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Profesores:
Violeta Larios Serrato.
Rogelio Benítez Ibarra.
Francisco C. Fernández López.
Gabriela Olguín Ruiz.
Reporte de práctica 1 y 2:
Determinación de proteínas por el método de Lowry, y Bradford.
Resultados.
Tabla No. 1 Curva de calibración de hemoglobina para el método de Lowry y Bradford.
0.25
0.2
A (590 nm)
0.15
SERIE A
0.1 SERIE B
0.05
0
0 20 40 60 80 100 120 140
µg de Proteína.
Figura No.1, Curva tipo para Hemoglobina por el método de Lowry. Se muestran la serie A y su
duplicado, tomando en cuenta los datos de la tabla No. 1 para el método citado.
0.5
0.4 SERIE A
0.3 SERIE B
0.2
0.1
0
0 20 40 60 80 100 120 140
µg de proteína.
Figura No.2 Curva tipo para Hemoglobina por el método de Bradford . Se muestran la serie A y su
duplicado (Serie B) , tomando en cuenta los datos de la tabla No. 1 para el método citado.
Tabla No. 2 Réplicas para análisis estadístico por el método de Lowry y Bradford.
Tabla No. 3 Resultados del análisis estadístico por el método de Lowry y Bradford.
µ (intervalo de confianza
Media para la media
S S² % C.V
muestral poblacional)
α=0.05
METODO DE LOWRY 80.4609 6.7967 46.1951 8.4472 (85.3226,75.6)
METODO DE BRADFORD 77.1323 7.65 58.5218 9.92 (71.6601,82.6044)
La pendiente es el incremento que se produce en la absorbancia cuando la variable X aumenta una unidad. La
ordenada al origen es la altura a la que la recta corta al eje, es decir, se utiliza para determinar en este caso la
absorbancia o la concentración de un analito en cuestión. El coeficiente de correlacion indica una dependencia
total entre las dos variables denominada relación directa: cuando una de ellas aumenta, la otra también lo hace
en proporción constante teoricamente. Si 0 < r < 1, existe una correlación positiva. Si r = 0, no existe relación
lineal. Sin embargo en ambas curvas de calibración observamos que esta relación no se cumple de tal modo
que el coeficiente arroje por resultado la unidad, aunque este es muy cercano a 1. Esto nos indica que existieron
errores que provocaran que la correlacion fuera directamente proporcional.
Si cumple la ley de Bouger-Beer, ya que las soluciones de prueba demostraron el fenómeno de absorción de
REM, por tanto la intensidad de lus transmitida era menor a la incidida, y para el caso de ambos métodos, esto
se cumple para el método de Lowry en un intervalo de (75.6-85.3226 µg), y para el caso de Bradford esto se
cumple en el intervalo de (71.6601-82.6044).
Estos métodos realizados, fueron diseñados para cuantificar específicamente proteína, y si los comparamos
con el método de Biuret, este es un análisis mas cualitativo que cuantitativo, ya que este ensayo nos hacia ver
que si daba una reacción colorida inmediatamente al agregar un reactivo, indicaba que existían PEPTIDOS
mayores a 3 aminoácidos por lo cual, no indicaría como tal presencia de proteínas. Para el caso de la presencia
de proteínas a 280 nm este método si arroja que existe presencia de proteína en una muestra, pero como tal
no es el analito de interés, todo lo contrario, busca la pureza y la concentración del DNA, y como tal se
descartan como impureza del trabajo. Por ello los métodos empleados, son específicos para proteínas, estos
métodos si nos permiten medir con exactitud los microgramos existentes en una muestra.
Discusión de resultados.
La determinación de proteínas por el método de Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rápida,
barata y sensible. Es necesario construir una curva de calibración para determinar la concentración de las
muestras, por ello por cada método se realizo una curva y su duplicado, esto con la finalidad de comprobar si
los valores de absorbancia eran iguales, ya que un mismo analista fue quien las elaboro para ambos
experimentos. El método de Bradford se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassie brillante
G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los residuos de las
proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia
máxima a 470 nm. A diferencia del método de Lowry (otra técnica colorimétrica para determinar proteínas) que
es muy sensible a la composición de la solución que acompaña a las proteínas, el método de Bradford sólo es
afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas de este método es que el colorante CBBG se une
fuertemente a las celdas de cuarzo. Por esto se recomienda usar celdas de vidrio. Sin embargo en el análisis
estadístico encontramos que el método de Bradford fue mas delicado en su tratamiento que el método de
Lowry, y aquí podemos elucidar el porque:
En la replica del análisis estadístico se encuentra que el %C.V para el método de Lowry es de 8.44%
aproximadamente, este coeficente nos indica que tan bien o que tan mal desarrollo el trabajo el analista. Para
el método de Bradford, este valor se eleva hasta un máximo de 9.92, lo que nos pudiera indicar que se
acumularon muchos errores en el método y que al final estose vio reflejado en los resultados, pero no es asi. Al
momento de realizar la segunda parte (Bradford), un alumno se percato que el reactivo que se proporciono, ya
estaba precipitando, este reactivo, al ser altamente fotosensible, pudo haberse precipitado parcialmente, pero
recordando que una REM es absorbida por toda solución absorbente, las partículas en suspensión lógicamente
absorberían mas energía que si el reactivo hubiese estado en buen estado, esto se vio reflejado en los resultados
de las abosrbancias, ya que se encontraban valores muy variados, como es el caso del primero y el decimo tubo
de la curva, notamos una diferencia numérica muy grande. Por el contrario en el método de Lowry este aspecto
analizado no se presento porque el reactivo altamente fotosensible no fue preparado de manera anticipada,
sino que los mismos alumnos preparon un reactivo, eliminando una posible interferencia por interacciones
solido-liquido.
Por ello el coeficiente de variación entre ambos métodos es muy diferente, aunado a esto también, se acumulan
errores de paralaje, de un mal uso del material volumétrico, una falla en las concentraciones de reactivos a
utilizar, etc. Aun asi, aunque el método de Lowry implica mas procedimiento experimental, pudo obtenerse un
resultado confiable, en comparación con el método de Bradford.
Para el efecto de sustancias no proteínicas, en el método de Lowry se encontró que un interferente por
excelencia de este método es el fenol, Ya que al tener su anillo activado, este podrá alterar su estado de
resonancia y reduciendo a los acidos fosfotungstico y fosfomolibdico, y oxidando su propio grupo R-OH, hacia
un grupo cetónico, esto provocó una tonalidad totalmente negra, dando asi, la falsa idea de que la muestra esta
saturada de aminoácidos aromáticos como lo son tirosina y triptófano. Por ello no es recomendable, para este
método, dar un tratamiento previo con fenol a una muestra con contenido proteico, ya que en caso de darse
un análisis como el realizado en laboratorio, se presentarían falsos positivos. Fuera de este interferente, los
otros interferentes se encuentran dentro del intervalo de confiaza para la media de esta determinación.
Para el caso del método de Bradford, aquí los interferentes por excelencia son los detergentes, ya que los
detergentes desnaturalizan y precipitan a las proteínas, entonces, al ya no haber una homogeneidad en la
distribución de la proteína lo que ocurrirá es que se observaran valores muy bajos con es al utilizar SDS 1% .La
disolución de proteínas que se van a analizar se mezcla en primer lugar con SDS, un detergente aniónico que
desnaturaliza las proteínas, eliminando sus estructuras secundaria y terciaria (pero sin alterar los enlaces
disulfuro y además confiere una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa). Sin SDS, las distintas
proteínas que tienen masas moleculares similares migran de forma diferente debido a diferencias en la
proporción carga/masa, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico distinto. Ademas el detergente
comercial tiene una acción similar al, porque logra precipitar proteínas. Ademas otro interferente importante
es el Mer-OH, ya que al ser un alcohol de cadena compleja, disminuye la constante dieléctrica y por tanto
también precipitan las proteínas.
Para las pruebas de hipótesis respecto a la diferencia de medias y cociente de varianzas poblacionales,
encontramos que no existe diferencia significativa en ambos métodos, por lo tanto ambos son útiles al momento
de determinar presencia de proteínas, sin embargo para que la eficiencia de ambos métodos sea alta, deben
haber mucha precaucion al utilizar los reactivos, y saber darle buen uso al material de trabajo.
Conclusiones.
Estadisticamente ambos métodos son aptos para su uso. Sin embargo el método mas exacto es el
método de Lowry.
La ley de Bouger y Beer se cumplen dentro de los intervalos de confianza para las medias de cada
experimento.
Es de suma importancia trabajar con muestras libres de contaminantes que reacciónen con los reactivos
de cada método, de no ser asi, se pueden dar falsos positivos en determinaciones posteriores.
Bibliografía.
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology pág. 182, 50-69.
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html
Skoog, Douglas A.; F. James Holler; T.A. Nieman. 2005. Principios de análisis instrumental. 8° edición., Editorial
Mc Grawhill Interamericana de España, Madrid, España, pág: 1028