrição.
Dentro do RNAm temos igualmente sequências que traduzem proteínas
intercaladas com outras que não traduzem. Estas sequências não tradutoras
designam-se UTR-3’, para o lado 3’, e UTR-5’, do lado 5’, em que UTR está
para Untranslated Region.
Quanto à numeração das bases do gene, +1 significa a primireira base
codificante do gene, da esquerda para a direita. A numeração do promotor é
feita a partir do ponto de união com o gene da direita para a esquerda, com
números negativos, ou seja, à esquerda da base +1, a primeira base
codificante do gene, temos a base –1, que é a primeira base do promotor.

Hipercolesterolemia familiar - resulta da ausência de receptores LDL,

que deixaram de existir pela existência de sequências ALU.
As sequências Alu encontram-se espalhadas pelo genoma humano.
Estas sequèncias Alu, sendo rigorosamente iguais umas às outras, podem
permitir que haja um emparelhamento desigual dos cromossomas homólogos
na meiose e levar à formação, durante o crossing-over, de um produto que vai
conter o exão 4 e o exão 6, mas que perdeu o exão 5, levando ao
aparecimento da deficiência de receptores de LDL.

Estrutura dos cromossomas:

A estrutura base da cromatina corresponde ao nucleossoma. O

nucleossoma é constituido por um conjunto de 4 histonas repetidas duas
vezes, H2A, H2B, H3 e H4. Á volta deste núcleo de histonas vai estar enrolado
do DNA formando o nucleossoma. A histona H1, permite selar as duas pontas
do DNA que se enrola em torno das histonas centrais, para impedir o seu
desenrolamento e completando assim a estrutura do nucleossoma final.

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 Quanto às características das histonas são proteínas pequenas,
carregadas positivamente com aminoácidos como a lisina e arginina, para que
possam interactuar mais facilmente com o DNA, já que este tem carga
negativa. A hipoacetilação destas histonas reprime a transcrição, enquanto que
uma hiperacetilação está associada à activação da transcrição.
No primeiro grau de empacotamento os nucleossomas encontram-se
ligados entre si apenas por um bocadinho de DNA.
O próximo grau de empacotamento da cromatina corresponde ao
selenoide. Aqui a porção de DNA que se localiza entre dois nucleossomas –
DNA ligação - e que está portanto muito vulnerável às DNAses, vai também
enrolar-se à volta das histonas H1.
A seguir ao solenoide passamos a ter uma estrutura proteíca chamada
scaffold, à qual o solenóide se vai associar em alguns pontos (SAR – scaffold
atachment regions), permitindo um empacotamento ainda maior.
A estrutura scaffold associada ao solenóide vai agora sofrer uma
extensa fosforilação com a formação de ligações internas entre as hitonas e
consequente maior empacotamento da cromatina.
Por último, há a associação de dois cromatídeos pelo centrómero
constituindo o cromossoma.

O relaxamento da estrutura da DNA implica o desenrolamento do

nucleossoma para que a RNA polimerase possa actuar, voltando à sua forma
enrolada após a sua passagem.
A cromatina pode portanto existir em duas formas: eucromatina e
heterocromatina. A heterocromatina é mais compacta e pode ser facultativa –
porque pode passar a eucromatina e ser transcrita, e outra constitutiva – que
nunca está acessível e nunca poderá ser utilizada para transcrição. A
eucromatina corresponde assim à forma de cromatina que pode ser transcrita.

Replicação
A síntese de DNA ocorre na direcção 5’ para 3’, porque as células
utilizam para síntese da cadeia nova núcleosideos fosfatados, pois a quebra da
ligação do grupo fosfato fornece a energia necessária para o estabelecimento
da ligação fosfodiéster.
No caso de DNA eucariota, existem sempre várias origens de replicação,
enquanto que nos procariotas existe apenas uma origem de replicação. A
velocidade de replicação bacteriana é portanto muito maior que a eucariota.

Experiências de Meselson e Stahl – a replicação semi-conservativa

Os cientistas pressupõem, numa primeira hipótese, que a replicação é

semi-conservativa, em que ao fim de um ciclo de replicação, cada molécula é
constituida por uma cadeia antiga e por uma cadeia nova.
A segunda hipótese seria a replicação conservativa, em que ao fim de
uma replicação existe uma molécula toda antiga, que se mantêm, e uma
molécula toda nova.
Uma terceira hipótese, dispersiva, sugere que não há regra alguma de
replicação, em que certas porções são conservadas e outras não.

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 Usaram bactérias marcadas radioactivamente com azoto 15 e
transferiram-nas para um meio de cultura com azoto 14.
Se a replicação fosse semi-conservativa, começando inicialmente com
duas cadeias com azoto 15, ao fim de um ciclo de replicação ao apareceriam
apenas cadeias hibridas, isto é, uma cadeia com azoto 15 e outra com azoto
14, de peso intermédio. Ao longo das gerações o número de moléculas apenas
com azoto 14, de cadeia leve, aumentaria.
Se a replicação fosse conservativa, nunca haveriam moléculas de DNA
híbridas, ou seja, ou há só moléculas de cadeia pesada azoto 15, ou só com
azoto 14, em que o número de moléculas de DNA leve aumentaria ao longo do
tempo.
Se for dispersiva é ao acaso, em que num primeiro ciclo são de tamanho
híbrido, com tendência para aumentar ao longo das gerações as de cadeia leve
de uma forma imprevisível.
Após a formulação das hipóteses e experimentação chegaram à
conclusão que a primeira hipótese – semi-conservativa – era a correcta.

Processo de replicação

Inicia-se na origem de replicação – local rico em adeninas em timinas,

uma vez que são em menor número as pontes de hidrogénio estabelecidas
entre elas, o que facilita a sua ruptura pelas DNAases.
Os processos de replicação são bidireccionais, em que a partir da
origem de replicação esta poderá ocorrer nos dois sentidos, originando duas
forquilhas de replicação de cada lado.

1 – Replicação procariota

Sendo as cadeias de DNA antiparalelas, durante a replicação há uma

cadeia que é sintetizada de 5’ para 3’ – cadeia continua/leading e outra de 3’
para 5’ – cadeia lagging, composta por fragmentos de Okazaki.

O DNA procariótico é circular e possui apenas uma origem de

replicação, chamada OriC. Ela ocorre a partir desta origem, bidireccionalmente,
e prossegue ao longo de toda a molécula até que as duas moléculas se
separem.
Para além desta origem de replicação, são também necessárias
proteínas que vão permitir o início da replicação pela separação das duas
cadeias mãe:
- DnaA – ligam-se na região rica em A-T levando à separação das cadeias máe
junto ao local de replicação.
- DnaB – funciona como helicase quebrando as pontes de hidrogénip
- DnaC – elo de ligação entre a DnaB e a DnaG
- DnaG – funciona como primase, necessária para síntese de fragmentos de
Okazaki, pela formação de primers de RNA.
- Dna girase – desenrola a porção à frente da helicase para que esta possa
continuar a separar as cadeias mãe..
- SSB – ligam-se a porções de cadeia simples para evitar que elas se voltem a
unir e possam ser replicadas, mas também para as proteger de ataques de
DNAases.

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 O conjunto de DnB,C e G constituem o primossoma, fundamental para a
replicação da cadeia lagging, apenas para que possa haver a síntese dos
primers de RNA.

A partir deste primer de RNA é depois possível a síntese do fragmento

de Okazaki por uma DNA polimerase.

Enzimas da replicação

Síntese da cadeia lagging:

A partir do primer, a enzima responsável pela síntese do fragmento de
Okazaki é a DNA polimerase III, que só para no primer de RNA à frente, ou
seja começa num primer e termina no primer seguinte.
O passo seguinte será a remoção dos primers e sua substituição por
DNA, pela DNA polimerase I.
Finalmente há a ligação dos fragmentos de Okazaki entre si por uma
ligação fosfodiester pela DNA ligase.

Síntese da cadeia leading:

É precisa apenas a DNA polimerase III de forma contínua. A mesma
DNA polimerase III faz a síntese da cadeia lagging e leading ao mesmo tempo.

Propriedades das DNA polimerases:

Todas elas, I, II e III, são capazes de polimerização de 5’ para 3’ e de
proofreading exonuclease de 3’ para 5’. Apenas a exonuclease de reparação
de 5’ para 3’ pertence à DNA polimerase I, que lhe permite retirar e colocar
nucleótidos ao mesmo tempo.

2 – Replicação eucariota:
Existe uma DNA polimerase para cadeia lagging e outra para a cadeia
leading.
Existem 5 tipos de DNA polimerases em eucariotas. Apenas duas delas
estão envolvidas na replicação do DNA nuclear, a alfa e a delta. A alfa faz
síntese da cadeia lagging enquanto que a delta a da cadeia leading. A alfa têm
igualmente a função de primase, sintetizando os primers.
Quanto às outras 3, a DNA polimerase beta e epslon têm funções
semelhantes de reparação, à DNA polimerase II no caso da beta ou à DNA
polimerase I e II no caso da epslon, não participando na replicação
directamente. A DNA polimerase gama, é mitocondrial, e têm uma função
semelhante à DNA polimerase III procariota, por fazer a síntese das duas
cadeias.
Existem igualmente DNA ligases para unirem os fragmentos de Okazaki,
topoisomerases I e II, semelhantes à DNA girase, e ainda helicases
A cadeia leading necessita apenas na DNA polimerase delta, mais
nenhuma outra enzima acessória.

No caso dos eucariotas, as extremidades dos cromossomas –

telómeros, necessitam da enzima telomerase, que adiciona simplesmente um
primer de RNA necessário para que a DNA polimerase possa actuar. A
replicação dos telómeros é unidireccional.

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 Os procariotas não tem este problema porque o seu DNA é circular, não
tendo por isso extremidades problemáticas.

4 – DNA mitocondrial – a origem de replicação não coincide nas duas

cadeias, começando em alturas diferentes para ambas. Começa por ser
unidireccional, aparecimento exclusivo da forma D, mas acaba por se tornar
bidireccional, havendo uma cadeia que acaba primeiro do que a outra.

5 – Replicação Rolling-circle – único processo de replicação

puramente unidireccional, em que há replicação apenas de uma das cadeias,
uma ou mais vezes. Inicia-se com uma quebra na origem de replicação, em
que vai ocorrendo replicação à volta do DNA circular.
Ocorre durante a conjugação nas bactérias.
Posteriormente há a quebra do produto final em porções unitárias que
são depois duplicadas, ou o inverso, com a duplicação primeiro do produto final
e posterior quebra nos constituintes unitários. Em ambos os casos ficamos com
uma molécula de DNA circular.