UNIVERSIDAD NACIONAL AGRAGRIA DE LA SELVA

Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIA, TECNOLOGÍA E INGENIERÍA

DE LOS ALIMENTOS

“PRÁCTICA N°4: ANÁLISIS PARA EVALUAR LA CALIDAD

MICROBIOLÓGICA DE LA LECHE“

CURSO : Tecnología en industrias lácteas

DOCENTE : Blga. ALCEDO ROMERO, Margarita

ALUMNO(A) : VELEZ DE VILLA ESCALANTE, Jacqueline.

SEMESTRE : 2018- II

FECHA : 28/08/2018

TINGO MARÍA – PERÚ

2018
 I. INTRODUCCIÓN

Una forma de determinar la calidad microbiológica de la leche, es

determinando el número de microorganismos que se encuentran en ella. Existen

varios métodos para determinar el recuento total de microorganismos en la leche;

uno de ellos es el recuento estándar en placa, determinándose mediante este

método, el contaje de bacterias.

La técnica realizada para la numeración de microorganismos

aerobios viables en la presente práctica será la de pour plate, o siembra por

incorporación.

OBJETIVO

- Determinar el número de microorganismos mesófilos viables presentes en

una muestra de leche.

- Determinar la condición higiénica de la leche con relación a la

contaminación con bacterias coliformes.

- Determinar si la leche es apta para consumo humano.

 II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE

La microbiología está estrechamente relacionada con todos los

sectores de la industria lechera. Los principios microbiológicos son la base de

las técnicas de producción higiénica de la leche, dirigen muchos de los

tratamientos para su transformación industrial y son el fundamento de los

métodos de conservación de los productos lácteos (AMIOT, 1991).

En lactología, se aplican los conocimientos microbiológicos con tres

finalidades: La primera, prevenir e impedir la transmisión de bacterias patógenas

vehiculadas por la leche y los productos lácteos para proteger la salud de los

consumidores. La segunda, prevenir y reducir el desarrollo de las bacterias

indeseables en la leche y los productos lácteos para impedir su alteración. La

tercera, favorecer y dirigir el desarrollo de las bacterias útiles en algunos

productos lácteos como los fermentados (AMIOT, 1991).

2.1.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

ASOCIADOS A LA LECHE

El sistema de identificación utilizado se basa principalmente en las

pruebas de tinción de Gram, catalasa, oxidasa, fermentación de los azúcares y

esporulación. La formación de esporas puede comprobarse por la supervivencia

de un organismo sometido a un calentamiento de 85 °C durante 10 minutos. En

la tabla 1, se presenta la clasificación basada en las mencionadas pruebas de

algunas especies microbianas asociadas a la leche (AMIOT, 1991).

Tabla 1. Clasificación de algunas bacterias asociadas a la

leche
Fermentan la lactosa con producción de ácido en
Catalasa + En condiciones anaerobicas: Staphyloccus -
aglomerados o racimos S. aureus es coagulasa +
Cocos
No fermentan la glucosa: Micrococcus
Homofermentativos: Streptococcus, Pediococcus
GRAM +
Catalasa - Heterofermentativas: Leuconostoc
Aerobios: Bacillos
Esporulados
Anaerobios: Clostridium
Bacilos
No esporulados Lactobacillos

sapolítos, frecuentemente psicrótrofos

Oxidasa -
Pseudomonas, alcaligenes, flavobacterium

fermentan la glucosa con producción de acidos Enterobacterias:

GRAM -
Escherichia, Enterobacter, Citrobacter,klebsiella, Salmonella, Shigella y otros
Oxidasa-

No fermentan la glucosa Xanthomonas

Fuente: AMIOT, 1991.

2.1.2. PROCEDENCIA Y CARACTERÍSTICAS DE LOS

MICROORGANISMOS ASOCIADOS A LA LECHE

Un aspecto fundamental de la calidad de la leche es su flora

microbiana. Desde el punto de vista cuantitativo, se considera que las leches con

bajos niveles de población son de mejor calidad. Cuando se trata de

microorganismos patógenos como Salmonella, su presencia, incluso si se

encuentran en pequeña cantidad, es absolutamente indeseable (AMIOT, 1991).

La calidad real de un producto lácteo, es el resultado directo de la

calidad bacteriológica de la leche de la que procede (AMIOT, 1991).

Con la introducción de los métodos sanitarios de ordeño y de

refrigeración, es posible obtener leche con poblaciones microbianas inferiores a

50.000/ml. En la tabla 2 se indica, según el origen, el número de bacterias que

generalmente contiene una leche de buena calidad en la granja (AMIOT, 1991).

Tabla 2. Contaminación de la leche en la granja

Origen Número de bacterias/ml

Salida del pezón 500-1000
Equipo de ordeño 1000-10000
Tanque de refrigeración 5000-20000
Fuente: AMIOT, 1991.

2.1.2.1. Microorganismos procedentes del animal

 Vaca sana

Durante el ordeño, las primeras fracciones de leche están

generalmente más contaminadas que el resto; la leche final del ordeño puede

contener una población microbiana hasta cinco veces menor que la del principio

(AMIOT, 1991).

Aunque teóricamente la leche al salir del pezón debería ser estéril,

siempre contiene de 100 a 10000 bacterias por ml. La población media se sitúa

alrededor de 1000, pero los datos son variables (AMIOT, 1991).

Tabla 3. Contaminación de la leche en la ubre

Contaminación, gérmenes/mL Frecuencia

menos de 100 41%
100 a 1000 35%
1000 a 10000 23%
más de 10000 1%
Fuente: AMIOT, 1991
  Vaca enferma

Son muy diversas las infecciones que pueden afectar a la vaca, pero

la más frecuente es la mastitis, que es una importante fuente de contaminación

de la leche además de disminuir considerablemente la rentabilidad del rebaño

afectado. Se trata esencialmente de una infección de la glándula mamaria

(AMIOT, 1991).

En las leches mamíticas se han aislado muy frecuentemente tres

especies de estreptococos: Streptococcus agalactiae, Str. Dysgalactiae y Str.

Uberis (AMIOT, 1991).

El primero de ellos, Streptococcus agalactiae es un parásito de

glándula mamaria y no se encuentra en el entorno ambiental, mientras que los

otros dos se pueden multiplicar en el exterior de la mama. Estas bacterias son

muy exigentes en lo que no se multiplican en la leche en refrigeración (AMIOT,

1991).

Streptococcus agalactiae se ha identificado en infecciones vaginales

humanas asociadas a infecciones neonatales. Por su parte, Str. Dysgalactiae y

Str. Uberis están muy extendios en la naturaleza y no son patógenos para el

hombre (AMIOT, 1991).

Con la profusa administración de tratamientos contra la mamitis,

parece que actualmente Staphylococcus aureus es el agente etiológico más

frecuente de esta enfermedad porque es más resistente a los antibióticos que

los estreptococos. Staphylococcus aureus sintetiza una enterotoxina

termoestable capaz de provocar intoxicaciones alimentarias (AMIOT, 1991).

  El aire

En el aire hay muchas partículas finas que pueden contribuir a la

contaminación de la leche. Estas partículas de polvo transportan esporas de

mohos, bacterias esporuladas, micrococos y estreptococos. Entre las bacterias

esporuladas se encuentra Bacillus cereus que no produce mucho esporos en

leche cruda, pero cuya esporulación tiene lugar en soluciones diluidas de leche

y en los sedimentos húmedos. La pasterización, no sólo no destruye los esporos

de Bacillus cereus, sino que activa su germinación, por lo que la leche

pasterizada se vuelve su medio de crecimiento (AMIOT, 1991).

 Estiércol

Es la principal fuente de enterobacterias que contaminan la leche.

Este grupo incluye bacterias generalmente inofensivas como los coliformes

(Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter), pero contener también cepas

patógenas de E.coli y de Klebsiella pneumoniae (AMIOT, 1991).

La presencia de coliformes indica la posibilidad de una

contaminación fecal y el riesgo de contaminación por otras enterobacteriaceas

patógenas como Salmonella y Shigella, o por virus indeseables (enterovirus). Sin

embargo, su presencia no se debe obligatoriamente a una contaminación fecal.

Enterobacter puede multiplicarse en el suelo y coliformes pueden desarrollarse

en las zonas sucias del equipamiento, que ciertamente es una fuente importante

de coliformes en la leche (AMIOT, 1991).

  Equipo lechero

Generalmente, el contacto con el material utilizado en el ordeño, el

paso de la leche a través de las conducciones y su permanencia en el tanque de

refrigeración, multiplican por un factor de 2 a 50, según la limpieza de las

superficies, el número de bacterias en la leche cruda (AMIOT, 1991).

El equipo en malas condiciones higiénicas, es el origen de diversas

especies de bacterias termorresistentes higiénicas, es el origen de diversas

especies de bacterias termorresistentes que contaminan la leche (Tabla 4).

Estos microorganismos se encuentran en el sarro de leche que queda en las

superficies del equipo y por ello, cuando el equipo no está suficientemente limpio,

la leche obtenida contiene una gran proporción de gérmenes termorresistentes

(AMIOT, 1991).

Tabla 4. Bacterias termorresistentes de la leche

Género
Especies
1.- Alcaligenes A. tolerans
2.- Streptococcus S. bovis, S. faecalis, S. durans, S. thermophilus
3.- Micrococcus M. luteus
4.- Microbacterium M. lacticum
B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis
5.- Bacillus
B. circulans, B. megatherium.
6.- Clostridium C. butyricum, C. perfringens, C. sporogenes.

Fuente: AMIOT, 1991.

 2.1.3. REQUISITOS MICROBIOLÓGICOS

La leche cruda debe cumplir con los siguientes requisitos (Tabla 5)

(LLAMOSAS, 2003).

Tabla 5. Requisitos microbiológicos

Ensayo Requisito
Conteo de celulas somáticas Máx. 500,000 unidades por ml
Numeración de microorganismos
mesófilos, serobios y facultativos Máx. 1,000.000 ufc
viables por ml.
Numeración de coliformes por ml Máx. 1,000 ufc
Fuente: NTP 202.001, 2003.

2.1.3.1. DECRETO SUPREMO N°007-2017

 Planes de muestreo

El plan de muestreo sólo se aplica a lote o lotes de alimentos y

bebidas. Se sustenta en el riesgo para la salud y las condiciones normales de

manipulación y consumo del alimento, y establece:

a) Categoría de riesgo: Escala relativa al riesgo que representa un

alimento y a la manipulación posterior prevista (DIGESA, 2003).

b) Componentes del plan de muestreo

- "n" (minúscula): Número de unidades de muestra requeridas para

realizar el análisis, que se eligen separada e independientemente, de acuerdo a

normas nacionales o internacionales referidas a alimentos y bebidas apropiadas

para fines microbiológicos (DIGESA, 2003).

 - "c": Número máximo permitido de unidades de muestra

rechazables en un plan de muestreo de 2 clases o unidades de muestra

provisionalmente aceptables en un plan de muestreo de 3 clases. Cuando se

detecte un número de unidades de muestra mayor a “c” se rechaza el lote

(DIGESA, 2003).

- "m" (minúscula): Límite microbiológico que separa la calidad

aceptable de la rechazable (DIGESA, 2003).

En general, un valor igual o menor a “m”, representa un producto aceptable y los

valores superiores a "m” indican lotes rechazables en un plan de muestreo de 2

clases (DIGESA, 2003).

- "M" (mayúscula): Los valores de recuentos microbianos superiores

a "M" son inaceptables, el alimento representa un riesgo para la salud (DIGESA,

2003).

c) Tipos de plan de muestreo para lote o lotes:

Plan de 2 clases: Es un plan de muestreo por atributos, donde

puede establecerse únicamente la condición de "aceptable" o "rechazable". Un

plan de 2 clases queda definido por “n” y “c”;

Para microorganismos patógenos:

Condición de "aceptable" = ausencia

Condición de "rechazable" = presencia

Para otros microorganismos

 Condición de "aceptable" = menor o igual al nivel crítico establecido,

“c”

Condición de "rechazable" = mayor al nivel crítico establecido, “c”

Plan de 3 clases: Es un plan de muestreo por atributos que queda

definido por "n", "c", "m", "M"; donde se establece:

Condición de "aceptable":

Cuando todas las unidades de muestra presentan recuentos igual o

inferiores a "m" (DIGESA, 2003).

Cuando hasta "c" unidades de muestra pueden tener recuentos entre

"m" y "M" (incluido "M") (DIGESA, 2003).

Condición de "rechazo":

Cuando más de "c" unidades de muestra presentan recuentos entre

"m" y "M" (incluido "M") (DIGESA, 2003).

Cuando al menos 1 de las unidades de muestra presentan recuentos superiores

a "M" (DIGESA, 2003).

 Tabla 6. Planes de muestreo para combinaciones de diferente grado de

riesgo para la salud y diversas condiciones de manipulación.

Fuente: DIGESA, 2003.

La leche cruda destinada a la comercialización debe provenir de

animales libres de enfermedades (sanidad animal) y cumplir con las

especificaciones de calidad sanitaria e inocuidad que establece el Ministerio de

Salud, según la tabla 6 (DIGESA, 2003).

Tabla 6. Especificaciones microbiológicas para leche cruda

Límite por mL
Agente Microbiano Unidad Categoría Clase N c
m M
Aerobios mesófilos UFC/mL 3 3 5 1
Coliformes UFC/Ml 4 3 5 3
Notas:

Categoría: Grado de riesgo que representa los microorganismos en relación a las condiciones

previsibles de manipulación y consumo de alimento.

Clase: Es la clasificación que se dá a los planes de muestreo por atributos, que pueden ser de dos

o tres.
 III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS

3.1.1. APARATOS

- Placas de Petri estériles

- Tubos de ensayo con diluyente (9 mL).

- Pipetas estériles de 2,5 mL.

- Gradillas/plumones

- Mechero bunsen

3.1.2. EQUIPOS

- Incubadora a 35 °C

- Cuentacolonias

3.1.3. MEDIOS DE CULTIVO

- Agar plate count

- Diluyente: Agua peptonada al 0,1 %

 3.1.4. PROCEDIMIENTO

3.1.4.1. Preparación de diluciones

- Se tomó 1 mL. de muestra de leche (muestra original) previamente

homogeneizada (se agitó varias veces para homogeneizar la muestra) y

se introdujo en un tubo de ensayo conteniendo 9 mL. de diluyente.

- Se cambió de pipeta, y se pipeteó 10 veces el contenido del tubo para

−1
homogeneizar la muestra. Este correspondía a la dilución .

- Se tomó 1 mL. del primer tubo y se introdujo en un segundo tubo de

ensayo contenido de 9 mL. de diluyente, y procedió igual a los descrito

−
anteriormente. Este tubo correspondía a la dilución .

- Para las demás diluciones, se repitió con lo descrito anteriormente. Se

realizaron tantas diluciones como corresponde de acuerdo al estado de

contaminación de la muestra.

3.1.4.2. Recuento Estándar en Placas

- Se tomó 1 mL. de las tres últimas diluciones y se colocarón en placas de

petri vacías identificadas, por duplicado.

- Se adicionaron a cada placa de petri con el inoculo, 15 mL. de medio de

cultivo licuado y temperado a 40 °- 45 ° C. y se esperó que solidifique el

medio de cultivo.

- Se invirtió las placas y se incubó a 35 ° ± 2° C/24 – 48 horas.

- Después del tiempo transcurrido se realizaron las lecturas

correspondientes con la ayuda de un cuenta colonias.

 3.1.4.3. Lectura

- Se contaron las placas libres de “Spread” que presentaron entre 30 a 300

colonias.

- Se sacó el promedio de las dos placas y se multiplicó el número por el

factor de dilución e inoculo.

N° promedio de colonias x Factor de dilución x inóculo =

Número de colonias (UFC)

Finalmente se expresaron los resultados en unidades formadoras de

colonias (U.F.C) por mL. de muestra.

N° U.F.C./ mL

3.2. NUMERACIÓN DE COLIFORMES

3.2.1. APARATOS

- 3 grupos de 3 tubos de ensayo conteniendo medio de cultivo

(caldo BRILA) y tubitos de fermentación (durham).

- Tubos de ensayo con diluyente (9 mL)

- Placas de Petri con medio de cultivo (EMB).

- Pipetas estériles de 2 y 5 mL.

- Gradillas/plumones

- Mechero bunsen
 3.2.2. EQUIPOS

- Incubadora 35°± 2°C

3.2.3. MEDIOS DE CULTIVO

- Caldo lactosa verde brillante bilis al 2% (BRILA)

- Agar eosina azul de metileno (EMB)

- Diluyente: agua peptonada al 0,1%.

3.2.4. PROCEDIMIENTO

Se realizaron las diluciones como anteriormente se había descrito

(práctica anterior)

3.2.4.1. Prueba presuntiva

- Se tomó 1 mL. de la primera de las tres últimas diluciones escogidas, y

las colocamos en un tubo de ensayo contenido caldo brilla.

- Se homogenizó con cuidado la muestra con el medio de cultivo

- Se incubó a 35°± 2°C/24 - 48horas.

- Después del tiempo transcurrido se pasó a realizar las lecturas de los

tubos.

- Finalmente se anotó los tubos positivos, y confirmarlos.

 3.2.4.2. Prueba confirmativa

- De los tubos positivos, tomar con el asa de siembra una alícuota y

sembrar por estría en placas conteniendo agar EMB, para confirmar los

tubos positivos.

- Incubar las placas a 35° ± 2°C/ 24 horas.

- Después del tiempo transcurrido realizar la lectura de las placas.

3.2.4.3. Lectura

- En la prueba presuntiva se consideró tubos positivos los que

presentaron gas en los 2/3 del tubo de Durham o tubo de fermentación.

- En la prueba confirmativa: se consideró positivo el tubo del cual

provinieron las alícuotas.

- Se anotó los tubos positivos de cada una de las tres series y se leyó en

la tabla de Número más probable.

 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 RESULTADOS

4.1.1 NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS

A continuación se muestra en el cuadro 1 los datos obtenidos en el

laboratorio.

Tabla 1. Datos experimentales

FACTOR DE
N° MICROORGANISMOS PROMEDIO
DILUCIÓN
54
𝟏𝟎−𝟏 54.5
55
42
𝟏𝟎− 43.5
45
25
𝟏𝟎− 26
27

Fuente: Elaboración propia

Cálculos:

Para 𝟏𝟎−𝟏 :

( 4. ) ( 1)
𝑁° 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 =
( 𝑚𝐿)

𝑵° 𝑼𝑭𝑪/𝒎𝑳 = 545
Para 𝟏𝟎− :

(43. ) ( )
𝑁° 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 =
( 𝑚𝐿)

𝑵° 𝑼𝑭𝑪/𝒎𝑳 = 4350

Para 𝟏𝟎− :

(26) ( )
𝑁° 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 =
( 𝑚𝐿)

𝑵° 𝑼𝑭𝑪/𝒎𝑳 = 𝟔𝟎𝟎𝟎

En el cuadro 2 se muestran los resultados obtenidos

Cuadro 2. Número de microorganismos aerobios viables en la

leche fresca

FACTOR DE
INÓCULO (mL) N° UFC/mL
DILUCIÓN
𝟏𝟎−𝟏 1 545

𝟏𝟎− 1 4350

𝟏𝟎− 1 26000

Fuente: Elaboración propia

 4.1.2 NUMERACIÓN DE COLIFORMES

 Prueba presuntiva

En el cuadro 3 se presentan los resultados obtenidos de la prueba

presuntiva del número más probable de coliformes.

Cuadro 3. Tubos positivos en la prueba presuntiva

DILUCIONES
𝟏𝟎−𝟏( ) 𝟏𝟎−𝟏( ) 𝟏𝟎−𝟏(𝑪) 𝟏𝟎− (A) 𝟏𝟎− ( ) 𝟏𝟎− (𝑪) 𝟏𝟎− (A) 𝟏𝟎− ( ) 𝟏𝟎− (𝑪)
+ + + + + + + + +
3 3 3

Fuente: Elaboración propia

 Prueba confirmativa

En el cuadro 4 se presentan los resultados obtenidos de la prueba

presuntiva del número más probable de coliformes.

Cuadro 4. Tubos positivos en la prueba presuntiva

DILUCIONES
𝟏𝟎−𝟏( ) 𝟏𝟎−𝟏( ) 𝟏𝟎−𝟏(𝑪) 𝟏𝟎− (A) 𝟏𝟎− ( ) 𝟏𝟎− (𝑪) 𝟏𝟎− (A) 𝟏𝟎− ( ) 𝟏𝟎− (𝑪)
- - - - - - + + +
0 0 3

Fuente: Elaboración propia

- Por lo tanto, se puede decir que el resultado del número más probable es: 0–0–3.

- Para este resultado la tabla de NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de

fermentación utilizando 3 diluciones con tres repeticiones (3 tubos), nos da un valor de 0.09

bacterias/mL de leche.
 4.2 DISCUSIONES

- DIGESA (2003), describe las especificaciones que debe tener una leche

cruda para que sea apta para consumo humano o comercialización dando

los siguientes valores:

N° m.o aerobios mesófilos = 500000 – 1000000 UFC/mL

N° Coliformes = 100 – 1000 UFC / mL

Comparando con los resultados obtenidos en práctica estos difieren

con los siguientes valores:

N° m.o aerobios mesófilos = 10298 UFC/mL

N° Coliformes = 0.09 UFC / mL

Donde podemos decir que para el número de microorganismos

aerobios mesófilos viables se encuentra dentro del límite establecido, mientras

que para el número de coliformes el resultado no es creíble y esto puede ser

debido a que no se realizó el análisis correctamente.

 V. CONCLUSIONES

- Se determinó el número de microorganismos mesófilos viables presentes

en una muestra de leche, la cual fue igual a 10 298 UFC/Ml.

- Se determinó la condición higiénica de la leche con relación a la

contaminación con bacterias coliformes.

- Se llegó a la conclusión que la leche si apta para consumo humano ya

que si cumple con los límites establecidos por DIGESA.

 VI. BIBLIOGRAFIA

AMIOT, J. 1991. Ciencia y tecnología de la leche. Trad. por Rosa

Oria. Zaragoza, España, Acribia S.A. 547 p.

DECRETO supremo N° 007. 2017. Reglamento de leche y productos

lácteos. [En línea]: MINAGRI,

(http://www.digesa.minsa.gob.pe/orientacion/DS_7_2017_MINAGRI.pdf)

RESOLUCIÓN ministerial N° 615-2003-SA/DM. 2003. [En línea]:

DIGESA, (http://www.digesa.minsa.gob.pe/norma_consulta/Proy_RM615-

2003.pdf).

LLAMOSAS, J. 2003. NORMA TÉCNICA PERUANA. [En línea]:

INDECOPI, (https://infolactea.com/wp-content/uploads/2015/03/723.pdf).
 ANEXOS

Figura 1. Diluciones de la muestra de leche Figura 2. Placas contenidas de colonias

Figura 3. Tubo positivo prueba presuntiva coliformes