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BIOQ200
BLOQUE 2
2018
PURIFICACIÓN DE LISOZIMA
INTRODUCCIÓN
La lisozima (muramidasa) es una enzima que hidroliza los enlaces glicosídicos β-1,4 entre
residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina de un péptidoglicano que se encuentra
en la pared celular de ciertas bacterias. De esta manera la lisozima sirve como la primera línea de
defensa contra infecciones bacterianas. Lisozima se encuentra ampliamente distribuida en la
naturaleza, en animales y plantas. La lisozima que ha sido más estudiada es la lisozima de huevo
de gallina, que fue la primera enzima cuya estructura tridimensional se determinó. En mamíferos
se encuentra en secreciones como lágrimas y saliva, en leche, en ciertas células de hígado y de
riñón, etc. La lisozima de la orina humana ha sido cristalizada y caracterizada. Se ha señalado que
esta lisozima puede ser un mediador de la función anti-tumoral de macrófagos, los cuales secretan
esta enzima.
Existe gran interés en la lisozima como agente antibacteriano natural y como una ayuda en
el diagnóstico de enfermedades. Por ejemplo, en leucemia monocítica y mono-mielocítica se han
encontrado niveles elevados de lisozima plasmática y urinaria. La presencia de la enzima en el
fluido cerebroespinal es indicativa de tumor en el sistema nervioso central.
Tarea: Indagar acerca de características moleculares de la lisozima de huevo de gallina (PM,
estructura, punto isoeléctrico, estabilidad, etc.)
Reactivos
Buffer A: buffer Tris –HCl 50 mM, pH 8.2, conteniendo 50 mM NaCl
Buffer B: buffer Tris-HCl 50 mM, pH 8.2, conteniendo 600 mM NaCl
CM- sefarosa en buffer A
Insumos
1 Huevo fresco
Gasa
Equipamiento
Columna para cromatografía y soporte universal con pinza para tomar la columna
Pipeta plástica pasteur para llenar la columna
27 Tubos de ensayos
Vasos de precipitados,
embudo,
probeta
1 Tubo falcon de 15 ml
1 Tubo falcon de 50 ml
Procedimiento
1. Rompa el huevo sobre un vaso de precipitados, y deje caer la clara al vaso. Filtre la clara
de huevo a través de varias capas de gasa colocadas en un embudo (aprox. 8) hacia una
probeta.
3. Para montar la columna de CM-sefarosa cierre la llave de paso y coloque 5 ml del buffer A
en la columna. Agite el intercambiador con una varilla de vidrio para obtener una
suspensión. (Evite la formación de burbujas, ya que pueden formar grietas o canales en la
columna. Las grietas reducen el volumen efectivo de la columna, ya que el líquido tiende a
fluir preferentemente a través de estos canales, evitando el contacto de las proteínas con
la resina.)
Abra la llave de paso de la columna y comience a colocarle el intercambiador. Importante:
La superficie del lecho del intercambiador en la columna nunca se debe secar, sobre esta
superficie siempre debe quedar un poco del buffer, tanto durante el montaje de la
columna como durante la elusión.
Continúe hasta tener 3 ml de intercambiador sedimentado en la columna.
4. Mida la velocidad de flujo de su columna colectando las gotas que caen en un determinado
tiempo (ej. 5 min). El flujo de la columna debería ser de al menos 20 gotas por minuto (1
gota cada 2-3 segundos). Si el flujo es muy lento, verifique que su columna no contenga
burbujas de aire en la salida.
5. Numere 30 tubos de ensayos colocados en una gradilla (Nos 1-30). Coloque 3 ml de agua en
un tubo similar a los numerados y marque el nivel con un lápiz permanente. Luego marque
los 15 primeros tubos a este nivel. Repita lo mismo usando ahora 1 ml de agua, para
marcar los tubos del número 16 en adelante.
10. Elusión de las proteínas con el buffer B. Retire el resto del tampón A que pueda haber
quedado sobre la columna mediante una pipeta.
Coloque cuidadosamente en la columna (sin perturbar el lecho) 15 ml de buffer B.
11. Continúe con la colección de fracciones, esta vez de 1 ml, hasta completar 25 fracciones
totales.
PROCEDIMIENTO:
Las fracciones de lisozima cruda, lavado y lisozima semi-purificada serán ensayadas para
determinar su actividad enzimática y así poder establecer el grado de pureza relativa alcanzado
para la enzima y el porcentaje de rendimiento de la cromatografía.
Reactivos:
1. Sustrato tamponado (medio para el ensayo): Micrococcus luteus, 0,25 mg/ml suspendido
en tampón fosfato de sodio 40 mM pH 6,2, solución temperada a 25°C. (Esta solución se
debe preparar en el día del práctico).
2. Tampón fosfato de sodio 40 mM pH 6,2
3. Solución de lisozima de huevo de gallina 0,025 mg/ml.
Procedimiento
Dilución de las muestras con tampón fosfato pH de 6,2 para el ensayo: Mezcle 10 µl del
extracto crudo con 990 µl de tampón. Para la dilución del pool de elusión y del lavado use factores
de dilución adecuados (considere los resultados obtenidos previamente). La actividad de la
solución de lisozima 0,025 mg/ml se mide sin diluir.
Se usarán los espectrofotómetros con portacubetas termoregulable y el programa para
cinéticas. Corrobore que el Peltier esté encendido y la temperatura fijada en 25°C. En la
programación del ensayo se ingresan la longitud de onda, 450 nm, los intervalos de lectura, 15
seg, y el tiempo total del ensayo, 2 min. Los espectrofotómetros estarán programados.
1.- Coloque una cubeta con agua en el espectrofotómetro y calibre presionando “Measure
Blank”. Retire la cubeta.
2.- Coloque 0,95 ml de medio para el ensayo en una cubeta, adicione 50 µl de la muestra diluída,
tape con Parafilm, mezcle por inversión rápidamente, coloque la cubeta en el instrumento y
presione “Measure Sample”.
3.- Anote el valor de ∆A/min informado por el instrumento al concluir el ensayo.
Sesión I:
- Tabla de datos Absorbancia de las fracciones colectadas.
- Perfil de elusión.
- Cuantificación de proteínas totales: presente una tabla que contenga para cada muestra el valor
de la A medida, la concentración calculada directamente, la concentración calculada considerando
la dilución, el volumen y la cantidad de proteína total de la muestra. En el caso del extracto crudo
use el volumen aplicado en la columna.
Sesión II: - Ensayos de actividad enzimática: presente una tabla que contenga para cada muestra el
valor de ∆A/min obtenido, la actividad enzimática en U/ml calculada directamente y la actividad
enzimática considerando la dilución.
- Incluya en el informe además la tabla que resume los datos de la concentración de proteínas
(datos de la sesión I).
- Tabla de purificación de lisozima. Confeccione una tabla del tipo siguiente:
(Falta colocar las unidades correspondientes a cada columna).
I…
En general se utiliza la etapa I o la actividad del extracto crudo como referencia para calcular
la purificación y el rendimiento logrado.
La actividad específica se usa como un criterio de pureza de una muestra de enzima. Así, la
actividad específica de la lisozima debería aumentar después de la cromatografía de intercambio
iónico pues se van descartando otras proteínas contaminantes.
Procedimiento: