Universidad Central del Ecuador

Facultad de Ciencias Médicas

Ciencias Biológicas y Ambientales

Integrantes:

Mariana Duque Gabriela Quinto Esteban Navarro

Fecha: 18/05/2016

Cuenta en placa de bacterias

Se determina el número de microorganismos en una muestra en

relación a las colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras
de Colonias).

Se utilizan principalmente para la cuantificación de bacterias,

levaduras y hongos filamentosos.

La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias”

o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera
que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección
después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura
adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos.

Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales
necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica para realizar este
procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico”

El medio de cultivo no debe fundirse más de una vez, y debe mantenerse en baño de agua
regulado a 45 °C, durante el tiempo suficiente para que alcance esta temperatura, y hasta su
utilización.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

Procedimiento

Técnica de vertido en placa.

1. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación y la adición de
medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los
datos pertinentes antes de inocular.

2. Inocular por duplicado, 1 mL de la dilución correspondiente en cada caja, mediante pipeta

estéril. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a 45 °C. Para homogenizar, mezclar
mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en
sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la
completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las
cajas. Dejar solidificar. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al
diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20
minutos.

3. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de
esterilidad.

4. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera.

Resultados:

Se consideran “representativas“ las cajas que tienen un número de colonias dentro del rango de
sensibilidad del método, en este caso, entre 25 y 250 UFC.
NUMERO MÁS PROBABLE (NMP)

Este método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y

agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.

El método consiste en la estimación del número de microorganismos viables a partir de diluciones

sucesivas (1/10) partiendo de 1 g de suelo o sedimento en base húmeda o 1 ml de agua;
posteriormente, de tres o más de las diluciones se inoculan tubos con medio de cultivo con
sustratos y aceptores de electrones específicos. En este método se asume que en las series de
diluciones los microorganismos se encuentran distribuidos al azar y que al menos un
microorganismo generará crecimiento, produciendo una respuesta positiva (turbidez, cambio de
color del medio, producción de algún metabolito específico). Esta técnica se basa en la estimación
de la densidad bacteriana por el método estadístico de máxima probabilidad, utilizando la teoría
de las diluciones.

Para realizar la estimación microbiana se utiliza un mínimo de tres diluciones y un intervalo de 3 a

10 réplicas (“n” tubos de medio para crecimiento) por dilución; el número de diluciones y réplicas
utilizadas estará en función de la precisión requerida. Actualmente, existen tablas estándar como
las publicadas por la FDA o NACE para estimar el número de microorganismos más probable. Estas
tablas están limitadas a tres diluciones y a 3, 5 y 10 réplicas por dilución; sin embargo, también
existen programas de computadora (MPN CalculatorTM, “Chem SW”) para obtener la estimación
microbiana empleando más de tres diluciones y un número mayor de réplicas.

Proceso o metodología en suelos

1. Muestras: Colectar asépticamente las muestras frescas de suelo (10 gr) de varios lugares,
u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcos.
2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células podrán ser
removidas y homogenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que contenga
9 ml de solución salina.
Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.
3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo 1 ml
a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en
10. Repita en serie el procedimiento de dilución hasta alcanzar la dilución 10-7.
4. Placas Petri: Dividir la placa Petri en cinco zonas de igual tamaño (marcador).
Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser
inculcado.
5. Inoculación: Transferir 5µl de la dilución
apropiada al área correspondiente. Repita esta
operación cinco veces por cada dilución.
6. Permita que el inoculo seque sobre el medio de
crecimiento. Selle la placa con una trilladle de
parafina, invierta la placa e inocule a 25ºC por 7
días.
7. Evaluación del crecimiento: Para cada dilución
es ascendencia evalué el crecimiento o No
 crecimiento sobre cada replica inoculada.

Resultados

Con la tabla, determina la población estimada para su muestra.

Si el patrón de respuestas no se encuentra en la tabla, se promedia el valor estimado del patrón

superior e inferior en la tabla. Estos valores son el NMP sin ajustar. Para calcular la densidad
poblacional de la muestra, entonces tendrá que multiplicar el NMP sin ajustar por el factor de
corrección de volumen, por el reciproco del factor de dilución menor inoculado en la placa.
 De acuerdo con estas tablas, multiplicar el número de microorganismos por la dilución más
baja inoculada.

NMP/g suelo húmedo = Vt * FD.

NMP/g suelo húmedo = número más probable de microorganismos por g de suelo húmedo.

Vt = valor de tablas (NACE, 1990).

FD = factor de la primera dilución.

Cuenta de microorganismos por la humedad de la muestra para obtener los resultados en

base seca.

NMP/g suelo seco = NMP x (100/(100-h)).

h = humedad del suelo con respecto al peso húmedo (%).

RECUENTO DE MICROORGANISMOS

El recuento es un procedimiento que permite conocer el número de microorganismos que hay en

una muestra. Para este propósito, existen diferentes métodos mediante los cuales se pueden
contar microorganismos vivos (recuento de viables), o bien vivos y muertos (recuento de totales).

A su vez todos los tipos de recuento, se pueden clasificar en directos e indirectos. Un recuento
directo es aquel en el que se cuentan las células por observación directa al microscopio, y el
recuento indirecto es aquel en el que se determina el número por crecimiento o alguna propiedad
de los microorganismos.

Recuento de Breed
Es un método que entrega recuento de totales. Se utiliza para recuento de microorganismos en la
leche.

Para realizar este método usted, sobre un porta objetos limpio y desengrasado dibuje con un lápiz
un cuadrado de un centímetro cuadrado.

Homogenice la muestra problema y con una pipeta Pasteur coloque una gota de la muestra
(aproximadamente 0,01 ml) sobre el cuadrado y extiéndala bien sin salirse de él.

Seque y fije al calor suavemente, luego cubra la extensión con cristal violeta durante un minuto.
Lave con agua y seque. Observe al microscopio con aceite de inmersión.

Cuente el número de microorganismos en varios campos, no menos de 5.

Luego calcule el promedio de microorganismos contados y multiplique por 3000 (área del campo
del microscopio) y por 100 (inverso del inoculo colocado en el cuadrado).

Nº de células/ml = X de células por campo x 3000 x 100 3000, corresponde al área del campo del
microscopio y debe ser calculado para cada uno, o referirse al fabricante. 100, corresponde al
inverso del inoculo depositado en el portaobjeto.

Recuento con cámara de Petroff-Hauser o Hemocitómetro.

Este método consiste en colocar una diminuta gota de cultivo en un portaobjetos especial llamado
Hemocitómetro (porque fue ideado originalmente para el recuento de glóbulos rojos).

La muestra queda depositada en un espacio de 0,02 mm entre el porta y el cubreobjeto.

La excavación completa tiene 25 cuadrados cada uno dividido en 16 cuadrados más pequeños.

Para calcular el número de células por ml de muestra, se debe hacer la siguiente operación:

- Contar las células presentes en varios cuadrados grandes y sacar un promedio.

- Multiplicar el promedio por 25 (con esto se obtiene el Nº de células en un mm 2 ).
- Multiplicar por 50
(esto entrega el número de
células en un mm3 ).
- Multiplicar por 1000,
para transformar todo a cm3 .
Nº cel/ml = X cel x 25 x 50 x
1000.

Este recuento representa la

cantidad de células vivas y
muertas. El método es aplicable
a cualquier suspensión de
partículas microscópicas.
 PREGUNTAS ESTRUCTURADAS

Escoja lo correcto:

La Técnica del Número más probable (NMP) en análisis microbiológicos tiene como
características:

a) Se emplea cuando una aplicación cualitativa de elementos individuales no es

factible
b) Se emplea cuando una aplicación cuantitativa de elementos individuales es factible
c) Se emplea cuando una aplicación cuantitativa de elementos individuales no es
factible
d) Determina la presencia de atributos específicos de microorganismos aerobios en
copias obtenidas en disoluciones consecutivas a partir de muestras de suelos u otros
ambientes.
e) Determina la presencia o ausencia de atributos específicos de microorganismos en
copias obtenidas en disoluciones consecutivas a partir de muestras de suelos u otros
ambientes.
f) La precisión del NMP aumenta a medida que el número de tubos es menor.
g) La precisión del NMP aumenta con el número de tubos que se usa
h) Es una estrategia eficiente de estimaciones de densidad de poblaciones
i) Es una estrategia eficiente de estimación de riqueza en poblaciones microbianas
1) a, d, f, i
2) b, e, g, i
3) a, d, f, h
4) c, e, f, h
5) c, e, g, h

Ordene los pasos que se realizan en el proceso del Análisis de microorganismos por el método del
NMP (Número más Probable)

1. Colección 2. Placas Petri 3. Dilucion en 4. Inoculación de

aséptica de la dividida en 5 serie de 1 en 5µl de la
muestra zonas de igual 10 dilusion
tamaño
5. Evaluación de 6. Extracción de 7. Permitir que 8. Datos y análisis
crecimiento microorganism el inóculo se utilizando los
por disolución os viables seque sobre valores de la
el medio de tabla dada
crecimiento
y sellar la
placa con
tirillade
parafina
 1) 1, 2, 4, 7, 3, 6, 5, 8
2) 1, 3, 6, 7, 4, 2, 5, 8
3) 1, 6, 3, 2, 4, 7, 5, 8
4) 1, 6, 7, 4, 2, 3, 5, 8
5) 1, 2, 6, 3, 4, 7, 5, 8
6) 1, 3, 6, 2, 4, 7, 5, 8

Seleccione las características apropiada de biomasa microbiana:

1) La biomasa microbiana (BM) define el componente funcional de la microbiota del suelo,

responsable principalmente de la descomposición de la materia orgánica

2) Considerado que puede ser usado como un indicador ecológico que no es sensible a los
cambios ambientales

3) La biomasa de microorganismos es una excelente fuente de nutrientes

a) 1,3 b)2,3 c) 1,2 d) 1,2,3