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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

Y PREGUNTAS SOBRE TEMAS DE LAS CLASES


TEÓRICAS

CURSO DE INMUNOLOGÍA BÁSICA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS


U.N.C.P.B.A.
2016
CURSO DE INMUNOLOGÍA BÁSICA
2015

Introducción al sistema inmunitario. Células de la inmunidad innata


Objetivos: introducir al alumno a la función del sistema inmunitario, conocer los factores
fisiológicos que pueden modular su funcionamiento. Enumerar y describir las barreras
naturales de un animal y describir las moléculas que pueden ser reconocidas como extrañas
por el sistema inmunitario. Conocer cuáles son los órganos linfoides, su localización y
clasificación. Identificar los componentes celulares de la inmunidad innata. Conocer la
ontogenia, localización e identificación de las células sanguíneas.
Contenidos: Inmunidad. Estructura del sistema inmunitario (breve reseña de órganos, células
y moléculas involucradas). Órganos linfoides primarios (médula ósea, bursa de Fabricio,
placas de Peyer ileocecales, timo). Órganos linfoides secundarios: linfonódulos, bazo, placas
de Peyer yeyunales. Sistema inmune asociado a mucosas (MALT) y sus compartimientos.
Barreras naturales: físicas, químicas y biológicas. Generalidades de los sistemas inmunitarios
innato y adaptativo. Antígeno e inmunógeno. Concepto. Tipos de sustancias antigénicas.
Células de la inmunidad innata: granulocitos: neutrófilos, eosinófilos, basófilos.
Agranulocitos: monocitos, linfocitos. Patrones moleculares asociados a patógenos (PMAPs):
concepto, ejemplos. Receptores para moléculas asociadas a patógenos: localización y función.
Macrófagos: subpoblaciones (características morfológicas, receptores, localización).
Opsonización y fagocitosis. Mecanismos bactericidas. Células dendríticas: subpoblaciones
(ontogenia, características morfológicas, localización y función). Mastocitos: características
morfológicas, localización, función. Células NK: características morfológicas, reconocimiento
y función. Linfocitos T y linfocitos B1: localización y funciones.

Componentes humorales de la inmunidad innata


Objetivo: Identificar los principales mecanismos efectores de la inmunidad innata y la
inflamación.
Contenidos: Proteínas y péptidos de acción inespecífica: defensinas, enzimas antibacterianas,
proteínas captadoras de nutrientes, etc. Complemento: definición, características, funciones.
Proteínas de fase aguda: definición, características, funciones. Citoquinas definición y
funciones generales. Quimioquinas. Interleuquinas proinflamatorias. Respuesta de fase
aguda. Sistema del interferón (INF) tipo I. Inflamación: efectos locales y sistémicos.

Receptores de antígeno. Procesamiento y presentación. Tolerancia central


Objetivos: Conocer los distintos mecanismos de reconocimiento del Ag, los receptores
involucrados, localización, estructura y especificidad. Conocer las vías de procesamiento del
Ag. Conocer las características y etapas de la respuesta inmunitaria adaptativa.
Contenidos: Receptores de Ag de linfocitos B y T: generación de diversidad, estructura. Co-
receptores. Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH): concepto. Moléculas de clase I
y II del CMH: estructura, propiedades y función. Captación, procesamiento y presentación de
Ag. Vía endosómica y citosólica de procesamiento del Ag. Concepto de presentación cruzada
y presentación en moléculas CD1. Maduración de los linfocitos T: selección tímica positiva y
negativa. Células y moléculas que intervienen. Concepto de tolerancia central. Selección
clonal: concepto, localización.

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Respuesta inmunitaria celular adaptativa
Objetivos: Conocer las interacciones celulares y las moléculas y factores solubles
involucrados en la respuesta inmunitaria celular adaptativa. Conocer los mecanismos
inmunitarios conducentes a la eliminación de células infectadas por parásitos intracelulares y
células anormales. Conocer factores que determinan inmunogenicidad o tolerancia, y los
mecanismos involucrados en la tolerancia.
Contenidos: Linfocitos T: Subpoblaciones (LT citotóxicos, LTh0, LTh1, LTh2, LTh17,
LThf Ontogenia, receptores de Ag, localización y función. Citoquinas más importantes.
Respuesta inmunitaria contra bacterias intracelulares y virus. Activación de Macrófagos.
Citotoxicidad (LTc y NK): diferencias y similitudes. Inducción de apoptosis. Factores que
determinan inmunogenicidad o tolerancia. Mecanismos de tolerancia central, periférica y oral.

Respuesta inmunitaria humoral adaptativa. Funciones biológicas de los


anticuerpos. Síntesis de Ig en mucosas
Objetivos: Conocer los requisitos necesarios para el reconocimiento de Ag por parte de LB y
LT, las interacciones celulares y las moléculas y factores solubles involucrados en la
respuesta inmunitaria humoral. Conocer las funciones biológicas de los anticuerpos y la
síntesis de IgA secretoria. Diferenciar la respuesta inmunitaria primaria de la secundaria y
comprender el fundamento de estas diferencias. Diferenciar las repuestas a Ag T-dependientes
con respecto a T-independientes.
Contenidos: Activación de linfocitos B. Fenómeno de cooperación entre LT y LB: moléculas
y citoquinas involucradas, localización. Coestimulación y citoquinas principales. Anticuerpos:
definición, estructura. Maduración de la afinidad. Cambio de isotipo de Ig, localización y
funciones biológicas de cada isotipo. Generación de memoria. Respuesta inmune primaria y
secundaria. Diferencias entre Ag T-dependientes y T-independientes. Respuesta a antígenos T
independientes. Eliminación de complejos inmunitarios solubles. Síntesis de IgA en mucosas.

Respuesta inmune en acción


Objetivos: Identificar y relacionar los mecanismos efectores de la inmunidad innata y
adaptativa involucrados en la respuesta a bacterias y virus.
Contenidos: Respuesta inmune a bacterias. Bacterias extracelulares. Bacterias intracelulares.
Respuesta inmune a virus.

Inmunoprevención
Objetivo: Conocer los tipos de inmunidad, los objetivos de la inmunoterapia y de la
inmunoprevención, los tipos de vacunas y adyuvantes.
Contenidos: Inmunidad pasiva. Transferencia materno-fetal. Sueroterapia. Sueros inmunes,
producción, efecto, ejemplos. Inmunidad activa. Vacunación. Vacunas: mecanismo de acción.
Fines de la vacunación. Clasificación (estado biológico, relación con el agente etiológico,
variedad de componentes). Adyuvantes: clasificación y función. Vías de administración.
Respuesta a vacunas vivas y muertas. Importancia del sistema inmune común de las mucosas
en la inmunización.

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Regulación de la respuesta inmunitaria
Objetivo: Conocer los principales mecanismos de regulación de la respuesta inmune celular y
humoral.
Contenidos: Interacción entre el sistema inmunitario y otros sistemas. Regulación de la
respuesta inmune por parte del antígeno. Regulación de la respuesta inmune por parte de
anticuerpos. Células T reguladoras.

Trabajos Prácticos:
TP 1: Toma y conservación de muestras. Proteinograma. Serología. Medición de Ig
totales
Objetivos: Conocer las muestras más utilizadas para la detección de anticuerpos y/o antígenos
en el diagnóstico serológico, su obtención, remisión y conservación, y los fundamentos de la
serología. Conocer distintas técnicas para evaluar los niveles de Ig totales.
Contenidos: Venas de elección para la extracción de sangre en las diferentes especies.
Material necesario, modo de obtención. Toma de muestra con y sin anticoagulantes. Remisión
al laboratorio. Separación de plasma y suero. Características de una buena muestra.
Conservación de la muestra (tiempo y temperaturas adecuadas). Toma de otros tipos de
muestra: secreciones (leche, calostro, lágrimas, mucus, secreción vaginal y prepucial, semen y
plama seminal, líquido articular, etc) y tejidos (biopsias). Serología: definición y valor
diagnóstico. Anticuerpos. Fuerzas de unión entre anticuerpos y antígenos.
Observación de diferentes técnicas para evaluar los niveles de Ig totales: Proteinograma
electroforético, precipitación de Ig con sales, coagulación con glutaraldehído y densitometría.

TP2 : Pruebas de interacción primaria: fundamentos

Objetivo: Comprender los fundamentos de las principales técnicas serológicas de


interacción primaria utilizadas en diagnóstico veterinario.
Contenidos: Clasificación de las pruebas serológicas. Sueros policlonales y Ac monoclonales:
diferencias, obtención, aplicaciones. Anti-inmunoglobulinas como herramientas en técnicas
inmunológicas. Técnicas de interacción primaria. Fundamentos, conjugado, tipos de
marcadores, enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunohistoquímica e inmunocitoquímica,
inmunofluorescencia directa e indirecta (IFD, IFI), radioinmunoensayo (RIA), Western blot,
polarización de la fluorescencia, inmunocromatografía, citometría de flujo.

TP3: Pruebas de interacción primaria: ELISA e inmunocromatografía

Objetivos: Conocer los pasos de una prueba de ELISA indirecto, comprender la


importancia del uso de controles en la pruebas de laboratorio e interpretar los resultados.
Interpretar diferentes variantes de pruebas de ELISA y sus posibles resultados. Conocer las
etapas de una prueba de inmunocromatografía e interpretar los resultados. Conocer y utilizar
los materiales de laboratorio empleados para realizar estas pruebas.
Contenidos: ELISA indirecto en placa. Pasos, material y reactivos necesarios. Importancia del
bloqueo, lavados y controles. Lectura de resultados. Inmunocromatografía para diagnóstico de
embarazo en humanos. Pasos, material y reactivos necesarios. Lectura e interpretación de los
resultados.

TP4: Pruebas de interacción secundaria: fundamentos

Objetivo: Comprender los fundamentos de las principales técnicas serológicas de interacción


secundaria utilizadas en diagnóstico veterinario.

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Contenidos: Pruebas de interacción secundaria. Concepto. Fundamentos, clasificación
(aglutinación en placa, aglutinación en tubo, precipitación, tipos de inmunodifusión).
Fenómeno de prozona. Identificación de diferentes isotipos de Ig.

TP5: Pruebas de interacción secundaria: aglutinación y precipitación


Objetivo: realizar pruebas de aglutinación en placa (rápidas) cualitativas y semicuantitativas.
Calcular el título de un suero. Observar resultados de pruebas de aglutinación en tubo (lentas)
y de inmunodifusión radial y bidimensional. Identificar los factores que influyen sobre las
pruebas de interacción secundaria. Explicar el fenómeno de prozona. Identificar el isotipo
responsable de la aglutinación comparando resultados de pruebas en presencia y ausencia de
-mercaptoetanol.
Contenidos: Pruebas de interacción secundaria. Fundamentos, clasificación (aglutinación en
placa, aglutinación en tubo, inmunodifusión radial, inmunodifusión bidimensional), detección
de diferentes isotipos de Ig. Fenómeno de prozona. Título de un suero.

TP6: Características de las pruebas serológicas. Integración de TP


Objetivos: Discutir conceptos importantes relacionados a la serología. Identificar y describir
las pruebas serológicas adecuadas para distintas situaciones, realizando un repaso de los temas
tratados en los diferentes TP.
Contenidos: Conversión serológica o seroconversión. Ac monoclonales. Afinidad, avidez,
especificidad de un Ac, reacción cruzada, sensibilidad y especificidad de una prueba
serológica. Pruebas de interacción primaria y secundaria.

PERFIL DEL CURSO


Departamento: Sanidad Animal y Medicina Preventiva (SAMP)
Cuatrimestre de Dictado: 1er Cuatrimestre
Duración: 11 semanas
Página web: http://www.vet.unicen.edu.ar/facultad/areas

Organización:
Clases guía: 9
Talleres: 2
Taller de integración: 1
Trabajos Prácticos: 6
Integrantes del curso:
Guillermo Arroyo, M. V. gharroyo@vet.unicen.edu.ar
Silvia Estein, M. V., Dr. silmares@vet.unicen.edu.ar
Analía Etcheverría, M. V., Dr analiain@vet.unicen.edu.ar
Silvina Gutiérrez, M. V., Dr. segutier@vet.unicen.edu.ar
Paula Lucchesi, Ing. Agr., Dr. paulaluc@vet.unicen.edu.ar
Claudia Lützelschwab, M.V., Dr. clutz@vet.unicen.edu.ar
Nora Lía Padola, M. V., Dr. nlpadola@vet.unicen.edu.ar
Marcelo Sanz, M.V., Dr. msanz@vet.unicen.edu.ar
Daniel Fernández, M.V., Dr. dfer_inm@vet.unicen.edu.ar
Vanesa Fernández, M.V. vanesaf@vet.unicen.edu.ar

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Descripción del curso:
El curso provee conocimientos sobre los componentes del sistema inmune y los
mecanismos inmunológicos básicos, cubriendo aspectos importantes para la formación del
profesional veterinario. Estos temas se desarrollarán en las clases guía y luego aspectos de
los mismos se trabajarán durante los talleres. En el taller de integración se realizarán
actividades de autoevaluación con una discusión grupal posterior. Los trabajos prácticos
desarrollarán los fundamentos de las pruebas de diagnóstico con base inmunológica más
importantes para el diagnóstico clínico. Los talleres y los trabajos prácticos son de
asistencia obligatoria.

Objetivos
A-Objetivos del Curso
Los objetivos del curso son:
1. Comprender los conceptos más importantes sobre los que se basa el funcionamiento
del sistema inmune.
2. Conocer las funciones de tejidos, células, proteínas y genes del sistema inmune.
3. Comprender los mecanismos, interacciones y regulación de la respuesta inmune.
4. Conocer el fundamento de los métodos con base inmunológica utilizados para el
diagnóstico veterinario.

B-Objetivos de aprendizaje
Para que el alumno adquiera dominio de la fisiología del sistema inmune debe lograr:
1. Adquirir el vocabulario específico de la materia.
2. Identificar los estímulos capaces de activar al sistema inmune.
3. Comprender las diferencias entre inmunidad innata y adaptativa.
4. Conocer y relacionar los mecanismos humorales y celulares que intervienen en la
inmunidad innata.
5. Conocer y relacionar los mecanismos que intervienen en la respuesta humoral y
celular de la respuesta inmune adaptativa y su regulación.
6. Comprender los principios de la inmunoprofilaxis
7. Comprender los fundamentos de los métodos inmunológicos utilizados para el
diagnóstico veterinario.
Aptitudes que se
Objetivos de Recursos para la
Evaluación pretende
aprendizaje enseñanza
desarrollar
 Selección de
conceptos relevantes
 Clases teóricas
 Comprensión e
guía
 Evaluación interrelación de
 Talleres
mediante 1 examen componentes y
 Taller de
parcial escrito y mecanismos
integración
B1, B2, B3, B4, B5, talleres  Comprensión de
 Uso de libros de
B6  Evaluación los mecanismos
texto y material
formativa durante el inmunitarios más
seleccionado por los
taller de integración importantes
docentes
 Adquisición y
 Confección de
desarrollo de una
glosario personal
metodología de
estudio
 Evaluación  Manejo de
 Clases prácticas escrita de trabajos material de
B7
 Clases teóricas prácticos laboratorio
guía  Examen parcial  Comprensión del

6
 Taller escrito fundamento de las
 Uso de libros de pruebas con base
texto y material inmunitaria.
seleccionado por los
docentes

Bibliografía
• Tizard I.R. 2009. Introducción a la Inmunología Veterinaria: 8va. Ed. Elsevier España
S. L. ISBN 978-84-8086-431-2.
• Tizard I.R. 2012. Veterinary Immunology: 9th. Ed. Elsevier Inc. ISBN 978-1-4557-
0362-3.
• Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. 2008. Inmunología Celular y Molecular. 6ta.
Ed. Elsevier. ISBN N° 9788480863117.
• Fainboim, L., Geffner, J. Editores. 2011. Introducción a la Inmunología Humana. 6ª Ed.
Editorial Médica Panamericana. ISBN 978-95-0060-.70-92.
• Pennimpede, E., Gomez, C., Stanchi, N. Editores. 2004. Introducción a la
Inmunobiología. 1º Ed. Edulp. La Plata. Argentina. ISBN 950-34-0259-x.
• Gómez-Lucía, E.; Blanco, M.; Doménech, A. Coordinadoras. 2006. Manual de
Inmunología Veterinaria.: Pearson Educación S.A. ISBN 978-84-8322-358-1.
• Murphy, K.; Travers, P.; Walport, M. 2009. Inmunobiología de Janeway. 7ma. Ed. Mc
Graw Hill. ISBN 13: 978–970–10-7347-6.
• MacPherson, G. y Austyn, J.M. 2013. Inmunología: Conceptos y evidencias. 1º Ed.
McGraw Hill Interamericana Editores SA. ISBN: 978-607-15-0938-3
• Material complementario elegido por los docentes.
• Guía de Trabajos Prácticos. Curso de Inmunología Básica 2016. Disponible en
Fotocopiadora del Centro de Estudiantes y en la página web del curso.

Conocimientos Previos requeridos


Se espera de los alumnos tengan conocimiento básico de:
• biología celular
• anatomía macroscópica
• histología del sistema linfático y sanguíneo

Estructura de los talleres:


Los talleres se llevarán a cabo en grupos reducidos a cargo de un docente. Se trabajará con
participación activa de los alumnos, los cuales elaborarán gráficos para representar los
conceptos más relevantes de los mecanismos inmunológicos y responderán preguntas por
escrito, teniendo como objetivo mostrar de una manera clara y sencilla un resumen del
contenido teórico seleccionado para el taller. Los talleres contarán con una evaluación
individual al inicio de los mismos, referida a conceptos clave correspondientes al tema del
taller.

Estructura del taller de integración:


Tendrá lugar luego de la última clase guía, previo al parcial, para reforzar e integrar los
conceptos más importantes. Se realizará una puesta en común de errores detectados en los
talleres. Los alumnos trabajarán con un cuestionario semejante al del parcial y luego se
discutirán las respuestas entre docentes y alumnos.

Estructura de las clases prácticas:


Las clases prácticas introducirán a los fundamentos de las principales pruebas inmunológicas
utilizadas en diagnóstico veterinario, para lo cual se cuenta con una guía de trabajos prácticos

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que contiene los fundamentos teóricos del tema a desarrollar y que cada alumno debe traer
leída al momento del práctico. Se desarrollarán en 4 comisiones de trabajo en los laboratorios
del edificio SAMP e incluirán una explicación introductoria por parte de los docentes, con
participación activa de los alumnos, y luego la realización de tareas de laboratorio, lectura de
pruebas serológicas y actividades de integración de fundamentos teóricos.

Evaluaciones:

Trabajos prácticos: serán evaluados mediante un breve cuestionario escrito al final de la


actividad de laboratorio y calificados como “aprobado” o “desaprobado”.
Examen parcial: será escrito, con preguntas estructuradas, semiestructuradas y a desarrollar.

-Condiciones de aprobación del curso:


1) 75% de asistencia y aprobación de actividades obligatorias (mínimo de 6 actividades
prácticas aprobadas de un total de 8 que incluyen: 6 trabajos prácticos y 2 talleres).
2) Aprobación del examen parcial y del examen final.

-Para poder recuperar, deben tener un mínimo de 4 actividades prácticas aprobadas, dado
que se recupera hasta el 50% de las actividades obligatorias desaprobadas. Los ausentes sin
certificado no se recuperan.

Los certificados médicos se deben traer dentro de las 48 hs de la inasistencia (hasta martes
siguiente inclusive)
Un ausente con certificado a una actividad obligatoria se recupera el viernes siguiente.

Clases de consulta:
Se atenderán consultas, con el fin de aclarar temas puntuales, en la oficina de atención de
alumnos del edificio SAMP, en los horarios que figuren en cartelera.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº1
TOMA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA – PROTEINOGRAMA – SEROLOGÍA -
MEDICIÓN DE Ig TOTALES

Extracción sanguínea: obtención de plasma y suero, remisión y conservación de la


Muestra.
La toma de muestra es una etapa esencial para asegurar un buen diagnóstico. En la extracción
sanguínea es imprescindible que se utilice material limpio y seco (agujas de calibre adecuado,
jeringas, tubos rotulados, tapones) para evitar la contaminación y hemólisis de la muestra. Es
importante conocer para qué se utilizará la muestra y qué volumen de muestra es necesario
tomar. Si se desea obtener sangre para recuento de células sanguíneas, para analizar la
presencia de microorganismos o para obtener plasma, la extracción debe realizarse en tubos
con anticoagulante (EDTA o heparina). Para obtener suero, la sangre se deja coagular en
determinadas condiciones de tiempo y temperatura.

Suero

Coágulo

Sangre sin anticoagulante

Sangre entera
Plasma
Leucocitos

Glóbulos rojos

Sangre con anticoagulante

Las técnicas de extracción varían de una especie a otra, según el vaso sanguíneo de elección y
el espesor, dureza y capa de la piel.
En los rumiantes y equinos, la sangre se extrae de la vena yugular o bien de la vena caudal
(bovinos). La vena yugular se ingurgita por compresión manual del canal yugular y se
introduce la aguja por encima de este punto. La extracción puede realizarse directamente de la
aguja al tubo o con jeringa llevando el émbolo hacia atrás lentamente. También puede
utilizarse el sistema de tubos al vacío (tipo vacutainer), que presentan mayor facilidad de uso
y garantía en cuanto a la asepsia y preservación de las muestras. Este sistema manejado en
forma adecuada presenta un menor riesgo de hemólisis de las muestras con respecto al
sistema de extracción con jeringa. Si la extracción se practica sin jeringa, para que no se
genere turbulencia y se produzca la hemólisis, se saca la aguja y se deja que la sangre fluya
lentamente por las paredes del tubo. Cuando la extracción se realiza a partir de la vena caudal,
se levanta la cola y se introduce la aguja a 15 cm de la base de la cola en la línea media hasta
que penetre en el vaso.
En cerdos la muestra se obtiene a partir de la punción de la vena de la oreja.

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En perros y gatos la muestra se extrae de la vena cefálica antebraquial o de la vena safena.
En las aves se realiza por punción de la vena radial (alar).

Equino Vena yugular


Bovino, ovino, caprino Vena yugular o vena caudal (bovino)
Cerdo Vena de la oreja
Perro y gato Vena cefálica antebraquial o vena safena
Ave Vena radial
Cuando la muestra se toma con la adición de anticoagulante, luego de verter la sangre entera
en el tubo, se realiza la homogeneización mediante una suave inversión. Cuando la sangre
entera no se procesa inmediatamente, debe conservarse refrigerada (4ºC-8ºC) de lo contrario
se mantiene a temperatura ambiente (20-22ºC). Para obtener el plasma, la sangre se centrifuga
a 1500-2000 r.p.m. durante 10-15 min y se separa la capa líquida (superior). Éste se extrae
mediante aspiración con una pipeta y se almacena en viales o tubos.
Para la obtención del suero, se deja coagular la sangre en el tubo a temperatura ambiente
durante un tiempo mínimo de 1-2 h. y máximo de 12 h. (cuanto más tiempo se deje para que
la retracción tenga lugar, mayor cantidad de suero se obtendrá aunque nunca más del 40% del
volumen total). La coagulación y retracción se produce más rápido si se incuba la sangre en
estufa a 37ºC durante 1-2 hs y luego se lleva a refrigeración durante 30 min. más. El suero
obtenido a partir de la retracción del coágulo es separado con la ayuda de una pipeta. Si
existieran glóbulos rojos en suspensión deberá centrifugarse a 1500-3000 r.p.m. y obtener el
sobrenadante.
La coagulación es un proceso que ocurre a temperatura corporal. Para obtener un buen suero
la muestra se debe incubar entre 20-37ºC (a menor temperatura mayor tiempo de incubación).
Las muestras de suero y plasma (sin células) pueden conservarse refrigeradas (4ºC) si van a
utilizarse en corto plazo, de lo contrario si se pretende una conservación por más tiempo se
distribuye en alícuotas y se congela a (-20ºC). El fraccionamiento evita las congelaciones y
descongelaciones sucesivas las cuales conllevan a la desnaturalización y agregación de las
proteínas.
Las características deseables de un suero o plasma es que sea translúcido e inodoro. Esto
implica que no deben utilizarse en las pruebas serológicas sueros hemolisados o
contaminados.

Otras muestras de utilidad para el inmunodiagnóstico o diagnóstico serológico


Para obtener muestras de secreciones vaginales o de tracto prepucial se realiza la perfusión de
solución salina, luego se colecta el líquido del lavado y se centrifuga para eliminar todo tipo
de partículas.
Cuando se desea obtener plasma seminal debe usarse un electroeyaculador o vagina artificial.
Una vez obtenida la muestra debe centrifugarse para obtener el sobrenadante que se retira con
pipeta.
Las muestras de descargas nasales, lágrimas, secreciones vaginales o prepuciales se realizan
mediante hisopado. Luego el hisopo se coloca en solución salina con el agregado de un agente
bacteriostático durante 24 h. a 4ºC para permitir la difusión de las moléculas. La eliminación
de partículas extrañas se logra mediante centrifugación. La muestra se conserva a (-20ºC).
Las muestras de leche o calostro se toman directamente en el tubo y se agrega algún agente
bacteriostático. La conservación y remisión de la muestra se realiza a 4ºC.

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Muestras de tejidos:
Las muestras tomadas se procesan hasta obtener el preparado histológico en el portaobjetos.
Éste puede utilizarse para la detección de Ag o Ac en pruebas de inmunofluorescencia o
inmunohistoquímica. Estas pruebas también pueden desarrollarse sobre frotis o improntas.
PROTEINOGRAMA ELECTROFORÉTICO
El proteinograma electroforético (o electroforesis de proteínas del suero) es una técnica
simple de laboratorio que permite separar las proteínas séricas en distintas fracciones por
medio de la aplicación de un campo eléctrico.
Esta prueba es muy usada para evaluar y monitorear distintos cuadros clínicos así como
también de gran ayuda en el diagnóstico de distintas enfermedades asociadas a desórdenes
proteicos.
Fundamento:
El plasma contiene muchas proteínas (proteínas transportadoras, enzimas, anticuerpos, etc.).
Tanto la carga eléctrica que poseen las proteínas, dada por los aminoácidos que la componen,
como su peso molecular afectan su movimiento sobre un soporte cuando se aplica un campo
eléctrico. Es decir, pequeñas proteínas altamente cargadas migran más rápido que grandes
proteínas, lo que permite que se separen durante la corrida electroforética.
La distinta velocidad de migración permite la formación de varias bandas o fracciones en el
gel de electroforesis, formadas por grupos de proteínas de tamaño y carga similar.
Procedimiento:
Se coloca una pequeña muestra de suero en un soporte, que puede ser de distintos tipos:
- Soportes tipo 1: acetato de celulosa gelificado o agarosa, donde se observan 5-6 bandas de
proteínas plasmáticas (la migración es según relación carga-masa de cada proteína)
- Soportes tipo 2: almidón o poliacrilamida, donde se observan 25 o más bandas (la
migración es según la relación carga-masa y tamaño).
En los laboratorios se usa habitualmente los soportes tipo 1 ya que son más fáciles de
interpretar.
Se coloca el soporte en la cuba de electroforesis con un buffer de corrida de pH y fuerza
iónica determinados tal que las proteínas posean carga eléctrica negativa y migren hacia el
ánodo (polo +) cuando se aplica voltaje.
Luego de terminada la corrida se retira el soporte y se deja evaporar el solvente. Se fijan las
bandas y se colorean con algún colorante para proteínas (según el soporte usado):
- Rojo Ponceau (acetato).
- Negro Amido (agarosa), etc.
Las bandas pueden mirarse a simple vista o leerse con un densitómetro (aparato que permite
cuantificar la intensidad y el ancho de cada banda para conocer el porcentaje de cada fracción
proteica). Si por otro método se determina la concentración de las proteínas totales del suero,
es posible calcular el contenido de cada fracción.

Albúmina

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Fig.1 Gel de un proteinograma de suero normal, y su lectura en densitómetro.
Como se observa en la Fig.1, las proteínas se separan normalmente en 5 fracciones:
albúmina, y ,  2, y globulinas
Albúmina: es una proteína que se sintetiza en el hígado, y es la de mayor concentración en el
suero. Además de su función de transportadora de algunas sustancias endógenas y exógenas,
es de gran importancia en el mantenimiento de la presión coloidosmótica y reservorio móvil
de aminoácidos.

globulinas: incluye varias proteínas, algunas se mencionan a continuación:
globulina: incluye principalmente a la -antitripsina, una proteína de fase aguda.
globulina: en esta fracción se encuentra la haptoglobina, una proteína que une
hemoglobina intravascular evitando su excreción por el hígado. También se encuentran
macroglobulina y ceruloplasmina.
En general, los niveles de las proteínas de las fracciones y globulina se incrementan en
inflamación.
globulinas: incluye proteínas de baja densidad involucradas en el transporte lipídico
(lipoproteínas), de hierro (transferrina) y factores del complemento (C3 y C4).
globulinas: en esta fracción están incluidos los Ac del isotipo IgG.
Es importante aclarar que no todos los anticuerpos migran electroforéticamente con las -
globulinas, sino que algunos de ellos lo hacen con las  y globulinas. (ver fig.2)

Fig. 2
22
2222
2

(Fig. extraída de http://inmunologia-online.tripod.com)

Los niveles de gamma globulinas pueden estar disminuidos en hipogammaglobulinemias


como en agammaglobulinemias, mientras que pueden estar aumentados en enfermedades
inflamatorias crónicas (artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistémico) e infecciones.
Además de las gammapatías policlonales, el proteinograma también permite identificar
gammapatías monoclonales mediante la detección de bandas estrechas en las fracciones
gamma y beta (y, excepcionalmente, en la fracción alfa).
Las disminuciones de los niveles de Ig pueden corresponder a estados de inmunodeficiencia.
En Medicina Veterinaria se cuantifican inmunoglobulinas por ejemplo, para conocer si un
recién nacido ha recibido suficientes Ig maternas (transferencia de inmunidad de la madre al
recién nacido = inmunidad natural pasiva). El nivel de Ig alcanzado en el suero del neonato
dependerá fundamentalmente de la fuente original de Ig, es decir, el calostro materno
(cantidad consumida y contenido en Ig) y del momento de su ingesta.

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En algunos casos, puede ser necesario evaluar el contenido en Ig del calostro, para saber si es
inmunológicamente adecuado o no. En otros, puede interesarnos conocer el nivel de Ig en
suero del recién nacido o de un animal cualquiera, independientemente de su edad.
En ambos casos, estamos buscando evaluar los niveles de Ig totales.
Para ello se cuenta con diferentes técnicas:

 Precipitación de Ig con sales


 Coagulación con glutaraldehído
 Electroforesis
 Inmunoelectroforesis
 Inmunodifusión radial cuantitativa
 ELISA
 Densimetría

PRECIPITACION DE Ig CON SALES (SULFITO DE SODIO O SULFATO DE ZINC)


La prueba de precipitación de Ig con sales como sulfito de sodio o sulfato de zinc, es efectiva
y rápida, mediante ésta es posible determinar la concentración de inmunoglobulinas maternas
en suero del neonato. Permite realizar la prueba varias crías en un mínimo tiempo, y con un
equipo básico, lo cual hace posible su utilización en condiciones de campo. Se basa en la
precipitación de las Ig del suero con sulfito de sodio o con sulfato de Zinc.

Fundamento:
Se utilizan sales de metales pesados como el sulfato de zinc (Zn SO4) o sulfito de sodio
(Na2 SO3) que en determinada concentración pueden unirse al Fc (fracción cristalizable) de las
Ig produciendo un fino precipitado. Se denominan también pruebas turbidimétricas porque la
precipitación enturbia la mezcla (mayor turbidez corresponde a una mayor concentración de
Ig).

COAGULACION CON GLUTARALDEHIDO


El glutaraldehído es un reactivo que tiene la propiedad de coagular las proteínas séricas (razón
por la cual es una sustancia tóxica). El suero se mezcla con una solución de glutaraldehído y
se observa luego si hay formación o no de un coágulo. La formación de un coágulo firme y
adherente indica un nivel adecuado de Ig.

DENSITOMETRIA
El calostro es rico en Ig. Dentro de las fracciones proteicas del calostro, las Ig son las que
sufren mayor variación cuantitativa. Por lo tanto, la densidad del calostro varía más en
función del contenido en Ig que por otros factores. Midiendo la densidad del calostro, se
puede tener una idea aproximada de su contenido en Ig. La densidad puede estimarse
fácilmente mediante el uso de un calostrómetro.

13
concentración en
inmunoglobulinas
(g/l)
80

60

40

20

1030 1040 1050 1060 1070

densidad del calostro

SEROLOGÍA
La serología es la ciencia que estudia la detección de anticuerpos (Ac) en los distintos
líquidos corporales tales como lágrimas, secreciones bronquiales, líquido sinovial, leche,
calostro, plasma seminal, moco vaginal, suero sanguíneo, plasma, etc.
Aunque la palabra "serología" se refiere al suero (y más precisamente, al suero sanguíneo), se
utiliza en un sentido amplio abarcando todas las técnicas empleadas para identificar Ac en
cualquier humor o tejido del organismo. Por ej., en el diagnóstico de algunas enfermedades,
resulta importante detectar Ac en plasma seminal, en moco vaginal, en leche o suero lácteo.
Los Ac son elaborados por las células plasmáticas en respuesta a la estimulación producida
por una molécula extraña para el organismo llamada Ag. Estos Ag se hallan en las bacterias,
los virus, parásitos, hongos, partículas del polvo ambiental, células eucarióticas, etc. Los Ag
poseen sitios de unión (epitopes o determinantes antigénicos) a los cuales se unen los Ac en
forma específica. El número de epitopes constituye la valencia del Ag. Estos pueden ser
iguales o diferentes entre sí, pueden estar repetidos en un mismo Ag (Figura 2).

Figura 3 El suero contiene Ac dirigidos contra los distintos epitopes (1, 2, 3, 4)

Fuerzas de unión Ag-Ac Factores que afectan la unión


Las fuerzas de unión que participan en la interacción Ag-Ac son de tipo no covalente (Figura
4). Si bien cada una de éstas por sí sola es débil, la sumatoria de las mismas crea una
unión estable y reversible. Los factores que influyen en esta unión son:
- pH
- temperatura

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- tiempo de incubación
- agitación
- concentraciones relativas de Ag-Ac
- concentración de electrolitos

Anticuerpo Antígeno

H
O O
Enlace de
hidrógeno N N
H

Enlace - +
electrostático
- +

Fuerzas de - + - +
van der Waals
+ - + -

Fuerzas
hidrofóbicas

agua excluida

Figura 4. Fuerzas de interacción atractivas. Extraído de: Regueiro J.R., López Larrea C.
“Inmunología. Biología y Patología del sistema inmune”. Editorial Médica Panamericana.
1996.

15
TRABAJO PRÁCTICO Nº2
PRUEBAS DE INTERACCION PRIMARIA: FUNDAMENTOS

Clasificación de las pruebas serológicas


Las pruebas serológicas pueden clasificarse en tres categorías principales:
Pruebas de interacción primaria: Detectan la unión Ag-Ac, es decir la formación del
complejo inmune.
- inmunofluorescencia
- ensayo de polarización de luz fluorescente
- radioinmunoensayo
- enzimoinmunoensayo
- inmunocromatografía

Pruebas de interacción secundaria: Detectan la consecuencia de la unión Ag-Ac que se


observa como un aglutinado o precipitado de acuerdo a las características físicas del Ag
(particulado o soluble).
- aglutinación
- precipitación

Pruebas de interacción terciaria: La unión Ag-Ac desencadena un fenómeno biológico


visible in vitro (ej: lisis de glóbulos rojos en la prueba de fijación del complemento) o in vivo
(ej: reacción intradérmica) gracias a la acción de otros efectores solubles o celulares.
- Fijación de complemento
- Pruebas intradérmicas

Título de un suero
El título es una forma de expresar la potencia de un suero inmune. Si en una prueba se
enfrenta al Ag con distintas diluciones del suero a analizar, se puede determinar el título del
suero. El título se expresa como la inversa de la máxima dilución del suero que dio reacción
positiva.

PRUEBAS DE INTERACCION PRIMARIA:


Las pruebas de laboratorio que detectan la unión directa (o interacción molecular) entre un Ag
determinado y el Ac específico para ese Ag se conocen como pruebas de interacción
primaria. Estas pruebas pueden ser utilizadas para detectar tanto Ag como Ac en muestras
problema.
Estas pruebas se basan en el reconocimiento de un Ag por parte de los Ac, formando
inmunocomplejos. Normalmente, uno de los dos componentes (Ag o Ac) está adsorbido
(inmovilizado, fijado) en una fase sólida, como por ejemplo un tubo de poliestireno, una placa
multipocillos de plástico, un portaobjetos conteniendo tejidos o células, o una membrana de
nitrocelulosa; y el otro reactivo está "marcado" para facilitar la detección del
inmunocomplejo formado. Luego de producida la interacción entre el Ag y el Ac (para lo cual
se incuba determinado tiempo), se separara el reactivo marcado libre (en exceso) de aquel que
está formando parte de los inmunocomplejos fijos a la fase sólida, para lo cual se realizan
sucesivos lavados.
El "marcado" del Ag o del Ac se realiza mediante la unión covalente con elementos que
emiten una señal característica y observable. A este reactivo (Ag o Ac) marcado se lo
denomina conjugado.

16
Las sustancias marcadoras más comúnmente utilizadas para la fabricación de conjugados son
isótopos radiactivos, enzimas o colorantes fluorescentes; siendo la señal emitida detectada
mediante contadores de radiactividad, a simple vista y/o con espectrofotómetros,
fluorocitómetro y/o microscopio de fluorescencia, respectivamente.
En algunas de estas pruebas se utilizan los anticuerpos anti-inmunoglobulinas. ¿Cómo se
obtienen estos reactivos?: cuando inmunoglobulinas (Ig) purificadas provenientes de una
determinada especie animal (ej. bovino) se inyectan en un animal de otra especie (ej. conejo),
éstas se comportan como Ag (son reconocidas como extrañas). En este caso, el sistema
inmune del conejo reacciona formando anticuerpos (anti-inmunoglobulinas) contra las Ig
bovinas, los cuales se purifican para utilizarlos como reactivo en el laboratorio.

Entre las pruebas de interacción primaria más utilizadas en el diagnóstico de enfermedades se


encuentran
Inmunofluorescencia (IF)
Enzimoinmunoensayo (Enzyme linked immunosorbent assay o ELISA)

INMUNOFLUORESCENCIA
Es una técnica utilizada para la detección de moléculas (tanto Ag como Ac, dependiendo del
diseño) usando reactivos con colorantes fluorescentes, como el isotiocianato de fluoresceína
(FITC), la rhodamina o la ficoeritrina (PE). Estas sustancias al ser excitadas con luz de
longitud de onda del rango ultravioleta (190-380 nm), emiten luz visible de longitud de onda
mayor que se observa como una fluorescencia amarillo-verdosa (FITC, 495 nm) o anaranjado-
rojiza (PE y rhodamina, 480-565 nm).
Existen dos variantes de esta técnica: la IF directa y la IF indirecta.

Inmunofluorescencia Directa (IFD)


En esta técnica se utiliza un Ac marcado con una sustancia fluorescente para detectar la
presencia del Ag en una muestra de tejido o células o en frotis de cultivos de
microorganismos (ver Fig 1A).
La muestra es previamente fijada sobre un portaobjetos con un solvente (metanol-acetona).
Esta fijación además permeabiliza la membrana de las células para facilitar la entrada del Ac.
En un paso posterior se incuba la muestra con el conjugado y luego se elimina el reactivo
excedente por medio de lavados con solución salina tamponada. La muestra se examina en un
microscopio de fluorescencia con luz azul o verde observándose la fluorescencia generada por
el conjugado en los lugares en que ha quedado unido al Ag de la muestra; el resto del campo
permanece oscuro.

Fig 1A. Inmunofluorescencia directa

17
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)
Esta variante de la IF utiliza como conjugado un Ac anti-Ig marcado con sustancias
fluorescentes, para detectar la unión entre un Ac no marcado con su Ag específico (ver Fig
1B)
El procedimiento es similar al de IFD, excepto que al corte de tejido (o a las células) fijado al
portaobjetos conteniendo un Ag determinado (microorganismo, receptores, etc), se le agrega
una muestra problema (conteniendo potencialmente Ac que reconocerán al Ag). Los
inmunocomplejos formados luego de la incubación de estos dos componentes serán
detectados por la adición del conjugado (la anti-Ig marcada). Luego de los lavados necesarios
para la eliminación del conjugado libre, la muestra se observa con microscopio de
fluorescencia.

Fig 1B. Inmunofluorescencia indirecta

ENSAYO DE POLARIZACIÓN DE LUZ FLUORESCENTE (FPA)


Se basa en que una molécula en solución rota con una velocidad inversamente proporcional a
su tamaño. Si esa molécula está unida a un marcador fluorescente (por ej. FITC) y se lo excita
con luz polarizada, se puede evaluar la tasa de rotación de la molécula según en qué
direcciones emita la luz. Esto es medido por un detector que lo traduce en una señal.
Para la detección de Ac, se hace reaccionar la muestra (por ejemplo suero o sangre) con un
Ag de pequeño tamaño marcado con una sustancia fluorescente. Si en la muestra hay Ac
específicos contra ese Ag, se unirán al Ag marcado por lo cual este complejo (Ac + Ag
marcado), al tener mayor tamaño molecular, tendrá una menor velocidad de rotación que el
Ag libre, y esto podrá ser medido mediante un lector de polarización de fluorescencia.
Las principales ventajas de este ensayo son que no es necesario separar los complejos Ag-Ac
del reactivo en exceso, es una prueba rápida (el resultado se obtiene en menos de 10 minutos
habitualmente) y de fácil automatización. En veterinaria se ha estandarizado para el
diagnóstico de unas pocas enfermedades infecciosas, y es utilizada más ampliamente en la
detección de drogas y metabolitos en distintos fluidos.

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
El RIA es una prueba de interacción primaria que utiliza un radioisótopo como marcador del
conjugado. El más común es el 125I. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar
concentraciones muy pequeñas de una sustancia (hasta el orden de pg/ml), Los
radioinmunoensayos pueden realizarse en fases fluidas (RIA) o sólidas. Por ejemplo, en

18
endocrinología permite la cuantificación de hormonas mientras que en clínica se usa para el
diagnóstico de enfermedades atópicas detectando la presencia de IgE y alergenos (RIST y
RAST).
Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los
potenciales peligros para la salud y la contaminación ambiental que supone el manipuleo de
sustancias radiactivas.

ENZIMOINMUNOENSAYO (EIA)
El enzimoinmunoensayo es una técnica versátil y muy sensible, que puede utilizarse para
detectar y medir en una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen
como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa, la
fosfatasa alcalina y la ß-galactosidasa.
Esta técnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza: cuando es
en placa, se denomina ELISA; sobre tejidos, inmunohistoquímica y sobre células, inmuno-
citoquímica.

ELISA (en placa)


La prueba se realiza en placas de plástico (poliestireno) de 8 cm x 12 cm que contienen 96
pocillos, cada uno de aprox. 1 cm de profundidad y 0,7 cm de diámetro (Fig. 2)

Fig. 2 Placa de ELISA con 96 pocillos


Existen muchas variantes del ELISA y su diseño depende de lo que se quiera determinar. La
más utilizada es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en una
muestra problema, utilizando como conjugado un Ac anti-Ig marcado con una enzima (Fig 3).
Para detectar la presencia de este conjugado, se agrega a la reacción un sustrato específico de
dicha enzima y un cromógeno que permita observar la acción de la enzima sobre su sustrato.
Si luego de la reacción inmunológica y de los posteriores lavados, el reactivo marcado
permanece unido a la fase sólida, al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno la enzima
actuará sobre su sustrato, modificándolo, y este producto inducirá un cambio de color en el
cromógeno soluble sobrenadante (Fig 2). La intensidad de color es directamente proporcional
a la cantidad de anti-Ig marcada que se haya captado, y ésta a su vez será proporcional a la
cantidad de Ac que se encuentren en la muestra problema. La intensidad de color se puede
estimar a simple vista (cualitativo), o lo que es más adecuado, mediante espectrofotometría,
expresándose como densidad óptica. Si uno deseara determinar el título de un suero debería
incubar la placa en la que se encuentra fijado el Ag con diferentes diluciones del suero
problema. La inversa de la última reacción que da reacción positiva es el título del suero.

19
Inmunohistoquímica (IHQ) e inmunocitoquímica (ICQ)
Cuando el enzimoinmunoensayo se realiza sobre tejidos o células, hablamos de
inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, respectivamente. Estas pruebas se realizan
sobre cortes de tejido de un modo similar a las IF, pudiendo ser directas o indirectas. En este
caso, el conjugado es una inmunoglobulina marcada con una enzima que al actuar sobre su
sustrato, lo modifica, y este producto induce un cambio en el cromógeno, convirtiéndolo en
un producto de reacción coloreado. Esta prueba se lee con microscopio de luz observándose
una reacción positiva como un precipitado de color sobre las estructuras histológicas o las
células que contengan el Ag buscado (Fig. 4).

Fig. 4. Esquema de una Inmunohistoquímica.

INMUNOCROMATOGRAFÍA (CROMATOGRAFIA DE FLUJO LATERAL)


La inmunocromatografía es un tipo de prueba de interacción primaria que se utiliza en
ensayos sencillos y de lectura rápida.
En esta prueba uno de los componentes está marcado con nanopartículas coloreadas, por
ejemplo con metales pesados (oro o selenio coloidal, generando bandas de color rosa o azul
respectivamente). Otros marcadores pueden ser partículas de látex coloreadas o de carbón.
La reacción se lleva a cabo sobre una tira de un material poroso (por ejemplo, nitrocelulosa).
En las tiras reactivas se pueden distinguir 5 zonas:
1. Zona de siembra de la muestra
2. Zona del conjugado
3. Zona de detección
4. Zona de control
5. Región absorbente

El procedimiento es muy sencillo: la muestra con el Ag a analizar se coloca en la zona de


siembra de la muestra, y fluye por capilaridad hasta la zona del conjugado, en donde el Ac
específico marcado (conjugado) se encuentra inmovilizado. Al pasar la muestra solubiliza al
conjugado, y en caso de haber Ag en la muestra forma inmunocomplejos. Estos
inmunocomplejos formados siguen migrando lateralmente hasta la zona de detección, en la
cual se hallan fijados a la membrana Acs específicos contra otro epitope del Ag, de manera
que los inmunocomplejos son fijados en esta zona de detección, formando una banda
coloreada, rosa o azul dependiendo del metal utilizado en el conjugado.
La muestra fluye por capilaridad hasta la zona de control. Aquí el exceso de conjugado es
capturado por un Ac anti-conjugado, formándose una banda coloreada tanto si el Ag está
presente en la muestra como si no lo está. Este control indica que la prueba ha sido realizada
correctamente y todos los reactivos funcionan bien. Finalmente el resto de la muestra es
absorbida en la región absorbente (ver figura 1).

20
Esta prueba puede ser utilizada también para la detección de Acs. En este caso, el conjugado
es el Ag específico marcado. En la zona de detección está fijado un Ac anti-Ig (dependiendo
de la especie en la cual se buscan los Acs), el cual capturará los complejos inmunes formados
si la muestra posee Acs específicos. En la zona de control un Ac específico para el conjugado
(en este caso el Ag marcado) captura el exceso de Ag solubilizado por la muestra.
Aplicaciones:
En medicina humana se utiliza este test para detectar la gonadotrofina coriónica (test de
embarazo).
En medicina veterinaria se utiliza para detectar antígenos (Virus de la leucemia felina, parvo y
rotavirus, parásitos como Dirofilaria inmitis, y bacterias) o anticuerpos (anticuerpos anti-
virus de la inmunodeficiencia felina).

Zona de la muestra Zona del conjugado Zona de detección Zona de control


Fig 1: Esquema de una prueba de inmunocromatografía para detección de antígeno. En la parte superior se
esquematiza la prueba positiva, dando una banda en la zona de detección y una segunda banda en la zona de
control. En la parte inferior, se esquematiza la prueba negativa, donde sólo se observa reacción en la zona de
control.
………………………
La siguiente tabla resume los marcadores utilizados en algunas de las pruebas de
interacción primaria más importantes y los equipos utilizados para la lectura o
visualización de los resultados.

Marcador del
Técnica Lectura de la prueba
conjugado
Inmunofluorescencia Fluorocromo Microscopio de fluorescencia
Lector de
Polarización de luz fluorescente Fluorocromo
polarización de fluorescencia
Radioinmunoensayo Radioisótopo Contador de radiactividad
ELISA Espectrofotómetro o a simple vista
EIA Inmunohistoquímica Enzima Microscopio óptico
Inmunocitoquímica Microscopio óptico
Nanopartículas
Inmunocromatografía A simple vista
coloreadas

21
Fig 3. Enzimo inmuno ensayo (ELISA) indirecto

23
24
25
26
TP3: PRUEBAS DE INTERACCIÓN PRIMARIA:
ELISA E INMUNOCROMATOGRAFÍA

ELISA INDIRECTO: procedimiento e interpretación de resultados


Objetivos: conocer los pasos de una prueba de ELISA indirecto, comprender la importancia
del uso de controles en la pruebas de laboratorio e interpretar los resultados.

Se utilizará la técnica de ELISA indirecto para determinar la presencia/ ausencia y título de


los Acs específicos contra un virus.
Materiales necesarios:
- Placas de 96 pocillos o tiras de 8 pocillos, recubiertas con Ag.
- Suero control negativo (sin Acs específicos) y positivo (con Acs específicos)
- Diluyente para las muestras y controles
- Conjugado (Ac anti-Ig bovina marcado con peroxidasa)
- Solución de lavado
- Mezcla de sustrato-cromógeno
- Servilletas de papel
- Micropipetas mono y multicanal
- Espectrofotómetro lector de ELISA
Procedimiento:
A continuación se detalla el procedimiento completo. En el TP terminaremos una prueba
comenzada por los docentes (a partir del paso 3)
1. Colocar los reactivos a TA con 30 minutos de anticipación.
2. Incubación de las muestras y controles en los pocillos recubiertos con Ag, según los
siguientes diseños:

a. Diseño utilizado para detectar presencia/ausencia de Acs específicos. En este caso


tanto los controles como la muestra problema se colocan a una dilución
determinada, por ejemplo 1:10. En los pocillos que no se coloca muestra (blancos)
se coloca solamente el diluyente de muestras.

POCILLO MUESTRA COLOR DO 405 nm RESULTADO


A -
B -
C Ctrl. positivo
D Ctrl. positivo
E Ctrl. negativo
F Ctrl. negativo
G M. problema
H M. problema

b. Diseño utilizado para determinar el título de un suero. Se analizan varias


diluciones de una muestra problema (MP)

POCILLO MUESTRA COLOR DO 405 nm RESULTADO


A1 -
B1 -
C1 Ctrl. positivo
D1 Ctrl. positivo
E1 Ctrl. negativo

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F1 Ctrl. negativo
G1 MP 1:25
H1 MP 1:25
A2 MP 1:50
B2 MP 1:50
C2 MP 1:100
D2 MP 1:100
E2 MP 1:200
F2 MP 1:200
G2 MP 1:400
H2 MP 1:400

Incubación durante 1 hora a 37ºC.


3. Lavar 4 veces con solución de lavado (Invertir las tiras y eliminar el líquido, llenar los
pocillos con solución de lavado. Repetir este procedimiento 4 veces. Invertir la tira
sobre una servilleta de papel para escurrir)
4. Agregar 100 µl/pocillo de conjugado. Incubar 15 minutos a 37ºC.
5. Lavar 4 veces con solución de lavado (Idem paso 3).
6. Agregar 150 µl/pocillo de mezcla sustrato/cromógeno (ABTS/H2O2)
7. Incubar de 20 a 30 min a temperatura ambiente.
Observar el desarrollo o no de color en los distintos pocillos. Registrar los resultados
en la tercera columna de la tabla.
8. Realizar lectura espectrofotométrica a 405 nm. Registrar los valores obtenidos en la
cuarta columna de la tabla.
9. Interpretación de resultados:
¿A qué se debe el desarrollo de color en los pocillos C y D?
¿Por qué no se desarrolla color en los pocillos E y F?
¿Cuál es el título de la muestra problema?

INMUNOCROMATOGRAFIA: procedimiento e interpretación de resultados

Objetivos:
Conocer las etapas de una prueba de inmunocromatografía e interpretar los resultados.

Se utilizará un test comercial de inmunocromatografía para detectar la presencia de una


hormona (gonadotrofina coriónica humana) en orina. Se seguirán las instrucciones provistas
por el fabricante. Se interpretarán los resultados obtenidos y se discutirán otros posibles
resultados.

28
TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
PRUEBAS DE INTERACCION SECUNDARIA: FUNDAMENTOS

Estas pruebas comprenden dos etapas. En la primera se forman rápidamente los complejos
Ag-Ac (complejos primarios), los cuales no pueden observarse directamente. Luego, en la
segunda etapa o reacción secundaria, los complejos se van agregando hasta hacerse visibles
como precipitado o aglutinado. La temperatura acelera esta segunda etapa, que además es
dependiente de la concentración de electrolitos (generalmente la reacción se realiza en
solución fisiológica).
Las uniones entre los complejos primarios dan origen a estructuras tridimensionales en forma
de red (enrejado de Marrack). La formación de estos agregados es una consecuencia de la
multivalencia de los Ac y los Ag, ya que si no se cumplen estos requisitos, la red no puede
formarse. Además, los reactivos deben estar en proporciones óptimas, dado que la
concentración en exceso tanto del Ag como del Ac origina complejos solubles (Fig. 1).
Si a la preparación antigénica se le agrega un exceso de Ac no se produce reacción. Este
fenómeno se denomina prozona.

Zona de exceso de Zona de proporciones Zona de exceso de


Precipitado formado (mg)

anticuerpos óptimas antígeno

0,3 1 1,5
Antígeno (mg)
Figura 1: Curva de precipitación cuantitativa.
Modificado de Tizard, I. Inmunología Veterinaria. Ed. Interamericana, Méjico. 1995.

Cuando los Ac se combinan con Ag solubles (toxinas, proteínas, extractos de pared


bacteriana) en soluciones con condiciones apropiadas, los complejos precipitan (REACCION
DE PRECIPITACION). Si los Ag son particulados (bacterias, eritrocitos) y están en
suspensión, entonces se aglutinan al unirse a los Ac específicos en condiciones adecuadas
(REACCION DE AGLUTINACION). Un mismo Ac puede dar aglutinación y
precipitación, por ejemplo, con una suspensión bacteriana y con un lisado de la misma,
respectivamente.

PRUEBAS DE AGLUTINACION
Se pueden leer a simple vista o bajo aumento (microscopio óptico o lupa).
La reacción positiva (presencia de aglutinado o grumos) indica que Ag y Ac están presentes
en la reacción (y en proporciones óptimas).
En la figura 2 se muestra un esquema de los resultados obtenidos en dos pruebas de
aglutinación en tubo. La primera (Fig. 2a) se realizó con suero del primer muestreo de un
animal, ensayando las diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640. Se ve que la reacción

29
es positiva sólo en los 2 primeros tubos (1/20 y 1/40). La segunda prueba (Fig. 2b), realizada
con suero de un muestreo del mismo animal a los 40 días del primero, muestra reacción
positiva hasta una dilución 1/320. Esto indica que hubo seroconversión (conversión
serológica), ya que el título del suero en el primer muestreo fue 40 y en el segundo fue 320.

1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640


Figura 2a: Aglutinación en tubo. Reacción positiva en diluciones 1/20 y 1/40.

1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640


Figura. 2b: Aglutinación en tubo. Reacción positiva en diluciones 1/20 a 1/320.

Las pruebas de aglutinación pueden clasificarse según:


Los elementos reactivos, en:
- directas: cuando el Ag es particulado.
- indirectas o pasivas: cuando el Ag soluble se acopla a partículas (por ejemplo: partículas de
látex, glóbulos rojos) para que la reacción con Ac específicos sea una aglutinación en vez de
una precipitación.

el tiempo de realización, en:


- rápidas: si se pueden realizar en pocos minutos.
- lentas: si se requiere una incubación de horas o días.

el grado de detección, en:


- cualitativas: si sólo detectan presencia o ausencia de Ac.
- semicuantitativas: si permiten estimar la concentración de Ac en la muestra (título del
suero).

el soporte, en:
-en placa (corresponde a las pruebas rápidas).
- en tubo (corresponde a las pruebas lentas).

Aplicaciones:
- Diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas.
- Identificación de serotipos bacterianos.
- Tipificaciones de sueros sanguíneos (para determinación de grupos sanguíneos).

30
- Identificación del isotipo de Ig (IgG o IgM) al que pertenecen los Ac presentes en el suero:
mediante el tratamiento previo del suero con -mercaptoetanol se despolimeriza la IgM,
perdiendo su capacidad de aglutinar. Este procedimiento permite conocer en qué etapa de la
respuesta inmune del animal se obtuvo la muestra.
- Valoración de anticuerpos “incompletos” o bloqueantes (prueba de Coombs): ciertos Ac
(monovalentes desde el punto de vista funcional), al estar en presencia de las partículas
correspondientes, se unen a ellas pero no las aglutinan. Esta unión bloquea a las partículas,
impidiendo la aglutinación por Ac específicos bivalentes.
Para valorar estos Ac bloqueantes, luego de que éstos se han unido a las partículas, se agrega
una antiglobulina la cual producirá la aglutinación por unión a los Ac bloqueantes.
Esta prueba permite detectar la presencia de anticuerpos en suero que reaccionan con
antígenos presentes en la superficie de los glóbulos rojos como ocurre en la isoeritrolisis
neonatal del potrillo.

PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN

Se utilizan para detectar tanto Ag como Ac, en forma cuali o cuantitativa. Pueden realizarse
en medio líquido (en tubos) o en medio semisólido (en tubos, placas, portaobjetos).
Cuando se realizan en medio semisólido (gel de agar o agarosa) reciben el nombre de
inmunodifusión. Al difundir y ponerse en contacto el Ag con el Ac, precipitarán formando
una banda o halo cuando estén en la relación óptima. El número de bandas de precipitación
indica la cantidad mínima de sistemas reaccionantes presentes. Es decir que, si las soluciones
contienen varios Ag y Ac diferentes, se producirá una línea de precipitación separada para
cada grupo interactuante de Ag y Ac.
En las pruebas de inmunodifusión se preparan, por ejemplo, placas de Petri con una capa de
gel de agar o agarosa donde se realizan pequeños orificios.

En la inmunodifusión radial (Fig. 3) uno de los reactivos (por ejemplo, el Ac) se añade al
gel antes de preparar la placa, y en los orificios se siembra el otro reactivo a analizar (por
ejemplo, muestras conteniendo o no al Ag), colocando siempre controles positivos. Al
difundir en forma radial y enfrentarse el Ag con el Ac correspondiente, se formará un halo o
anillo de precipitación alrededor del orificio.
La lectura se realiza midiendo el área del anillo de precipitación, y comparándola con los
valores de una curva estándar, siendo el diámetro del halo proporcional a la cantidad de
reactivo sembrado en el pocillo (Fig. 4).
anticuerpos disueltos en el
gel

antígeno en los
pocillos
Figura. 3: Inmunodifusión radial

31
Figura 4. Curva estándar para determinación de la concentración de Ig mediante
inmunodifusión radial
En la inmunodifusión doble bidimensional (prueba de Ouchterlony) ambos reactivos (Ag y
Ac) son sembrados en orificios enfrentados y los dos difunden en el gel. La presencia de una
banda de precipitación entre los dos orificios, indica una reacción positiva (Fig. 5).

Pocillos 2, 4 y 6:
controles
sueros 6 2
positivos.
Pocillos 1, 3 y 5:
problema
sueros
a. Ag
Pocillo central: Ag
5 3
Agantígeno.

Figura 5: Inmunodifusión doble bidimensional

De acuerdo a las leyes de la difusión, la distancia a la que una sustancia difunde está en
relación directa con su concentración y en relación inversa con su peso molecular. Es decir
que, si uno de los reactivos está en exceso, la banda se formará cerca del pocillo del reactivo
presente en menor concentración (Fig. 6, reactivo a) y si uno de los reactivos tiene moléculas
de distinto peso molecular, éstas difundirán con distinta velocidad, dando lugar a la formación
de más de una banda (Fig. 7).

a b c d

Figura 6 Figura 7

32
Aplicaciones:
- Las reacciones en medio líquido se aplican al diagnóstico e identificación de distintas
proteínas animales en productos alimenticios (análisis bromatológicos) o en medicina forense.
- Las pruebas de inmunodifusión se aplican en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y
para la determinación de Ig, C3, transferrina y otras proteínas. También se utilizan para el
análisis de la pureza de una preparación antigénica y de las reacciones cruzadas entre distintos
Ag.
En esta última aplicación se investiga el grado de identidad que presentan dos Ag entre sí,
enfrentándolos con un suero específico para uno de ellos. Pueden obtenerse distintos
resultados:

Ag x Ag x Ag x Ag x-y Ag x Ag y

Ac x Ac x + Ac y Ac x + Ac y

a)Identidad total b) Identidad parcial c) No identidad


Figura 8

La identidad total indica que ambos Ag son idénticos, es decir, no pueden ser diferenciados
entre sí por el antisuero utilizado. Las bandas de precipitación se funden en una sola línea
(Fig. 8 a).
La identidad parcial indica que existe una cierta relación entre los Ag, pero que uno de ellos
(Ag x-y) presenta componentes antigénicos (epitopes) no compartidos con el otro. Las bandas
de precipitación se funden parcialmente en una línea, apareciendo una prolongación o espolón
(Fig. 8 b).
La no identidad expresa que no hay ninguna característica compartida entre ambos Ag. Cada
sistema reacciona independientemente, originando bandas de precipitación que se cruzan (Fig.
8 c).

1) ¿Cuáles son las condiciones necesarias para que ocurra una reacción de aglutinación? ¿Y
una de precipitación?

2) ¿Qué ocurre si en una precipitación se emplea un suero con exceso de Ac?

3) Esquematice una reacción de aglutinación con IgG, otra con IgM. ¿Qué ocurre en ambos
casos si el suero se trata con -mercaptoetanol?

4) ¿Cómo se calcula el título de un suero?

33
TRABAJO PRÁCTICO Nº5
PRUEBAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA: AGLUTINACIÓN Y
PRECIPITACIÓN

PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN:
Objetivo: realizar pruebas de aglutinación en placa (rápidas) y observar resultados de pruebas
de aglutinación en tubo (lentas). Realizar reacciones de aglutinación cualitativas y
semicuantitativas (empleando distintas diluciones de un suero para determinar el título del
mismo). Identificar el isotipo responsable de la aglutinación, comparando los resultados de la
prueba en presencia y ausencia de -mercaptoetanol. Explicar el fenómeno de prozona.

Materiales:
Sueros
Suspensiones de antígenos
Tubos
Pipetas
Pro-pipetas
Solución fisiológica
Aglutinoscopio

Procedimiento/Protocolo:
Aglutinación en placa:
1) Colocar sobre el vidrio 30 l de la suspensión antigénica y un volumen igual del suero sin
que se mezcle con la suspensión.
Repetir el procedimiento utilizando 30 l de solución fisiológica en vez de suero (control
negativo).
Mezclar el suero con el antígeno, y por otro lado, la solución fisiológica con el antígeno.
El resultado se expresa como positivo (+) cuando se forma un aglutinado o negativo (-)
cuando esto no ocurre. Esta es entonces una reacción cualitativa.
Describa cómo observa una reacción positiva y una negativa.

2) Emplear el suero puro y también realizar las siguientes diluciones, empleando solución
fisiológica como diluyente:

Diluciones
puro 1/2 1/4 1/8 1/16
Soluc. fisiol.: 40l 40l 40l 40l
Suero: 80l 40l

40l 40l 40l 40l


Esta es una reacción semicuantitativa. Observar hasta cuál dilución hay aglutinación. Calcular
el título (inversa de la máxima dilución que dio resultado positivo).

Aglutinación en tubo:
Esta prueba es lenta, ya que luego de mezclar en el tubo la suspensión del antígeno con el
suero, debe incubarse en estufa a 37ºC durante 48 h. Por lo tanto observaremos el resultado de
pruebas realizadas con anterioridad.
Considerar que todos los tubos tienen el mismo volumen de antígeno y que las diluciones del
suero son: 1/25, 1/50, 1/100, 1200 (Esta es una reacción semicuantitativa).
Observar aglutinado en el fondo del tubo y líquido claro (reacción positiva). Diferenciar con
botón y líquido turbio (reacción negativa).

34
1) ¿Cuál sería el resultado si ocurre el fenómeno de prozona con un determinado suero?

2) Calcular el título de uno de los sueros en presencia y en ausencia de -mercaptoetanol.

3) Realizar un esquema de lo que ocurre en presencia y en ausencia de -mercaptoetanol si la


aglutinación se debe a la presencia de IgM específica contra ese antígeno. Dibujar las
moléculas de antígeno y los anticuerpos.

PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN (INMUNODIFUSIÓN):


Objetivo: Conocer cómo se realiza una inmunodifusión doble bidimensional, realizando la
siembra de sueros y soluciones de antígenos. Observar la presencia de bandas en reacciones
preparadas con anterioridad. Observar reacciones de inmunodifusión radial. Conocer los
factores que influyen sobre la velocidad de difusión y las causas que originan una doble banda
de precipitación.

1) Realizar un esquema de:


a) una prueba de inmunodifusión doble bidimensional realizada para determinar la
presencia de anticuerpos contra un antígeno determinado.
b) una prueba de inmunodifusión radial
c) una prueba de inmunodifusión doble bidimensional que evidencia identidad parcial
entre 2 antígenos. Realice también el esquema para identidad total y no identidad.

2) Sobre una placa conteniendo un gel de agarosa, sembrar 5 l de la solución del antígeno en
el pocillo central y 5 l de cada suero en los demás pocillos. Haga además un esquema de
resultados a obtener si algunos de los sueros contienen anticuerpos específicos contra ese
antígeno.

35
TRABAJO PRÁCTICO Nº6
CARACTERÍSTICAS DE LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS. INTEGRACIÓN DE TP

Repaso y discusión de conceptos importantes: conversión serológica o seroconversión, Ac


monoclonales, afinidad, avidez, especificidad de un Ac, reacción cruzada, sensibilidad y
especificidad de una prueba serológica.

El suero es una fuente heterogénea de Ac producto del contacto con diferentes antígenos
(Ag). Si deseamos investigar la presencia de Ac específicos contra un Ag determinado
debemos utilizar una prueba serológica adecuada (por ejemplo alguna de las vistas en los TP
precedentes). El resultado de la prueba nos permitirá establecer si el animal tuvo contacto
con el Ag en cuestión. La presencia de Ac para un determinado Ag no implica que el animal
esté enfermo.
Para determinar si ocurre una evolución de la respuesta inmunitaria (humoral), deben
compararse los títulos de dos muestras de suero tomadas con un intervalo de 3 semanas, y si
el título de la segunda muestra es mayor (mínimo 4 veces) que la primera se dice que ocurrió
seroconversión o conversión serológica. También se habla de seroconversión cuando la
muestra tomada en primera instancia es negativa, y la segunda muestra, obtenida
posteriormente, da resultado positivo, independientemente del título del suero.
Por lo anteriormente expuesto se dice que la serología cumple un papel complementario en la
confirmación de un diagnóstico.

La respuesta del sistema inmune a cualquier antígeno, aún el más simple, es policlonal. Esto
significa que el sistema fabrica anticuerpos contra un gran rango de epitopes del Ag. Los
sueros policlonales obtenidos luego de la inoculación de un Ag en un animal, son
comúnmente utilizados como herramientas en serología, diagnóstico e investigación.
Los anticuerpos monoclonales (ANEXO 1) son anticuerpos idénticos de especificidad única
sintetizados por un único clon de células plasmáticas modificadas artificialmente para que
pueda hacérselos crecer indefinidamente. Los Ac monoclonales son hoy ampliamente usados
como reactivos de diagnóstico e investigación.

Afinidad – La afinidad de un Ac es la fuerza de reacción entre uno de sus sitios de


combinación con el Ag (paratope) y un epitope del Ag. Es la sumatoria de las fuerzas de
atracción y repulsión que operan entre el determinante antigénico y el sitio de unión al Ag del
Ac (Figuras 5 y 6).
Alta afinidad Baja afinidad

Ac Ac

Figura 5.

36
Avidez Avidez es la medida de la fuerza total de unión de Ac multivalentes con un Ag que
presenta varios determinantes antigénicos (Figura 6).
Por lo tanto, la afinidad se refiere a la fuerza de unión de un solo determinante antigénico y un
sitio de combinación para el Ag en un anticuerpo individual, mientras que la avidez se refiere
a la fuerza de unión total entre varios antígenos y anticuerpos polivalentes.
La avidez es influenciada por las valencias del anticuerpo y del antígeno.

Afinidad: 104 Avidez: Avidez:


106 1014
Figura 6

Especificidad de un Ac: se refiere a la capacidad de un Ac de reaccionar con un solo epitope


a través de un sitio individual de unión con el Ag. También puede decirse de un conjunto de
moléculas de Ac que tiene la capacidad de reaccionar con solo un Ag. En general, existe un
alto grado de especificidad en las uniones Ag-Ac.
Reacción cruzada: se refiere a la capacidad de de un Ac individual o de un conjunto de Ac de
reaccionar con más de un Ag. La reacción cruzada puede originarse por el reconocimiento de
Ag que comparten epitopes con el Ag original o epitopes similares al del Ag original (Figura
7).

Reacción cruzada

Ac Ac
Ac Anti-A Anti-A
Anti-A

Ag A Ag B Ag C
Epitope compartido Epitope similar
Figura 7

Dos conceptos importantes: Sensibilidad y especificidad


Para interpretar una prueba serológica se deben tener en cuenta los conceptos de sensibilidad
y especificidad. La sensibilidad de una prueba serológica es la capacidad para detectar la
mínima cantidad de Ag o Ac presente en la muestra (Tabla 3). La especificidad de una prueba
serológica está dada por la capacidad de la prueba para detectar uniones Ag-Ac específicas.

37
Pruebas Valores Ac (mg/ml)
Pruebas de unión primaria
Radioinmunoensayo competitivo 0,00005
ELISA 0,0005

Pruebas de unión secundaria


Neutralización de antitoxina 0,00005
Inhibición de la hemaglutinación 0,005
Aglutinación bacteriana 0,05
Hemaglutinación pasiva 0,01
Prueba de precipitación en anillo 18
Precipitación en gel 30
Pruebas de unión terciaria
Prueba de fijación de complemento 0,05

Tabla 3. Cantidad mínima de anticuerpo detectable con ciertas pruebas inmunológicas.


Extraído de: Tizard I. “Inmunología Veterinaria”. Editorial Interamericana. 1996.

Cuestionario para la integración de TP

1) Para cada uno de los siguientes objetivos, elija una prueba serológica y describa cómo la
realizaría para:
a) determinar si en las muestras de suero de 3 animales hay Ac contra cierta bacteria
b) conocer cuál es el título de esos sueros
c) determinar el isotipo de esos Ac (si son IgM o IgG)
d) detectar la presencia de una bacteria en un tejido
e) conocer en qué células de un tejido está presente determinada proteína
f) cuantificar IgM total en un suero canino
g) determinar si un animal está respondiendo a un determinado Ag
h) detectar la presencia de Ac incompletos o monovalentes

2) En una prueba de interacción secundaria, ¿en qué situaciones puede haber formación de
complejos inmunitarios sin formación de la red de Marrack? ¿Cómo se podrían confirmar las
distintas hipótesis?

38
ANEXO 1
ANTICUERPOS MONOCLONALES

Los anticuerpos generados en un animal por inmunización activa, (natural o artificial),


son heterogéneos ya que tienen diferentes especificidades y afinidades. Proceden de distintos
clones de linfocitos B estimulados, por lo que constituyen un conjunto policlonal de
anticuerpos. Esta respuesta policlonal representa una ventaja adaptativa, permitiendo disponer
de Ac capaces de unirse a una gran variedad de antígenos, de expresar diferentes funciones
biológicas y de evolucionar adaptándose al curso de la respuesta inmunitaria.
Por ser reactivos específicos (hacia un antígeno), los Ac pueden ser también utilizados
por el hombre para diversos fines, por ejemplo, para diagnóstico, en terapéutica o para separar
moléculas con fines industriales. Tradicionalmente, un Ac hacia un antígeno se obtiene
inmunizando animales y obteniendo su suero, fuente principal de Ac. Los conejos y los
caballos han sido y aún son muy usados como productores de sueros inmunes. Recordemos
que éstos son reactivos policlonales.
Para algunos usos, sin embargo, la heterogeneidad de los Ac de un suero puede ser una
desventaja. Además, cada preparación de suero es diferente, aún cuando se usen animales
genéticamente idénticos, inmunizados con la misma preparación de antígeno y con el mismo
protocolo de inmunización. Dicho en otros términos: cada respuesta inmunitaria es única. Por
lo tanto es imposible usar reactivos serológicos idénticos en una larga serie de pruebas.
Estas desventajas pueden ser salvadas por los anticuerpos monoclonales, que, como su
nombre lo indica, derivan de un único clon de linfocitos B y son por lo tanto específicos para
un epitope determinado e idénticos entre sí, constituyendo una población homogénea.
Como no es posible purificarlos a partir de un suero policlonal, G. Köhler y C. Milstein
desarrollaron en 1975 un método para su preparación, que se basa en la fusión de un linfocito
B normal con una célula plasmática tumoral (célula de mieloma). La célula híbrida resultante
(llamada hibridoma) hereda de la célula de mieloma la capacidad de crecer indefinidamente in
vitro, y del linfocito B la de secretar anticuerpos.
Luego de la fusión, las células híbridas deben separarse de las que no se fusionaron y de
las que se fusionaron con otra célula del mismo tipo. Esto se logra usando células de mieloma
deficientes en una enzima requerida para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos por una
vía alternativa que reutiliza las purinas. Por lo tanto, si luego de la fusión las células se
cultivan en un medio que contiene un inhibidor de la vía de síntesis de novo de los
nucleótidos (medio HAT), sólo podrán desarrollar las células que puedan utilizar la vía de
síntesis alternativa (es decir, los hibridomas, porque heredan del linfocito la capacidad de
utilizar esta vía). Las células de mieloma que no se fusionaron o se fusionaron entre ellas no
se multiplicarán porque no poseen la vía alternativa, y a su vez, los linfocitos B que no se
fusionaron o se fusionaron entre ellos tampoco se multiplicarán ya que no tienen la capacidad
de crecer indefinidamente in vitro.
El paso siguiente es la selección de los clones que secreten el Ac con la especificidad
deseada, para lo cual se analiza el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma mediante
pruebas serológicas como ELISA y RIA.
Una vez detectados los hibridomas productores del Ac deseado, y controlada su
clonalidad, cada clon se cultiva para producir el Ac monoclonal deseado. El cultivo puede
hacerse in vitro (en medios apropiados para células) o bien in vivo, inyectando
intraperitonealmente las células del hibridoma en ratones y obteniendo tiempo después el
líquido ascítico acumulado, que contendrá una elevada concentración del Ac monoclonal. Los
hibridomas por su parte, se conservan indefinidamente por congelación, pudiendo
descongelarse y cultivarse todas las veces que se desee, obteniendo siempre el mismo Ac.
Como cada hibridoma es un clon derivado de la fusión de un único linfocito B, todas las
moléculas de Ac que produce son idénticas en estructura y por lo tanto tienen el mismo sitio
de unión al antígeno e isotipo.

39
Antígeno

Aislar
células
del bazo Fusión Selección

Suero

Linfoblastos Cél. de mieloma Hibridomas

Ac4

Ac1
Ac1 Ac1 Ac2 Ac3 Ac4
Ac3
Ac2
Ac3
Ac2
Ac4

Anticuerpos policlonales Anticuerpos monoclonales

Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales

Ac policlonales (suero) Ac monoclonales


Epitopes que
Varios * Unico
reconocen
Varía entre animales y entre
No varía.
Especificidad sangrías.
Alta especificidad.
Afinidad Variable entre sangrías. Fija
Bajo en cultivo de tejidos.
Concentración media 1 mg/ml Alto (hasta 20 mg/ml) en
Rendimiento
Volumen variable (según especie) líquido ascítico)

Costo relativo Bajo Alto

*Sin embargo, cada uno de los Ac presentes en el suero reconoce un único epitope.

Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales

- Investigación (purificación y detección de antígenos).


- Diagnóstico in vitro (de preñez, microorganismos patógenos, medición del nivel de ciertas
drogas en sangre, estudios de histocompatibilidad, detección de antígenos tumorales) e in
vivo (detección de antígenos tumorales).
- Fines terapéuticos (inmunotoxinas compuestas por Ac monoclonales específicos de
células tumorales unidos a una toxina letal).

Bibliografía:
- Kuby, J. 1997. Immunology. 3rd. ed. W. H. Freeman and Company, New York. p. 131-135.
- Campbell, A. M. 1984. Monoclonal antibody technology. 1st. ed. Elsevier Science Publishers B.V.,
Amsterdam. p. 1-30.

40
ANEXO 2
Pruebas de interacción primaria
Enzimo Inmuno Ensayo
Dentro de las pruebas de interacción primaria, las pruebas de ELISA han sido de las más
difundidas. Pueden utilizarse para detectar o cuantificar tanto antígenos como anticuerpos,
pueden aplicarse fácilmente a diversos fluidos como leche u orina, requieren pequeños
volúmenes de muestra y son relativamente rápidas. Otra propiedad importante es que la señal
(color) puede ser cuantificada por aparatos específicos (espectrofotómetro) dando un
resultado objetivo que puede ser fácilmente automatizado.
En el desarrollo de los TP Nº3 y 4, se discutió el ejemplo de prueba de ELISA llamado
ELISA indirecto. Dependiendo de la secuencia en que se empleen los diferentes reactivos
(anticuerpos, antígeno y conjugado), podemos generar gran cantidad de variantes de esta
prueba. A continuación se describen algunas de ellas, como son el ELISA de captura o
sandwich y el ELISA competitivo (fig. 1 y 2)

Fig 1. ELISA de captura o sandwich

41
Este tipo de ELISA puede utilizarse tanto para la detección de Ag como la de Ac. En este
ejemplo se utiliza para la detección de un AgX en una muestra compuesta por diferentes
proteínas. Los Ac del isotipo.

Fig. 2: ELISA competitivo.

El ELISA competitivo puede utilizarse para determinar la concentración tanto de Ag como


Ac. En el ejemplo de la Fig. 2, se determina la concentración de Ag de una muestra utilizando
un Ac específico inmovilizado en la placa. El método se basa en la competencia por la unión
con el Ac de captura entre el Ag de la muestra y un Ag marcado con enzima. Cuanto menor
sea la intensidad del color generado, es decir menor absorbancia medida con el
espectrofotómetro, mayor será la concentración de Ag en la muestra problema. El Ag de la
muestra (Ag sin marcar) desplaza al conjugado (Ag marcado), que se elimina con los lavados,
disminuyendo así la cantidad de enzima presente en el pocillo y por consiguiente la cantidad
de color generado al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno. Las concentraciones del Ag en
la muestra se calculan a partir de una curva patrón construida con concentraciones conocidas
del Ag.

42
Veamos algunos de los reactivos que se utilizan en las pruebas de interacción primaria:
Anticuerpos policlonales, obtenidos a partir del suero de animales inmunizados con el
antígeno de interés.
Anticuerpos monoclonales, es decir, producidos por un único clon de células plasmáticas, por
lo tanto con única especificidad. Investigue en la bibliografía como se obtienen los
anticuerpos monoclonales.
Anticuerpos anti-inmunoglobulina, obtenidos por inmunización con inmunoglobulinas de una
especie determinada en un animal de otra especie. Por ejemplo: anticuerpos generados en
conejo anti-IgG bovina (conejo anti IgG bovina)
Por su practicidad y relativo bajo costo, las pruebas de ELISA son de fácil implementación en
programas de control y erradicación de enfermedades infecciosas y en relevamientos
serológicos.

Aplicaciones del ELISA


Hay una gran variedad de infecciones en animales domésticos en las que el ELISA puede ser
aplicada para su detección. A continuación se resumen algunas de las aplicaciones de esta
técnica tanto en la detección de Ag como de Ac en enfermedades infecciosas (Cuadro 1) y no
infecciosas. En el cuadro 2 se muestran las aplicaciones de la técnica de ELISA en otras áreas
distintas a las enfermedades infecciosas.

Enf. Virales Enf. Enf.


Bacterianas parasitarias
Rotavirus Leptospira Trichinella
spiralis
Detección de Ac Parvovirus Salmonella Tripanosoma

Coronavirus Brucella Babesia


abortus
Rabia Campylobacter Toxoplasma
fetus gondii
Leucosis aviar Haemophilus Toxoplasma
gondii
Leucosis Toxina tetánica Fasciola
Detección de
bovina hepatica
Ag
Aftosa Enterotoxina de Echinococus sp.
E. coli
Parvovirus Brucella
abortus
Anemia
Infecciosa
Equina
Rotavirus

Cuadro 1: Aplicaciones de la técnica de ELISA para el diagnóstico de enfermedades

infecciosas.

43
Hormonas Enf. Inmunoglobulinas Bromatología
Autoinmunes
Insulina Ac anti IgG especie de origen
tiroglobulina de las carnes
Estrógenos Ac anti IgA
eritrocitos
Progesterona Complejos IgE
inmunes
Hormonas Ac anti ADN IgM
tiroideas
Cuadro 2: Otras aplicaciones de la técnica de ELISA.

Otras pruebas de interacción primaria utilizadas tanto en investigación como para el


diagnóstico de enfermedades se enumeran a continuación:
Radio Inmuno Análisis (RIA)
Test de adsorción inmune (Radio Inmuno Sorbent Test o RIST)
Test de adsorción de alergeno (Radio allergo Sorbent test o RAST)
Western Blot
Inmunofluorocitometría

Radioinmunoanálisis (RIA)
El RIA es una prueba de interacción primaria que utiliza un radioisótopo como marcador. El
más común es el 125I. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar concentraciones muy
pequeñas de una sustancia (hasta el orden de pg/ml), por ejemplo, en endocrinología permite
la cuantificación de hormonas (Fig 3).
En clínica se usa para el diagnóstico de enfermedades atópicas detectando la presencia de IgE
total y específica para un determinado antígeno (RIST y RAST, respectivamente). El soporte
sólido utilizado en ambos casos es un disco de celulosa.
RIST (radioinmunosorbent test) es un RIA competitivo en el cual se detecta la cantidad total
de IgE del suero de un paciente alérgico sin importar su especificidad. Los niveles séricos de
IgE son generalmente bajos. Una respuesta de Ac en la que se elevan significativamente las
concentraciones séricas de IgE sugiere una predisposición genética a padecer alergia, pero no
aporta datos sobre el Ag que provoca esa respuesta. Se detectan asimismo niveles aumentados
de IgE en animales parasitados.
RAST (radio allergo sorbent test) es un radioinmunoensayo donde se detecta IgE específica
para un determinado Ag o alergeno.
Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los
potenciales peligros para la salud y la contaminación ambiental que supone el manipuleo de
sustancias radioactivas.

44
Fig. 3 Radioinmunoensayo competitivo

Western Blot
Mientras que el ELISA detecta los anticuerpos contra un determinado Ag presentes en
líquidos biológicos, dando resultados negativos, positivos o indeterminados, el Western Blot
es un test más específico. Esta técnica permite identificar un Ag o Ac determinado en una
muestra de composición heterogénea. Por ejemplo, se pueden identificar los Acs generados
contra diferentes fracciones de un patógeno, que componen una respuesta policlonal contra el
mismo. El Western Blot combina la separación de proteínas de una mezcla de acuerdo a su
peso molecular, con la detección inmunológica de Ag individuales mediante el uso de Ac
específicos para esos Ag. (Fig. 4).

45
Dada su alta especificidad, el Western Blot se utiliza en muchos casos como prueba
confirmatoria (p.e.: SIDA) y ha probado ser una herramienta muy útil para identificar los Ag
más importantes en microorganismos complejos y parásitos.

Fig. 4 Western Blot

46
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) o Citometría de flujo
Fluorescence activated cell sorting (FACS o Citometría de flujo) es una técnica que permite
analizar ciertas propiedades físicas y químicas de células o partículas a las que se les ha unido uno
o mas Ac monoclonales marcados con colorantes fluorescentes, capaces de reconocer epitopes
sobre antígenos de superficie celular (por ejemplo CD4, CD8 y CD3). (Fig. 5). Estas células o
partículas se encuentran en suspensión y fluyen, una a una, frente a un rayo láser. A su paso frente
al rayo, la luz es desviada en un ángulo determinado, el cual es proporcional al tamaño de esa
célula. A su vez, los fluorocromos (colorantes fluorescentes) de los anticuerpos unidos a la célula
son activados por la luz del rayo láser, emitiendo fluorescencia, que es colectada por sensores,
filtrada y almacenada en una computadora.

PE (CD8)

Doble positivo
CD4-CD8+ (CD4+CD8+)
1000
100

CD4-CD8- CD4+CD8-
10
1

1 10 100 1000
FITC fluoresc. (CD4)

Histograma Diagrama de puntos

Fig. 5. Esquema de funcionamiento del Citómetro de flujo y gráficos de resultados

El análisis de poblaciones celulares mediante citometría de flujo ha impactado enormemente en


inmunología dada su capacidad para diferenciar y cuantificar simultáneamente sub-poblaciones
47
celulares. Los resultados obtenidos de este análisis pueden graficarse de diferentes formas, entre
ellas en forma de histograma y en forma de diagrama de puntos. En el histograma se representa la
cantidad de células con una alta intensidad de fluorescencia (área sombreada) debida a la unión del
conjugado con moléculas de la superficie celular comparada con una población control negativa
(area blanca). En el ejemplo presentado para el diagrama de puntos se analizan, mediante el uso de
dos conjugados (Ac anti CD8 marcados con Phicoeritrina (PE), y Ac anti CD4 marcados con
fluoresceína (FITC), las subpoblaciones de linfocitos T colaboradores (CD4+), citolíticos (CD8+) e
inmaduros (CD4+CD8+) de una suspensión de timocitos.
Entre las aplicaciones de esta prueba se pueden nombrar medición de la intensidad de expresión de
moléculas de superficie, contenido de ADN, ARN y proteína, tamaño, viabilidad, granularidad y
pH.

48
Preguntas sobre temas de clases

49
INTRODUCCIÓN AL SISTEMA INMUNITARIO
1. ¿Qué es el sistema inmune?¿Qué ocurre en ausencia de un sistema inmunitario funcional?
2. ¿La vigilancia inmunitaria se cumple sólo frente a agentes externos al organismo?
3. Indique las barreras naturales que posee un animal, clasificándolas en físicas, químicas y
biológicas. Identifique algunos factores que puedan alterarlas.
4. Frente a las siguiente situaciones, indique en qué caso espera obtener mayor respuesta inmune
del animal inyectado y justifique su respuesta.
I Un bovino al que se le inyecta:
a) Una proteína de ratón
b) Una proteína de ovino
II Un bovino al que se le inyecta :
a) Una proteína de 200 KDa
b) Un pequeño péptido, proveniente de la digestión de esta proteína.
III Un bovino al que se le inyecta :
a) Una proteína
b) Un lípido
5. ¿Cuáles células del sistema inmune derivan de la línea mieloide y cuáles de la línea linfoide?
Para cada uno de los tipos celulares mencionados, indique la función y la principal localización.
6. ¿Qué diferencias existen en el reconocimiento de material por parte de la inmunidad innata y la
inmunidad adaptativa. ¿Qué estructuras son reconocidas por la inmunidad innata? Indique los
receptores que las reconocen y su localización.
7. Realice un esquema de los pasos del proceso de fagocitosis. Indique las células y moléculas
involucradas.
8. ¿Cuáles son las diferencias entre la actividad fagocítica de los macrófagos y de los neutrófilos?
9. Indique cuáles son los mecanismos bactericidas más importantes que se desencadenan tras la
fagocitosis.
10. ¿En qué tipo de infecciones participan las células NK?
Glosario
Dar una definición de los siguientes términos. Puede incluir en la lista otros términos nuevos para
su vocabulario.
Antígeno Microorganismos comensales
Epitope Epitope
Inmunógeno Epitope secuencial y conformacional
Hapteno Opsoninas
Barreras naturales Quimioquinas
Paratope
Bibliografía :
Escriba los datos del /los libros o material utilizado citando: Autor/es del capítulo si corresponde
(apellido e iniciales de cada uno separados por “;”). Año de publicación. Nº de Capítulo. Título
completo del capítulo. Página inicial y final. Editor/es o autor del libro (apellido e iniciales ). Título
completo del libro. Nº de Edición. Editorial, lugar de publicación.
Ejemplo: Coffin, J.M. (1996). Capítulo 26. Retroviridae: the viruses and their replication, pp 763-
843. En: B.N. Fields; D.M. Knipe; P.M. Howley; et al. Fundamental Virology. 3ra edición.
Lippincott – Raven Publishers, Philadelphia.
En el caso de ser material encontrado en Internet citar: Nombre del sitio. Año de actualización.
Título del artículo. Dirección completa del sitio.Ejemplo: ONUSIDA-OPS. 2004.
Vigilancia del SIDA en las Américas. Disponible en http://www.unaids.org.
50
COMPONENTES HUMORALES DE LA INMUNIDAD INNATA
1) Complete el siguiente cuadro sobre el sistema del complemento:
a)……………………………………………………………………………………
Vías de
b)……………………………………………………………………………………..
Activación
c)……………………………………………………………………………………….

Funciones del a)……………………………………./…………………………………………


C´/ Factores b) ……………………………………./…………………………………………
involucrados c) ……………………………………./…………………………………………

d) ……………………………………./…………………………………………
2) Teniendo en cuenta las distintas funciones del complemento, esquematice las células y
moléculas que intervienen en los siguientes mecanismos:
a) fagocitosis
b) inflamación
3) Complete el siguiente cuadro teniendo en cuenta solo los interferones relacionados con la
inmunidad innata:
Tipo de Nombre Principal célula que lo Función
interferón produce

4) ¿A qué se llama respuesta de fase aguda? ¿Qué componentes y mecanismos intervienen? ¿qué
signos y síntomas se presentan a nivel sistémico?
5) ¿Cuál es la función de la respuesta inflamatoria? ¿Por qué se desencadena esta respuesta?
¿Cómo se relaciona con otros componentes de la respuesta inmunitaria?
6) ¿Cuáles son los signos característicos de la inflamación local y qué los provoca?
7) Indique cuáles son las citoquinas proinflamatorias. ¿Qué células las producen? ¿Sobre qué
tejidos/órganos actúan y qué efecto tienen sobre los mismos?
Glosario
Respuesta de fase aguda Virus Proteínas de fase aguda
Interferones de tipo I Inflamación
Interleuquinas proinflamatorias

Bibliografía utilizada:

51
ORGANIZACIÓN DEL SISTEMA INMUNITARIO. CÉLULAS DE LA INMUNIDAD
ADAPTATIVA.
1) Describa la organización celular del tejido linfoide en el ganglio linfático ¿Cómo circulan los linfocitos
en este órgano?
2) Qué procesos se llevan a cabo en :
a. zona paracortical del ganglio
b. folículo secundario
c. centro germinativo
d. médula
e. vénula de endotelio alto
3) ¿Qué rol tiene la bolsa de Fabricio y cuál es su equivalente en otras especies?
4) Complete el siguiente cuadro:
Propiedad Linfocitos B Linfocitos T
Órgano donde madura
Distribución
Circulación
Receptores de Ag
Tipo de Ag que reconocen
Células diferenciadas
Productos secretados
5) Ordene en una lista las siguientes células en relación con el desarrollo. Identifique al lado de cada célula
el órgano en el cual se las encuentra y además si en el mismo hay contacto con antígeno o no.
a. Linfocito B virgen
b. Progenitor linfoide común
c. Linfocito T citotóxico
d. Plasmocito
e. Célula troncal pluripotente
f. Linfocito T virgen.
6) a)¿Qué componentes del sistema inmunitario se verán afectados en un animal cuya médula ósea es
destruída por irradiación?
b)¿Cuál sería el efecto de una timectomía (extirpación del timo) en un animal recién nacido?
7) Realice un esquema de los mecanismos que se llevan a cabo en el timo indicando las células y moléculas
de superficie involucradas más importantes. ¿Cuál es la consecuencia de la falla de estos procesos?
8) Indique que tipo de selección interviene y su consecuencia sobre los LT inmaduros en los siguientes
casos:
a. No hay TCR 
b. TCR + MHC+ autoantígeno 
c. TCR + MHC de diferente haplotipo 
d. TCR + MHC +Ag X extraño 

9) Realice un esquema de una molécula de inmunoglobulina e identifique sus diferentes componentes y


regiones.
Glosario
Timocitos Vénulas de endotelio alto (HEV)
Selección positiva LT autorreactivo
Selección negativa Tolerancia
Selección clonal Células M
Haplotipo Órganos linfoides primarios
Centro germinal Órganos linfoides secundarios
Células dendríticas
Células dendríticas foliculares
52
RECEPTORES DE ANTÍGENO. PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE ANTÍGENO.
1) ¿A qué se denomina Ag? Explique las características que debe poseer una sustancia para comportarse
como Ag. Cite ejemplos de sustancias antigénicas y no antigénicas para cada una de esas características.
2) ¿Qué diferencias existen en el reconocimiento del Ag por el LT y el LB? Describa los receptores
involucrados en el reconocimiento.
3) ¿Qué camino debe seguir un Ag para ser reconocido y activar a un LT? Mencione células, receptores
más importantes y moléculas que participan. Indique el lugar anatómico donde ocurre la activación del
LT.
4) ¿Cuántos péptidos diferentes puede presentar una misma célula presentadora? ¿Cuántos epitopes
diferentes puede reconocer un LB? ¿Y un LT? Explique
5) ¿Cómo el sistema inmunitario puede reconocer y responder específicamente a una gran variedad de
antígenos (y al mismo tiempo preservar su identidad sin agredirse)?

Glosario
Antígeno
Hapteno
Repertorio
TCR
BCR
CMH
Restricción del CMH
Coestimulación
Especificidad
Diversidad

Bibliografía utilizada:

53
RESPUESTA INMUNITARIA HUMORAL

1) En la respuesta inmunitaria en relación a un antígeno T-dependiente (que es procesado por la vía


endosómica):
a) ¿Qué células son capaces de procesar y presentar este antígeno?
b) ¿Cómo es reconocido este antígeno por los linfocitos B y T? Indique las moléculas y células
involucradas. ¿Cómo son los epitopes reconocidos en cada caso (LB y LT)?
c) ¿Qué subpoblación de linfocitos T interviene? ¿Cómo lo hace?
d) ¿Cuáles son las consecuencias de la activación de los linfocitos B específicos?

2) La respuesta humoral frente a un antígeno T-dependiente evoluciona en 2 fases denominadas


respuesta primaria y secundaria.
a) ¿Por qué se llaman 1aria y 2aria?
b) Realice una curva que represente los niveles e isotipos de anticuerpos a través del tiempo (días)
para esas 2 respuestas
c) Observando el gráfico indique cuál de las 2 respuestas:
- tiene mayor duración
- tiene menor nivel (es decir que alcanza una menor concentración de anticuerpos)
- tiene a la IgG como isotipo predominante
- tiene a la IgM como isotipo predominante
- es más rápida
Explique el por qué de cada una de esas características.

3) ¿Qué características tienen los antígenos T-independientes (TI)? Dé ejemplos. Esquematice cómo
interacciona un antígeno TI con las células que intervienen y las características de la respuesta humoral
que éste genera. Realice un cuadro señalando las diferencias con la respuesta humoral que genera un
antígeno T-dependiente.

4) Identifique los mecanismos en los que los anticuerpos intervienen para eliminar o limitar la acción de
un agente patógeno. Realice esquemas en los que se representen estas funciones biológicas de los
anticuerpos.

Glosario
Antígenos T dependientes
Antígenos T independientes
Maduración (aumento) de la afinidad
Procesamiento de Ag
Inmunidad humoral
Centro germinal
Cooperación celular
Cambio isotópico
Selección clonal
Clase o isotipo de Ig
Moléculas coestimulatorias

Bibliografia utilizada:

54
RESPUESTA INMUNITARIA CELULAR

1) Mencione las distintas subpoblaciones de linfocitos T y qué factores influencian su diferenciación


2) Elabore un cuadro indicando receptores celulares de las subpoblaciones de linfocitos T, vías de
presentación que las activan, función y principal citoquina/s que liberan.

3) Identifique los elementos celulares y humorales que intervienen en la respuesta inmune frente a un
antígeno que es procesado por la vía citosólica
a. Describa el mecanismo de presentación del antígeno, indicando las moléculas de membrana
que intervienen.
b. ¿Cuáles son los requerimientos para la activación de la célula efectora?
c. ¿Cuáles son las consecuencias de la activación de la célula efectora? ¿Cómo lleva a cabo la
eliminación del antígeno?

4) Elabore un cuadro comparando las vías de activación y mecanismo de citotoxicidad de los linfocitos T
citotóxicos y de las células NK (naturales asesinas).

5) ¿Cómo se diferencian la vía de citotoxicidad mediada por FAS de la mediada por perforinas?

6) ¿Qué mecanismos llevan a la activación de los macrófagos? ¿Cuáles son las consecuencias de su
activación?

Glosario
Linfocitos Th1
Linfocitos Th2
Linfocitos Th0
Apoptosis
FAS/ ligando de FAS
Perforinas
Citotoxicidad
INF
Macrófago activado
citotoxinas
Células naturales asesinas o NK

Bibliografia utilizada

55
RESPUESTA INMUNE EN ACCIÓN

1) Cite al menos 2 ejemplos de BACTERIAS EXTRACELULARES, de importancia en Medicina


Veterinaria, que sean productoras de EXOTOXINAS. Identifique sus principales factores de virulencia.
2) Ante la primera entrada de una bacteria productora de exotoxinas, identifique:
a. Las barreras naturales debe vencer para establecer una infección
b. Los principales mecanismos de la inmunidad innata que intervienen. ¿Cómo actúan estos
mecanismos para la eliminación y neutralización del microorganismo?
c. Los mecanismos de la inmunidad adquirida que son importantes para la eliminación de la
infección y para la protección frente a una nueva invasión del mismo microorganismo.
Explique brevemente como se inducen esos mecanismos, indicando cuál es la vía de
procesamiento principal del antígeno, poblaciones y subpoblaciones celulares que intervienen y
principales citoquinas liberadas.
¿Cómo actúan estos mecanismos para la eliminación y neutralización del microorganismo?
3) Conteste las preguntas 1 y 2, pero tomando en consideración BACTERIAS de vida
INTRACELULAR FACULTATIVA de importancia en Medicina Veterinaria.
4) Conteste las preguntas 1 y 2, pero tomando en consideración un VIRUS.
Con la información obtenida, complete el siguiente cuadro:
Tipo de microorganismo
Mecanismos Bacteria extracelular Bacteria intracelular Virus
toxigénica
Mec. solubles
efectores de
la II celulares

Vía de procesamiento
principal del Ag
Principal subpoblación
de LT colaborador que
actúa
Mec. Solubles
efectores de
la IA Celulares

Glosario:
Virus
Endotoxina
Endotoxina
respuesta protectora
mecanismos de evasión de la respuesta inmune

Bibliografía utilizada:

56
INMUNOPREVENCIÓN

1) Complete el siguiente cuadro con los términos escritos en negrita:

Tipo de Efectores involucrados Duración de Generación


inmunidad inducidos/transferidos la protección de memoria
activa/pasiva/ células/Ac corta/larga si/no
natural/artificial
Vacunación
Sueroterapia
Infección o
enfermedad
Transferencia de
Ig vía placentaria
Transferencia de
Ig vía calostral

2) Indique en el siguiente cuadro las ventajas y desventajas del uso de vacunas convencionales vivas y
muertas.
Tipo de vacunas Ventajas Desventajas/riesgos
Vivas/ atenuadas

Muertas/inactivadas/inertes

3) ¿En qué tipo de vacunas deben usarse adyuvantes? ¿Cómo actúan estas sustancias sobre el sistema
inmunitario? Cite los adyuvantes de mayor empleo en medicina veterinaria.

4) ¿Qué es una anavacuna/anacultivo/vacuna integral?

5) ¿Con qué propósito vacunaría una hembra gestante? ¿Qué tipo de vacuna utilizaría y en qué momento
antes del parto lo haría? Fundamente sus respuestas.

6) ¿Cómo será la respuesta a una vacuna en la cual el Ag es un polisacárido de la cápsula de un


microorganismo? ¿Cómo se denominan este tipo de antígenos? ¿Qué tipo de vacuna sería más adecuado
si se quiere desarrollar una respuesta más eficiente y duradera contra ese Ag?

7) Ud. recibirá en clase un frasco de vacuna. En base al estudio del mismo complete este informe:
 Se trata de una vacuna: combinada o mixta
monovalente / polivalente
viva / inerte
liofilizada / en suspensión o solución

 El contenido es monodosis / varias dosis (¿cuántas?)


 ¿Por qué vía se aplica? ocular / subcutánea / intramuscular./ oral/ intranasal
 ¿Contiene adyuvante? SI-NO ¿cuál?
 ¿Qué tipo de antígenos incluye? Somas bacterianos / somas virales / toxoides / lisados / otros
 ¿Hay indicaciones respecto de su conservación?
 Tiene etiqueta de aprobación oficial (SENASA). ¿Qué información hay en la misma?
 ¿A qué controles debió haberse sometido esta vacuna?
Glosario:
Bibliografía utilizada:

57
REGULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA
1) Describa en qué se fundamenta la tolerancia hacia los propios tejidos.
2) ¿Por qué están regulados los mecanismos de la inmunidad innata?
3) ¿Por qué la respuesta inmunitaria frente a un Ag determinado no aumenta indefinidamente? Explique.
4) Identificar los procesos (incluidos los de regulación) que ocurren en cada etapa de la respuesta inmune
humoral (1-2-3).

1 3

5) ¿Por qué 2 animales pueden desarrollar una respuesta inmunitaria diferente frente a una misma
vacuna?
6) Compare las siguientes curvas de respuesta frente a vacunas atenuadas (vivas) e inactivadas (muertas).
¿A qué se debe la diferencia? Relacione con las funciones de los adyuvantes.

Rta. a vacuna Rta. a vacuna


inactivada atenuada

7) Discuta cuáles componentes incluiría en vacunas que protejan contra:


a) una potente exotoxina
b) una bacteria de vida intracelular facultativa
c) un virus
8) Discuta cómo debería ser el esquema de vacunación para proteger a un ternero contra enfermedades
que podría presentar en sus primeras semanas de vida. ¿Vacunaría al ternero recién nacido? Justifique su
respuesta.

Glosario:

Bibiografía utilizada:

58