MICRORGANISMOS INDICADORES – uso e interpretações

INTRODUÇÃO

A qualidade de um alimento, segundo KRAMER & TWIGG (1970), é o conjunto de

características das diferentes unidades individuais de um produto que determina o seu
grau de aceitabilidade (EIROA, 1977).
Embora se utilize geralmente o termo “qualidade” no singular para se referir a
determinado alimento, é preciso levar em conta que essa qualidade é resultante de uma
soma de certo número de atributos, alguns deles positivos e desejáveis, outros negativos,
indesejáveis e, às vezes até perigosos.
Dentre esses atributos alguns são óbvios ao consumidor, tais como a cor, o odor,
a textura, o sabor: são geralmente, as qualidades pelas quais o comprador julga se
comprará ou não determinado alimento.
Existem porém, outros atributos não tão óbvios, como valor nutricional, presença
de aditivos químicos, resíduos de pesticidas, traços de metais, microrganismos, toxinas,
que constituem geralmente objeto de legislações e regulamentos e aos quais o
comprador não tem acesso com facilidade (GOMEZ RUIZ, 1973).
Dentro dos atributos indesejáveis, pode-se estabelecer certa escala de prioridade
quanto aos riscos que apresentam ao consumidor, da seguinte maneira:
• Riscos microbiológicos;
• Riscos de uma nutrição deficiente;
• Riscos pela presença de tóxicos ambientais
• Riscos ocasionados por tóxicos naturais (compostos tóxicos naturalmente presentes
em plantas e animais);
• Riscos provocados por resíduos de pesticidas;
• Riscos devidos a aditivos químicos.

TRUSWELL e cols. (1978) consideram que o risco de um indivíduo adquirir uma

enfermidade de origem microbiana através de um alimento e 1.000 vezes maior do que
por poluentes ambientais, como metais pesados, por exemplo, e 100.000 vezes maior do
que por pesticidas. Isto demonstra que a qualidade microbiológica de um alimento,
portanto, é o atributo mais importante, devendo ser controlada adequadamente por duas
razões fundamentais:

• Para prevenir as toxinfecções de origem alimentar;

• Para retardar ou inibir a contaminação e a multiplicação microbiana, causadora da
deterioração dos produtos, melhorando-os, assim, quanto à qualidade e conservação.
 O controle de qualidade microbiológica dos alimentos surgiu, inicialmente, como
uma necessidade para prevenir e controlar surtos de toxinfecções produzidos pela
ingestão de alimentos contaminados com patógenos. Nos últimos anos, uma série de
fatores têm contribuído ao aumento das doenças de origem alimentar, como:
• produção de alimentos em grande escala;
• transporte dos alimentos a grandes distâncias do seu lugar de fabricação;
• uso crescente de alimentos instantâneos, semipreparados, em pó e congelados;
• manutenção incorreta dos alimentos em estabelecimentos comerciais;
• colocação dos produtos por períodos prolongados a temperaturas ideais ao
desenvolvimento de patógenos;
• novas práticas de cria e abate;
• fabricação de alimentos mediante processos tecnológicos novos e uso de embalagens
em tipos de recipientes, às vezes, insuficientemente avaliados quanto aos riscos que
apresentam.

Segundo dados encontrados na literatura, desde aproximadamente 1880 é

conhecida a contaminação dos alimentos por microrganismos produtores de
enfermidades (JAY, 1973; APHA, 1992). A partir dessa época, já são relatados casos de
doenças transmitidas por alimentos, entre elas as toxinfecções alimentares.
- Antes do desenvolvimento dos métodos de pasteurização era freqüente a
transmissão através do leite de enfermidades como brucelose, escarlatina,
febre tifóide, difteria e outras.
- Antes da obrigatoriedade da inspeção dos animais de açougue também era
freqüente a transmissão através da carne, de enfermidades dos animais
transmissíveis ao homem como a brucelose, tuberculose, etc.
- A contaminação dos alimentos durante a elaboração, quer seja por
manipuladores, por equipamentos e etc., constitui a outra fonte de
transmissão de enfermidades, sendo, atualmente, uma das mais importantes
no desenvolvimento de surtos de toxinfecções, especialmente com
determinados alimentos.

O ideal, para assegurar a qualidade microbiológica de um alimento, seria a

análise completa de todas suas unidades, no sentido de demonstrar a ausência de
microrganismos patogênicos e baixo nível de deteriorantes. Em geral, não é
possível examinar cada produto (por isso se faz amostragem) ou alimento e, muito
menos, investigar a presença dos patogênicos mais importantes (a pesquisa
desses implica em diferentes problemas), o que traz uma série de dificuldades.
 Fatores que dificultam a pesquisa de patogênicos (MARTINEZ-MANZANARES e
cols., 1991):

1. Alto custo dos materiais e equipamentos utilizados nas técnicas de isolamento;

2. Técnicas muito sofisticadas → demoradas;
3. Quais patogênicos pesquisar ?;
4. Seria demorada a emissão de laudos → alimento não pode esperar.
Na prática utiliza-se da pesquisa de microrganismos indicadores e somente
alguns patogênicos ou, quando ocorre um surto, dos prováveis agentes envolvidos.
Os microrganismos indicadores foram inicialmente utilizados com o propósito de
determinar o grau de contaminação fecal de águas naturais e, só mais recentemente, na
análise de alimentos (MARTINEZ-MANZANARES e cols., 1991)
Atualmente, os microrganismos indicadores são utilizados tanto na avaliação das
condições higiênico-sanitárias da produção de determinado tipo de alimento, realizado em
nível industrial por serviços de controle de qualidade, como na avaliação de sua
microbiologia como um todo, no sentido de comparar com padrões oficiais, realizado por
órgãos oficiais.
Microrganismos indicadores são microrganismos ou grupos cuja identificação
qualitativa e quantitativa pode proporcionar informações sobre as condições higiênico-
sanitárias do produto em análise. Através da utilização desses microrganismos existe a
possibilidade da verificação da qualidade do alimento, como foi produzido e qual a
perspectiva de sua vida comercial.

Segundo SANTIAGO (1972) o objetivo da determinação de alguns grupos de

indicadores, em particular no leite, não é o de determinar quantos
microrganismos de um determinado tipo existe em uma amostra, mas identificar
o produtor que está fazendo um trabalho inferior com as ferramentas de que
dispõe.

Com a utilização dos indicadores:

- se analisa o alimento com vistas a risco → se verifica o aspecto sanitário;
- se verifica as condições da produção do alimento → aspecto higiênico →
controle de qualidade.
Os INDICADORES são considerados ainda como determinados microrganismos
ou grupos de microrganismos, através dos quais pode-se determinar:
- qualidade da matéria prima;
- condições de trabalho das etapas tecnológicas;
 - potencial de risco, dependendo do grupo utilizado e do momento de sua
determinação dentro do fluxograma de produção de determinado tipo de alimento.

Como características os indicadores devem:

Ser de fácil determinação através de processos rápidos e seguros;

Ser determinados através de processos não muito caros;

Apresentar resultados reprodutíveis;

Apresentar resistência igual ou maior que a dos patogênicos mais importantes no
alimento em estudo.

PRINCIPAIS GRUPOS DE INDICADORES

1. Microrganismos heterotróficos aeróbios ou facultativos, psicrotróficos, mesófilos e

termófilos viáveis. (muito usados para verificar aspectos higiênicos)
2. Bactérias anaeróbias.
3. Indicadores de contaminação fecal (aspectos sanitários)
3.1 Coliformes totais: pode conter mais de 20 espécies
3.2 Coliformes fecais: predominantemente E. coli
3.3 Escherichia coli
3.4 Família Enterobacteriaceae: importante como indicadores da contaminação de
ovos por salmonelas.
3.5 Enterococos(indicam basicamente contaminação fecal de origem animal).
3.6 Clostridium perfringens: utilizado como indicador de contaminação fecal em
água.

4. Outros indicadores: Streptococcus salivarum; S. aureus; Bactérias mesófilas

produtoras de esporos; clostrídios sulfito redutores; bolores e leveduras; microrganismos
halófilos, proteolíticos, lipolíticos e osmofílicos.
O grupo a ser escolhido dependerá da característica do alimento.

MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO E SIGNIFICADO DOS INDICADORES DE USO

CORRENTE.

1. Preparo da amostra: diluições (Apresentado no capítulo de amostragem)

2. Quantificação de microrganismos heterotróficos, psicrotróficos, mesófilos e

termófilos viáveis, através do método da contagem padrão em placas.
 Meio utilizado: Ágar padrão para contagem (PCA)
Técnica “pour plate”, em duplicata, das diluições que mais se adequarão, de forma
a se ter no final da incubação placas com números entre 25 e 250 colônias.
Temperatura e tempo de incubação:
psicrotróficos: 7oC / 10 dias
o
mesófilos: 35-37 C / 24 a 48 horas. Para produtos lácteos a temperatura deve ser
de 32oC.
o
termófilos: 55 C / 48 horas.
Contar placas que apresentem entre 25 e 250 colônias

Possibilidade quanto ao número de colônias em placas (Utilizando contador de

Quebec):

a. Número de col. entre 25 e 250 (duplicata)

a.1 Mesma diluição – Calcular a média das contagens das duas placas e
multiplicar pelo inverso da diluição inoculada. Resultado em UFC/g ou mL.
a.2 Diluições diferentes – Contar cada placa individualmente, multiplicar os
resultados pelo inverso da diluição de cada placa utilizada e calcular a média para a
obtenção do resultado final.
b. Todas as placas com mais de 250 colônias
b.1 Com número ≤ 10 col./ cm2 – Contar 12 quadrados de 1cm2 cada
(quadriculado na superfície de vidro do aparelho) sendo 6 quadrados consecutivos na
horizontal e 6 na vertical, tirar a média e multiplicar o resultado por 65 (65 cm2 = área total
da placa). O resultado final é obtido após a multiplicação pelo inverso da diluição da placa
utilizada.
b.2 Com número > 10 col./ cm2. Contar as colônias em 4 quadrados, tirar a
média e multiplicar o resultado por 65. O resultado final é obtido conforme item b.1.
c. Todas as placas com menos de 25 colônias
Contar a placa de menor diluição.
d. Nenhuma placa entre 25 e 250 colônias
Registrar o número mais próximo de 250.
e. Todas as placas sem colônias
Considerar a menor diluição
f. Placas com colônias invasoras (crescimento difuso)
Contar as colônias em uma parte da placa quando:
f.1 Bem distribuídas em áreas livres de invasão;
f.2 A área coberta por invasoras não exceda metade da placa;
 obs. Se a área inibida exceder a ¼ da área total, expressar o resultado como
inibidores do crescimento.

Interpretação:

Contagem alta de mesófilos

1. Matéria prima contaminada;
2. Condições inadequadas de higiene durante a produção;
3. Condições de tempo e temperatura inadequadas durante o processamento;
4. Ação conjunta dessas circunstancias.

Números altos de bactérias mesófilas indicam que houve possibilidade de

multiplicação, inclusive de patogênicos. A medida que aumenta o número de
microrganismos se incrementa a possibilidade de existir microrganismos patogênicos e a
presença de produtos tóxicos, resultantes do metabolismo microbiano. Assim sendo, os
mesófilos são indicadores também voltados aos aspectos sanitários do produto.
A quantificação de microrganismos psicrotróficos tem valor na avaliação dos
aspectos higiênicos da produção de determinado alimento, tendo em vista que são, na
sua maioria, microrganismos deteriorantes.
Quanto maior o número de microrganismos maior é o risco de decomposição
(FEHLHABER & JANETSCHKE, 1992). Populações entre 106 e 108/grama ou mililitro
indicam alteração evidente. Assim, a avaliação da população microbiano de determinado
alimento pode dar idéia da forma higiênico-sanitária da elaboração deste produto, bem
como da perspectiva de seu futuro em termos de “vida de prateleira” (TOMPKIN, 1983).

Limitações da contagem de mesófilos

1. Alimentos tratados pelo calor, frio ou dessecados, onde ela subestima a população
ativa antes do processo;
2. Alimentos refrigerados → mais indicado psicrotróficos;
3. Alimentos fermentados ou maturados, como salame, queijos, etc. → sem significado
pela impossibilidade de se diferenciar os possíveis deteriorantes ou patogênicos,
daqueles fermentadores.

3. Coliformes totais, fecais e Escherichia coli.

Dentre os indicadores, os coliformes são os mais utilizados quando se visa

aspectos sanitários e isso se deve a algumas características necessárias a indicadores
e que eles atendem com facilidade.
 Em 1887, Escherich descreveu um microrganismo ubiqüitário, isolado de fezes
humanas (Bacillus coli), que atualmente recebe o nome de Escherichia coli e que, em
1892, foi proposta por Shardinger de ser utilizada como indicadora de contaminação fecal
por ser mais facilmente isolada que a Salmonella (APHA, 1992).
Mais tarde esse microrganismo foi englobado em um grupo denominado
coliformes. O grupo caracterizado como coliformes totais, compreende bactérias na
forma de bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios ou anaeróbios
facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas a
35oC. Assim, segundo a definição, o grupo pode incluir cerca de 20 espécies, dentro as
quais encontram-se tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal do homem e outros
animais de sangue quente, como também diversos gêneros e espécies de bactérias não
entéricas, como Serratia e Aeromonas, por exemplo. Por essa razão, sua enumeração
em água e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do
que a enumeração de coliformes fecais ou E. coli (APHA, 1992).
Os grupo dos coliformes fecais recebe a mesma definição dos totais, porém,
restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás em
24 horas a 44,5±0,2 ou 45,5oC±0,2 (termotolerantes). Esta definição objetivou, em
princípio, selecionar apenas os coliformes originários do trato gastrintestinal. Atualmente
sabe-se, entretanto, que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros,
Escherichia, Enterobacter (cloacae) e Klebsiella (pneumoniae), dos quais os dois últimos
podem incluir cepas de origem não fecal. Por esse motivo a presença de coliformes
fecais em alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do
que a enumeração direta de E. coli, porém, muito mais significativa do que a presença de
coliformes totais, dada a alta incidência de E. coli dentro do grupo fecal (APHA, 1992;
SILVA e cols., 1997).
Dentre as bactérias de “habitat” reconhecidamente fecal, dentro do grupo dos
coliformes fecais, E. coli é a mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos
membros não fecais. Todos os demais membros do grupo têm uma associação duvidosa
com a contaminação fecal e E. coli, embora também possa ser introduzida nos alimentos
a partir de fontes não fecais, é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido até o
momento (SILVA e cols., 1997).

E.coli → tem seu habitat no intestino do homem e animais.

Enterobacter → além do trato intestinal pode estar no solo, água e plantas.

Características que fazem dos coliformes fecais e, em particular da E. coli, bons

indicadores:

Especificidade: as bactérias selecionadas só devem ser encontradas no meio
intestinal, particularmente a E. coli;

Estão presentes em grandes quantidades nas fezes, de tal forma que podem ser
detectados em altas diluições;

São resistentes às condições ambientais extra-intestinais;

Mesmo em pequenas quantidades são detectados de forma fácil e completa.

- Coliformes totais: indicam mais como o alimento foi preparado, indicam

condições de higiene, não indicam risco. Isto tendo em vista que este grupo engloba
várias espécies e, entre elas, o Enterobacter e o Citrobacter que podem se desenvolver
no ambiente, particularmente na água.
- Coliformes fecais: indicam contaminação por fezes, têm conotação de risco.
Este grupo compreende basicamente a E. coli, que tem como habitat natural o trato
intestinal e que pouco sobrevive a condições ambientais.
“A presença de grande número desses microrganismos na água ou alimentos
indica a possibilidade da existência de agentes patogênicos eliminados pelas fezes”.
A ausência desses microrganismos (intestinais) no exame de alimentos indicará
boas condições de higiene porém não de inocuidade. A inocuidade dos alimentos só pode
ser garantida após investigação dos microrganismos patogênicos.
Grande parte dos alimentos é controlada por padrões microbiológicos referentes a
coliformes.

3.1 Determinação de coliformes totais, fecais e de Escherichia coli pelo método do

número mais provável (NMP) (APHA, 1992)

Teste de tubos múltiplos

Semeia-se diluições em 3 ou mais séries de 3 ou 5 tubos.
Teste presuntivo: tubos com caldo lauril sulfato triptose.
Incubação por 24 a 48 horas/35 - 37oC.
Dos tubos com crescimento e gás semeia-se para o teste confirmativo:
Coliformes totais - Caldo lactosado bile verde brilhante - 37oC /24 a 48 horas.
Coliformes fecais - Caldo EC 44,5oC ± 0,2 / 24 horas ou 45,5oC ± 0,2 / 24 a 48 horas

Após a incubação levar o número de tubos positivos para uma tabela de NMP
(Hoskins), partindo da maior diluição que tenha 3 tubos positivos. É importante que haja
pelo menos um tubo negativo dentre as diluições escolhidas. (Tabela em anexo)
Para o NMP de Escherichia coli semeia-se dos tubos de caldo EC com resultado
positivo, ágar EMB e a partir de colônias características (negras com brilho metálico ou
rosadas de centro escuro) realiza-se, para cada um dos tubos, as provas do IMViC (indol,
VM, VP e citrato). A Escherichia coli apresenta as características:
indol: + ou -, VM: +, VP: - e Citrato: -
O NMP de E. coli é obtido levando-se à tabela o número de tubos de caldo EC
positivos, que deram resultado característico para E. coli através das provas do IMViC.

4. Quantificação de Staphylococcus sp. e de S. aureus através da contagem em

placas

Nesta determinação as diluições em estudo são colocadas na superfície do ágar

(Ágar seletivo para Staphylococcus segundo Baird-Parker), na quantidade de 0,1 a 0,2 ml
e espalhadas com uma alça de Drigalsky ou bastão em forma de “L”.
Após incubação a 35-37oC/24-48 horas, conta-se as colônias negras, com e sem
halo de transparência, separadamente, nas placas que apresentem entre 20 e 200
colônias.
Para a confirmação, toma-se entre 3 e 5 colônias de cada tipo e semeia-se em
ágar nutriente inclinado e, após incubação, realiza-se esfregaços corados pelo método de
Gram para a verificação de morfologia. O total de colônias contadas corresponde à
população de Staphylococcus sp.
O total correspondente à espécie S. aureus pode ser obtido submetendo-se às
provas da catalase, coagulase, termonuclease, Voges-Proskauer e utilização do manitol
em anaerobiose, as colônias características previamente isoladas em ágar nutriente
(KLOOS & SCHLEIFER, 1986).
A partir do número de colônias que deram resultados característicos para o
S. aureus nessas provas, proporcionalmente ao número contado, chega-se ao número de
bactérias/grama ou mililitro.

Provas que diferenciam o Staphylococcus aureus de outros coagulase positivos:

Prova S.aureus S. intermedius S. hyicus S. delphini

Coagulase + + + +
VP + - - -
Ac. do manitol
anaerobiose + - - -
aerobiose + 11 a 89% + + -
Ac. da maltose + 90% + - +
Ac. da trealose + + + -
Termonuclease + + + -

A contagem de S. aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos

diferentes, um relacionado à Saúde Pública, para confirmar o envolvimento em surtos de
intoxicação alimentar, e outro relacionado com o controle de qualidade higiênico-sanitária
dos processos de produção de alimento ou atendimento de padrões oficiais. Nesses
casos o Staphylococcus aureus serve como indicador de condições higiênicas de
processamento, de superfícies e, em particular, da participação do homem como fonte de
contaminação, tendo em vista que este microrganismo tem como seu habitat natural,
entre outros locais, as mãos, fossas nasais e boca do ser humano.
De maneira geral, alimentos envolvidos em surtos apresentam uma grande
população de S. aureus, não exigindo métodos particularmente sensíveis, enquanto na
enumeração como indicador, o número de células geralmente é reduzido, exigindo
métodos mais sensíveis, principalmente se o S. aureus não representa a espécie
predominante no alimento. O ágar de Baird-Parker se presta de forma adequada a esse
fim.
É importante ressaltar que alimentos submetidos a tratamento térmico após um
período de manutenção em condições que permitam o crescimento podem não
apresentar células viáveis de S. aureus, destruídas pelo calor, e ainda assim conter
toxinas estafilocócicas, altamente resistentes ao calor.

5. Quantificação de clostrídios sulfito redutores e de Clostridium perfringens

através da contagem em placas (APHA, 1992)

Os clostrídios sulfito redutores e junto a eles o Clostridium perfringens são comuns

em diferentes tipos de alimentos, particularmente em carnes frescas, aves, alimentos
desidratados, vegetais e ingredientes de uma forma geral. Isto faz com que a simples
presença desses microrganismos seja praticamente inevitável. Em casos de surtos de
intoxicação alimentar a demonstração de centenas, milhares ou mais microrganismos por
grama no alimento suspeito é um suporte ao diagnóstico, quando acompanhado de
evidências clínicas e epidemiológicas. A confirmação deve ser realizada através da
enumeração de esporos de Clostridium perfringens nas fezes dos pacientes acometidos.
Como indicadores os clostrídios sulfito redutores se prestam a demonstrar a
possível presença de outros patógenos, de origem intestinal ou não, inclusive do
Clostridium botulinum. O Clostridium perfringens é também utilizado como indicador de
contaminação fecal em água, principalmente em águas tratadas como a água clorada. O
fato de ser esporulado permite a sua sobrevivência ao tratamento.
 Há vários meios de cultura disponíveis para a enumeração de clostrídios sulfito
redutores e Clostridium perfringens em alimentos, como o ágar sangue neomicina, o ágar
sangue cicloserina, o ágar sulfito polimixina sulfadiazina (SPS) e o ágar triptose sulfito
cicloserina (TSC), entre outros, sendo que este último pode ser usado com ou sem gema
de ovo. A seletividade destes meios é resultante da incorporação da um ou mais
antibióticos, para inibir diversos anaeróbios e anaeróbios facultativos e, salvo no caso dos
meios com sangue, a característica diferencial comum a todos os demais é a presença de
ferro e sulfito. Dentre esses meios os mais utilizados na enumeração de clostrídios em
alimentos são o SPS e o TSC.
Os clostrídios reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro e precipita
na forma de sulfeto de ferro, produzindo colônias negras.

5.1 Contagem ppdita.

As diluições eleitas são semeadas, pela técnica de “pour plate”, em placas de

Petri, utilizando-se o Ágar sulfito polimixina sulfadiazina (SPS), fundido e resfriado a ±
45oC, em dupla camada.
Após incubação a 46oC/18 a 24 horas (SILVA e cols., 1997) ou 35 a 37oC/24 horas
(APHA, 1992), em anaerobiose, conta-se as colônias negras nas placas que contenham
entre 20 e 200 colônias.
Para a confirmação das colônias típicas de clostrídios sulfito redutores deve-se
selecionar várias colônias e transferir para tubos contendo caldo infusão cérebro coração,
previamente desaerados. Para desaeração do meio, submeter os tubos à fervura em
banho por 15 minutos, com as tampas afrouxadas, e resfriar imediatamente em banho de
gelo. Incubar os tubos inoculados a 35oC/24 horas, preparar um esfregaço da cultura para
coloração de Gram e utilizar o caldo remanescente para teste de catalase.
Teste de catalase – adicionar ao tubo de BHI, 1,0 ml de peróxido de hidrogênio a
3% e observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (negativo). Os
clostrídios sulfito redutores são bastonetes Gram positivos e catalase negativos.
Para efeito de resultado considerar como confirmadas todas as culturas de
bastonetes Gram positivos catalase negativos. Calcular o número de UFC/grama ou
mililitro em função do número de colônias típicas, diluição inoculada e porcentagem de
colônias confirmadas. (Cuidado pois pode haver crescimento e produção de toxina pelo
C. botulinum).

Para se chegar a Clostridium perfringens deve-se selecionar de 5 a 10 colônias e

repicar em ágar nutriente inclinado e, após incubação em anaerobiose, realizar
esfregaços corados pelo método de Gram. Constatada a presença de bastonetes
grandes e G+, realizar as provas da motilidade e redução do nitrato a nitrito (ágar nitrato
motilidade). O C. perfringens é positivo para as duas provas. Provas adicionais podem ser
realizadas como da fermentação da lactose e hidrólise da gelatina (também positivo nos
dois testes). O resultado final é obtido em função também do número de colônias típicas,
diluição inoculada e porcentagem de colônias confirmadas.

6. Quantificação de bolores e leveduras pela contagem em placas

Os bolores e leveduras se constituem em um grande e diversificado grupo de

microrganismos que compreende milhares de espécies. Esses microrganismos são
facilmente encontrados no solo e no ar e dado ao fato de sua natureza heterotrófica e sua
capacidade de adaptação a diferentes condições ambientais, podem ser encontrados
como contaminantes e com ativa capacidade de desenvolvimento em diferentes tipos de
alimentos, principalmente naqueles processados sob condições inadequadas de higiene
(principalmente de equipamentos).
Esses microrganismos podem determinar graus variáveis de decomposição de
alimentos. Dado ao fato de serem microrganismos pouco exigentes em termos de pH, aw
e outros fatores, invasão e crescimento podem ocorrer em qualquer tipo de alimento se
as condições ambientais assim o permitir.
A contagem de bolores e leveduras é realizada após a preparação das diferentes
diluições decimais, através da técnica de semeadura em superfície, de 0,1 ml, em ágar
adicionado de antibiótico ou acidificado (APHA, 1992). Para esse fim pode ser usado o
PCA adicionado de cloranfenicol (100 µg/ml), o ágar batata dextrosado acidificado a pH
3,5 e o ágar extrato de malte também acidificado (sol. a 10% de ácido tartárico ou
láctico). A vantagem da utilização do cloranfenicol é a possibilidade do mesmo ser
autoclavado juntamente com o meio de cultura dado a sua termoresistência.
A incubação deve ser realizada entre 22 e 25oC/5 dias com as placas em pé e
contadas aquelas que apresentam entre 15 e 150 colônias. Na predominância de bolores
deve ser contada a placa que mais se aproxima de 15 colônias e, na predominância de
leveduras, a que se aproxima de 150. A incubação pode ser realizada também em
temperatura ambiente.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Como exemplo da utilização de indicadores, na avaliação da qualidade

microbiológica de alimentos e na prevenção de surtos ou casos de enfermidades
bacterianas veiculadas por alimentos, muitos países e organizações internacionais
estabeleceram critérios microbiológicos baseados, na sua maioria, na determinação de
microrganismos indicadores. Assim, no Brasil, o Ministério da Saúde, através da
o
Resolução RDC n 12 de 02 de janeiro de 2001 da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária, estabelece:

Anexo II
Conclusão e interpretação dos resultados das análises microbiológicas de alimentos
destinados ao consumo humano

I - Interpretação dos resultados:

Para interpretação dos resultados, compara-se os valores encontrados nas
análises realizadas com os valores estabelecidos no Anexo I. De acordo com a
comparação temos:
Ia - Produtos em condições sanitárias satisfatórias: São aqueles cujos resultados
analíticos estão abaixo ou igual aos estabelecidos para amostra indicativa ou amostra
representativa.
Ib - Produtos em condições sanitárias insatisfatórias:
Ib1 – São aqueles cujos resultados analíticos estão acima dos limites estabelecidos para
amostra indicativa ou amostra representativa, conforme especificado no Anexo I da
Resolução n.12
Ib2 – São aqueles cujos resultados analíticos demonstram a presença ou a quantificação
de outros microrganismos patogênicos ou toxinas que representem risco à saúde do
consumidor.

II - Conclusão
IIa – “Produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) de
acordo com os padrões legais vigentes” para as situações enquadradas no item Ia.
IIb – “Produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente)
impróprio para o consumo humano por apresentar...” (citar o resultado(s) analítico(s)
e o(s) parâmetro(s) não atendido(s) para as situações enquadradas no item Ib1.
IIc – “Produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente)
impróprio para o consumo humano por apresentar...” (microrganismos patogênicos
ou toxina que representa perigo severo à saúde do consumidor).
A análise preventiva com o objetivo de impedir a ocorrência de transtornos na
saúde pelo consumo de alimentos, realizada através da determinação, na grande maioria
dos estabelecimentos, de microrganismos indicadores, tem sido considerada de pouca
eficiência, não somente pela problemática da amostragem ao acaso, mas também pela
duração das investigações laboratoriais. Estas últimas são justificadas somente para
aqueles alimentos que podem chegar ao consumidor depois de contar com o resultado da
análise. Por isso, em muitas ocasiões, é mais eficaz controlar de maneira contínua a
higiene da elaboração. Este tipo de processo é conhecido como controle de pontos
críticos (FEHLHABER & JANETSCHKE, 1992).
Pontos críticos são considerados como todos os pontos do processo tecnológico
em pode ocorrer um aumento da carga microbiana por contaminação ou por multiplicação
da microbiota presente, ou aqueles pontos que são decisivos na eliminação ou na criação
de uma estabilidade microbiológica. Entre eles se encontram as higienizações corretas de
equipamentos e dependências, a comprovação de que as aplicações de calor são
corretas, o controle do pH, das concentrações de NaCl e das temperaturas de
armazenagem. Os pontos críticos de controle são estabelecidos a partir de uma análise
de risco da totalidade do processo de produção. Com a colocação deste conceito
(ARPCC) em prática pode garantir-se uma higiene mais perfeita dos alimentos do que
aquela conseguida somente a partir da análise do produto terminado (FEHLHABER &
JANETSCHKE, 1992).

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