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Présentation des outils du

laboratoire:
l ttechniques
les h i chromatographiques
h t hi

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
HAUTE PERFORMANCE (HPLC)
&
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
GAZEUSE (GC)

Emeline Houël – 04/06/2007


RAPPELS THEORIQUES
Q

y Principe de la CHROMATOGRAPHIE:

{ Technique d’analyse
d analyse pour séparer les constituants d
d’un
un mélange en
phase liquide ou gazeuse

{ Les molécules
L lé l à séparer
é sontt entrainées
t i é par un fl
fluide
id (liquide
(liq id ou gaz))
= phase mobile

{ Elles interagissent (ou pas) avec un support fixe (solide ou liquide


fixé) = phase stationnaire

Séparation <-> différence d’affinité des substances à analyser à l’égard


des deux phases.
RAPPELS THEORIQUES
Q
Mais aussi:
CCM &
Chromatographie
sur colonne

GPC / GPCHT: Chromatographie par perméation de gel


HPLC: Chromatographie liquide haute performance
CI: Chromatographie ionique
GC: Chromatographie en phase gazeuse
RAPPELS THEORIQUES
Q

y Résultats
Ré lt t obtenus:
bt

{ Sous la forme d’un CHROMATOGRAMME


= tracé représentatif de la concentration de chaque constituant
en fonction du temps

{ « Un pic = une molécule »

Exemple de chromatogramme GC
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)

yP
Principe:
i i
{ Exploiter les interactions entre les solutés et deux phases

{ Pour séparer les solutés en


fonction de leurs affinités

{ Et les identifier et/ou les doser


CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)

y Appareillage:
A ill

{ Injection:

Ù Injecteur =
vanne haute
h pression
i
(manuelle ou non)
à plusieurs voies

Chaine HPLC semi-preparative: http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/


de l’ordre de 45 000 €
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
Beaucoup moins rétentif que le
C18 (généralement nécessite
un plus grand % d’eau en mode
phase inverse))
p
{ Colonnes:

Analytique: 15 cm x 4.6 mm x 5 µm
(450 €)
Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm
x 5 µm (2500 €)

Analytique: 15 cm x 4.6
4 6 mm x 5 µm
(510 €)
Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm
x 5 µm (2800 €)
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)

{ Détecteurs:

Ù UV (détecteur à barrette de diodes)

Ù Indice de réfraction ( RID)


Ù Diffusion de lumière
Ù Viscosimétrie,
Vi i é i conductivité,
d i i é él
électrochimique,
hi i fl
fluorescence, RMN
RMN…
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)

y E
Exemples
l d’d’applications
li ti
{ Etude d’une tisane de Quassia amara

¤ Profil suivi à 245 nm


¤ Phase stationnaire C18
Time (min) flow (mL/min) % water % ACN curve
1,00 70 30
10,00 1,00 50 50 6
12,00 1,00 0 100 11

Bertani, S., Houël, E., Stien, D., Chevolot, L., Jullian, V., Garavito, G., Bourdy, G., Deharo, E.,
Simalikalactone D is responsible for the antimalarial properties of an amazonian traditional
remedy made with Quassia amara L. (Simaroubaceae), J. Ethnopharmacol., 108 (2006), 155-157
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)

{ Dosage d’un
d un composé: exemple de la Simalikalactone D
1. Courbe de calibration

Concentration (mg/mL) Aire du pic


0 0
0,0061
1,22
137258
13933630
Courbe de calibration
3 05
3,05 38926414
84000000
6,1 69117131 70000000
56000000

Aire du pic
42000000
28000000
14000000
0
0 1 2 3 4
Concentration (mg/ml)5 6 7

Droite de régression: Y= 11611021,7856 X

Quassine SkD Quassine SkD

Bertani, S., Houël, E., Bourdy, G., Stien, D., Landau, I., Deharo, E., Quassia amara L. (Simaroubaceae) leaf tea: effect of
the growing stage and dessication status on the antimalarial activity of a traditional preparation, J.
Ethnopharmacol., (2007), 111, 40-42
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)

{ Etude d’extraits
d extraits de Vouacapoua americana (Wacapou)
80:20 90:10 95:5 98:2

99:1

¤ Profil suivi à 230 nm


¤ Phae mobile Hexane / Isopropanol
¤ Phase stationnaire PEG (mode NP)
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)

{ Mise au point d
d’un
un protocole HPLC pour ll’étude
étude d
d’extraits
extraits
méthanoliques d’Eperua falcata (Wapa): influence de la
colonne

¤ Profil suivi à 245 nm ¤ Profil suivi à 245 nm


¤Mode
M d iisocratique
i ((100 % ACN) ¤ Phase
Ph stationnaire
t ti i PEG ((mode
d NP)
¤ Phase stationnaire C18
Time (min) flow (mL/min) % hexane % iProp curve
1,00 99 1
10,00 1,00 90 10 6
11 00
11,00 1 00
1,00 99 1 11
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
Thèse Mariana Royer

{ Identification de composés: extraits d


d’Eperua
Eperua falcata (Wapa)

Catéchine = composé
majoritaire
j it i d des extraits
t it
Chromatogramme de
Chromatogramme de la
l’extrait de Wapa à l’acétate
catéchine pure.
d’éthyle
d éthyle.

Chromatogramme
Chromatogramme de de l’extrait de
l’extrait d’aubier de Wapa duramen externe de
au méthanol.
méthanol Wapa au méthanol.
méthanol
Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y Principe:
P i i

{ Technique de séparation basée sur les interaction entre les


composés gazeux et la phase stationnaire
Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y Appareillage
A ill
Phase mobile Colonne
= gaz vecteur (exemple Hélium) = tube de silice qui contient la
Æ Élution phase stationnaire
I j t
Injecteur
Mass spectrometer
detector

Traitement
des données
Colonne et détecteur

GC/MS: de l’ordre de 70 000 €


Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y Détection:
{ Détecteurs universels
Ù Catharomètre (ou détecteur à conductibilité thermique - DTC): tous
composés
é ((1 à 10 ng))
Ù Détecteur à ionisation de flamme (FID): composés organiques (20 à 100 pg)

1. L
Les composés é organiques
i
sont ionisés par la flamme
2. Les ions sont collectés
d
dans l’él
l’électrode
t d
3. Obtention d’un courant
électrique

{ Détecteurs spécifiques: sensibilité pour certaines familles de


composés
Ù Dé
Détecteur à capture d’él
d’électrons: composés
é hhalogénés
l é é ((0,1 pg))

http://perso.orange.fr/sand4/CPG.htm http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/ http://www.ac-nancy-metz.fr/


Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y Dét
Détection
ti
{ Détecteurs donnant des informations structurales

g g

Infra-rouge (IR)
MCounts AN024.SMS 30:450

Ù
30:450

30

Ù Spectrométrie de masse (MS) 25

1A

20

15

10

10 20 30 40
minutes

GC/MS : Gas Chromatography/ Mass


Spectrum 1A
BP 161,0 (534543=100%) an024.sms 19.194 min. Scan: 1011 30:450 Ion: 51 us RIC: 3,471e+6 (BC)
161.0
100% 534543

Spectrometry 75%
105.1
413708

119.1

-GC
GC = séparation des molécules
367949

volatiles
50%

204.0
193352

-MS = analyse des molécules


41.0
146721
25% 81.0
39.0 114898 120.0
103847 162.0
100821 93300
43.1 117.0 205.0

pour leur identification


66568 79.2 60693
95.1 54444
42298
33195

0%

100 200 300 400


m/z
Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))
Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y Analyse
A l d
de l’
l’espace d
de têt
tête (h
(headspace)
d ) par GC (HS/GC)

{ H d
Headspace statique:
i

{ Préconcentration:
Ù Headspace dynamique (DHS) et méthode « purge & trap » (P&T)

Ù SPME (Solid Phase Microextraction)


Pérès, C., Begnaud, F., Eveleigh, L., Berdagué, J.-L., Fast
Characterization of Foodstuff by Headspace Mass Spectrometry
(HS-MS), Trends in Analytical Chemistry, 22(11), 2003, 858-866.
Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y SPME/GC/MS (Solid Phase Micro Extraction)


Extraction des composés volatils contenus
dans une matrice solide ou liquide

Fibre qqui p
piège
g les volatils
contenus dans l’espace de
tête (headspace)

FIBRE

SPME GC MS
= EXTRACTION = SEPARATION = IDENTIFICATION
Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y IInfluence
fl de
d lal quantitétité ett d
du ttemps d’
d’extraction:
t ti
{ Analyse de volatils dans des feuilles

Scan Range: 1 - 2796 TimeRange: 0.00- 43.97 min. Date: 05/04/2007 13:26
MCounts AN115.SMS30:450
30:450
Scan Range: 1 - 2806 Time Range: 0.00 - 43.98 min. Date: 05/04/2007 17:13 Scan Range: 1 - 2841 TimeRange: 0.00- 43.98 min. Date: 05/04/2007 18:13
MCounts an118.sms 30:450 MCounts an119.sms 30:450
30:450 30:450

10.0
7

6 1.5

7.5

4 1.0

5.0

2 0.5

2.5

0 0.0
0.0

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
minutes
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 minutes
minutes Seg1, <nodescription>, Time: 0.00-44.00, EI-Auto-Full, 30-450 m/z

100 mg - 15 minutes 100 mg - 5 minutes 15/30 mg - 5 minutes

Stage Elodie Courtois, 2007


Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y IInfluence
fl du
d choix
h i d de lla fib
fibre:
{ Analyse des volatils d’un même échantillon d’écorce
MCounts an003.sms 30:450
30:450

4
Fibre PDMS/DVB
3

1
PDMS PDMS PDMS PA PDMS/ CAR/ CAR/ CAR/
0 100µm 30µm 7 µm DVB DVB PDMS PDMS/
DVB
MCounts an008.sms 30:450
30:450

4
Fibre PDMS
3
volatils Semi- Com- Semi- Volatils, Alcools et Gaz et Volatils
volatils posés volatils amines, composés composés et semi-
2
apolaires apolaires polaires composés polaires de faible volatils :
1
de haut arom- poids arômes et
PM atiques molé- odeurs
nitrés culaire
0

MCounts an013.sms 30:450


30:450

4 Fibre CAR/PDMS
3 Pillonel, L., Bosset, J.O., Rapid Preconcentration and Enrichment Techniques
2
for the Analysis of Food Volatile. A Review, Lebensmittel Wissenschaft, 35,
2002, 1-14.
1

10 20 30 40
minutes

Échelles identiques

Stage Elodie Courtois, 2007


Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y Influence du choix du programme de température


{ Comparaison de la séparation des sesquiterpènes d’un échantillon
d’écorce
MCounts an017.sms 30:450
30:450
20

15
30°C (1 min) Æ 5°C/min Æ
10
150°C (5 min) Æ 5°C/min Æ
250°C
250 C
5

MCounts an022.sms 30:450


30:450

10.0

3
30°C ((1 min)) Æ 5
5°C/min
/ Æ
150°C (7 min) Æ 7,5°C/min Æ
7.5

250°C
5.0

2.5

0.0

MCounts an029.sms 30:450


30:450

7.5
30°C Æ 10°C/min Æ 100°C
5.0 (3 min) Æ 3°C/min
Æ 150°C
5 4 min) Æ
(4
7,5°C/min à 250°C
2.5

0.0

17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5


minutes
Stage Elodie Courtois, 2007
Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

yE
Exemples
l d’d’utilisation:
tili ti
{ Obtention de signatures chimiques d’écorces de bois par
SPME/GC/MS
MC oun ts an0 24 .sms 3 0:4 50
30 :45 0
30

25

20

15
Vouacapoua americana (Caesalpiniaceae)
10

0
kC oun ts an0 37 .sms 3 0:4 50
30 :45 0
7 00

6 00

5 00

4 00

3 00
Eperua falcata (Caesalpiniaceae)
2 00

1 00

0
MC oun ts an0 49 .sms 3 0:4 50
30 :45 0

15

10 Duguetia surinamensis (Annonaceae)


5

0
kC oun ts an0 61 .sms 3 0:4 50
30 :45 0
7 00

6 00

5 00

4 00

3 00
I
Iryanthera
th sagotiana
ti (M i ti
(Myristicaceae)
)
2 00

1 00

0
kC oun ts an0 68 .sms 3 0:4 50
8 00 30 :45 0

7 00
6 00

Gustavia hexapetala (Lecythidaceae)


5 00
4 00

3 00
2 00
1 00
0
10 20 30 40
m in ute s Stage Elodie Courtois, 2007
Présentation
é i d des outils
il ddu llaboratoire:
b i
les techniques chromatographiques

MERCI DE VOTRE ATTENTION !


Chromatographie
g p en p
phase g
gazeuse ((GC))

y Principe
P i i de d lla spectrométrie
t ét i dde masse
- Source d’ions: Bombardement des
molécules par des électrons qui vont
y z les ioniser
Source d'ions
-Φ0

Electrode en calotte
+Φ0 d +Φ0
x

y
-Φ0
U+V Electrode en anneau
x
Quadripôle Détecteur
Ions piègés
y
Source z
d'ions

x Electrode en calotte

- filtres d’ions: z

de type quadripôle ou trappe ionique Æ Détecteur


ne vont laisser passer qu’un type d’ions