Tema 5.

Enzimas 1

TEMA 5. ENZIMAS

1. Introducción

2. Las enzimas como catalizadores

3. Nomenclatura y clasificación de enzimas

4. Cofactores enzimáticos

5. Modelos de actuación de las enzimas

6. Cinética enzimática

1.- Introducción

Las enzimas son proteínas especializadas en la CATÁLISIS de las reacciones

biológicas. Se trata, pues, de sustancias naturales que se caracterizan por su alto poder

catalítico y por su alta especificidad (por uno o más sustratos). El nombre de enzima

("en la levadura") no se empleó hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que

ciertos catalizadores biológicos intervenían en la fermentación del azúcar para formar

alcohol (de ahí que inicialmente se conocieran como fermentos). Así en 1835, Berzelius

descubrió que el almidón se hidrolizaba más rápidamente y con más eficiencia, en una

disolución de destace de malta (actualmente identificada como una enzima), que en una

disolución de ácido sulfúrico. En 1897, Büchner, consiguió extraer las enzimas que

catalizaban la fermentación alcohólica de las células de levadura. No obstante hubo de

esperar hasta 1926, cuando Sumner consiguió purificar y cristalizar por primera vez una

enzima, una ureasa, demostrando su naturaleza proteica. En la actualidad se conocen

más de 2000 enzimas diferentes, muchas de las cuales se han aislado en forma pura y

homogénea.

2. Las enzimas como catalizadores

La función principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las

reacciones de los seres vivos. Como tales catalizadores tienen ciertas características que

vamos a estudiar a continuación. Todas las reacciones químicas tienen lugar porque

cierta fracción de la población de moléculas reactantes, poseen la suficiente energía como

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para alcanzar un estado activado, llamado estado de transición, en el que es muy elevada

la probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los productos.

Este estado de transición reside en la cima de la barrera energética que separa los

reactantes de los productos, como muestra la Figura 1. En ella se observa el diagrama de

energía para una reacción química , no catalizada y catalizada; donde la energía libre de

activación es la cantidad de energía necesaria para llevar todas las moléculas de un mol

de sustancia, a una temperatura determinada, al estado de transición.

Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad

de una reacción química. Uno de ellos es la elevación de la temperatura (ya que provoca

un incremento en la velocidad de vibración de las moléculas); el otro consiste en utilizar

un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio

activándolos, produciendo un estado de transición de menor energía que en la reacción

no catalizada. Una vez formado los productos el catalizador queda libre, y puede ser de

nuevo utilizado. La Tabla 1, muestra una comparación de las energías de activación para

la descomposición del peróxido de hidrógeno, en ausencia o presencia de un catalizador.

En ella se puede apreciar como el catalizador enzimático baja aún más la barrera

energética. Esta es una característica común de las enzimas debido a su alta

especificidad por los sustratos, la cuál puede ser absoluta para un único sustrato, o

relativa cuando permite la reacción de compuestos diferentes pero con una estructura

similar.

La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada

célula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas

combinaciones posibles entre las reacciones químicas que estos compuestos pueden

experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera específica, aquellas

reacciones que son esenciales e indispensables para que la célula viva.

3. Nomenclatura y clasificación de las enzimas

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Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al nombre del

sustrato, es decir, la molécula sobre la cuál ejerce su actividad catalítica. Por ejemplo la

ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrólisis de la arginina.

Otras enzimas han recibido su nombre en función del tipo de reacción que catalizan, así

la lactato deshidrogenasa cataliza la reducción de piruvato a lactato (última etapa de la

glucolisis). Incluso algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre,

sin dar información alguna del sustrato o la reacción que catalizan (tripsina).

No obstante existe una clasificación sistemática de las enzimas que las divide en 6

grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases. La Tabla 2

recoge dicha clasificación:

1: oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción), 2: Transferasas (transfieren

grupos funcionales), 3: Hidrolasas (reacciones de hidrólisis), 4: Liasas (reacciones de

adición a los dobles enlaces), 5: Isomerasas (reacciones de isomerización), 6: Ligasas

(formación de enlaces con consumo de ATP).

4. Cofactores enzimáticos

La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como

proteína, mientras que otras necesitan, además uno o más compuestos no proteicos,

llamados cofactores. El cofactor (Fig.2) puede ser un ion metálico o bien una molécula

orgánica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El complejo

enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se

separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es inactiva catalíticamente, se

designa con el nombre de apoenzima. Las Tablas 3a y 3b recogen algunas enzimas que

precisan iones metálicos y coenzimas.

En las enzimas el ion metálico puede actuar como:

1) centro catalítico primario,

2) grupo puente para reunir el sustrato y la enzima,

3) agente estabilizante de la actividad enzimática (conformación).

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Por su parte cada uno de las coenzimas catalogados contiene, como parte de su

estructura, una molécula de alguna vitamina, (sustancias orgánicas que, en cantidades

mínimas, son vitales para el funcionamiento de todas las células, y deben figurar en la

dieta de algunas especies). Las coenzimas actúan por lo general como transportadores

intermedios de átomos específicos o de electrones.

Aquellos cofactores que están fuertemente unidos a la apoenzima son

denominados grupos prostéticos; en otros casos los coenzimas están unidos débilmente a

la apoenzima y actúan fundamentalmente como uno de los sustratos específicos de la

enzima.

5. Modelos de actuación de las enzimas

Para explicar la actividad catalítica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo

cíclico general, en dos etapas, que se representa en la figura siguiente.

S + E <=====> [ES] < = = = = = > P + E

En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molécula de sustrato (S), para

formar el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se

fragmenta dando lugar al producto (P) y al enzima (E), que vuelve a estar disponible

para reaccionar con otra molécula de sustrato. Por lo general, la molécula de enzima es

mucho mayor que la del sustrato (Fig.3) por lo que sólo una pequeña parte de la enzima

está implicada en la formación del complejo; esta región que interacciona con el sustrato

y en la que tiene lugar la reacción, se denomina sitio activo de la enzima. El centro activo

es una región tridimensional específica con una única distribución de los grupos que

posibilitan la unión de la enzima al sustrato (estos grupos no tienen por qué ser

necesariamente consecutivos) y reciben el nombre centros catalíticos.

El modelo más conocido sobre el mecanismos de reacción de las enzimas, es el de

Fischer, quien propuso que la molécula de sustrato se adapta al centro activo de la

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enzima del mismo modo que lo haría una llave al encajar en una cerradura, es decir, que

tienen una relación complementaria. En la Figura 3A se esquematiza este modelo. No

obstante, el inconveniente de esta hipótesis es que si el centro activo posee una

estructura prediseñada para el sustrato, caso de que sea reversible el proceso, a la vez

debe estar perfectamente diseñado para que también encaje el producto de la reacción.

Otra hipótesis más moderna es la del enzima flexible o de ajuste inducido (modelo de

Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad previa

geométricamente rígida y preexistente, sino que debe tener una disposición espacial

precisa y específica que se induce y adapta al sustrato cuando interacción con él (Fig.

3b). Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato,

mediante un mecanismo de distorsión (Figura 3C), se activan los enlaces que hay que

romper y se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formación del

producto resultante de la reacción catalizada y quedando la enzima libre para comenzar

de nuevo el proceso catalítico. La Figura 3d muestra el caso de una enzima

(carboxipeptidasa) que se comporta según el modelo de Kochland, en ella se puede ver

como en el sitio activo, en el que se encuentran los centros catalíticos (Arg-145, Glu-

270, tyr-248) y el cofactor (Zn), posee una conformación inicial que se modifica al

interaccionar con el sustrato y formal el complejo [ES.

6. Cinética enzimática.

Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a

las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, estas

muestran (además del fenómeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo

característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la

saturación con el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros activos de

todas las moléculas de enzima. La Figura 4 muestra el efecto de la concentración del

sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por un enzima, en la cuál se

distinguen tres fases:

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1) para una concentración baja de sustrato, la velocidad es directamente

proporcional a la concentración del sustrato (lineal) y la cinética se denomina de

primer orden.

2) para una concentración alta de sustrato, la velocidad de la reacción se hace

prácticamente constante e independiente de la concentración de sustrato, la

cinética se considera de orden cero.

3) en la zona intermedia de [S] la velocidad del proceso deja de ser lineal, y a esta

zona se la denomina de cinética mixta.

Este comportamiento es característico de la mayoría de las enzimas y fue

estudiado por Michaelis y Menten en 1913. La velocidad de una reacción catalizada

presentada en la figura, nos indica la cantidad de sustrato consumido o producto

formado por unidad de tiempo, en el Sistema Internacional se designa por “U” (unidad

de actividad enzimática) y corresponde a los µmoles de sustrato consumido en 1 min.

1 U = µmol S/min

A partir de la figura se definen dos parámetros cinéticos de gran importancia, que

son característicos de cada enzima, la velocidad máxima (Vmax), y la constante de

Michaelis (Km).

La velocidad máxima se obtiene cuando la velocidad de reacción se hace

independiente de la concentración de sustrato. Este valor depende de la cantidad de

enzima que tengamos.

La Km nos indica la concentración de sustrato a la cuál la velocidad de reacción

es la mitad de la velocidad máxima, este parámetro es independiente de la concentración

de enzima, y es característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios).

No obstante, la Km nos da más información, pues también nos indica la afinidad que

posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la Km. Así, cuanto
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menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato, necesaria para alcanzar la mitad de

la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad hacia ese sustrato, o dicho de otra

forma, si es poco afín necesitará más sustrato para alcanzar ese valor de velocidad.

La relación entre la velocidad de reacción, la concentración de sustrato, velocidad

máxima y la Km, quedan reflejadas en la ecuación de Michaelis-Menten:

v = Vmax [S] / (Km+[S])

a partir de ella podemos explicar matemáticamente las tres fases de la curva de Michaelis

(Fig.4). A baja [S (es decir, si Km >>> [S) el termino Km+[S podemos aproximarlo a la

Km, quedando un expresión del tipo:

v = k’ [S (cinética de primer orden)

por otro lado, a altas [S (es decir, Km<<<<[S) despreciaríamos Km frente a [S, con lo

que v = Vmax (que sería constante), la una cinética de orden cero y habríamos alcanzado

la saturación. El tramo intermedio, en el que la [S  Km correspondiente a una cinética

de orden mixto y se justifica directamente, con la ecuación de Michaelis.

Pero, veamos un ejemplo de la importancia que pueden tener estos parámetros,

en especial la Km. Algunos tipos de Leucemia (en la que los glóbulos blancos proliferan

anormalmente) pueden evitarse por la administración de una enzima la Asparraginasa,

que cataliza la reacción de hidrólisis de la Asn a Asp

Asn + H2O <======> Asp + NH+4

este descubrimiento condujo a la conclusión de que la Asn presente en la sangre es un

principio nutritivo para el crecimiento de los linfocitos malignos; el problema apareció

cuando se utilizaron distintas fuentes de asparraginasa, descubriéndose que no todas eran

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eficientes. Al final se encontró la razón. Estas enzimas de diferentes fuentes (animal,

vegetal o microbiana), tenían diferente Km respecto a la Asn. Como la [Asn] en la sangre

es muy baja, sólo aquellas enzimas con el valor de Km muy bajo (una alta afinidad),

serían capaces de provocar la hidrólisis de la Asn. Así, la enzima que presentaba menor

Km resultó ser la de una bacteria (E.Coli), utilizándose para detener la enfermedad.

Es pues de vital importancia conocer estos parámetros cinético. En principio,

podrían obtenerse a partir de la curva de Michaelis de la figura, pero existen métodos

gráficos más fiables que facilitan el cálculo de la Km y la Vmax, todos ellos se hacen en

base a transformaciones matemáticas de la ecuación de Michaelis y entre ellas la más

utilizada es la representación de Lineweaver-Burk también conocida como dobles-

inversos), en ella (Fig. 5) se representa 1/v frente a 1/[S, se obtiene una recta cuya

intersección con el eje de X es -1/km, y con el eje Y es 1/ Vmax, siendo la pendiente

Km/Vmax.