TERMINOLOGÍA CROMATOGRÁFICA

Curso Química Analítica Cualitativa

Jorge Yáñez S

Depto. de Química Analítica e Inorgánica

Facultad de Ciencias Químicas
Universidad de Concepción

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 TERMINOLOGÍA CROMATOGRÁFICA

Etapas de una cromatografía:

• Siembra o inyección de muestra
• Elución de fase móvil y solutos
• Detección de componentes separados

Siembra o inyección Detección de solutos

de solutos en mezcla en orden de salida

Fase Estacionaria Elución de solutos

Eluyente o fase móvil
(separación de solutos) separados

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• Siembra o inyección

• La siembra o inyección de la muestra corresponde a la incorporación de la mezcla de

solutos dentro del sistema fase móvil-fase estacionaria.
• Se siembra en unidades de volumen, por ejemplo mL o µl.

Ejemplos:

ü En una cromatografía planar como la cromatografía en capa fina o papel la muestra

se siembra sobre la fase estacionaria en la parte inferior del papel o poco sobre el
nivel inicial de la fase móvil que asciende por efecto de impregnación.

ü En una cromatografía en columna la muestra se siembra en la parte superior de la

columna y luego se agrega la fase móvil que desciende a través de la columna por
gravedad.

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 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Fase estacionaria
Pipeta de papel
siembra

Fase móvil líquida

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Pipeta: siembra
de muestra

muestra con 2
solutos

Columna abierta
rellena con
Fase estacionaria

Filtro

salida de
solvente y solutos solvente solvente soluto 1 soluto 2

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA CERRADA

columna cerrada
rellena con
fase estacionaria
Flowrate: 2 mL/min

salida de
válvula de injección
solvente y solutos
Fase móvil bomba impulsora
o de fase móvil
solvente

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• Elución

• Proceso que consiste en hacer pasar la fase móvil (líquido o gas) a lo largo de la fase
estacionaria
• Su fin es arrastrar los solutos a través de la columna y finalmente sacarlos de ella.

• El consumo de fase móvil o eluyente durante este proceso se mide en flujo, es decir
volumen por unidad de tiempo, por ejemplo, 1 mL/min.

• La elución se puede realizar usando un solvente o una mezcla de solventes miscibles

que permita la separación óptima de los solutos.

• Muy importante en su capacidad de elución de la fase móvil es:

- composición química (polaridad)

- pH
- flujo

Estas variables que deben ser optimizadas experimentalmente.

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• Forma de elución según el tipo de Cromatografía:

1. Cromatografía en capa fina: la elución es por impregnación de la FM en FE.

2. Cromatog. en columna abierta: la elución se produce por descenso de la FM a

través de la FE, simplemente por gravedad.

3. Cromatog. en columna cerrada: la elución se produce al ser la FM impulsada

mediante una bomba través de la FE.

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• Detección

Consiste en la demostración de la presencia del soluto en el eluido mediante alguna

evidencia física de éste.

Ejemplo:
Propiedad óptica como color (absorción de luz), fluorescencia, refracción de luz
Propiedad eléctrica como carga (conductividad).

• Los detectores entregan una respuesta eléctrica (voltaje o corriente) al detectar los
solutos que salen en el eluido (voltaje v/s tiempo).

• Esta respuesta es proporcional a la concentración del soluto detectado y puede ser

representada gráficamente dando origen a un cromatograma.

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Los detectores más comunes usados en cromatografía líquida son:

a) Detector ultravioleta - visible,

Detecta compuestos coloreados o que absorven luz en
el rango ultravioleta o rango visible del espectro.

b) Detector de fluorescencia
Detecta compuestos fluorescentes.

c) Detector refractométrico,
mide índice de refracción de los compuestos, que es
una característica específica de cada compuesto, por
ejemplo en identificación de azúcares.

d) Detector de conductividad
Detecta compuestos con carga eléctrica o conductores.

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 Características fundamentales de un sistema de detección:

Sensibilidad : Respuesta de un detector a una cantidad dada de analito.

La sensibilidad es una medida relativa que depende de las condiciones de
medida.

Limite de detección: concentración mínima de un analito que puede ser determinada

por un detector.
Según IUPAC corresponde 3 veces la desviación estándar de los
valores de 30 determinaciones del blanco, donde la concentración
del analito es cero.

Selectividad: Capacidad de un detector o un reactivo de responder a la presencia de un

soluto o un tipo se solutos específicos.

Rango lineal: Rango de concentración de un analito donde la respuesta del detector es

proporcional a una variación de la concentración (normalmente
incrementos de 5%).

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El límite de detección puede ser informado de dos formas:

• Límite de detección relativo:

expresado en base a una concentración. Por ejemplo, la concentración
mínima detectable de cloruro en agua de regadío por cromatografía iónica
es 10 ng/mL (ppb).

• Límite de detección absolutos:

expresado en base a una cantidad. Por ejemplo, la cantidad mínima

detectable de cloruro en agua de regadío por cromatografía iónica es 1 ng,
ya que se inyecta 0,1 mL de muestra para el análisis.

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 CROMATOGRAMA

• Un cromatograma es la presentación gráfica de los compuestos después que éstos han

sido separados en la fase estacionaria y el proceso de elución ha sido terminado.

• Tipos de Cromatográmas:

1. Cromatografía planar:

• El cromatograma estará dado por los compuestos separados en función de la distancia

recorrida en la fase estacionaria por cada uno de ellos.

• Este tipo de cromatogramas o revelados son típicos de la cromatografía en capa fina o

en papel, donde el cromatograma será envidenciado después de aplicar un reactivo
colorante.

• El reactivo revelador reacciona con todos los solutos separados y forma productos
coloreados sobre la fase estacionaria claramente distinguibles sobre la placa o papel.

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Por ejemplo: el sulfuro de hidrógeno con metales por formación de sulfuros insolubles y
coloreados. En este caso el cromatograma será más bien un “revelado” de los solutos

(a)
1 2 3 4
cromatograma
revelado en
papel

Punto de
siembra
frente del
solvente

4
1
(b)
2
3 cromatograma
en función
de distancia

0 distancia desde el punto de partida, cm

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2. Cromatografía en columna

• Los compuestos que salen de la columna son detectados en el líquido eluido.

• El detector del sistema, se encuentra a la salida de la columna y genera una señal o

respuesta en función a la concentración de cada soluto detectado en el líquido eluido.

• Como tiempo inicial (t0), se considera al momento de la introducción de la muestra al

sistema cromatográfico y se termina cuando se eluye el último compuesto separado
desde la columna.

• Al terminar el proceso de elución, el resultado gráfico de la salida de los compuestos

separados es el cromatograma, donde se representa:

respuesta o señal del detector v/s tiempo de elución.

• Obviamente el soluto que presenta menor afinidad por la fase estacionaria avanzará
más rápido y saldrá primero de la columna siendo éste el primero en ser detectado por
el detector.

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 4

1
Respuesta
del
2 cromatogram a
detector
3 en función
del tiempo

frente del tiempo de elución (salida de la columna), min

solvente

Cada pico del cormatograma representa la elusión de un soluto separado desde la columna

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Forma típica de un pico o peak cromatográfico y sus características.

• Los picos están representados por:

• la altura
• el ancho

• Altura y área son proporcionales a la concentración de soluto detectado.

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 INFORMACION CUALI Y CUANTITATIVA DEL CROMATOGRAMA

Mediante el manejo dos datos del cromatograma se puede extraer valiosa información
cualitativa para la identificación de los compuestos separados a través:

- tiempos de retención ⇒ identificación de compuestos

- área del peak o su altura ⇒ cuantificación de compuestos

• Tiempo de retención de los solutos

• Se define como el tiempo que demora todo soluto desde su inyección hasta la
llegada al detector pasando por la columna.

• Cada soluto tendrá un tiempo de retención característico que identificará su

comportamiento cromatográfico y lo diferenciará de los otros solutos.

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Tiempo de retencion ajustado:

Tra = Tr’ = Tr - t m

Tm = tiempo que demora en salir la fase móvil de la columna

Tr = tiempo que demora en salir el soluto disuelto en fase móvil de la columna

• En cromatografía en capa fina los solutos se caracterizan por su coeficiente de

migración, para cuyo cálculo en vez de usar el tiempo como referencia se usa la
distancia recorrida por los solutos con respecto al avance del solvente.

• Dicho valor se conoce con el nombre de coeficiente de migración (Rf).

distancia recorrida por el solvente

Rf =
distancia recorrido por el soluto

Rf es una característica de cada soluto a T, P , solvente y Q constante

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 TEORÍA DE PLATOS TEÓRICOS

• Trata de explicar la separación de compuestos en mezcla mediante la formación de

sitios de equilibrio, en donde se producen los repartos de los solutos entre la fase móvil
y estacionaria.

• Cada sitio de intercambio se llamará un “plato”, término que deriva de los platos de
una columna de destilación, en donde se produce la condensación del líquido destilado
(equilibrio líquido/gas).

• Un plato teórico en cromatografía está definido como un evento teórico en el cual se

produce un equilibrio de intercambio (sitio de reparto), por ejemplo, 1 tubo en una
extracción por solventes

• Como la cromatografía es un proceso contínuo se consideran segmentos imaginarios en

la columna (fase estacionaria) donde se forman sitios de intercambio con su coeficiente
de distribucion correspondiente.

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Cada segmento imaginario o sitio de reparto es un “plato teórico”, definido como:

AEPT = L / N

AEPT = altura equivalente de platos teóricos

L = largo de la columna
N = segmento de la columna donde hay un equilibrio

• Normalmente una columna tiene muchos “platos teóricos” (miles)

• Mientras más platos teóricos tengan, mayor es su capacidad de separación de

componentes, ya que un mayor número de sitios de reparto conlleva a una separación
más efectiva.

• Las columnas modernas usan fases estacionarias con una gran cantidad de platos
teóricos para lograr una eficiente separación de compuestos parecidos.

“ Platos teóricos - sitios de intercambio - separación más efectiva “

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• La gran cantidad de sitios de intercambio se ha logrado usando fases estacionarias
soportadas en gránulos de pequeño tamaño, para así aumentar la superficie de contacto
entre ambas fases
• Las columnas actuales presentan tamaños de rellenos tan pequeños (µm) en las
columnas, la fase estacionaria opone una tremenda resistencia al paso de la fase móvil
(resistencia al paso de un fluido).
• Por lo tanto es necesario aplicar altas presiones para vencer esta resistencia (> 100
atmósferas o bar).

• Estas condiciones extremas de pequeños tamaños de material de relleno, altas presiones

y alta capacidad de separación, requiere el uso de sistemas altamente herméticos,
resistente a altas presiones y ambiente químico corrosivo.

• Debido a estas características se habla actualmente de la cromatografia líquida de alta

eficiencia, que se abrevia (HPLC) del inglés High Preformance (Pressure) Liquid
Chromatography.

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