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INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 1
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................................. 2
RESUMEN............................................................................................................................................. 2
OBJETIVOS.......................................................................................................................................... 2
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................... 2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................................... 2
CONTENIDO ........................................................................................................................................ 3
CAPÍTULO I ..................................................................................................................................... 3
EXTRACCIÓN ENZIMÁTICA ...................................................................................................... 3
1.1. PARÁMETROS .................................................................................................................... 3
1.2. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN ENZIMÁTICA .............................................................. 3
1.2.1. MÉTODOS MECÁNICOS .......................................................................................... 3
1.2.1.1. ULTRASONIDO .................................................................................................... 3
1.2.1.2. HOMOGENIZADOR A PRESIÓN ........................................................................ 4
1.2.1.3. ROMPIMIENTO POR LISIS CON PERLAS ........................................................ 5
1.2.2. MÉTODOS NO MECÁNICOS ................................................................................... 6
1.2.2.1. MÉTODOS FÍSICOS ........................................................................................... 6
CHOQUE OSMÓTICO .............................................................................................................. 6
DESINTEGRACIÓN TÉRMICA ............................................................................................... 7
1.2.2.2. MÉTODOS QUÍMICOS ...................................................................................... 8
DISOLUCIÓN LIPÍDICA .......................................................................................................... 8
TRATAMIENTO CON ÁLCALI ............................................................................................... 8
PERMEABILIZACIÓN.............................................................................................................. 8
1.2.2.3. MÉTODOS ENZIMÁTICOS .............................................................................. 9
LISOZIMA Y EDTA .................................................................................................................. 9
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA ................................................................................................... 10
CAPÍTULO II ..................................................................................................................................... 11
PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA ..................................................................................................... 11
2.1. PARÁMETROS ....................................................................................................................... 11
2.2. PROCESO ................................................................................................................................ 11
2.3. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA .............................................................. 12
2.3.1. SEPARACIÓN POR SOLUBILIDAD ...................................................................... 12
2.3.1.1. PRECIPITACIÓN POR SALES ........................................................................... 12
2.3.1.2. PRECIPITACIÓN POR EL PUNTO ISOELÉCTRICO ...................................... 13
2.3.1.3. SISTEMA DE BIFASES ACUOSAS ................................................................... 13
2.3.2. SEPARACIÓN POR EL TAMAÑO ......................................................................... 14
2.3.2.1. DIÁLISIS .............................................................................................................. 14
2.3.2.2. ULTRAFILTRACIÓN .......................................................................................... 14
2.3.2.3. CENTRIFUGACIÓN............................................................................................ 15
2.3.3. CROMATOGRAFÍA.................................................................................................. 15
2.3.3.1. CROMATOGRAFÍA POR FILTRACIÓN EN GEL ........................................... 15
2.3.3.2. CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIO IÓNICO ....................................... 16
2.3.3.3. CROMATOGRAFÍA POR AFINIDAD ............................................................... 17
2.3.4. ELECTROFORESIS .................................................................................................. 18
CAPÍTULO III .................................................................................................................................... 19
INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA ............................................................................................... 19
3.1 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA ......................................................... 20
3.1.1. INMOVILIZACIÓN POR RETENCIÓN FÍSICA....................................................... 20
3.1.1.1 ATRAPAMIENTO ..................................................................................................... 20
3.1.1.2 INCLUSIÓN EN MEBRANAS.................................................................................. 20
3.1.2 INMOVILIZACIÓN POR UNION QUIMICA .............................................................. 22
3.1.2.1. UNION A SOPORTES .............................................................................................. 22
3.1.2.2. RETICULADO........................................................................................................... 23
3.2 EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA................................................. 23
CONCLUSIONES............................................................................................................................... 24
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................. 25
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son catalizadores biológicos (también conocidos como biocatalizadores) que
aceleran las reacciones bioquímicas en organismos vivos, y que pueden extraerse de las células
y luego usarse para catalizar una amplia gama de procesos comercialmente importantes
(Robinson, Enzymes: principles and biotechnological applications, 2015). Por ejemplo, tienen
funciones importantes en la producción de agentes edulcorantes y la modificación de
antibióticos, se usan en detergentes en polvo y en varios productos de limpieza, y desempeñan
una función clave en dispositivos analíticos y ensayos que tienen aplicaciones clínicas, forenses
y ambientales. La palabra "enzima" fue utilizada por primera vez por el fisiólogo alemán
Wilhelm Kühne en 1878, cuando describía la capacidad de la levadura para producir alcohol a
partir de azúcares, y se deriva de las palabras griegas en (que significa "dentro") y zume (que
significa 'levadura').
Las enzimas presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no
biológicos, por ello cada día se incrementan los procesos catalizados por enzimas en la industria
y la demanda de enzimas aumenta debido a su amplio campo de aplicación. Varias técnicas
han permitido al hombre beneficiarse de las diferentes enzimas presente en organismos
(Arroyo, 1998).
Así también la célula, existen varios componentes como las enzimas, ácidos nucleicos, lípidos,
entre otros, por lo que se necesita eliminar el material contaminante para purificar le enzima y
aumentar su actividad específica (Robinson, 2015). La purificación de una proteínas es muy
importante para la caracterización de su función, estructura e interacción de la proteína de
interés (Shanmugan & Sathishkumar, 2009).
1
JUSTIFICACIÓN
El estudio de las enzimas, así como los procesos de obtención de las mismas son importantes
para conocer y brindar alternativas industriales, farmacéuticas, genéticas, alimenticias entre
otras. Los ingenieros biotecnólogos pueden hacer uso de esa información para dar solución a
varios problemas, pero primero es necesario reconocer los diferentes métodos de extracción,
para que tipo de organismos se emplea cada uno y sus procedimientos, además de los procesos
necesarios para que la enzima de interés sea pura. Esta investigación bibliográfica recopila
información para conocer los aspectos antes mencionados y esperando que sea el primer paso
para dar solución a problemas posteriores.
RESUMEN
La extracción enzimática comienza siempre con una ruptura celular o lisis, con el objetivo de
obtener la máxima cantidad de la enzima de interés, evitando la degradación térmica o las
alteraciones secundarias por oxidación, proteólisis, etc. que afectan la actividad de la enzima.
Los métodos más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los tejidos y la
destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o
químicos, obteniéndose lo que se denomina extracto crudo, por lo que se han desarrollado una
amplia gama de técnicas de disrupción celular, que se usan a escala de laboratorio que se
pueden clasificar como: métodos mecánicos: agitación con abrasivos, homogeneización a alta
presión o extrusión por presión; y métodos no mecánicos entre los cuales están los métodos
físicos, químicos y enzimáticos. Según (Shanmugan & Sathishkumar, 2009), la purificación
enzimática tiene pasos que va primero con la precipitación, diálisis, técnicas de cromatografía
y la comprobación de la pureza con cromatografía o espectometría. Las proteínas se pueden
purificar según la solubilidad, el tamaño, la carga y la afinidad de unió
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2
CONTENIDO
CAPÍTULO I
EXTRACCIÓN ENZIMÁTICA
1.1.PARÁMETROS
Existe una gran diversidad de procedimientos para extraer una enzima, denominados métodos
de disrupción o lisis celular; y se los escoge, considerando: naturaleza de la fuente de la enzima,
escala de operación, velocidad del método de la extracción, estabilidad de la enzima, pureza
requerida y costo del proceso ( Rodicio & Bordello , 2005).
Los métodos mecánicos implican someter a las células a una deformación en fase sólida o
líquida. Son aplicados principalmente por la industria.
1.2.1.1. ULTRASONIDO
Los ultrasonidos se asocian principalmente con la disrupción celular (lisis) o ruptura (Allinger
1975). Cuando se sonican líquidos a altas intensidades, las ondas de sonido que se propagan al
medio líquido dan como resultado ciclos alternos de alta presión (compresión) y baja presión
(rarefacción), con velocidades que dependen de la frecuencia. Durante el ciclo de baja presión,
las ondas ultrasónicas de alta intensidad crean pequeñas burbujas de vacío o huecos en el
líquido. Cuando las burbujas alcanzan un volumen en el que ya no pueden absorber energía,
colapsan violentamente durante un ciclo de alta presión. Este fenómeno se denomina
3
cavitación. Durante la implosión, se alcanzan localmente temperaturas muy altas
(aproximadamente 5.000 K) y presiones (aproximadamente 2.000atm). Las fuerzas de corte
resultantes rompen la envoltura celular mecánicamente y mejoran la transferencia de material.
El ultrasonido puede tener efectos destructivos o constructivos para las células dependiendo de
los parámetros de sonicación empleados.
Bajo una sonicación intensa, las enzimas o proteínas pueden ser liberadas de células u
orgánulos subcelulares como resultado de la ruptura celular. En este caso, el compuesto a
disolver en un solvente está en el interior de una estructura insoluble. Con el fin de extraerlo,
se ha de destruir la membrana celular. La ruptura celular se trata de un proceso sensible, debido
a la capacidad de la pared celular para soportar la alta presión osmótica del interior. Por ello,
se requiere un buen manejo del proceso de rotura celular para evitar una liberación
descontrolada de todos los productos intracelulares, incluyendo desechos celulares y ácidos
nucleicos, o evitar la desnaturalización del producto. La ultrasonicación supone un método
controlado para la disrupción celular, ya que los efectos mecánicos de los ultrasonidos permiten
una penetración más rápida y completa del disolvente en el material celular, mejorando así la
transferencia de masa. Es decir, los ultrasonidos consiguen una mayor penetración de un
disolvente en el tejido vegetal. Las ondas ultrasónicas generan cavitación que rompe las
paredes celulares y facilita la liberación de los componentes del citoplasma (Hielscher, 1999).
𝑘 = 𝑏(𝑝 − 𝑝𝑜)0.9
Donde:
p= potencia
po= potencia umbral necesaria para que tenga lugar la cavitación
1.2.1.2.HOMOGENIZADOR A PRESIÓN
Consiste en una bomba de pistón de desplazamiento positivo, se aplica una gran presión a una
suspensión celular a través de una válvula de descarga que se ajusta con un orificio de
restricción, sometiendo a las células a un alto estrés de corte. Las células son forzadas a pasar
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a través de un pequeño orificio, produciendo su ruptura por el esfuerzo de corte (Huerta Ochoa,
2015).
𝑅𝑚
𝑙𝑛 = 𝑘𝑡
𝑅𝑚 − 𝑅
Donde:
Las células son prensadas entre perlas de vidrio, se aplica al rompimiento a gran escala para
suspensiones de células y células de plantas (Tejada, 2000). Son instrumentos muy eficientes
en la lisis celular, pueden utilizar diseños de cámara vertical o también de cámara horizontal,
las cuales poseen un eje central que está unido a agitadores y se encuentra a baja temperatura
para evitar la desnaturalización de las enzimas; para la disrupción la cámara se llena hasta un
nivel deseado de bolas de acero o vidrio, muy pequeñas (0.1-0.5 mm) y las bolas ingresadas
son las encargadas de romper la célula por efecto de choque y fricción entre esferas y la pared
interior del vaso de molienda o mortero.
𝑘 = 𝐾(𝑢𝑡 )
5
Ilustración 3. Molino de perlas (Garibay, 2014)
Estrés
Método Técnica Principio sobre el Costo Ejemplo
producto
Células cortadas Tejido y células
Homogenización Moderado Moderado
en licuadora animales
Células rotas con Suspensión de
Ultrasonicación cavitación Fuerte Caro células a
ultrasónica pequeña escala
Se hace pasar Tratamiento a
células por un gran escala de
Homogenización
MECÁNICO pequeño orificio Fuerte Moderado suspensión de
de alta presión
y se rompen por células excepto
estrés bacterias
Tratamiento a
Se aplastan gran escala de
Rompimiento en
células con perlas Fuerte Moderado suspensión de
molino de perlas
de vidrio células
vegetales
1.2.2.1.MÉTODOS FÍSICOS
CHOQUE OSMÓTICO
6
del contenido celular excepto en las células que disponen de una pared rígida (Real academia
de ingenieria, 2011).
Se puede desarrollar una expresión para el cálculo de la presión osmótica necesaria para romper
una célula a partir de la definición de equilibrio químico, ya que en el equilibrio el potencial
químico de las soluciones acuosas es igual en ambos lados de la membrana celular de tal
manera que (Tejada, 2000):
Empleando la ley de van’t Hoff, donde ∆𝑃 es la variación del potencial químico externo e
interno del agua la y Ci es la concentración del soluto
∆𝑃 = −𝑅𝑇 ∑ 𝐶𝑖
DESINTEGRACIÓN TÉRMICA
7
Ilustración 5. Congelamiento/Descongelamiento (Albéitar, 2003).
1.2.2.2.MÉTODOS QUÍMICOS
DISOLUCIÓN LIPÍDICA
La extracción por solventes orgánicos ha sido usada para la disolución selectiva de ciertos
componentes, sin embargo su uso puede inhibir la actividad biológica de las enzimas, por lo
que se deben seleccionar solventes cuyos parámetros de solubilidad sean apropiados para los
lípidos de la pared celular, pero inadecuados para disolver las enzimas localizadas dentro de la
célula, además, este proceso requiere de bajas temperaturas para que se produzca la separación
(Ruptura y disrupcion celular, 2012).
Entre los compuestos más usados está el del sulfato de amonio (NH4)2SO4, empleado como
floculante y, además, como un reactivo en purificación de proteínas para precipitar proteínas
solubles; otra técnica consiste en añadir a la suspensión celular un volumen de tolueno
aproximadamente igual al 10% de la biomasa, el tolueno es absorbido dentro de los lípidos de
la pared celular produciendo su expansión y ruptura (Tejada, 2000).
Existen solventes miscibles con agua (ETOH, Acetona), que pueden liberar proteínas del
espacio periplasmático.
Esta procedimiento consiste en el tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH,
NaOH) con un pH 11.5-12.5 en un tiempo de 20-30 min; sin embargo, aplica únicamente si las
enzimas a aislar son estables a pH alcalino; además, es un tratamiento fuerte, por lo que es un
ejemplo extremo de la solubilización (saponificación del lípidos que se convierten a
detergentes) (Huerta Ochoa, 2015).
PERMEABILIZACIÓN
Alterar la estructura de la pared y la membrana celular para facilitar la difusión del producto
hacia el exterior de la célula, sin embargo la principal ventaja de la permeabilización con
8
respecto a todos los mecánicos y a la lisis enzimática es que libera menos proteína por unidad
de tiempo (Real academia de ingenieria, 2011).
La base de una solubilización efectiva radica en la estructura química del agente solubilizante
ya que estas estructuras poseen una parte hidrofílica (iónica) y una parte hidrofóbica haciendo
que los detergentes sean compuesto anfipáticos, capaces de interaccionar tanto con el agua
como con un lípido, esto permite que sean empleados para solubilizar la pared celular ( Rodicio
& Bordello , 2005).
1.2.2.3.MÉTODOS ENZIMÁTICOS
LISOZIMA Y EDTA
La lisozima en una enzima también llamada muramidasa, la cual cataliza la hidrólisis de los
enlaces beta 1,4 entre los residuos de la N-acetil-D-glucosamina y el ácido N-acetilmurámico
presentes en el peptidoglicano de la pared celular de las bacterias; comercialmente ex extraída
de la clara de huevo en donde está presente en grandes cantidades. Esta enzima también se
encuentra en las lágrimas y la saliva; este método no es efectivo para una aplicación a gran
escala debido al elevado costo de la enzima y que esta es eliminada tras la extracción. El EDTA
es un agente quelante responsable de proteger a las enzimas de proteólisis inactivando a las
proteasas. El EDTA logra esta inactivación actuando como quelante de cationes divalentes
como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales son indispensables para el funcionamiento de las enzimas
citadas (Universidad de Valladolid, 2013).
9
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
Estrés
Método Tipo Técnica Principio sobre el Costo Ejemplo
producto
Choque Ruptura osmótica Suave Barato Ruptura de
osmótico de la membrana glóbulos
Físicos rojos
Desintegrac Cambios de Fuerte Barato
ión térmica temperatura para
la ruptura celular
Químicos Disolución Solventes Moderado Barato Rompimient
lipídica orgánicos actúan o de
sobre la pared levaduras
celular con tolueno
desestabilizándola
Tratamient La saponificación Fuerte Barato
o alcalino de los lípidos
NO solubiliza la
MECÁNI membrana
CO Permeabiliz Detergentes Suave Moder
ación solubilizan la ado/
membrana caro
Enzimátic Lisozima y Permeabilización Suave Caro Tratamiento
os EDTA de la membrana de M.
ocasionando la lysodeikticus
ruptura de la con lisozima
célula
Digestión Rompimiento por Suave Caro Micrococcus
enzimática la digestión de la lysodeikticus
pared celular con lisozima.
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CAPÍTULO II
PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA
2.1. PARÁMETROS
La purificación enzimática implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan propiedades
fisicoquímicas o biológicas de la proteína de interés para separarla del resto de las moléculas,
con el objetivo de retener la mayor cantidad de enzima funcional con el menor número de
contaminantes (Ritchie, 2012)
El éxito de la purificación de enzimas depende del cuidado con que se eviten las condiciones
en las cuales son inestables, por lo que existen ciertos parámetros que se deben considerar para
realizar una purificación adecuada (Calvo, 2012):
Las purificaciones deben llevarse a cabo sin pérdidas inútiles de tiempo, por lo tanto, el
esquema de purificación de una proteína debe ser optimizado para completar el proceso en
el menor número de pasos posible.
Durante el aislamiento y la purificación es conveniente trabajar entre 0 y 4 oC y evitar pH
mayor que 9 o menor que 5; sin embargo, se debe elegir la temperatura y pH óptimos en
las zonas de mayor estabilidad de la enzima, además de seleccionar un buffer adecuado
para evitar cambios de pH.
Debe evitarse la formación de espuma, ya que la misma es indicador de desnaturalización
proteica.
Los solventes orgánicos inactivan muchas enzimas a temperatura ambiente; de modo que
los fraccionamientos con los mismos deben llevarse a cabo a baja temperatura y ésta no
debe elevarse hasta que el solvente se haya eliminado o diluido a concentraciones inocuas.
Evitar la introducción de trazas de otras enzimas (por ejemplo saliva).
Elegir una cantidad de enzima adecuada para obtener variaciones apropiadas de la
magnitud a medir.
2.2. PROCESO
11
2. Elegir la fuente (matriz biológica)
Es necesario considerar la concentración, accesibilidad, costo y facilidad de la extracción
ya que la actividad de una enzima varía considerablemente en diferentes organismos y aún
en los diversos tejidos de un mismo organismo.
3. Extraer la proteína de la fuente (proteínas intracelulares o extracelulares)
El conocimiento de la localización y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido
desarrollar procedimientos de extracción diferencial que facilitan la purificación (Calvo,
2012).
4. Estabilización de la molécula
Los factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento son el pH, grado de
oxidación (-SH), presencia de metales pesados o sustancias contaminantes, polaridad y
fuerza iónica de la solución, presencia de proteasas, temperatura y actividad de la molécula
(UFQ, 2015).
5. Aislamiento y concentración (fraccionamiento)
Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el rendimiento (R) en la
purificación, pureza (P) y actividad específica (AE) de cada fracción obtenida.
𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑖
𝑨𝑬 =
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑖
12
mutuamente o con las de otras moléculas, resultando en una aglomeración. De esta forma las
proteínas con regiones hidrofóbicas más abundantes formarán agregados y se precipitarán más
rápidamente que aquellas con pocas regiones resultando un fraccionamiento (Harris & Angal,
1995); por tanto la proteína no es desnaturalizada y la actividad enzimática es recuperada
mediante la resuspensión del pellet; adicionalmente, las sales pueden estabilizar las proteínas
contra la desnaturalización, la proteólisis o la contaminación bacteriana, características que
hacen de este método una alternativa fácil y confiable para la separación de proteínas (Rojas,
2009).
Uno de los métodos más fáciles para la precipitación de proteínas se lleva a cabo ajustando el
pH de la solución a uno cercano o igual al punto isoeléctrico de la proteína de interés; ya que
en este punto, las cargas positivas y negativas presentes en la superficie se neutralizan unas con
otras y la repulsión electrostática con otras moléculas no ocurre, dando lugar a la atracción
entre las moléculas de proteína disueltas y formando así un precipitado, este proceso es llamado
también precipitación isoeléctrica (Harrison , Todd, Rudge, & Petrides, 2003).
Los sistemas de bifases acuosas se definen como aquellos que aprovechan la inmiscibilidad
entre las soluciones acuosas de dos polímeros de cadena larga o de un polímero de cadena larga
y una sal formada por enlace iónico. La presencia significativa de agua en cada una de las fases
en equilibrio que se generan es una de las razones por la cual estos sistemas son empleados en
bioseparaciones, ya que el agua, presente en concentraciones de alrededor del 85-90% en cada
una de las bifases inmiscibles, ofrece un ambiente factible para los procesos de aislamiento de
proteínas, por cuanto es requerimiento importante para el mantenimiento de la actividad
enzimática (Harrison , Todd, Rudge, & Petrides, 2003). Otros factores como la baja tensión
superficial en la interfase del sistema y el efecto estabilizante que pueden tener los polímeros,
derivan en la protección de las proteínas y en el impedimento de su desnaturalización y
disminución de su actividad biológica en general (Harris & Angal, 1995).
13
2.3.2. SEPARACIÓN POR EL TAMAÑO
2.3.2.1.DIÁLISIS
2.3.2.2.ULTRAFILTRACIÓN
El agua y otras pequeñas moléculas son pasadas a través de una membrana semi-permeable
mediante una fuerza transmembranal tal como la centrifugación o las altas presiones (Harris &
Angal, 1995). Las técnicas de separación con membranas son particularmente dirigidas a la
extracción o purificación parcial de biomoléculas de alto valor agregado solubles en agua, dado
que no involucran agentes químicos y no generan desnaturalización térmica.
14
2.3.2.3.CENTRIFUGACIÓN
Las partículas que difieren en densidad o tamaño sedimentan a distintas velocidades por
aplicación de una fuerza centrífuga (campo gravitacional, g), por lo tanto, una centrifugación
diferencial permite la separación del homogenato en varias fracciones; las fracciones
precipitadas pueden tratarse con agentes químicos para solubilizar las enzimas que fuesen
particuladas (Calvo, 2012).
SOBRENADANTE
(enzimas solubles)
SOBRENADANTE
SOBRENADANTE 105.000 xg /60 PRECIPITADO
(extracto libre de min.
células) (microsomas,
ribosomas, retículo
HOMOGENATO 8000 - 10000 xg /
endotelial)
20 - 30 min. RECIPITADO
600 - 900 xg / 10 -
15 min.
PRECIPITADO
(restos celulares,
núcleos)
2.3.3. CROMATOGRAFÍA
15
moléculas se separan en función de su tamaño, eluyendo en orden decreciente de peso
molecular (Sancho, 2013).
Separa las enzimas en función de la carga. La solución de proteína es agregada a una columna
que contiene un polímero insoluble, como la celulosa o agarosa, a la que la modifican sus
características iónicas para determinar el tipo de ión que atraerán, funcionará como catión o
anión (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2002). Las columnas de intercambio catiónico están
cargadas negativamente y atraerán a proteínas con carga positiva, sucedería inversamente si las
columnas tuvieran carga negativa (Phillips, 2017).
Las proteínas cargadas negativamente se unen a la matriz sólida cargada positivamente y son
retenidas. Las proteínas cargadas positivamente son rechazadas por la matriz sólida cargada
positivamente y son eludidas. La elución de las proteínas cargadas negativamente se consigue
cambiando el pH del solvente hasta igualarlo a su punto isoeléctrico o hasta invertir su carga
neta (Sena, 2018).
16
2.3.3.3.CROMATOGRAFÍA POR AFINIDAD
Separa las proteínas en función de su afinidad de unión a ligandos específicos, Así, las proteínas
tiene una gran afinidad por sus sustratos, grupos prostéticos, receptores de membrana o
anticuerpos desarrollados frente a ellas. Uno de estos compuestos puede unirse covalentemente
a una resina insoluble para construir la fase estacionaria de una cromatografía en columna.
Cuando se aplica en la columna una mezcla de proteínas, solo aquella susceptible de unirse a
los grupos específicos de la resina quedaran ancaladas en la fase estacionaria, mientras que las
demás proteínas de la mezcla se lavan a través de la columna. Posteriormente se aplica un
tampón adecuado que, generalmente, incluye el ligando libre y que hace factible la elucón de
la proteína anclada (Phillips, 2017).
La mezcla de muestra pasa por la columna, la proteína interactúa con el ligando inmovilizado
y se une, siendo retenida y los otros componentes pasan a través de la columna. Luego se
introduce una solución con ligandos para liberar y recuperar la enzima de interés de forma
purificada (Robinson, Enzymes: principles and biotechnological applications, 2015).
En esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el nombre
de ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de
proteínas se aplica a la columna, la proteína buscada se unirá al ligando inmovilizado mientras
que las demás saldrán de la columna con el tampón. En este caso también se utiliza el
incremento de fuerza iónica para eluir las proteínas (Phillips, 2017).
Técnica separativa, en la que se pasa un solvente liquido (fase móvil) que posee la mezcla de
los componentes a identificar, a través de una columna densamente empaquetada con pequeñas
17
cantidades de resina insoluble, que constituye la fase estacionaria. La separación se realiza
mediante interacciones entre la muestra y la fase estacionaria. Las fases estacionarias más
utilizadas son las fases enlazadas, de naturaleza apolar, con una cadena alquílica unida a una
partícula de sílice. Es muy importante considerar el tamaño de las partículas del relleno, han
de ser tan pequeñas como sea posible para que la muestra este en contacto con la máxima
cantidad de superficie de relleno, el tamaño promedio es de 5 a 15 um. La fase móvil es
bombeada a través de la columna a elevada presión puesto que la fase estacionaria está
densamente empaquetada. Los compuestos son detectados mediante detectores ópticos
(ultravioleta, visible, de fluorescencia o índice de refracción) o electroquímicos al eluir de la
columna y cada compuesto se caracteriza, en las condiciones experimentales establecidas, por
su tiempo de retención (Florez, 2013).
Ilustración 13. Cromatografía de líquidos de alta resolución HPLC (Universidad Autónoma de Barcelona, 2016).
2.3.4. ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica que permite separar moléculas cargadas eléctricamente, entre
las cuales se encuentran los ácidos nucleicos (DNA y RNA) o las proteínas. Las proteínas
pueden tener carga neta positiva o negativa. El movimiento de las moléculas cargadas se hace
a través de una matriz porosa (o gel), que está inmersa en un medio acuoso. Bajo el campo
eléctrico aplicado, las diferentes moléculas de la muestra se mueven a través de la matriz a
diferentes velocidades, de forma que al final de la electroforesis las distintas moléculas se
pueden diferenciar como bandas separadas a distintas posiciones en la matriz. Dichas bandas
se detectan mediante tinción o autorradiografía, o pueden transferirse a una superficie
membranosa (Universidad de Cádiz, 2016).
18
empapa previamente el soporte poroso, debidamente escogidas para que no formen
precipitados con las especies del problema. Como soportes se han utilizado alúmina, lana de
vidrio, almidón, agar-agar, gel de sílice, etc. (UNAM., 2007).
Las proteínas pequeñas se mueven rápidamente a través del gel, mientras que las proteínas
grandes se quedan en la parte superior, cerca del punto de aplicación de la mezcla. La movilidad
de la mayoría de las cadenas de polipéptido en estas condiciones es linealmente proporcional
al logaritmo de su masa (Stryer, 2012).
CAPÍTULO III
INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA
La inestabilidad que las enzimas presentan en los procesos químicos industriales y la dificultad
de separar sustratos y productos, hacen que las enzimas no sean reutilizables. Se han ideado
métodos de inmovilización a un soporte inerte, para la generación de procesos biotecnológicos
rentables (Espinosa, 2012).
Una enzima inmovilizada es aquella que esta físicamente localizada en una región del espacio,
que permiten mantener la actividad catalítica, pudiendo ser reutilizada continuamente (Figuera
& Gomez, 2014). Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilización, las enzimas pueden ser
inmovilizadas tanto de forma permanente como temporal para ser utilizadas repetida y
continuamente en diversos procesos químicos. Las ventajas de las enzimas inmovilizadas en
comparación con las enzimas en solución son: el aumento de la estabilidad y su actividad en
función del pH y temperatura, disminuye el coste en la industria debido a la reutilización de
componentes y el diseño de reactores adaptables para cada enzima. Entre sus desventajas se
menciona la alteración de la enzima de su estado nativo, una heterogeneidad en diseño del
sistema enzima soporte donde puede haber diferentes proteínas catalíticas inmovilizadas y
perdida de la actividad catalítica (Figuera & Gomez, 2014).
19
3.1 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA
3.1.1. INMOVILIZACIÓN POR RETENCIÓN FÍSICA
3.1.1.1 ATRAPAMIENTO
Es la retención de la enzima en cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida por
polímeros de tipo poliacrilamida o resinas de poliuretano que permite pasar al sustrato y
productos a través de ellos y retener las enzimas. Este método evita que la enzima sufra cambios
en la estructura debido a que no sufre unión covalente al soporte. El proceso de inmovilización
se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero.
Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición
de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más
resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel,
mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades
de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental,
requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la
enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere
un control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la
naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína (Arroyo, 1998).
a) MICRO ENCAPSULACIÓN.
En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el
paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas
semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no
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permanentes (generadas por surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las
microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 µm
de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad
de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones
que suceden en múltiples pasos (Arroyo M. , 1998).
b) REACTORES DE MEMBRANA
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3.1.2 INMOVILIZACIÓN POR UNION QUIMICA
c) ABSORCIÓN
Este método consiste en poner en contacto la enzima en solución acuosa con un soporte
adsorbente por un lapso de tiempo de 2 a 48 horas, para después lavar el soporte y eliminar la
enzima que no fue inmovilizada. Se emplea soportes orgánicos o inorgánicos que presentan un
adsorbente activo que permiten atraer la enzima ser retenidas por interacciones hidrofóbicas,
fuerzas de van der Waals y puentes de hidrogeno. Presenta la ventaja de ser una preparación
sencilla y de bajo costo, no altera la actividad catalítica, estas son afectadas por las elevadas
concentraciones de sustrato y los cambios de pH (Fig. 29) (Baron, 2004).
d) IÓNICA
e) QUELACIÓN
Utiliza metales de transición, normalmente titanio, como una forma de activar la superficie del
soporte. La enzima se acopla a este enzima (Baron, 2004).
f) COVALENTE
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Este método de inmovilización se lo realiza cuando se requiere que el producto esté libre de la
enzima. Se basa en la formación de enlaces covalentes entre la enzima y el soporte. Es proceso
de acoplamiento puede ocurrir de dos maneras la primera por la activación de la matriz por
adición de una función reactiva en un polímero y la segunda por modificación del polímero
para producir un grupo activado, los cueles permiten generar grupos electrófilos en el soporte
o matriz que reaccionan con los grupos nucleófilos presentes en los aminoácidos de las
enzimas, lo que genera el enlace covalente. Grupos funcionales que interviene principalmente
en la formación de enlace son: amino (lisina), grupo tiol (cisteína), grupo carboxílico (aspartato
y el glutamato).
3.1.2.2. RETICULADO
Se utiliza reactivos que generan uniones intermolecular entre las moléculas de enzimas,
eliminado la necesidad de soportes tiene la característica de ser insolubles en agua, capaces de
resistir condiciones extremas de pH, temperatura y el ataque de proteasas (Figuera & Gomez,
2014).
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Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por
diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede deberse a: que la unión al
soporte impide el paso del sustrato al centro activo. Los grupos reactivos del soporte reaccionan
con algún aminoácido que forma parte del centro activo o que es esencial para la actividad
catalítica de la enzima. La inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar
a una forma inactiva. Las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización o
desactivación de la enzima. Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización,
los cambios (disminución o aumento de la actividad enzimática) se deben principalmente a
efectos difusionales, electrostáticos, estéricos y/o del microentorno.
Tabla 4: Comparación de métodos respecto a los efectos de inmovilización
CONCLUSIONES
Los métodos de ruptura celular más utilizados son: homogenización a alta presión,
aplicación de ultrasonidos y rompimiento en molino de perlas. Dentro de los métodos no
mecánicos: físicos como congelamiento-descongelamiento; químicos como aplicación de
detergentes, solventes orgánicos y enzimáticos utilizando lisozima y EDTA.
La ruptura celular es necesaria cuando la enzima que se desee extraer se encuentre dentro
de la célula en forma uniloculada, biloculada o dentro de un organelo, liberando el
contenido interno de la célula al exterior.
La diferencia entre métodos mecánicos y no mecánicos radica en el modo en que se rompe
la membrana celular, en el primero se utilizan como principales herramientas la fricción o
la presión, mientras que en el segundo son los compuestos químicos orgánicos los que
permiten este fin.
Para la extracción de enzimas de las células, se puede emplear varios métodos para elegir
uno de ellos hay que considerar las características de la enzima a extraer, el tipo de muestra,
el costo del proceso y la escala de operación.
En un proceso de purificación enzimática es necesario considerar la actividad biológica de
la enzima que se va aislar, así como los parámetros externos como la temperatura, pH y la
fuente de la extracción (matriz biológica)
La purificación enzimática está basada en la solubilidad, tamaño, carga, y la afinidad de
unión de la enzima. Por lo general, mezclas de proteínas se someten a una serie de
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separaciones, cada una de estas separaciones deben tener características especiales para la
purificación de la proteína de interés.
BIBLIOGRAFÍA
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os_enzimaticos_enriquecidos_en_Pepsina
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