30/09/2010

INTRODUCCIÓN
EN LA MAYORÍA DE LOS
PROBLEMAS ANALÍTICOS
SEPARACIONES REALES, SE TIENE QUE SEPARAR,
ANALÍTICAS IDENTIFICAR Y MEDIR
CUANTITIVAMENTE UNO O MÁS
COMPONENTES DE UNA MEZCLA
COMPLEJA

SEPARACIONES ANALÍTICAS SEPARACIONES ANALÍTICAS

• Un interferente es una especia química
• El método de separación depende de la que ocasiona error sistemático en un
naturaleza del componente que se analiza análisis; puede aumentar o atenuar la
y de la muestra. señal analítica o el fondo.
• La separación se basa en la posibilidad • Existen métodos de separación que aíslan
de utilizar las diferencias que existen de al analito:
las propiedades físicas y químicas de los
– Modificación de la matriz
componentes.
– Enmascaramiento
– Dilución
– Saturación.

Métodos de Separación SEPARACIÓN

MÉTODO BASE DEL MÉTODO
SEPARACIÓN MECÁNICA A. PRECIPITACIÓN
DE LA FASE
A. PRECIPITACIÓN Y
1. Basada control de acidez
Diferencia de solubilidad de los compuestos formados.
FILTRACIÓN 2. De Sulfuros
B. DESTILACIÓN Diferencia en la volatilidad de los compuestos
3. Empleando otros precipitantes inorgánicos
C. EXTRACCIÓN Diferencia de solubilidad en dos líquidos inmiscibles
D. INTERCAMBIO IÓNICO Diferencia en la interacción de los reactivos con una resina
4. Cantidades trazas por precipitación
de intercambio iónico 5. Electrolítica
CROMATOGRAFÍA Diferencia en la velocidad del movimiento de un soluto a
6. Proteínas inducidas por la sal
través de una fase estacionaria
ELECTROFORESIS Diferencia en la velocidad de migración de especies
cargadas en un campo eléctrico.
B. DESTILACIÓN
FRACCIONAMIENTO CAMPO- Diferencia en la interacción con un campo o gradiente C. EXTRACCIÓN
FLUJO aplicado perpendicularmente a la dirección del
trasporte D. IONES POR INTERCAMBIO IÓNICO

1
 30/09/2010

A. PRECIPITACIÓN Separaciones de control acidez

1. Basada control de acidez
Ácidos, Óxidos acuosos, Hidróxidos
• Concentración iones H+ OH – ; varían en
un factor de de 10 15
• Categorías
– Soluciones relativamente concentradas
de ácidos fuertes
– Soluciones tamponadas a pH valor
medio
– Soluciones concentradas de NaOH,
KOH
• Fácil de controlar utilizando soluciones de
control de pH, soluciones tampon.

B. SEPARACIÓN DE ESPECIES POR

2. De Sulfuro
– Sulfuros escasamente solubles
– Fácil control de concentraciones de
iones sulfuro en soluciones H2S; se
ajusta el pH
– Forma precipitados con los cationes
de metales pesados
DESTILACIÓN
Destilación es separar analitos volátiles
de interferentes no volátiles.
1. Separación por extracción
2. Extracción de especies inorgánicas
3. Extracción en fase sólida

1. Separación por extracción SEPARACIÓN DE ESPECIES POR DESTILACIÓN

• K constante de distribución útil,
Ley de distribución, equilibrio entre el analito A
distribuido entre el agua y una fase orgánica calcula la concentración de analito que aún
A(acuoso) A(orgánico) permanece en una disolución después de
En condiciones ideales:
varias extracciones
• K da una guía de la forma más eficiente de
(a A )org [ A ]org realizar un separación por extracción
K  
(a A )ac [ A ]ac
i
K constante distribución, (constante equilibrio)  Vac 
( aA)org, (aA)ac son actividades A [A]i    [A]0

[ A] org, [ A ]ac concentraciones molares  VorgK  Vac 
Independiente de cantidad A

2
 30/09/2010

Cálculo de concentración del analito después de

varias extracciones i
con un disolvente orgánico [A]i estudiar:
i - Extracciones de especies inorgánicas
 Vac 
[A]i    [A]0

- Separación de iones por intercambio
 org  Vac
V K  iónico
• [A]i conc A: remanente en la solución acuosa
después de extraer V ac mL de la
solución de conc original con i
porciones del disolvente orgánicos,
con un volumen Vorg
• K constante de distribución del analito

SEPARACIÓN COLUMNA

CROMATOGRAFÍA
DE GASES

• La cromatografía es el método de
separación más usual y tiene varias
• CROMATOGRAFÍA modalidades dependiendo de la naturaleza
– Es una técnica en la que se separan los de la columna cromatográfica y de la
interacción de los componentes de la
componentes de una mezcla a partir de
muestra.
la velocidad en la que se transportan y
• En la cromatografía en fase gaseosa son
de su punto de ebullición.
los componentes volátiles los que se
separan de la muestra.
• Instrumento utilizado un cromatógrafo de
gases

3
 30/09/2010

Vista general de tópicos CROMATOGRAFÍA

en cromatografía de gases • La cromatografía es la separación física de
dos o más compuestos, basada en la
• Injector distribución diferente de dos fases, una de
• Columna la cuales es estacionaria y la otra móvil.
• Horno
• Detector • la fase estacionaria es un sólido ó un
líquido.
• Inyección de
muestra
• El componente que se va a separar, es
• Programación de usualmente introducido en la fase móvil,
temperatura que en el caso de la CG, el fluido es un gas

Diagrama instrumento GC • Componentes principales de un GC son:

Puerto de Columna Detector

inyección
acarreador
Gas

Registrador
integrator

Horno

CROMATÓGRAFO DE GASES
Ventajas del GC
• Rapidez en los análisis
• Eficiente, da una alta resolución
• Permite un análisis cuantitativo
con:
CV de 1 - 5 %
• Sensitivo, puede detectar arriba de
niveles de ppm

4
 30/09/2010

Desventajas del GC

• Posible acoplamiento en línea a un • Necesita de métodos espectrocópicos

espectrofotómetro de masa. – espectroscopía de masas, para
• No destructivo confirmación de las identidades de los
• Requiere pequeñas cantidades de picos.
muestra, usualmente < 10 L • No apropiado para
• Relativamente barato – Muestras no volátiles
– Muestras térmicamente inestables.
– Preparación prolongada de la muestra

COMPONENTES GAS PORTADOR

• Es la Fase móvil, con una presión
Poseen calentamiento regulada en psi, esta fase mueve la
• Bloque inyección muestra de vapor:
• Columna • del puerto de inyección a través de una
fase estacionaria (columna), en donde
• Horno se efectúa la separación
• Bloque Detector
• seguidamente pasa al detector donde
se convierte en señal eléctrica la cual
puede medirse con un graficador.

GAS PORTADOR MEDIDOR DE PRESIONES

• Este gas debe de ser puro, inerte, seco y
libre de oxígeno.

• Gases comúnmente utilizados: He, N2 y H2.

• En la columna, el tiempo de retención, es

directamente proporcional a la relación de
flujo.

• Dependiendo del tipo de detector, se

escoge el gas, para una separación
eficiente y rápida.

5
 30/09/2010

PUERTO DE INYECCIÓN
PUERTO DE INYECCIÓN
• Es un bloque de metal que contiene
calentadores y sensores de temperatura.
• Contiene al inicio, un porta septa
(tapadera) y en la parte final, una
conexión para la columna.
• El propósito principal es convertir una
muestra líquida en fase de vapor.
• El puerto de inyección se calienta para
que en el momento de inyectar la muestra
líquida se vaporice.
• En su construcción interior:
• Para precalentar la muestra tiene un
serpentín de tubos capilares.
• Una cámara de vaporización, en la cual la
muestra se convierte en gas
• La muestra gaseosa entra al flujo
acarreador
• Adaptadores para usar diferentes tipos de
columnas

PUERTO DE INYECCIÓN

SEPTA
Debajo
de la
tapa

TIPOS DE INYECCIÓN
PUERTO DE INYECCIÓN
• TEMPERATURA
• Debe ser lo suficientemente alta para
asegurar una vaporización instantánea
de las muestras.
• Temperaturas bajas conducen a una
vaporización incompleta y dan en el
cromatograma picos anchos.
• Temperaturas muy altas conducen a una
degradación de la muestra. % bajo Toda la
de muestra muestra
• Temperaturas entre 200–250 °C, son a la columna a la comuna
satisfactorias

6

•Es la técnica de inyección más sencilla.
•La muestra introducida en el puerto de
inyección contiene un cilindro de vidrio
desactivado.
•La muestra es vaporizada rápidamente
y únicamente el 0.1 – 10% del vapor
entra a la columna.
•El resto de la muestra vaporizada y la
gran cantidad de flujo del gas portador,
pasan a través de la válvula split.
•La cantidad de muestra introducida en
la columna es controlado por el flujo del
split. 10:1 to 100:1
• DESVENTAJAS
– No es apropiado para análisis de
trazas, porque a la columna entra
únicamente una fracción de la
muestra.
– Las muestras inyectadas con
solutos de alto peso molecular, no
son representativas de la muestra
entrando a la columna.
TIPOS DE INYECCIÓN
• SPLIT:
– 0.1 – 1.0% de la muestra va a la columna
– Resto a desperdicios
• SPLITLESS:
– Toda la muestra va a la columna
– Ideal para análisis cuantitativos
– Aplicado para análisis de trazas o muestras
de baja concentración
30/09/2010
Inyección Split
• VENTAJAS
– Tecnica sencilla.
– Se introduce una pequeña cantidad
dentro de la columna .
– Se pueden utilizar muestras puras,
limpias.
– Muestas impuras, se pueden utilizar,
siempre que se tenga un lana de vidrio
en el interior de la trampa del cilindro
de vidrio para atrapar los componentes
no volátiles.
• .
Se utiliza para trazas de análisis,
donde la cantidad de los componentes
son mayores a 200 ng
Con la válvula de split apagada, la
muestra es vaporizada y llevada a la
columna.
La muestra es introducida a la
columna como una banda ancha, y
debe ser reenfocada para obtener
bandas estrechas.
La temperatura inicial del horno de la
columna debe mantenerse alrededor
de 40°C debajo del punto de ebullición
del solvente de la muestra.
El solvente se condensa en la parte
inicial de la columna formando bandas
estrechas de solutos.
PUERTO DE INYECCIÓN
PROBLEMAS ESPECIALES
• ENTRADA
• Los componentes menos volátiles se
vaporizan más lentamente que los más
volátiles.
• Temperatura
• Septo, septum ó septa
7

MUESTRAS
• Muestras pueden ser gases, líquidos o
sólidos.
• Muestras líquidas y sólidas deben de
vaporizarse.
• La muestra es inyectada al puerto de
inyección, que es un bloque de metal
caliente, donde se vaporiza la muestra y
es llevada por el gas acarreador.
INYECCIÓN DE LA MUESTRA
Las muestras son inyectadas utilizando:
– Jeringa para muestras líquidas
– Jeringas herméticas para gas
– Válvulas muestreadoras de gas
Las muestras sólidas son disueltas en
solventes apropiados e inyectándolas
por medio de jeringas.
COLUMNAS
• Son la parte principal del
cromatógrafo de gas.
• Existen dos tipos de columnas
• Columna empacada
• Columna abierta tubular
30/09/2010
MUESTRAS
• Los componentes de la muestra en la
columna, interactúan de manera diferente
con la fase estacionaria, conduciéndolos
a una separación.
• Los componentes que interactúan menos
con la fase estacionaria, son los primeros
en eluir y ser determinados por un
detector al salir de la columna.
INYECCIÓN DE LA MUESTRA
• El tamaño de la muestra es determinado
por el tipo de columna
• La columna indica la cantidad en
microlitros de inyección de la muestra
COLUMNAS
• Columna Abierta tubular
Estas columnas son delgadas y
alargadas, llamadas columnas
capilares.
8
 30/09/2010

C O L U M N A S CAPILARES COLUMNAS CAPILARES

• Las columnas capilares tienen una fase

estacionaria reticular, enlazada Los tipos más comunes son:
químicamente a la superficie interna de
un capilar de sílice fundido. 1. COLUMNA TUBULAR ABIERTA CON
RECUBRIMIENTO DE PAREDES
• Se pueden obtener tubos de diferentes
diámetros internos, 0.25, 0.32, 0.53 mm (WCOT, Wall-coated open tubular column)
contiene una fase líquida estacionaria, es
• Existen variedad de tipos y grosores de una película adherida dentro de la pared de
fases estacionarias
la columna.
• La fase estacionaria más común, esta
basada en polímeros de silicones

COLUMNAS CAPILARES COLUMNAS CAPILARES

2. COLUMNA TUBULAR ABIERTA 3. COLUMNA TUBULAR ABIERTA

RECUBIERTA CON SOPORTE
(SCOT, Support-coated open tubular)
contiene una fase líquida
estacionaria recubierta a un
soporte sólido fijado a la pared de
la columna
DE CAPA POROSA
(PLOT, porous-layer open tubular)
contiene como fase estacionaria una
capa delgada de un polímero
poroso depositado dentro de la
pared de la columna.

COLUMNAS CAPILARES COLUMNAS CAPILARES

VENTAJAS
• Baja resistencia al flujo del gas
• Alta resolución
• Buena eficiencia
• Se pueden correr más muestras en el
instrumento

9
 30/09/2010

SELECCIONANDO FASE ESTACIONARIA

POLARIDAD DE LA FASE
ESTACIONARIA
• Debe de tener un buen efecto de
resolución en una mezcla de analitos.
• Determina la forma en que las moléculas
del analito interactúan en la fase
estacionaria.
• Se aplica, “lo igual se disuelve en lo
igual”.
• Las fases polares cuentan casi
completamente con la interacción
(contacto) entre los grupos
funcionales de las moléculas del
analito y las moléculas en la fase
estacionaria.
• Utilizar la fase menos polar que
proporcione una separación
satisfactoria.

SELECCIONANDO FASE ESTACIONARIA SELECCIONANDO FASE ESTACIONARIA

• Ejemplos de fases comunes:

POLARIDAD INTERMEDIA, polifenil metilsiloxano
NO POLAR
CH3 CH3 CH3
Polydimethyl siloxane SUPERFICIE DE SÍLICE
O Si O Si O Si O Si O Si etc.
CH3 CH3 CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 • POLAR, Carbowax

SUPERFICIE DE SÍLICE
O Si O Si O Si O Si O Si etc.
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 SUPERFICIE DE SÍLICE
O [ CH2 CH2 O] n

TIPOS FASES Y SOLUTOS COLUMNA DENTRO DEL HORNO

• Fases estacionarias polares
– -CN, -CO y –OH
• Fases estacionarias no polares
– Hidrocarburos
• Solutos polares
– Alcoholes, ácidos y aminas
• Solutos con polaridad intermedia
– Éteres, cetonas y aldehidos
• Solutos no polares
– Hidrocarburos saturados

10
 30/09/2010

COLUMNA DENTRO DEL HORNO COLUMNA DENTRO DEL HORNO

• Las columnas son colocadas dentro del
horno a una temperatura controlada.
• AL AUMENTAR LA TEMPERATURA DEL • AL DISMINUIR LA TEMPERATURA
HORNO: DEL HORNO
• Disminuye – Causa tiempos excesivos de
el tiempo de retención y el volumen de retención y picos no definidos
retención, los cambios de selectividad,
el factor de retención
• Aumenta
Ligeramente la eficiencia de la columna
La resolución dada es de picos altos y
delgados

COLUMNA DENTRO DEL HORNO

GRADIENTE T

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
140oC 110oC 75oC

Generalmente un cambio de 30°C en la temperatura de

un horno, dobla su tiempo de retención.

DETECTORES DETECTORES

Determinan el tiempo y la cantidad

cuando un compuesto emerge de la
columna.
Criterios en la selección de un detector
apropiado:
• Tipo de compuesto que ha ser detectado
• Tipos de compuestos que deben ser
detectados
• Límite de sensitividad de detección y
límite de cuantificación.
• Costo
• Límite del rango de concentración debe
aumentarse hasta que la respuesta sea
no linear
• Se quiera o no, las muestras son
destruidas durante el análisis

11

DETECTORES
• Propiedades de un buen detector
- alta sensitividad
- respuesta universal
- rapidez en la respuesta
- buena estabilidad
- bajo ruido de fondo
- confiable y seguro de operar
- fácil de operar
Conductividad Térmica, TCD
• Detector que responde a cambios en al
conductividad térmica del gas.
• Es un filamento de tungstenorenio, en
donde el gas que sale de la columna
aumenta la temperatura del filamento y lo
mantiene constante.
• Cuando sale el soluto de la columna la
conductividad térmica de la corriente de
gas disminuye, y el filamento se enfría.
30/09/2010
DETECTORES COMUNES PARA GC
DETECTORES UNIVERSALES
Conductividad Térmica,
Thermal Conductivity (TCD).
Mide los cambios en la conductividad
térmica de la muestra en el flujo
gaseoso y lo compara con el gas de
referencia.
Se puede aplicar a muestras de
concentración normal a alta, utilizando
casi siempre para análisis de gases,
como el CO, N2, O2,H2O.
Conductividad Térmica, TCD
• El paso de enfriamiento, cambia la resistencia y
esto causa que la corriente fluya a través de un
cambio de voltaje, cada vez que eluya un
componente, registrando el pico.
Muestra
Referencia
Fuente de poder A IMPRESORA
DETECTORES COMUNES PARA GC
IONIZACIÓN DE LLAMA
Flame Ionization (FID)
Es el detector más común en GC
Quema la muestra en una llama para
convertirla en iones, mide la corriente de
flujo dado por los iones dentro de los
electrodos.
Responde a compuestos conteniendo
C & H; es utilizado para análisis normales
y niveles de trazas, pero no se utiliza
para compuestos inorgánicos
12
 30/09/2010

ionización de llama FID

ionización de llama FID
• Los gases que eluyen de la columna pasan
a través de una llama de hidrógeno donde
los componente inflamables son quemados. • El colector cargado negativamente y el
quemador cargado positivamente, son
• Proceso de quemado, una pequeña porción
de moléculas son fragmentadas y la mayor parte de un circuito eléctrico; cuando
parte de los iones cargados positivamente, ocurre el proceso, la corriente cambia y
son llevados a un electrodo colector, un la carga es amplificada y vista como un
cilindro de metal alrededor de la llama pico en el cromatrograma.
cargado negativamente.
• Los iones cargados negativamente, se
dirigen a la parte positiva de la cabeza del
quemador

Ionización de Llama
Flame Ionization (FID) Comparación detectores universales

Detector Selectivity Detectivity

TCD organics and

inorganics, non- 2 ppm
destructive

FID C and H containing

compounds, 0.02 ppm
destructive

DETECTORES COMUNES PARA GC 1 2 3 4

• Detectores Selectivos
RESPUESTA
DETECTOR

- CAPTURA DE ELECTRONES
Electrón Capture (ECD
utilizado para halógenos, organometálicos
no apto para hidrocarburos,aminas y alcoholes.
- FOTOIONIZACIÓN, Photoionization (PID) 0 1 2 3 4 5 6 7 TIEMPO (min)
- CONDUCTIVIDAD ELÉCTRICA, Electric
Conductivity (ELCD). Peak # RT Area Area %
- TERMOIÓNICO ESPECÍFICO 1 2.35 1836293 22.76
Thermoionic Specific (TSD) 2 2.85 1978905 24.52
Es bueno para compuestos fosfatados y
nitrogenados, aplicación en pesticidas, 3 4.10 2344501 29.05
combustibles,fármacos y soborizantes. 4 5.10 1909922 23.67
Total 8069621 100

13

CROMATOGRAMA
Tr
Tm T´r
TIEMPO
RENDIMIENTO EN LA COLUMNA
Eficiencia en la medida
La eficiencia cromatográfica N es una
medida de la retención relativa del soluto
en comparación en el ancho de su pico.
• El parámetro de eficiencia N es útil para
comparar separaciones cromatográficas
efectuadas en distintas condiciones.
• El parámetro de eficiencia suele llamarse
“número de platos teóricos” = N
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
• Si se encuentra que la columna tiene
N equivalentes de platos teóricos, es
puede encontrar la
altura equivalente de un plato
teórica (H).
H = L/N (1)
30/09/2010
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
• Ya preparada la columna y lista para
utilizarse
¿funcionará bien? ¿cómo saberlo?
• Hay dos cosas que pueden determinarse
directamente del cromatograma:
LA EFICIENCIA, medida de la
capacidad de la columna para producir
picos estrechos
LA RESOLUCIÓN habilidad de la
columna para separar los dos picos
adyacentes
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
• Otra medida útil es número de platos
teóricos por unidad de longitud de la fase
estacionaria.
• Asuma que el empaque tiene
una longitud L externa
y que toda la longitud de la columna puede
emplearse para separar los componentes.
• El número de platos se puede calcular
con la siguiente ecuación:
N = 16 [ tr/w]2 (2)
N = número de platos teóricos
Tr = tiempo de retención
W = anchura del pico en la base W, en
unidades de tiempo
14
 30/09/2010

RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
RENDIMIENTO DE LA COLUMNA
Sustituyendo ecuaciones, (2) en (1) • CLASIFICACIÓN
H = altura equivalente del plato teórico HETP
N H cm
2
L W Excelente 500 0.06
H
16  tr 
Bueno 300 – 500 0.06 – 0.10
– Un sistema cromatográfico es mejor cuando
Justo 200 – 300 0.10 – 0.15
HETP es menor.
– El sistema se hace “más perfecto” a medida Dudoso 100 0.30
que HETP tiende a cero.

1 2 3 4
Respuesta detector

Principios generales de cromatografía

general aplicados a GC
• Resolución (Rs) de una columna:
medida cuantitativa de su capacidad para
separar dos analitos en relación a su
ancho
2 t R B  t R A 
0 1 2 3 4 5 6 7

Rs 
Tiempo (minutos)

Los componentes son identificados como: WA  WB

1 metil etanoato
2 etil etanoato
3 butil propanoato
4 isopentil propanoato

• Volúmenes de retención
– Se usan en vez de tiempos de
retención
VR = tRF

• VR = volumen de retención
• tR = tiempo de retención
• F = flujo promedio en el interior de la
columna

15
 30/09/2010

• La eficacia de una columna para

separar dos solutos esta dada por las • Constante de equilibrio K para
velocidades relativas con las que este proceso se denomina
eluyen las 2 especies. constante de distribución
K = cs/cM
• Estas velocidades están determinadas
por las constantes de equilibrio entre cs = conc. molar del soluto en la fase
las fases móvil y estacionaria estacionaria
soluto A móvil  soluto A estacionaria cM = conc. molar en la fase móvil

Factor de retención (k´A): Aplicaciones GC

Describe las velocidades de migración de los solutos
en las columnas
k´A = KAVS/ VM
VS = volumen fase estacionaria
VM = volumen fase móvil
– Si el factor de retención para una especie es mucho
menor que 1; la elución ocurre rápidamente.
– Si es del orden de 20 ó 30; entonces los tiempos de
elución son muy largos
– Ideal es que factores de retención oscilen entre 2 y 10
• Separación de mezclas orgánicas
complejas, organometálicos y sistemas
bioquímicos volátiles o especies que
pueden derivarse para dar sustancias
volátiles
• Información cualitativa: tiempo o volumen
de retención
• Información cuantitativa: alturas de picos o
áreas de picos

Análisis cualitativo Acoplamiento con otros

• Determinación de pureza de compuestos métodos
orgánicos: picos adicionales de impurezas
• Identificación de los componentes de
mezclas complejas
• Evaluar efectividad de los procesos de
• Cromatografía de gases / espectrometría
purificación
de masas GC-MS
• GC/espectroscopía infrarroja de
transformada de Fourier

16
 30/09/2010

TAREA
CAPÍTULO 20 Christian
1
2
4
6 – 7 TABLA
8

CAPÍTULO 31 SKOOG
5
15
19

17