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P R E S E N T A:
ASESOR DE TESIS:
En cual fuere la obra en que te ensayes, si falla acaso tú primer intento no te descorazones ni
desmayes, antes vuelve a empezar con nuevo aliento. No habrá dificultad ni resistencia que
dominar no puedas con talento, con firme voluntad y con paciencia. “Es muy breve la vida, el
arte es largo”; la perfección se alcanza, sin embargo a fuerza de trabajo y experiencia.
A MIS SINODALES
Por la revisión de este trabajo y sus valiosos comentario, sobre todo por el
apoyo en mi formación académica, personal y profesional
i
4.8 Comparación y selección del medio de cultivo óptimo para la
propagación de la cepa comprobada de Ustilago maydis 29
4.8.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido de extracto de maíz 29
4.8.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido de extracto de maíz 29
4.9 Preparado de inóculos de basidiosporas de Ustilago maydis a
diferentes concentraciones 29
4.10 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de
Ustilago maydis 30
4.11 Confirmación de la infectividad de las basidiosporas de Ustilago maydis
obtenidas para producir huitlacoche 30
5 DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO 31
6 RESULTADOS 32
6.1 Evaluación de la eficiencia de infección de un macerado de teliospora
de Ustilago maydis 32
6.1.1 Mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados 32
6.1.2 Inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis 34
6.1.3 Inoculación de mazorcas jóvenes y sanas con suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis 36
6.1.4 Aspersión de teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de
maíz germinando 38
6.2 Obtención de un concentrado de teliosporas puras de Ustilago maydis 38
6.2.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis 41
6.2.1.1 Prueba en medio líquido y sólido de extracto de maíz 41
6.3 Aislamiento de una cepa pura de la fase de basidiosporas de Ustilago
maydis en agar extracto de maíz 43
6.4 Determinación de la infectividad de los estadios de Ustilago maydis
sobre plantas de maíz 47
6.5 Comparación y selección del medio de cultivo adecuado para la
propagación del hongo de la cepa comprobada de Ustilago maydis 49
6.5.1 Evaluación del crecimiento en medio sólido 49
6.5.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido 50
6.6 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de
Ustilago maydis 51
7 DISCUSIÓN 55
8 CONCLUSIÓN 60
9 BIBLIOGRAFÍA 61
10 ANEXO 64
10.1 Material 64
10.1.1 Material biológico 64
10.1.2 Medios de cultivo 64
10.1.3 Soluciones y reactivos 64
10.1.4 Material 64
10.1.5 Equipo 65
10.2 Preparación de medios de cultivo 65
10.2 Preparación de Soluciones reactivas 66
ii
ÍNDICE DE FIGURAS
iii
29 Comparación en la generación de basidiosporas de Ustilago maydis en dos
diferentes medios líquidos 50
30 Basidiosporas de Ustilago maydis observadas en cámara de Neubauer 51
31 Jilotes de maíz antes de ser inoculados con basidiosporas de Ustilago maydis 52
32 Efecto de la inoculación por inyección de basidiosporas de Ustilago maydis en
jilotes de maíz 52
33 Crecimiento de basidiosporas de Ustilago maydis en agar extracto de papa 53
34 Basidiosporas de Ustilago maydis 54
35 Mazorca de maíz con huitlacoche 54
ÍNDICE DE TABLAS
iv
ABREVIATURAS
v
RESUMEN
Introducción
Objetivo
Material y Métodos
Resultados
Se logró obtener un concentrado puro de teliosporas con el método usado, así como
un cultivo puro de basidiosporas y se determinó que la fase del hongo más eficaz para
producir la infección en diferentes estadios de desarrollo del maíz fue la basidiospora,
se encontró que el medio de cultivo óptimo para obtener biomasa de basidiosporas fue
medio líquido con extracto de maíz diluido 1:2, se observó que al inocular por inyección
vi
en tejido en diferentes etapas de desarrollo resulto evidente como el jilote de la planta
adulta del maíz es la más susceptible para producir la formación de masas de
teliosporas en la mazorca, esto al inocular por inyección en el jilote de la planta a una
concentración de 2x106 basidiosporas/mL.
Conclusión
vii
1. INTRODUCCIÓN
Todas las plantas son atacadas por algún tipo de hongo, y cada uno de los hongos
parásitos ataca a uno o más tipos de plantas. Algunos hongos crecen y se reproducen
sólo cuando establecen una infección con las plantas que les sirven de hospedero,
1
durante todo su ciclo de vida estos hongos se conocen como parásitos obligados o
biótrofos. Otros requieren de una planta hospedera durante una cierta etapa de su ciclo
de vida, el cual lo pueden concluir desarrollándose en materia orgánica muerta o bien
creciendo y reproduciéndose tanto en materia orgánica muerta como en plantas vivas
(Agrios, 2005).
Gran parte de los hongos fitopatógenos pasan una porción de su ciclo de vida en las
plantas hospederas, y otra en el suelo o en los residuos vegetales depositados. Algunos
hongos pasan todo su ciclo de vida sobre el hospedero y sólo sus esporas alcanzan el
suelo, donde permanecen en reposo hasta que son llevadas a un hospedero en el que
germinan y se reproducen. Otros hongos deben pasar parte de su ciclo de vida como
parásitos de su hospedero y parte de él como saprófitos en tejidos muertos en el suelo,
a fin de poder concluir su ciclo de vida en la naturaleza. Sin embargo, este último grupo
de hongos se mantiene en estrecha asociación con los tejidos vivos o muertos de su
hospedero y, en la naturaleza, no se desarrollan en otro tipo de materia orgánica. Otro
grupo de hongos viven como parásitos de sus hospederos, pero continúan viviendo,
desarrollándose y reproduciéndose en los tejidos muertos de esos hospederos, incluso
pueden abandonar esos tejidos y depositarse en el suelo u otros órganos vegetales en
proceso de descomposición, donde se desarrollan y reproducen como saprófitos
obligados. Es indispensable que los tejidos vegetales muertos en los que se desarrollen
esos hongos no pertenezcan al hospedero que han parasitado. Por lo común, ese
grupo de hongos son patógenos que habitan en el suelo, que tienen una amplia gama
de hospederos y que sobreviven en el suelo durante varios años en ausencia de sus
hospederos (Agrios, 2005).
1.3 Basidiomicetos
Los basidiomicetos son un grupo de gran importancia entre los hongos, pues tienen
participación esencial en la naturaleza por la versatilidad de las especies que lo
constituyen, unas forman ectomicorrizas, otras son causantes de enfermedades como
las royas y los carbones, se encuentran también las especies comestibles como setas
que se cultivan con fines nutritivos. Pertenecen al grupo de especies con importancia en
la medicina por presentar metabolitos con actividad biológica contra una amplia gama
de patologías clínicas (Rojas, 2013).
La clase de los Basidiomycetes se considera que agrupa los hongos más
evolucionados, donde están algunos de los patógenos de plantas más importantes.
Esta clase se caracteriza por la formación de basidios estructuras tubulares o en forma
de clava y sus esporas sexuales las basidiosporas como se muestra en la Figura 1
(Islas, 1994).
2
Figura 1. Estructura característica de basidiomicetos. Se observa la estructura del basidio en
forma de clava y gemando sobre este las basidiosporas. Tomado de: INBio, 2014.
1.4 Carbones
3
cenocítico como se observa en la Figura 2, en los carbones no se forman las
basidiosporas sobre esterigmas (Agrios, 2005).
Basidiospora
Basidio
A) Teliospora
B) Teliospora
4
1.5 Huitlacoche
Reino Fungí
Subreino Eumycota
Rama Amastigomycota
Filo Basidiomycota
Clase Basidiomycetes
Subclase Heterobasidiomycetidae
Orden Ustilaginales
Familia Ustilaginaceae
Género Ustilago
Especie maydis
5
Tabla 3. Características taxonómicas de Ustilago maydis
Taxón Características
No poseen clorofila, su alimentación es por
Reino: Fungi o Mycetae
absorción, son eucariontes, son pluricelulares.
Pierden su fase móvil, no se adaptan a sistemas
División: Amastygomycota acuáticos, tienen hifas septadas, forman grandes
cantidades de micelio.
Son hongos que producen esporas sexuales
denominadas basidiosporas o esporidias, sobre
una estructura tubular o en forma de clava
Subdivisión: Basidiomycotina denominada basidio constituida por una o cuatro
células, su estado diploide el basidio es muy corto,
su estado dicariotico es muy prolongado, la
mayoría son heterotalicas.
Son parásitos de plantas, y no forman
basidiocarpo. Constituyen el segundo grupo en
importancia entre los hongos superiores que se
caracterizan por tener núcleo dicariótico. Se
diferencian de los Ascomicetos por la mayor
Clase: Basidiomycete importancia y duración de la fase dicariótica y,
ante todo, porque las esporas que se originan
después de la meiosis no son endosporas, sino
exosporas (llamadas basidiosporas), que se
forman en general en número de cuatro en la
superficie de la célula esporífera (denomina
basidio).
Forman esporas de resistencia llamadas
teliosporas con pared gruesa se encuentran
envueltas en grupos en unas estructuras llamadas
Subclase: Teliomycetidae
soros. En estas estructuras de resistencia se
produce cariogamia y meiosis, después de la cual
germinan, originando un basidio.
Hongos comúnmente conocidos como carbones.
Atacan principalmente las estructuras
reproductoras. Producen poco micelio, con
Orden: Ustilaginales
promicelio septado transversalmente. Forman
soros o agallas contienen teliosporas café
obscuras o negras.
Ataca a plantas de importancia económica como:
Género: Ustilago
avena, trigo, cebada, maíz, etc.
Sus teliosporas son lisas, con espinas o
Especie: maydis
reticuladas, atacan al maíz y al teosinte
Tomado de: Garibaldi, 2003; Cota, 2004; Agrios, 2005.
6
1.5.3 Signos y síntomas
El hongo hiberna en forma de teliosporas en los restos del cultivo del maíz y en el
suelo, donde se mantiene viable durante muchos años. En las estaciones de primavera
y verano, las teliosporas si encuentra las condiciones óptimas de temperatura y
humedad relativa germinan produciendo un basidio de cuatro células haploides (el
promicelio), de cada una de las cuales se desarrolla una basidiospora hialina, ovalada
uninucleada que son llevadas por las corrientes de aire y son salpicadas o arrastradas
por la lluvia hasta los tejidos jóvenes y en proceso de desarrollo de las plantas de maíz
donde germinan sobre la superficie del hospedero y producen una hifa fina
(pseudomicelio monocariotico), el cual puede vivir saprofito sobre la superficie del
hospedero y se introduce en las células epidérmicas por penetración. Sin embargo,
después de un desarrollo inicial, su crecimiento se detiene y la hifa por lo general se
marchita y en ocasiones muere, a menos que entre en contacto y se fusione con una
hifa haploide proveniente de una basidiosporas del tipo de apareamiento compatible. En
caso de que ocurra la fusión, la hifa resultante aumenta su diámetro y se vuelve
dicariótica. Esta hifa se desarrolla en los tejidos de la planta principalmente a nivel
intercelular. Las células que rodean a la hifa son estimuladas para que sufran hipertrofia
e hiperplasia y comienzan a formarse las agallas, estas pueden empezar a formarse
incluso antes de que el hongo invada a los tejidos (Agrios, 2005).
El micelio en la agalla permanece intercelularmente durante la formación de la
misma, pero antes de la esporulación, las células alargadas del maíz son invadidas por
el micelio, por lo que se colapsan y mueren. El micelio del hongo utiliza los contenidos
de la célula para desarrollarse, y la agalla consiste principalmente de micelio dicariótico
y restos de células de los granos de maíz. La mayoría de las células dicarióticas
posteriormente, se transforman en teliosporas y durante el proceso parecen absorber y
utilizar el protoplasma de las demás células miceliales, las cuales quedan vacías. Estas
teliosporas se agrupan en masas denominadas soros, las cuales se mantienen
firmemente unidas por medio de una membrana la cual cubre a la agalla y no es
afectada por el hongo, pero finalmente se rompe y las teliosporas son liberadas.
Algunas de éstas llegan a los tejidos jóvenes meristemáticos del maíz, produciendo
7
nuevas infecciones y agallas durante la misma estación, pero la mayoría de ellas caen
al suelo o permanecen en los restos del maíz, donde pueden sobrevivir durante años,
en la Figura 3 se esquematiza el ciclo de vida de Ustilago maydis (Agrios, 2005).
Figura 3. Ciclo de vida de Ustilago maydis. Al romperse el soro se liberan las teliosporas y de
cada una de ellas germinara un basidio que producirá cuatro basidiosporas haploides cada una de
estas podrá dividirse y formar pseudomicelio, al encontrar a su par sexual compatible podrá
producir la infección formando un micelio dicariótico que penetrara en todo el tejido propiciando la
hipertrofia e hiperplasia del tejido y la formación de teliosporas nuevamente. Tomado de: Tamayo,
2009.
8
1.5.5 Factores que influyen en formación del huitlacoche
Para que se produzca la infección tienen que estar presentes algunos factores que
propiciaran la germinación del hongo y su diseminación en el tejido de la planta de maíz
los cuales se describen en la Tabla 4.
Factores Características
Las temperaturas relativamente altas favorecen la germinación de
basidiosporas, el crecimiento del micelio y formación de nuevas
Temperatura teliosporas, el hongo se desarrolla muy bien entre 20-30°C. Sin
embargo, la temperatura no es un factor importante en la infección de
este hongo en el campo.
La humedad es necesaria para la germinación y crecimiento del tubo
germinativo antes de que el hongo invada la planta. Se han observado
Humedad buenos resultados a una humedad relativa entre un 77-80%. Aunque en
general se considera que la lluvia y el clima húmedo son factores críticos
para el desarrollo del hongo.
El desarrollo de la planta es de vital importancia en el crecimiento del
hongo, se sabe que las plantas que crecen vigorosamente entre 60-
90cm de alto son más susceptibles al ataque de este microorganismo.
Huésped En lotes fertilizados con nitrógeno se ha observado una mayor
incidencia de la infección, debido a que acelera el crecimiento del maíz
al mismo tiempo que aumenta la posibilidad de que un hongo infecte a la
planta, lo contrario ocurre en lotes fertilizados con potasio.
La inyección de basidiosporas al jilote de la planta produce un alto índice
Vía de de infección, comparada con otras como: la inyección de teliosporas,
inoculación aspersión de teliosporas en la planta, mezcla de teliosporas con semillas
de maíz.
Tomado de: Garibaldi, 2003; Valdez, 2010.
9
encima del maíz y que es molesto. En otros lugares, por ejemplo en la zona maya, se le
conocía como “Ta´wa nal chaak”, es decir, excremento del dios de la lluvia “Chaak”
(Valdez, 2012).
Recientemente, el huitlacoche ha sido considerado como un cultivo alternativo
debido al incremento de su popularidad como alimento, y ha sido introducido en la alta
cocina. El incremento en la aceptabilidad de este hongo podría estar relacionado, por
un lado, a su alto valor nutricional, pero, principalmente por su excelente sabor
(Martínez y col., 2008).
El aumento en el consumo de huitlacoche en el país y en el extranjero ha motivado el
desarrollo de tecnologías que conduzcan a la producción masiva de este hongo. Los
agricultores han tratado de producir huitlacoche desde siempre y se han utilizado
muchas estrategias un tanto rudimentarias. El huitlacoche para consumo y
comercialización en gran medida sigue siendo recolectado de campos de maíz donde
se presenta la infección de forma fortuita sin ningún procedimiento técnico establecido
donde la infección es menor al 5% del total de los cultivos de maíz (Ruiz, 2008).
Se estima que en la Ciudad de México, los principales puntos de distribución de
huitlacoche son los mercados donde se venden entre 4-500 toneladas de agallas
frescas de huitlacoche al año procedentes principalmente del centro y sur del país.
Pocas empresas son las encargadas de la comercialización de huitlacoche enlatado,
entre las que se encuentran Herdez, La Costeña, Monteblanco, San Miguel. (Al súper
en casa.com, 2016). La compañía Herdez procesa cerca de 100 toneladas de
huitlacoche al año. Para muchas personas de México este es considerado un manjar a
pesar de su apariencia, pues tiene un sabor y una textura exquisitos, los principales
estados de la República Mexicana donde se cosecha y es ampliamente consumido son:
el Estado de México, Puebla, Oaxaca, Morelos, Veracruz, Michoacán y Distrito Federal.
Actualmente, está teniendo gran interés en el extranjero a pesar que sea considerado
un fitopatógenos para el maíz y reduzca la producción de maíz (Cota, 2004).
10
material seco. Se puede decir que el huitlacoche tiene proteínas de muy buena calidad,
con un extraordinariamente alto contenido de lisina; muy elevado en relación a lo que
se ha reportado para el maíz y otros vegetales. Aquí vale la pena insistir que las
proteínas del maíz son deficientes en lisina, por lo que fue un inteligente acierto
nutricional la complementación histórica que hicieron las distintas culturas mexicanas al
consumir huitlacoche con tortilla. El contenido de carbohidratos 55.1-66.5% y fibra 16.0-
23.5% es muy alto y contiene poca grasa 1.6-2.3%; no obstante tiene gran cantidad
ácidos grasos como: linolenico, linoleico (conocido como omega 3) y palmítico, esencial
para el consumo humano, en la Tabla 5 se comparan las concentraciones de algunos
nutrientes del huitlacoche y el maíz en peso seco (Valdez y col., 2009; Juárez y col.,
2011).
Huitlacoche Maíz
Nutriente
(Ustilago maydis) (Zea mays)
Lisina 14.8% 2.6-3.5%
Leucina 10.4% 12.0-15.8%
Aminoácidos Glicina 11.3% 2.6-4.7%
Acido aspártico 8.2% 5.8-7.2%
Metionina 0.69% 1.98%
Oleico 41-46% 20-46%
Linoneico 27-34% 35-70%
Ácido graso Linolenico 1.2-1.8% 0.8-2%
Palmítico 14% 7-19%
Ácido araquidico 2-4.4% 0.1-2%
Glucosa 140-180 mg/g 0.1-8.9 mg/g
Fructuosa 60-100 mg/g Hasta 7.6 mg/g
Monosacárido Glicerol 8.82 mg/g No determinada
Manitol 3.17 mg/g No determinada
Sorbitol 4.45 mg/g Hasta 3.7 mg/g
Sacarosa No es encontrada 4.4-94.6 mg/g
Total de fibra dietética 40-60% 7-12%
Polisacárido Fibra dietética soluble 10-30% 1.5%
Fibra dietética insoluble 30-50% 5-10%
Tomado de: Juárez y col., 2011.
Se ha reportado que este hongo produce vitaminas del complejo B como: riboflavina,
biotina, niacina y ácido fólico, con excepción de la vitamina B12, al igual se han
encontrado compuestos fenólicos en altas concentraciones, los cuales poseen
propiedades antioxidantes que son muy útiles para la prevención de enfermedades
11
como el cáncer y la arteriosclerosis, se le puede incluir en lo que ahora se les conoce
como alimentos nutracéuticos (Valdez y col., 2009; Jiménez, 2013).
1.6 Maíz
Maíz, significa literalmente “lo que sustenta la vida”. Botánicamente, el maíz (Zea
mays) pertenece a la familia de las gramíneas y es una planta anual alta dotada de un
amplio sistema radicular fibroso (FAO, 1993). El maíz es uno de los cereales utilizados
por el hombre desde épocas remotas y una de las especies vegetales más productivas,
tanto en su producción global (cerca de 600 millones de toneladas por año) como en su
productividad (más de 4 t/ha). Su centro de origen está en México desde donde se
difundió a todo el mundo después del primer viaje de Cristóbal Colón a fines del siglo
XV (Paliwal, 2015).
El maíz es la forma domesticada de una subespecie de teocintle (Zea mays ssp.
parviglumis), un pasto silvestre, la domesticación del teocintle ocurrio aproximadamente
entre los 4 – 3,000 años A.C. El maíz que actualmente conocemos es un pasto gigante
domesticado (Zea mays ssp. mays) de origen mexicano. La planta es usada para
producir granos y forraje, los cuales constituyen la base para la elaboración de un buen
número de alimentos tanto para nuestra especie como para otros animales, así como
para la industria farmacéutica y manufacturera. El cultivo del maíz, y la elaboración de
diversos productos alimenticios están ligados con el surgimiento y evolución de las
civilizaciones mesoamericanas pre-colombinas. Debido a su adaptabilidad y
productividad el cultivo del maíz se expandió rápidamente alrededor del mundo
después de que los españoles y otros europeos exportaron la planta de las Américas en
los siglos XV y XVI. Actualmente el maíz es producido en la mayoría de los países del
mundo siendo el tercer cultivo por la superficie involucrada después del trigo y del arroz
(Salvador, 2001).
La mayor parte de la producción de maíz ocurre en los Estados Unidos, China y
Brasil, países que en conjunto obtienen un aproximado de 60% de la producción global
anual estimada en 1,000 millones de toneladas. México, ocupa el octavo lugar de
producción mundial, actualmente produce alrededor de 23 millones de toneladas
(Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, 2015).
12
1.6.1 Taxonomía del maíz
13
Figura 4. Estructura y desarrollo de la planta de maíz. Se observa el desarrollo de una planta de maíz desde la germinación de un grano
hasta observar una planta adulta de maíz. A) Raíces seminales, B) Raíces permanentes, C) Raíces adventicias, D) Tallo, E) Hoja, F) Flor
femenina y G) Flor masculina. Tomado de: Condori, 2014.
14
Tabla 6. Partes de la planta de maíz
Parte Descripción
La raíz de una planta de maíz es fasciculada con un potente desarrollo.
Tienen tres tipos de raíces:
A) Seminales: Nacen en la semilla después de la radícula. No son
permanentes.
B) Permanentes: En este grupo están incluidas las principales y
Raíz
secundarias. Están nacen por encima de las primeras raicillas en una zona
llamada corona. Este grupo constituye el llamado sistema radicular
principal.
C) Adventicias: Nacen de los nudos inferiores del tallo y actúan de sostén
en las últimas etapas del crecimiento, absorbiendo a la vez agua y
sustancias nutritivas.
Es erguido, sencillo y nudoso. Tiene surcos longitudinales en la parte
inferior. Tiene una altura de unos 2 metros (lo más común aunque hay de
Tallo mayor altura) con una serie de entrenudos de unos 16cm.
El primer tallo que emerge de la semilla se llama mesocotilo, que se alarga
más o menos según la profundidad de siembra, al final de este tallo se
forma la corona y luego el tallo final y las raíces.
Las hojas son alternas, abrazadoras, anchas, paralelinervias, lanceoladas y
Hoja ásperas. Su longitud es de 40-45cm y 6-8cm de ancho. La planta tiene de
cuatro a cinco hojas embrionarias que van protegidas hasta que salen a la
superficie por el coleoptilo, que se rompe saliendo la primera hoja.
Es una planta monoica, en la cual se distinguen dos tipos de flores:
Las flores femeninas, se encuentran en la axila de algunas hojas, están
formando una inflorescencia en espiga rodeada por largas bracteas que la
cubren por completo. La espiga llamada mazorca está formada por una
serie de espiguillas, cada una de las cuales está formada por dos flores de
Flor las cuales la inferior aborta. Cada espiguilla, en caso de fecundación dará
un grano. En el extremo de la mazorca se desarrollan unos estilos largos
llamados sedas en los cuales cae el polen y se desarrolla el tubo polínico.
La flor masculina está en la extremidad del tallo agrupada en panículas que
se llaman penachos. Está formada por 3 a 10 filas de espiguillas
emparejadas, cada una de ellas compuesta por dos glumas y contiene dos
flores con tres estambres cada una siendo las dos flores fértiles.
El grano se dispone en hileras longitudinales y hay varios cientos en una
Grano mazorca. Es generalmente aplastado en un plano perpendicular al eje de la
mazorca, como es el caso de la mayoría de los híbridos actuales.
El grano se inserta a la mazorca por el pedúnculo de la flor.
Tomado de: Pavón, 2003.
15
Tabla 7. Partes que conforman el grano de maíz
Estructura Característica
Protege la semilla antes y después de ser sembrada impidiendo la
Pericarpio entrada de hongos. La lesión en la cubierta puede inutilizar la
semilla.
Es la reserva nutricional del grano, está compuesto por un 90% de
almidón, 7% de proteína y el resto son aceites minerales. La función
principal consiste en proporcionar nutrientes al embrión durante su
Endospermo germinación y sustenta las etapas primarias del crecimiento, hasta
amiláceo que sus raíces y hojas estén bien desarrolladas para satisfacer sus
necesidades nutricionales. En el endospermo, las proteínas
conforman una matriz córnea en cuyo interior se hallan los gránulos
de almidón.
Está formado por el eje embrionario y por el escutelo. El eje
Embrión embrionario está formado por la plúmula (de 4-5 hojas) y radícula. El
escutelo corresponde al cotiledón.
Tomado de: Pavón, 2003.
Figura 5. Estructura del grano de maíz. Se observa cada una de las partes que conforma la
estructura de un grano de maíz, la porción más externa y que protege al grano el pericarpio,
seguida del endospermo y la porción central el embrión o germen. Tomado de: FAO, 1993.
16
1.6.4 Clasificación de los tipos maíz
La característica variable del maíz que más se relaciona con sus usos como alimento
es la composición de su endospermo. En la Tabla 8 se describe una sencilla
clasificación del maíz se basa en las características del endospermo donde se
distinguen cinco tipos de maíz.
Tipo Descripción
Consiste de pequeños frutos esféricos con un núcleo de almidón
harinoso (suave) y una capa de endospermo compacto (duro). La
Palomero
humedad atrapada en el almidón harinoso se expande mediante la
aplicación de calor haciendo que el almidón salga a través de dicha
capa endurecida, produciendo así las populares palomitas.
Similar al maíz palomero, pero con frutos más largos. El maíz cristalino
probablemente fue desarrollado a partir de maíces palomeros mediante
Cristalino la selección de frutos de mayor tamaño y rendimiento. Este tipo de maíz
(Duro) es producido en áreas donde puede requerirse tolerancia al frío o bien
en zonas donde las condiciones de germinación y almacenaje son
pobres.
El descubrimiento y selección de esta característica constituyó un paso
esencial para la amplia dispersión, desarrollo y adopción de una gran
cantidad de alimentos elaborados a base de maíz. La harina de maíz
Harinoso continua siendo la forma preferida para la elaboración de productos de
(Blando) consumo humano directo, debido a que consiste de almidón blando que
es fácilmente utilizable para producir alimento que puede consumirse
directamente (pinole), o bien para elaborar pan plano (tortilla), masa
cocida (tamal) o bebidas (atole).
Consiste de un núcleo de almidón harinoso con inclusiones laterales de
almidón duro. Debido a que el ápice del fruto consiste de almidón
harinoso, la pérdida de humedad de esta área al alcanzar la madurez
Dentado causa un ligero colapso en el volumen lo cual le brinda la típica
apariencia de un diente. Este es el tipo de maíz que se produce más a
nivel mundial, siendo usado en la alimentación del ganado así como
para diversos productos industriales (almidón, jarabe, aceite, alcohol).
El endospermo consiste principalmente de azúcar soluble, con un poco
Dulce de almidón y una forma intermedia de un polímero de azúcar llamado
fitoglicógeno.
Tomado de: Salvador, 2001.
17
1.6.5 Etapas de desarrollo del maíz
V12
V6
V3
V2
VE
Siembra
Figura 6. Etapas de desarrollo del maíz. Se observa el desarrollo de la planta de maíz, donde:
VE) es la fase de emergencia donde el coleoptilo emerge del suelo, V2) es la fase vegetal se hace
visible el cuello de la segunda hoja, V3) es la fase vegetal se hace visible el cuello de la tercera
hoja V6) es la fase vegetal donde es visible el cuello de la hoja número 6, V12) es la fase vegetal
donde es visible la hoja número 12, VT) fase vegetal donde comienza la floración masculina es
visible la última rama de la panícula, R1) fase reproductiva donde comienza la floración femenina y
son visibles los estigmas del jilote, R6) se alcanza la madures de la planta del maíz. Tomado de:
Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz Y Trigo [CIMMYT], 2015.
18
Tabla 9. Descripción de las etapas en el desarrollo del maíz
1.7 Antecedentes
19
buscado metodologías para la producción de este hongo para mejorar el rendimiento y
lograr la infección con el uso de diferentes cepas y estadios del hongo.
Actualmente, se busca la forma de producir a gran escala este hongo ya que los
métodos para la inducción aún siguen siendo rudimentarios como la aspersión de
teliosporas sobre la mazorcas o el campo, a pesar que ya excitan algunos métodos
para mejorar los resultados en la infección estos son caros y necesitan de instalaciones
adecuadas para manipular al hongo. Por lo tanto se busca lograr una metodología
sencilla y económica para lograr la infección inducida, otro punto importante para su
producción es su remuneración económica ya que es más elevada comparada con la
venta del maíz sin infección.
Leal (1996) evaluó el tipo de inóculo para obtener mejores resultados para inducir la
infección de plantas de maíz comparando teliosporas y basidiosporas de Ustilago
maydis, la frecuencia de inoculación, vía de inoculación y la concentración del inóculo,
obteniendo las teliosporas a partir de una mazorca infectada triturando las agallas y
tamizándolas con mallas del número 80mm hasta obtener solo teliosporas y
germinandolas en el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) posteriormente se
obtuvo biomasa de basidiosporas en un medio mínimo mineral líquido, se encontró que
es conveniente usar inóculo de basidiosporas en lugar de teliosporas encontrando
mayor incidencia de formación de agallas con el uso de basidiosporas, al comparar la
aplicación de una solo dosis de inóculo o dos, se encontró que al aplicar dos dosis de
basidiosporas incrementan el porcentaje de formación de agallas la primera al formarse
el jilote y la segunda cuando emergieron los estigmas, al comparar una concentración
de 1x105/mL y otra de 1x106/mL de teliosporas y basidiosporas, no se encontró
diferencia en la incidencia de infección, se determinó que la aplicación endógena
(inyección) es mejor la aplicación exógena (aspersión sobre la planta).
Martínez y col. (2000) evaluaron y seleccionaron cepas de Ustilago maydis con alta
virulencia sobre el maíz partiendo de teliosporas obtenidas de mazorcas totalmente
cubiertas con agallas de huitlacoche desinfectando las agallas y sembrando las
teliosporas en el medio de cultivo PDA hasta obtener basidiosporas generando biomasa
en este medio y ajustando los inóculos de basidiosporas a 106/mL con agua destilada y
con estas últimas inocular plantas de maíz, de 100 cepas de basidiosporas aisladas se
encontraron 12 cepas con un porcentaje de infección mayor al 70%.
Cota (2004) evaluó cepas locales de Ustilago maydis del Valle de Yaqui en Sonora
en plantas de maíz para la producción de huitlacoche en esa localidad, en su
investigación evaluó cruzas de cepas y cepas solas de basidiosporas seleccionadas de
un trabajo previo del Instituto Tecnológico de Sonora recolectadas en el 2004 por
Clavero de distintos puntos de la localidad, adaptadas a condiciones de laboratorio y
reactivadas en caldo dextrosa de papa, encontrando mayor porcentaje de infección en
las mazorcas de maíz usando las cruzas de cepas de basidiosporas.
Valdez y col. (2009) evaluaron la susceptibilidad de 15 diferentes genotipos de maíz
criollo de Guanajuato para la producción de este hongo usando basidiosporas de
20
Ustilago maydis a una concentración de 1x106/ml adaptadas a condiciones del
Laboratorio de Biotecnología de Alimentos del CINVESTAV-Irapuato reactivándolas en
medio PDA y generando biomasa en medio líquido extracto de Papa obteniendo
porcentajes de infección mayores al 90% en el maíz criollo de la localidad de Loma de
Cabra Guanajuato.
Madrigal y col. (2010) realizaron ensayos bajo condiciones de invernadero para la
producción de huitlacoche en hidropónia, evaluó la producción del hongo en híbridos
comerciales de maíz con cepas de teliosporas provenientes de los mismos tipos de
híbridos de maíz para considerarlos apropiadas cada uno de ellos, germinado las
teliosporas en medio PDA y así generar los inóculos de basidiosporas ajustando la
concentración a 1x106/mL con agua destilada, encontrando mayor incidencia de
infección en el hibrido comercial 30G40.
Jiménez (2013) obtuvo teliosporas de la localidad de Miahuatlán Veracruz las cuales
fueron sembradas en medio PDA para que estas germinaran en basidiosporas,
posteriormente generó biomasa en medio PDA y ajustó un inóculo de basidiosporas a
1x106/mL con agua destilada, conservándolas a 4°C hasta su uso, con esto produjo un
inóculo artificial de Ustilago maydis.
Escalante (2013) evaluó la infectividad de las teliosporas y basidiosporas de Ustilago
maydis en diferentes híbridos comerciales de maíz, obteniendo las basidiosporas de un
experimento anterior conservadas desde el 2001 en un cepario del laboratorio de
fitotecnia de la Universidad Autónoma de Chapingo estas se reactivaron en PDA y
ajustando los inóculos de basidiosporas a una concentración de 1x106/mL con agua
destilada y cloranfenicol, y las teliosporas obtenidas a partir de mazorcas con agallas
donde se trituraron las agallas en una licuadora domestica para así obtener el
concentrado de teliosporas, encontrando que se obtienen los mejores resultados en
infección con el uso de un inóculo de teliosporas a una concentración de 1x106/mL
sobre los híbridos de maíz.
Moncada (2014) evaluó un método para la obtención de teliosporas purificadas de
Ustilago maydis para encontrar cepas patógenas y así producir huitlacoche,
recolectando mazorcas con agallas las cuales fueron trituradas y filtradas,
posteriormente, lavadas con agua destilada y desinfectadas con sulfato de cobre al
0.5% sembrando las teliosporas lavadas, en medio de cultivo completo descrito por
Holliday en 1974, obteniendo colonias de basidiosporas sexualmente compatibles por
tener crecimiento de aspecto algodonoso al mezclar colonias levaduriformes.
21
2. JUSTIFICACIÓN
22
3. OBJETIVOS
Objetivo general
Desarrollar un protocolo para la inoculación de Ustilago maydis en maíz bajo
algunas condiciones controladas para la producción de huitlacoche a bajo costo.
Objetivos particulares
Obtener un concentrado puro de teliosporas de Ustilago maydis.
Determinar la viabilidad de las teliosporas de Ustilago maydis.
Aislar una cepa pura de basidiosporas de Ustilago maydis.
Evaluar las condiciones óptimas para el crecimiento de la fase de basidiospora de
Ustilago maydis.
Comparar y seleccionar el medio de cultivo adecuado para la propagación del hongo
y generación del inóculo.
Evaluar la eficiencia de infección del hongo Ustilago maydis en diferentes etapas de
desarrollo del maíz con el uso de teliosporas y basidiosporas.
Determinar la vía de inoculación más adecuada para obtener mayor eficiencia en la
infección de maíz, así como la concentración de inóculo adecuado.
23
4. MATERIAL Y MÉTODOS
Los criterios para la selección de las mazorcas infectadas por Ustilago maydis
fueron: mazorca sin estado de descomposición, evidente presencia de agallas color
grisáceas al abrir estas agallas debían tener una masa negra de teliosporas, y que aun
estuvieran cubiertas por las hojas y que estas siguieran verdes, se evitó aquellas que
tuvieran hojas con polvo, secas o marchitas para disminuir carga microbiana externa,
posteriormente se desinfectaron.
Los granos utilizados para las primeras pruebas tenían que ser de mazorcas recién
cortadas de cultivo de la localidad de San Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de
México, las mazorcas tenían que estar aún cubiertas por las hojas que lo recubre y
estás hojas sin marchitez, sin polvo y sin presencia de insectos, posteriormente se
desinfectaron.
Los granos ocupados tenían que ser granos de la recolección del año anterior, sin
evidencia de insectos e intactos, evitando aquellos rotos o con insectos, posteriormente
se desinfectaron.
4.4.1 Prueba en mezcla de granos de maíz jóvenes sanos con granos infectados
con Ustilago maydis
La primer prueba realizada fue determinar si era posible infectar granos de maíz
jóvenes, realizando una mezcla de granos de maíz jóvenes sanos y un macerado de
granos infectados con Ustilago maydis (fase de teliospora), lo primero fue la selección
de una mazorca infectada con Ustilago maydis aquella que presentara evidente
hipertrofia y una masa negra de teliosporas, retirando las hojas que lo cubrían y lavando
al chorro de agua corriente para eliminar restos de hojas, polvo y otros artefactos
contaminantes de la muestra, se desgrano y seleccionaron los granos en mejores
condiciones los más grandes y con abundancia en teliosporas, estos se lavaron con
solución jabonosa preparado con agua corriente más jabón líquido comercial, se eliminó
el exceso de jabón con agua corriente, posteriormente se sumergieron en hipoclorito de
24
sodio al 1% por 15 minutos y después se realizaron tres lavados con agua corriente
escurrieron perfectamente y posteriormente se trituraron los granos en un recipiente
con una cuchara previamente desinfectados con hipoclorito de sodio al 1%, hasta
obtener una masa homogénea.
Posteriormente, se lavaron las mazorcas sanas con granos jóvenes de la misma
forma que a las agallas hasta obtener los granos limpios. Con este macerado de los
granos infectados más los granos sanos se realizaron mezclas por triplicado en
proporciones volumen a volumen (V:V), infectado vs sano en diferentes diluciones 1:10,
1:5 y 2:5 y se colocaron en vasos de plástico de 250mL cubriendo los recipientes con
una malla de plástico, y se observaron periódicamente durante un mes para observar
los cambios en los granos sano.
25
4.4.4 Determinación de la infectividad de la fase de teliosporas de Ustilago
maydis por aspersión sobre granos de maíz germinando
26
4.5.1 Determinación de la viabilidad de teliosporas de Ustilago maydis
27
levaduriforme, resembrando cada colonia levaduriforme en agar extracto de maíz por
estría simple (una colonia por placa), se incubó a 37°C por 96 horas, para generar
biomasa, transcurrido este tiempo se realizó una suspensión de cada placa de agar
tomando cinco colonias por placa y resuspendiendo en 5mL de solución salina al
0.85%, después se tomó 1mL de cada suspensión en jeringa hipodérmicas y se
inocularon por inyección a plantas de maíz de un mes de desarrollo, se esperó observar
los efectos en las plántulas así inoculadas y posiblemente infectadas por este método.
Tres semanas después de los ensayos de infección con Ustilago maydis se
realizaron cortes de las zonas afectadas, se tiñeron con azul de metileno, se realizó la
observación al microscopio a (40X) y (100X), buscando el micelio y las teliosporas para
confirmar infección y la presencia del hongo, seleccionando las colonias que
presentaran las mismas características morfológicas macroscópicas y microscópicas
que produjeron la infección y se resembraron en medio agar extracto de maíz para su
posterior uso.
Se realizaron tres pruebas para evaluar los dos estadios del hongo (teliosporas y
basidiosporas), así como, la combinación de colonias de basidiosporas:
1) Se resembraron seis colonias provenientes de la misma placa de agar extracto
de maíz con las mismas características levaduriformes, por lo tanto, la misma cepa
confirmadas de Ustilago maydis (cepa haploide) en un tubo con 10mL de medio
líquido de extracto de maíz y se incubo a 37°C por 96 horas.
2) Después se seleccionaron seis colonias provenientes de diferentes placas con
morfologías levaduriformes y también seleccionando aquella que presentaba
pseudomicelio y con morfología microscópica idéntica, por lo tanto se consideraban
diferentes cepas confirmadas de Ustilago maydis para generar un apareamiento
sexual y formar un inoculo con cepas diploides, se resembraron en un tubo con 5mL
de medio líquido de extracto de maíz y se incubo a 37°C por 96 horas.
3) Por último se tomó un volumen de 1mL del concentrado de teliosporas, obtenidas
anteriormente como se mencionó en el punto (4.5) y se resuspendieron en 4mL de
solución salina estéril para obtener un volumen final de 5mL.
Se inoculó 1mL de cada uno de los tres preparados en el tallo de plantas de maíz de
un mes de desarrollo, observando periódicamente los efectos producidos.
28
4.8 Comparación y selección del medio de cultivo óptimo para la propagación de
la cepa comprobada de Ustilago maydis
Se prepararon diluciones con agua destilada estéril de los medios líquidos extracto
de maíz y de papa, obteniendo tres tubos por cada medio (concentrado, y diluciones de
1:1, y 1:3), las concentraciones finales en un volumen de 10mL se observan en la Tabla
10. A partir del medio líquido de extracto de maíz inoculado con basidiosporas
mencionado en el punto anterior (4.8.1) incubado por 96 horas, se inocularon con 1mL
los tubos con medio concentrado, diluido al 50% 1:1 (V:V) y el diluido al 25% 1:3,
después se dejó incubando por 24 horas a 37°C y se evaluó el crecimiento por conteo
celular en cámara de Neubauer.
29
4.10 Inoculación a plantas adultas de maíz con la fase de basidiosporas de
Ustilago maydis
30
5. DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO
Selección de Granos
material biologico maduros de
Mazorcas maíz
jovenes sanas
Mazorcas de maíz
infectadas por Obteción de
Ustilago maydis granos jovenes
sanos
Obtención de
un concentrado Germinación de
de teliosporas granos de maíz
Evaluación de
la eficiencia de
infección de
Purificación de teliosporas
teliosporas
Determinación
de infectividad Plántulas de
Determinación
en plantulas de maíz
de la viabilidad
de las maíz
teliosporas
Comparación y
selección del
medio de cultivo
óptimo para la
propagación de OBTENCIÓN DE
basidiosporas HUITLACOCHE
31
6. RESULTADOS
33
6.1.2 Inoculación de granos de maíz sanos jóvenes con suspensión de
teliosporas de Ustilago maydis
34
A) Día 0 B) Semana 1 C) Semana 2 D) Semana 3
Figura 10. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz
tiernos, control negativo. A) Día cero de inoculación, B) Granos después de una semana de
inoculación con teliosporas, C) Granos después de dos semanas de inoculación con teliosporas y
D) Granos después de tres semanas de inoculación con teliosporas.
35
A. Día 0 B. Semana 1 C. Semana 2 D. Semana 3
Figura 13. Evaluación de la infección con teliosporas de Ustilago maydis en granos de maíz
tiernos usando una concentración de teliosporas 1:1.5 (agua-teliosporas). A) Día cero de
inoculación, se observa una pequeña porción negra en el sitio de inoculación de las teliosporas, B)
Granos después de una semana de inoculación con teliosporas, C) Se observa un grano
germinando después de dos semanas de inoculación con teliosporas, los demás en estado de
descomposición y D) solo un grano germino después de tres semanas de inoculación con
teliosporas, todos los granos con evidente estado de descomposición.
36
A B
Figura 14. Mazorcas usadas para evaluar el efecto de las teliosporas de Ustilago maydis. A)
Mazorcas en un recipiente humedecido con agua potable para mantenerlas hidratadas y cubiertas
por sus hojas para protegerlas de infecciones no deseadas y B) Una de las mazorcas inoculadas
con teliosporas con las hojas cloróticas a la tercera semana de incubación.
37
6.1.4 Aspersión de teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de maíz
germinando
Al dejar actuar las teliosporas sobre plántulas de maíz, transcurridas cuatro semanas
de contacto las plántulas comenzaron a presentar evidencia de clorosis y a las cinco
semanas necrosis y muerte (Figura 16), en la sexta semana todas las plántulas
murieron.
Figura 16. Efecto de la exposición con teliosporas de Ustilago maydis sobre granos de maíz
germinando después de cuatro semanas. Se observan hojas necróticas y el tallo clorótico en
plántulas de maíz, después de cinco semanas de ser expuestas a una suspensión de teliosporas.
38
objetivo eliminar la microbiota bacteriana asociada que pudiera estar presente para
obtener teliosporas puras.
A B
S S
M M
F F
Figura 17. Separación de teliosporas por el efecto del gradiente de concentración con NaCl.
A) Suspensión de teliosporas al 8% de NaCl, B) Suspensión de teliosporas al 10% de NaCl, S)
Superficie con restos de tejido vegetal, M) Medio con solución acuosa y F) Fondo concentrado de
teliosporas.
39
En la Tabla 11 se observan los resultados de la separación de los restos de tejido
vegetal usando las concentraciones 0.85%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 5%,
6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25% y 30% de NaCl, marcando con un signo negativo (-)
aquellas que no lograron separar los restos vegetales de la suspensión de teliosporas y
con un signo positivo (+) las que sí lograron separa los restos vegetales de la
suspensión de teliosporas, la cantidad de signos positivos (+) es proporcional a la
concentración de tejido vegetal separado de la suspensión, por lo tanto, a mayor
cantidad de signos positivos mayor cantidad de tejido vegetal separado, esta cantidad
de tejido vegetal separado se media en volumen al ocupar tubos para centrifuga
graduados. Se aprecia que a una concentración de 4% de NaCl se logró separa el
tejido vegetal y a la concentración de 6% de NaCl fue mayor la concentración de tejido
vegetal separado, a medida que aumentaba la concentración de NaCl no solo el tejido
vegetal se iba a la superficie también las teliosporas, este efecto se hizo evidente a la
concentración de 10% de NaCl como se observa en la Figura 17.
40
A
Después del tratamiento al que fueron expuestas las teliosporas por el gradiente con
las diferentes concentraciones de NaCl para su separación y purificación, se tenía que
evaluar si las teliosporas al pasar por el estrés osmótico aun eran viables, así es que se
procedió a confirmarlo sembrando las teliosporas en medio extracto de maíz, utilizando
extracto de maíz ya que es el sustrato natural de este hongo.
41
Tabla 12. Resultados de la germinación de las teliosporas puras
Ustilago maydis obtenidas, inoculadas en medio extracto de maíz
A B
Figura 19. Germinación de teliosporas de Ustilago maydis. Observaciones del concentrado de
teliosporas incubado a 37°C en medio líquido extracto de maíz por 72 horas, preparaciones teñidas
con azul de metileno; A) se observa un conjunto de teliosporas y las flechas señalan la
germinación de estas a (40X) y B) se observa una teliosporas al centro germinando una de ellas a
(40X).
42
Figura 20. Basidiosporas de Ustilago maydis en división. Basidiosporas dividiéndose teñidas
con azul de metileno vista a inmersión, se encuentran formando pseudomicelio después de 120
horas de incubación a 37°C.
43
A B
Figura 21. Colonias levaduriformes evaluadas, presuntivas de basidiosporas de Ustilago
maydis. A) Primera colonia levaduriforme evaluada con células en forma ovalada observadas al
microscopio a (40X) y B) Segunda colonia levaduriforme evaluada se observan células polimórficas
al microscopio a (40X).
44
en tubos diferentes, se tomó 1mL de cada suspensión de células y se inoculó por
inyección a plantas de maíz de un mes de desarrollo, hasta observar algún cambio
sobre las plantas, dos semanas después de la exposición en la planta inoculada con la
cepa número tres (Figura 23) se señalada con una flecha la zona hipertrófica en el sitio
de inoculación (imagen A), también se muestra una planta a las tres semanas de la
explosión donde se aprecia la planta con una malformación severa con el tallo doblado
(imagen B), en dicha zona se realizó un corte y se observó al microscopio a (40X) en
donde se aprecia la presencia de teliosporas (imagen C) confirmando con esto la
obtención de la cepa de Ustilago maydis.
Se logró completar el ciclo de vida del hongo Ustilago maydis al obtener un
concentrado de teliosporas puras y viables, capaces de germinar y producir
basidiosporas infectivas para plantas de maíz (Figura 24), donde se observan las
teliosporas obtenidas por el método de purificación usando un gradiente de
concentración del 4% de NaCl (imagen A), dichas teliosporas germinaron en medio
líquido de extracto de maíz (imagen B), y en medio agar extracto de maíz obteniendo
basidiosporas (imagen C), al ser pasadas a medio liquido de extracto de maíz se
observó división de las basidiosporas formando pseudomicelio (imagen D), la biomasa
de basidiosporas generada fue usada para inocular plántulas de maíz (imagen E),
después de dos semanas de exposición al inóculo de basidiosporas se aprecia una
zona hipertrófica en la planta de maíz (imagen F), tres semanas después de la
exposición al inóculo con basidiosporas la planta de maíz presento un notable daño al
tallo el cual se encuentra malformado debido a la hipertrofia (imagen G) a dicho sitio se
le realizaron cortes los cuales fueron observados al microscopio encontrando
teliosporas (imagen H), con esto se logró confirmar que la colonia usada para infectar a
la plántula era una cepa de Ustilago maydis.
A B C
Figura 23. Efecto de las basidiosporas de Ustilago maydis sobre plantas de maíz. Se evaluó
la cepa levaduriforme número tres sobre una planta de maíz con un mes de desarrollo, A)
Corresponde al efecto producido después de dos semanas de exposición, la flecha señala una
zona hipertrófica en el sitio de inoculación, B) corresponde al efecto producido después de tres
semanas de exposición la flecha señala la zona hipertrófica que produjo malformación severa de la
planta y C) Donde se observan teliosporas en un corte de tejido afectado de la planta de maíz.
45
H A
Figura 24. Ciclo de vida de Ustilago maydis detectado experimentalmente bajo este
protocolo. A) Teliosporas purificadas, B) Teliosporas germinando en medio liquido extracto de
maíz, C) Basidiosporas en medio sólido extracto de maíz, D) Basidiosporas con pseudomicelio en
medio líquido de extracto de maíz, E) Plantas de maíz de un mes, F) Zona hipertrófica y G) Tallo
atrofiado, H) Teliosporas en corte de hoja de maíz.
46
6.4 Determinación de la infectividad de los estadios de Ustilago maydis sobre
plántulas de maíz
Se determinó que estadio del hongo Ustilago maydis produce los mejores resultados
en infección en plantas de maíz, comparando si existe diferencia entre una cepa de
basidiosporas y una mezcla de cepas de basidiosporas, así como comparar la fase de
teliosporas inoculando plantas de un mes de desarrollo con 1mL de las suspensiones
preparadas.
Las colonias de basidiosporas seleccionadas se observan en las placas de agar
extracto de maíz (Figura 25), la suspensión de basidiosporas de la misma cepa se
realizó tomando seis colonias con aspecto levaduriforme (imagen A),
microscópicamente se aprecian basidiosporas alargadas teñidas con azul de metileno
(imagen A, Figura 26), la suspensión de basidiosporas de diferente cepa se realizó
tomando seis colonias de placas diferentes dos colonias fueron tomadas de las dos
placas observadas en las (imágenes B y C, Figura 25) las colonia tomadas de estas
placas señaladas por las flechas son crateriformes y con pseudomicelio también
observadas al microscopio en donde se aprecia la presencia de pseudomicelio (imagen
B, Figura 26).
A B C
Figura 25. Placas de agar extracto de maíz con crecimiento de colonias de basidiosporas de
Ustilago maydis. A) Placa de agar extracto de maíz con colonias levaduriformes de basidiosporas
de Ustilago maydis. B) Placa de agar extracto de maíz con colonias cerebriformes de
basidiosporas de Ustilago maydis. C) Placa de agar extracto de maíz con colonias pigmentadas
con pseudomicelio de basidiosporas de Ustilago maydis.
47
A B
Figura 26. Basidiosporas de Ustilago maydis teñidas con azul de metileno. A) basidiosporas
unicelulares. B) Basidiosporas dividiéndose formando pseudomicelio señaladas por las flechas.
A B C
Figura 27. Efecto de las fase teliosporas y basidiosporas de Ustilago maydis sobre plantas
de maíz. Se observa el efecto producido por cada uno de los concentrados de las fases de
Ustilago maydis después de un mes de la inoculación. A) corresponde a la planta inoculada con el
concentrado de teliosporas, donde las hojas más viejas señaladas con la flecha se observan
marchitas y cloróticas, B) Corresponde a la planta inoculada con una suspensión de una sola cepa
de basidiosporas, donde se observa que las zonas de las hojas más viejas se encuentran
necróticas, cloróticas y de menor tamaño a la primera y C) Corresponde a la planta inoculada con
la mezcla de las seis cepas de basidiosporas, donde se observa la plántula completamente
marchita y en la sitio de inoculación hipertrofia.
48
6.5 Comparación y selección del medio de cultivo adecuado para la propagación
del hongo de la cepa comprobada de Ustilago maydis
A B
Figura 28. Colonias de Ustilago maydis en medio de cultivo sólido. Se muestra el desarrollo
de las colonias de basidiosporas de Ustilago maydis después de 72 horas de incubación a 37°C.
A) Corresponde al medio agar extracto de maíz donde se observa clara mente menor crecimiento y
B) Corresponde al medio agar extracto de papa donde se observa una mayor cantidad de colonias.
6.5.2 Evaluación del crecimiento en medio líquido
49
Para la determinación del crecimiento de basidiosporas en medio líquido se realizó el
conteo celular con ayuda de una cámara de Neubauer, evaluando el medio líquido
extracto de maíz y el medio líquido extracto de papa, cada medio líquido se diluyo con
solución fisiológica al doble teniendo un medio concentrado un medio diluido 1:1 (V:V) y
un medio diluido 1:3 (V:V) de cada uno, encontrando que el mayor crecimiento celular
se presentó en el medio extracto de maíz diluido 1:1 con 1.28x107 basidiosporas por
mililitro, seguido por el medio líquido extracto de maíz concentrado con 4.22x106
basidiosporas/mL, el medio que presento menor crecimiento fue el medio líquido
extracto de maíz diluido 1:3 con 8.4x105 basidiosporas/mL (Figura 29).
1.4E+07 1.28x107
1.2E+07
Medio
1.0E+07 líquido
Basidiosporas/mL
extracto
de maíz
8.0E+06
6.0E+06
4.22x106
3.12x106 Medio
4.0E+06
líquido
2.20x106 extracto
de papa
1.21x106
2.0E+06 8.40x105
0.0E+00
Concentrado 1:1 1:3
50
En la Figura 30 se aprecian las basidiosporas de Ustilago maydis contadas al
microscopio en cámara de Neubauer a un aumento de (40X) para realizar el cálculo de
basidiosporas/mL, se señalas las basidiosporas con flechas.
Se prepararon los inóculos a partir del medio de cultivo líquido con extracto de maíz
dilución 1:1 (V:V) (Concentración de harina de maíz del 20% y de sacarosa del 0.25%)
incubado por 96 horas, se tomó una alícuota de este medio de cultivo y se le realizó el
conteo celular al microscopio en cámara de Neubauer encontrando que se tenían 6x10 5
basidiosporas/mL del medio. Posteriormente, se realizaron diluciones para obtener las
concentraciones de 6x104 basidiosporas/mL y 6x103 basidiosporas/mL, teniendo un
volumen final de 10mL de cada concentrado de basidiosporas.
Se tomaron 3mL de cada concentrado de basidiosporas en jeringas hipodérmicas
para inocular el jilote de plantas adultas de maíz en estadio R1 (una a dos semanas
después de la salida del estigma del jilote) fueron sembradas en macetas de un
volumen de 20Lt (0=0.02m3) con suelo de cultivo de maíz de la localidad de San
Francisco Chimalpa, Naucalpan, Edo. de México (Figura 31), tres plantas fueron
51
inoculadas con la concentración de 6x105 basidiosporas/mL (imagen 1B), tres con la
concentración de 6x104 basidiosporas/mL (imagen 2B) y otras tres con la concentración
de 6x103 basidiosporas/mL (imagen 3B).
Figura 31. Jilotes de maíz antes de ser inoculados con basidiosporas de Ustilago maydis.
5
1B). Jilote antes de ser inoculado con una suspensión de 6x10 basidiosporas/ml, 2B) Jilote antes
4
de ser inoculado con una suspensión de 6x10 basidiosporas/ml y 3B) Jilote antes de ser inoculado
3
con una suspensión de 6x10 basidiosporas/ml.
A B
Figura 32. Efecto de la inoculación por inyección de basidiosporas de Ustilago maydis en
5
jilotes de maíz. A) Mazorca después de 24 días de inoculación con concentrado de 6x10
basidiosporas/mL, la flecha señala la zona afectada por el hongo y B) Micelio del hongo tenido con
azul de metileno.
52
La prueba anterior no fue tan representativa como se esperaba esto por factores
ambientales que afectaron el desarrollo de la planta de maíz por la temporada del año
de siembra (como temperatura y humedad relativa), así como la calidad del suelo de
cultivo, pero se demostró la infección en una de las mazorcas infectadas, por lo cual se
procedió a realizar una nueva prueba en plantas de maíz de la misma localidad usando
suelo de compostaje.
Se tomó una alícuota de 0.1mL del concentrado de teliosporas tratadas con el
gradiente de concentración de NaCl conservado a 4°C y se sembró en placa en agar
extracto de papa incubando a 37°C por 72 horas (Figura 33) las colonias presentaban
un aspecto crateriforme (imagen A), se seleccionaron cuatro colonias con evidencia de
pseudomicelio (imagen B) para resembrarlas en medio líquido de extracto de maíz.
A B
53
observación de la mazorca de maíz encontrando las agallas típicas del huitlacoche
(Figura 35).
Figura 35. Mazorca de maíz con huitlacoche. Se observa la infección característica de Ustilago
maydis sobre una mazorca de maíz formando agallas grisáceas.
54
7. DISCUSIÓN
55
distinguen y que no en cualquier etapa o estadio de crecimiento de la planta de maíz
esta infección se puede implantar.
Se evaluó otro método de infección de maíz utilizando una suspensión de teliosporas
donde se sumergieron granos germinando, encontrando que a medida que crecía la
plántula se presentaban zonas de clorosis y necrosis y a las seis semanas del contacto
con las teliosporas todas las plantas jóvenes murieron por lo tanto esto demuestra que
aun en granos germinados la infección por Ustilago maydis causa el mismo daño que
en el caso anterior confirmando que en etapas tempranas del crecimiento del maíz este
hongo resulta nocivo para la planta.
Por lo anterior, se procedió a la obtención de un concentrado de teliosporas por
medio de un macerado de granos infectados con Ustilago maydis, limpiando y
desinfectando con hipoclorito de sodio al 1% y purificando las teliosporas, utilizando un
gradiente de concentración de NaCl logrando obtener solo teliosporas libres de restos
vegetales y con ayuda de una solucion al 1% de CuSO4 como agente bactericida igual
al usado por Moncada en el 2014 se eliminó la microbiota asociada, encontrando que la
concentración a partir de la cual se lograron separar los restos vegetales fue al 4% de
NaCl y a la concentración de 6% de NaCl fue mayor la concentración de tejido vegetal
separado, a medida que aumentaba la concentración de NaCl no solo el tejido vegetal
se mantenía en la superficie sino también las teliosporas, este efecto se hizo más
evidente a la concentración del 10% de NaCl, se evaluó la viabilidad de las teliosporas
después de este tratamiento donde se compararon las teliosporas tratadas con NaCl al
4% y con 30% de NaCl, donde solo se obtuvo germinación de teliosporas en medio
líquido extracto de maíz y agar extracto de maíz con el tratamiento al 4% de NaCl, en
tanto con el tratamiento usando NaCl al 30% no se logró observar germinación en
medio líquido extracto de maíz de las teliosporas tampoco su desarrollo en agar
extracto de maíz. Al evaluar la viabilidad de las teliosporas se determinaron las
condiciones óptimas de incubación, donde la temperatura optima de desarrollo y
germinación de las teliosporas en medio líquido extracto de maíz fue después de 96
horas a 37°C y en agar extracto de maíz se comenzó a observar crecimiento a las 72
horas a 37°C, sin observar desarrollo ni germinación de las teliosporas en los medios
incubados a 27°C por lo tanto la germinación se da a 37°C y con este dato se comenzó
a trabajar en los siguientes procedimientos.
Para confirmar que las colonias obtenidas eran realmente de Ustilago maydis, se
tuvieron que comparar las cepas aisladas con características levaduriformes, al
obtenerlas por estría cruzada en agar extracto de maíz y así obtener colonias aisladas y
de fácil obtención de la siguiente fase del hongo Ustilago maydis la basidiospora, se
consideraron los postulados de Koch para lograr la confirmación de la cepa, se obtuvo
la fase de resistencia del hongo logrando aislar formas levaduriformes presuntivas de la
fase de basidiospora, inoculando plantas sanas jóvenes, y volviendo a aislar la fase de
resistencia (teliosporas), con esto se confirmaba la identidad de la cepa y la infectividad,
esto por carecer de una cepa tipo de Ustilago maydis para su comparación.
56
Al lograr obtener la cepa de la fase de basidiospora de Ustilago maydis, se tenía que
evaluar con cuál de las dos fase se lograba una eficiente infección, así es que se
comparó inoculando en plantas de maíz en estadio V5 (Tabla 4) la fase de teliospora y
la fase de basidiospora, logrando observar mejores resultados al inocular la fase de
basidiospora obteniendo una zona tumoral donde se encontraba una masa de
teliosporas nuevamente (imagen B, Figura 27), mientras que al inocular la fase de
teliospora solo se observaba clorosis y necrosis en las planta (imagen A, Figura 27),
confirmando lo que había encontrado Leal en 1996 y Cota en 2004, contrario a lo que
encontró Esclante en el 2013. De igual forma se comparó la combinación de cepas para
observar el efecto infectante sobre las plantas, esto ya que Ruiz en el 2008 cita la
necesidad que una basidiospora debe estar en contacto con su par sexual compatible
para que forme un micelio dicariótico y penetre al tejido del hospedero originando así la
infección, por lo tanto se comparó inoculando tres plantas de maíz con una solo colonia
y otras tres plantas con una combinación de 6 colonias, al final de esta prueba se
observó que al inocularse la combinación de 6 cepas se obtenía una zona hipertrófica
en el lugar de la lesión y una masa de teliosporas en la misma (imagen C, Figura 27),
mientas que al inocular con una sola colonia se observaban zonas cloróticas en el lugar
de la lesión y zonas necróticas en las zonas de las hojas más maduras de las plantas
con una ligera hipertrofia no tan marcada como la anterior (imagen B, Figura 27). Por lo
tanto la combinación de cepas resulto más eficiente para inducir la infección, al producir
una agalla y una masa de teliosporas abundante y con un efecto letal sobre las plantas
jóvenes en estadios V5 de maíz (Figura 27), mientras que con la fase de teliospora no
se logró observar los efectos de interés, como son la agalla y obtener nuevamente
teliosporas, de igual forma no se observó este efecto al inocular una sola colonia de
basiodiosporas, confirmando lo que describió Cota en el 2004 con el uso de cepas
sexualmente compatibles.
Las colonias confirmadas de Ustilago maydis crecidas en medio agar extracto de
maíz eran color crema y tomaban una coloración café conforme envejece el cultivo, son
circulares, con bordes enteros, convexas, con superficie lisa, y de aspecto húmedo con
consistencia suave (imagen A, Figura 25), con una morfología microscópica
levaduriforme con cuerpos refringentes como se muestra en la Figura 22 se tiene la
hipótesis que estas colonias son haploides. Las colonias apareadas con su par sexual
compatible presentaban una morfología microscópica con el mismo tipo de levaduras
refringentes pero formadoras de pseudomicelio (imagen B, Figura 26) presentaban una
coloración crema, circulares, con bordes filamentosos, con elevación crateriforme y
superficie rugosa con aspecto seco y consistencia suave (imagen B y C, Figura 25).
Se comprobando que es más eficiente la infección con la fase de basidiospora y es
más fácil obtenerla por un cultivo en medio sólido y/o líquido, en comparación con la
fase de teliosporas que necesitan un método físico-químico, es indispensable aplicar
este método de separación para obtener las teliosporas puras y poder realizar su cultivo
y obtener a las basidiosporas y con ello lograr inóculos eficientes para la infección de
57
Ustilago maydis y producción del huitlacoche. Por lo tanto, la fase de interés para
infectar a las plantas de maíz son las basidiosporas, por lo que se procedió a comparar
medios de cultivo con los cuales se obtendría una mayor cantidad de biomasa de
basidiosporas, primero evaluando que medio de cultivo sólido presentaba mayor
crecimiento de las basidiosporas al inocular 1mL de medio líquido crecido por 24 horas
a placas de agar extracto de maíz y agar de extracto de papa, encontrando que se
obtiene mayor desarrollo en agar extracto de papa al tener un desarrollo de 20 UFC/ml
mientras que en agar extracto de maíz se obtienen 6 UFC/ml como se muestra en la
Figura 28, de igual forma se comparó el medio a base de extracto de maíz y medio a
partir de extracto de papa, cada uno se diluyo en 1:1 y 1:3. determinando en cuál de los
seis diferentes medios líquidos se obtenía el mejor resultado, el cual fue el medios
extracto de maíz diluido 1:1 con 1.28x107 basidiosporas/mL, seguido del medio extracto
de maíz concentrado con 4.22x106 basidiosporas/mL, después el medio extracto de
papa diluido 1:1 con 3.12x106 basidiosporas/mL, luego el medio extracto de papa
diluido 1:3 con 2.2x106 basidiosporas/mL, hasta llegar a los que obtuvieron el menor
desarrollo el extracto de papa concentrado con 1.21x106 basidiosporas/mL y extracto de
maíz diluido 1:3 con 8.4x105 basidiosporas/mL como se muestra en la Figura 29.
Con los datos obtenidos como se menciona anteriormente se prosiguió a generar
biomasa para tener los inóculos y con ellos infectar plantas adultas de maíz en los
jilotes, aplicando inóculo de 6x105, 6x104 y 6x103 basidiosporas/mL, inyectando 1mL
por zona de la mazorca; en la base, en el centro y en el ápice. Después de 24 días se
evaluó la presencia de infección, en donde solo se observó evidencias de la formación
de micelio y algunas teliosporas en la mazorca inoculada con la concentración de 6x105
basidiosporas/mL, mientras que a la concentración de 6X104 y 6x103 basidiosporas/mL
no se logró observar la evidencia de teliosporas, solo un estado de descomposición en
el sitio de inoculación (imagen A, Figura 32).
Los resultados anteriores no fueron tan representativos al no presentase la evidencia
de agallas en la mazorca esto influenciado por factores ambientales que pudieron
afectar el desarrollo de la planta y la calidad del suelo, pero se tenía la evidencia del
crecimiento micelial y producción de teliosporas en la mazorca inoculada, por lo tanto
se procedió a realizar una nueva prueba en plantas de maíz de la misma localidad
usando suelo de compostaje rico en nutrientes, ya que Garibaldi en el 2003 menciona
que los suelos ricos en nitrógeno son propicios para la formación del huitlacoche, por lo
tanto se volvió a generar basidiosporas a partir de las teliosporas obtenidas por el
tratamiento con el gradiente de concentración de NaCl las cuales se habían conservado
en refrigeración, al obtener las colonias de basidiosporas se seleccionaron cuatro
diferentes cepas por sus diferentes características macroscópicas en especial aquellas
que presentaran pseudomicelio, se generó biomasa con estas y un inóculo de 2x106
UFC/mL con las que se inoculó en el jilote de una planta adulta de maíz estadio R1 (11
días después de la salida de los estigmas del jilote), después de cuatro semanas de
58
inoculación se observó la infección típica de Ustilago maydis con la formación de
agallas grisáceas y la presencia de abundaste teliosporas (Figura 35).
59
8. CONCLUSIÓN
60
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63
10. ANEXO
10.1 Materiales
10.1.4 Material
10.1.5 Equipo
65
Agar……………………………..………...……..20g
Agua destilada…………………………...…1000mL
Preparación
Hervir por una hora 200 g de papas cortadas en trozos pequeños
en 1L de agua, filtrar con gasa y agregar sacarosa y agar, ajustando
a 1L, esterilizar a 15 libras por 15 minutos.
Solución salina
Composición
Cloruro de sodio (NaCl)……………..…...…0.85g
Agua destilada………………...………..….100mL
Preparación
El NaCl pesado se afora a 100 mL y se disuelve.
66
Soluciones salinas (diferentes concentraciones porcentuales)
Composición
Cloruro de sodio (NaCl)……………………...….Xg
Agua destilada………………….………...…..10mL
Preparación
X = a la concentración de NaCl dependiendo del porcentaje de la
solución. El NaCl pesado se aforaba a 10mL y se disuelve.
67