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A – GÉNÉRALITÉS

Le diagnostic bactériologique est un ensemble de moyens permettant


de confirmer telle ou telle étiologie infectieuse d'origine bactérienne.

Ces moyens diagnostiques sont variés et caractérisent soit le diagnostic direct


soit diagnostic indirect :

•Diagnostic direct : mise en évidence de la bactérie elle-même, donc


finalement de sa culture ou isolement qui permettra l'identification ultérieure
ainsi que de préciser sa sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme) ou des
antigènes bactériens ou de l’ADN bactérien

•Diagnostic indirect : mis en évidence de la réponse de l'organisme à l'infection


par la présence d'anticorps spécifiques, le plus souvent sériques ou plus
rarement par une réponse d’ hypersensibilité, dite allergique C’est le
sérodiagnostic.

B-ÉTAPES PRÉLIMINAIRES

Sur le plan pratique différentes étapes précèdent le diagnostic bactériologique.


La qualité du diagnostic est étroitement liée à ces étapes :

1-La prescription

*L’identification du prescripteur : le médecin et l’unité d’hospitalisation.

*L’Identité du patient : le nom, la profession, l’âge et l’origine sont importants.

Ces trois derniers renseignements sont utiles à la qualité de l'analyse et à la


validation des résultats.
*La symptomatologie

-Précision de la nature des symptômes pathologiques

-localisation des lésions infectieuses

-Date d'apparition

-État physiologique du patient

-Existence d'affections associées

-Séjour en pays d'endémie

-Évoquer le risque d'infection ou de colonisation (ex : brucellose, tuberculose).

-Traitement éventuel pouvant interférer avec l'examen prescrit (ex :


antibiotiques, anticoagulants...)

-Le degré d'urgence.

*Le but de l'analyse

-Demande d'un examen bactériologique ou cytobactériologique (recherche de


cellules et de germes) de...

-Diagnostic d'une infection x

-Aide au choix des antibiotiques : antibiogramme

-Suivi de traitement, contrôle après traitement.

-Recherche de la bactérie : elle est nommément désignée.

-Le clinicien ne devra jamais oublier d'indiquer toute demande ou recherche


particulière, en raison de l'utilisation de milieux spéciaux.
Exemple : La culture du bacille tuberculeux (BAAR) se fera sur le milieu de
Lowenstein-Jensen.
2-Le prélèvement

Il s'agit d'un acte clé puisque de sa qualité va dépendre celle du diagnostic.

Le prélèvement est un acte médical : les personnes qui prélèvent mais qui ne
seraient pas du corps médical doivent se munir d'une habilitation.

*Conditions

-Le prélèvement doit être précoce, et réalisé avant l'administration


d'antibiotique. Une fenêtre thérapeutiques de 48h est nécessaire si
l’antibiothérapie a été est administrée au préalable du prélèvement(en
urgence).

-Le volume de prélèvement doit être suffisant.

-Les règles d’hygiène doivent être respectées.


Exemple : le prélèvement pour examen cytobactériologique des urines (ECBU)
doit être fait après une toilette soigneuse.

-L’étiquetage des prélèvements doit être rigoureux de façon à éviter toute


erreur.

*Nature du prélèvement.

Les prélèvements pour culture bactériologique sont ainsi très divers et


dépendent du site anatomique prélevé :

1) Avec un écouvillon stérile pour : les téguments, les muqueuses.

2) Ponction :

D'un liquide au niveau d'une séreuse. D'un hématome De la suppuration d'un


organe D'un abcès non fîstulisé

Ex : lombaire (LCR), pleural, articulaire, abdominal(ascite).

3) Sang pour hémoculture


4) biopsie : superficielle (pratiquée par tout médecin) ou profonde
(chirurgicale).

5) Grattage.

6) Prélèvement des interventions chirurgicales.

7) cathétérisme.

8) Utilisation d'une sonde (ex : urinaire).

9) Sécrétions naturelle : urines, sécrétions bronchiques, selles.

*Précautions

Ne pas infecter le patient.

Ne pas contaminer le prélèvement : pour cela, on peut utiliser un cathéter et


une brosse qui récolte les sécrétions bronchiques, et que l'on garde à l'abri de
la flore buccale et pharyngée.

*Recueil

Il se fait dans un récipient approprié : flacon ou tube stérile + lame destinée à


une coloration.

Il faut un milieu de transport approprié.

Il faut identifier : le nom, la date, l'heure (ces trois premiers éléments sont liés
à la traçabilité), la nature du prélèvement, le site du prélèvement, et l'identité
du préleveur.

*Conditions de conservation et de transport

On doit redouter la dessiccation et le froid.

L'acheminement doit être fait en moins de 30 min, ou mieux directement au


laboratoire (dans tous les cas, moins de 2 heures).

Les milieux de transport permettent une meilleure conservation, et d'allonger


ce délai, (il peut en exister des spécifiques à la recherche effectuée).
C-DIAGNOSTIC DIRECT

1-Examen macroscopique :

Toute infection bactérienne s'accompagne, outre la présence de bactéries, de


signes biologiques liés à l'inflammation avec l'éventuelle présence de
leucocytes, notamment de polynucléaires. Ces éléments peuvent entrainer au
delà d'un seuil, une modification visuelle, clairement perceptible à l'œil nu, qui
signe une anomalie patente. Divers éléments sont alors obtenus comme le
montrent les exemples suivants:

Trouble : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire

Hématurique : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire

Ictérique : LCR

Ce type de diagnostic est assez limité, puisqu'il ne permet souvent que de


suspecter une infection bactérienne.

2-Examen microscopique :

L'examen microscopique a un intérêt diagnostique. On recherche des bactéries


et des éléments cellulaires de type polynucléaire au microscope. Dans
certaines situations, seul cet examen est réalisable, car la bactérie ne peut être
mise en culture.

Ex : le Tréponème pâle (Microscope à fond noir, à l’état frais).

a-Examen microscopique a l'état frais :

Il donne des renseignements sur la forme, la mobilité des bactéries et aussi


permet aussi d’apprécier la numération cellulaire.

Au microscope optique Grossissement de 400:

Une préparation est obtenue avec le dépôt d'une goutte entre lame et lamelle,
puis on observe au microscope d'une part :
la présence éventuelle de bactéries (coque, diplocoque, chainette,
coccobacille, bacille...), le type de mobilité comme celle du "rameur" ou celle
en "en vol de moucheron".

Par ailleurs, lors de cette observation, seront évaluées les cellules avec une
appréciation semi-quantitative (rares, peu nombreux, nombreux, très
nombreux...) ou mieux quantitative, exprimée par nombre d'éléments / mm3
ou ml ou par champ.
Exemple d'une cellule de Malassez pour LCR, liquides de ponction, urines

b-Examen microscopique après coloration :

Réalisable sur de nombreux prélèvements et a partir des milieux de culture,


elle permet la mise en évidence des cellules et des bactéries.

Un frottis fin est obtenu à partir du produit pathologique, puis coloré


permettant une meilleure visualisation des bactéries et/ou des éléments
cellulaires

→Au microscope optique Grossissement de 1000:

• Coloration simple: Le frottis fin est traite par un seul colorant basique
(bleu de méthylène). Cette technique est simple et rapide.

Exemple : examen de pus urétral pour la recherche de gonocoque:


diplocoques en grain de café intracellulaires.

• Coloration différentielle : Compte tenu des différences structurales de la


paroi des bactéries, la coloration de Gram découverte par Hans GRAM en 1884
permet de distinguer les bactéries colorées en violet (G+) de celles en rose (G-
).Il est alors possible de suspecter en tenant compte de la réponse Gram+ ou –
et des morphologies observées d’évoquer un probable diagnostic.
• Coloration spéciale :

Certaines bactéries ne peuvent être visualisées par les techniques de coloration


conventionnelles. La visualisation nécessite une coloration spéciale.

*Coloration de Ziehl-Neelsen : cette coloration permet de visualiser Les


bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) .Elle est nécessaire pour le diagnostic
de la tuberculose a Mycobacterium tuberculosis.

*coloration au MGG: La coloration de May-Grunewald-Giemsa (MGG) est


principalement à visée cytologique pour une meilleure individualisation des
éléments cellulaires tels polynucléaires, macrophages, lymphocytes... Les
bactéries peuvent être néanmoins observées avec leur capsule comme le
pneumocoque (A). D'autres peuvent être spécialement recherchées telle
Borrelia burgdorferi dans la maladie de Lyme (B).

→ Autres types de microscopie

•Microscopie à fluorescence (source particulière ; lampe UV) :

 coloration spécifique des BAAR (mycobactéries) par fluorescence


(auramine).

 coloration par anticorps marqués par un conjugué fluorescent. Ce type


de technique est maintenant d'usage plus limité (sensibilité insuffisante)
comme celle de la recherche de Legionella pneumophila dans un
prélèvement pulmonaire. La recherche de l'antigène urinaire est très
supérieure en sensibilité.

•Microscopie au fond noir (condenseur spécial) : Il s'agit de rechercher des


bactéries sur lesquelles la lumière s'est réfléchie. Cette recherche est
inhabituelle: diagnostic bactérioscopique de la syphilis (Treponema pallidum)
sur un prélèvement de chancre.

•Microscopie électronique : rarement utilisée en pratique, plus souvent dans


le cadre de l'identification d'une nouvelle étiologie bactérienne (Bartonella,
Helicobacter...).

3-Recherche d'antigènes solubles :

Méthodes de diagnostic rapide

Les bactéries avec capsule polysaccharidique relarguent des antigènes. On peut


retrouver ces Antigènes :

Dans le LCR : méningocoques, pneumocoques, Haemophilus Influenzae.

Dans le sang : idem.

Les urines : Legionella +++

4- Mise en culture :

La majorité des bactéries d’intérêt médical peuvent être cultivées au


laboratoire. Cette étape consiste à ensemencer un échantillon du prélèvement
sur un milieu de culture, permettant d’obtenir dans certaines conditions
(température, pH, atmosphère, nutriments…) une croissance bactérienne sous
forme de colonies.

•Choix des milieux de culture

Toutes les bactéries ne possèdent pas les mêmes exigences de culture. Il existe
ainsi des milieux de base permettant la croissance de bactéries peu exigeantes
et des milieux enrichis en différentes substances (vitamines, sang, œuf…)
permettant la croissance d’espèces bactériennes plus exigeantes. Ces milieux
se présentent soit sous forme liquide (bouillons de culture : BGT, BHIB…), soit
sous forme solide par addition d’un agent gélifiant (milieux gélosés : gélose au
sang, gélose au sang cuit…)

En fonction du type de prélèvement et des bactéries recherchées, il existe


également des milieux de culture plus particuliers. Ainsi, pour des
prélèvements contaminés par de la flore bactérienne endogène (crachats,
selles…), certains milieux sont dits « sélectifs » de certaines espèces
bactériennes par addition d’antibiotiques, d’antiseptiques. De même, pour
permettre l’identification de certaines espèces bactériennes (Escherichia coli
dans les prélèvements urinaires par exemple) ,Il existe des milieux dits «
chromogènes » qui vont permettre de mettre en évidence une activité
enzymatique spécifique de l’espèce recherchée, entraînant l’apparition de
colonies bactériennes colorées.

Enfin, certaines bactéries pathogènes aux exigences particulières possèdent


des milieux de culture spécifiques : milieu de Bordet-Gengou pour Bordetella
pertussis, milieu de Tinsdale pour Corynebacterium diphtheriae, milieu peptoné
pour Vibrio cholerae…

•Conditions et délai de culture

*Atmosphère
Toutes les bactéries n’ont pas les mêmes exigences en matière d’oxygène pour
se développer :
- présence obligatoire d’oxygène : bactéries aérobies strictes
- absence obligatoire d’oxygène : bactéries anaérobies strictes
- obligation d’une faible concentration d’oxygène : bactéries micro-
aérophiles
- indifférence vis-à-vis de l’oxygène : bactéries aéro-anaérobies

*Température
La majorité des bactéries d’intérêt médical se développent à une température
proche de 35°C. Mais certaines espèces se développent préférentiellement à
des températures plus faibles (30°C) ou plus fortes (42°C)

*Durée d’incubation
La majorité des bactéries d’intérêt médical se cultivent en 24 à 48h. Cependant,
certaines espèces sont beaucoup plus lentes (28 a 72 pour les mycobactéries).
∞Les colonies isolées permettront, dans un deuxième temps de réaliser
l’identification de la bactérie, son profil de résistance aux antibiotiques et sa
conservation.

5-Identification du genre et de l’espèce bactérienne

L’identification bactérienne peut se faire selon des méthodes phénotypiques


et/ou génotypiques.

•Méthodes phénotypiques
-Hormis quelques tests simples notamment enzymatiques (recherche d’une
catalase, d’une oxydase…) permettant d’orienter le diagnostic, l’identification
précise de la majorité des bactéries d’intérêt médical se fait désormais à l’aide
de galeries biochimiques d’identification manuelles (galeries API®) ou
automatisées (automates Vitek®, Phoenix®). Ces galeries permettent de tester
un grand nombre de réactions chimiques (hydrolyse de substrats, métabolisme
glucidique, réactions enzymatiques…) sur une même colonie bactérienne en
peu de temps (une dizaine d’heures).

-La spectrométrie de masse est une technique d'identification récente. A partir


d'une colonie bactérienne, l'identification peut être obtenue en quelques
minutes.

-Pour un certain nombre de germes, l’identification bactérienne peut


également se faire en recherchant certains antigènes spécifiques de l’espèce. Il
s’agit principalement de réactions d’agglutination basées sur la réaction d’un
anticorps spécifique contenu dans le réactif vis-à-vis d’antigènes présents sur la
bactérie à identifier (kits pour identification du pneumocoque, des
streptocoques, de Staphylococcus aureus…).

Il faut noter que ces méthodes d’agglutination peuvent également être


utilisées pour le typage de certaines espèces bactériennes déjà identifiées,
notamment dans un but épidémiologique (typage des méningocoques, des
salmonelles, des Listeria…).
•Méthodes génotypiques

Ces méthodes permettent, à partir d’une colonie pure ou du prélèvement, une


identification précise de l’espèce bactérienne par amplification spécifique de
l’ADN bactérien (PCR). Le gène le plus souvent utilisé est le gène codant pour
l’ARN ribosomal 16S (PCR 16S) spécifique des bactéries. Le gène amplifié est
ensuite séquencé et comparé à des bases de données permettant d’obtenir
l’identification de la bactérie.

Ces méthodes, plus fiables que les méthodes d’identification phénotypiques,


demeurent longues et coûteuses et restent donc limitées à certains
laboratoires et à certaines analyses.

Réalisation d'une PCR à partir de la culture, puis séquençage de la bactérie et


comparaison à la base de données phylogénétique

6-tests de sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme)

Certains genres ou espèces bactériens possèdent des résistances naturelles à


certaines familles d’antibiotiques. L’identification de ces bactéries permettra
donc d’orienter rapidement la thérapeutique. Néanmoins, la résistance aux
antibiotiques est un phénomène évolutif susceptible de concerner des
bactéries habituellement sensibles : on parle alors de résistances acquises.
C’est pour détecter ces dernières qu’il convient de réaliser un antibiogramme
sur les bactéries isolées en culture pure.
L’objectif de l’antibiogramme est de prévoir l’efficacité d’un traitement en
évaluant in vitro l’activité des antibiotiques sur la souche bactérienne isolée.

• Choix des antibiotiques

1) Selon la souche.

2) Selon la localisation de l'infection.

3) selon les contextes cliniques


7-La conservation des souches bactériennes

En vue d'études complémentaires ou épidémiologiques, les souches


bactériennes isolées de prélèvements cliniques doivent être conservées au
laboratoire.
La conservation de courte durée consiste à effectuer des repiquages de culture
pure et récente sur milieu gélosé en tube, conservé à l'obscurité et à
température ambiante.
La conservation de longue durée se fait au congélateur à - 80°C ou dans l'azote
liquide à - 180°C à partir d'une suspension bactérienne riche.

D-LE DIAGNOSTIC INDIRECT

•Principe :

Le diagnostic indirect ou sérodiagnostic (sérologie) consiste à mettre en


évidence la réponse de l’organisme face à une agression bactérienne. Cette
réponse se traduit par la synthèse d’anticorps spécifiquement dirigés contre les
antigènes bactériens. Ces anticorps sont généralement recherchés dans le sang
du patient mais également dans le LCR (diagnostic de la neuroborréliose de
Lyme notamment).

-Le diagnostic sérologique s’applique pour les bactéries non ou difficilement


cultivables, infections décapitées par l’antibiothérapie, infections profondes ou
chroniques

•Technique

Recherche d'anticorps par test sérologique. Il existe :

-des techniques manuelles d'agglutination (brucellose, syphilis,


salmonellose...),
-d'immunofluorescence (rickettsies, fièvre Q...),
-de fixation du complément (Campylobacter),
- de neutralisation enzymatique (sérologie Streptocoque avec recherche des
ASLO, ASD)
-des techniques automatisées de type ELISA (mycoplasmes, Chlamydiae, Lyme,
tétanos, diphtérie...).

•Conditions

Tenir compte du délai d'apparition et de la cinétique des anticorps :la synthèse


des anticorps nécessite un délai pour se mettre en place, de l'ordre d'une
dizaine de jours en moyenne .

D'où la nécessite d’analyser deux sérum : Il faut un premier sérum le plus


précoce possible ; les anticorps peuvent ne pas être présents et un deuxième
sérum plus tardif (2 a 3 semaines): on cherche l'apparition de nouveaux
anticorps, l'augmentation des Anticorps dans le sérum, si cette augmentation
est significative.

•Limites

-La présence d'anticorps ne permet pas toujours de savoir si le contact avec la


bactérie est récent ou ancien, ni même de savoir s'il y a réellement eu infection
ou seulement contact.
-la spécificité du sérodiagnostic est parfois mise en défaut par l'existence de
réactions croisées entre plusieurs anticorps (un patient atteint de maladie de
Lyme peut avoir une sérologie positive pour la syphilis sans jamais avoir été en
contact avec Treponema pallidum).

E-CONCLUSION
Le diagnostic bactériologique classique nécessite un délai de réponse assez lent
24 a 48h par rapport au nouvelle techniques de biologie moléculaire qui non
seulement sont moins longue (réponse au bout de 02h) et en plus sont plus
spécifiques. Néanmoins l’isolement des souches est indispensable pour l’étude
de la sensibilité aux antibiotiques.
UNIVERSITÉ SAAD DAHLAB DE BLIDA

FACULTÉ DE MÉDECINE

ANNÉE UNIVERSITAIRE 2012/2013

3ÈME ANNÉE DE MÉDECINE

MODULE DE MICROBIOLOGIE

DR .S AZROU CHELLALI

LE DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE
D’UNE INFECTION
PLAN

A – GÉNÉRALITÉS

B-ÉTAPES PRÉLIMINAIRES

1-La prescription

2-Le prélèvement

C-DIAGNOSTIC DIRECT

1-Examen macroscopique

2-Examen microscopique :

a-Examen microscopique a l'état frais

b-Examen microscopique après coloration

3-Recherche d'antigènes solubles

4-Mise en culture

5-Identification du genre et de l’espèce bactérienne

6-tests de sensibilité aux antibiotiques

7-conservation des souches

D-DIAGNOSTIC INDIRECT

E-CONCLUSION