Practica Biotecnología –Consumo Preferencial de Azucares

Edison Javier Santacruz Delgado

Viviana Vanessa Pazmiño
Camilo Adrian Chavez
Wilmer Navarrete

Universidad de Nariño
Facultad de ciencias exactas y naturales
Biología
08/06/2018

INTRODUCCION

Saccharomyces cerevisiae, es una levadura que constituye el grupo de microorganismos más

íntimamente asociado al beneficio humano ; su nombre deriva del vocablo Saccharo (azúcar), myces
(hongo) y cerevisiae (cerveza) . Es una levadura heterótrofa, que obtiene la energía a partir de la
glucosa y tiene una elevada capacidad fermentativa . Puede aislarse con facilidad en plantas y tierra,
así como del tracto gastrointestinal y genital humano.
Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos hasta los
aminoácidos. Entre los azúcares que puede utilizar están monosacáridos como la glucosa, fructosa
manosa ,galactosa entre otros. También son capaces de utilizar disacáridos como la maltosa y la
sacarosa y trisacáridos como la rafinosa. Uno de los azúcares que no puede metabolizar es la lactosa,
utilizándose este azúcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces lactis
Saccharomyces cerevisiae, es capaz de sobrevivir siguiendo dos rutas metabólicas: una de ellas es la
fermentación en la que la levadura está fuera de contacto con el oxígeno, obteniendo la energía
necesaria para llevar a cabo sus procesos vitales a partir de metabolizar carbohidratos, produciendo
etanol y CO2, requiere que la glucosa sea catabolizada mediante la glucólisis o ruta de Embden-
Meyerhof, para obtener el piruvato el cual posteriormente por la acción de enzimas específicas, se
convierte anaeróbicamente en etanol y CO2.
METODOLOGIA:

Se prepararon medios de cultivo para 4 grupos de estudiantes. Como organismo modelo se empleó
Saccharomyces cerevisiae del cepario de biología.

Materiales:

 5 pipetas automáticas de 100 a 1000 ul

 5 cajas de puntas azules estériles de 1000 ul
 Cinco paquetes de 2 pipetas de 10 ml estériles
 Cinco pipeteadores para pipetas de 10 ml
 Cinco cámaras Neubauer
 Cinco microscopios
 Una caja de cubreobjetos
 30 tubos eppendorf de 1 ml (pesados sin muestra)
 5 jeringas nuevas de 10 ml
 Celdas para espectrofotómetro
 Espectrofotómetro

Material para ajuste de curvas

 1 tubo de ensayo con 9 ml del medio de cultivo A

 1 tubo de ensayo con 8 ml del medio de cultivo A
 1 tubo de ensayo con 7 ml del medio de cultivo A
 1 tubo de ensayo con 6 ml del medio de cultivo A
 1 tubo de ensayo con 5 ml del medio de cultivo A
 1 tubo de ensayo con 4 ml del medio de cultivo A
 1 tubo de ensayo con 3 ml del medio de cultivo A
 1 tubo de ensayo con 2 ml del medio de cultivo A
 1 tubos de ensayo con 1 ml del medio de cultivo A
 4 tubos vacíos
PROCEDIMIENTO

Medio de cultivo para el preinóculo

Se adiciono 100 ml de caldo A, en matraz de 250 ml.

MEDIOS DE CULTIVOS PARA LOS INÓCULOS

Se adiciono 100 ml de cada uno de los medios de cultivo (A, B, C, D) en matraces de 250 ml.

Preparación del preinóculo

Se Transfirio de forma aséptica tres colonias de Saccharomyces cerevisiae a un matraz con 100 ml
del medio de cultivo A, y se llevo a cultivar en horno durante 48 horas a 30 grados centígrados.

Cálculo de la longitud de onda

En un espectrofotómetro, a diferentes longitudes de onda se determinó la absorbancia del medio

de cultivo respectivo (A.B.C.D.E).

Los tubos con caldo estéril se mantuvieron bajo refrigeración para el proceso de fermentación, ese
medio se utilizó como blanco.

Preparación y ajustes de los inóculos

Se transfirió de forma aséptica 10 ml del medio de preinóculo a matraces con medio de cultivo
correspondiente (A, B, C, D, E), marcados como inóculos y se llevó a cultivar en horno durante 72
horas a 30 grados centígrados. Posterior mente se realizó la lectura de absorbancia del inoculo.

Fermentación

Se Transfirio de forma aséptica 20 ml del inoculo al caldo de fermentación correspondiente, se llevó

a incubar a 30 grados centígrados durante 48 horas. Durante este tiempo se realizaron lecturas de
absorbancia.
Posteriormente se colectó 2 ml de medio de cultivo correspondiente y realizo la lectura de acuerdo
con la tabla 1. Utilizando siempre como blanco medio de cultivo estéril (A, B, C, D, E)

Tiempo en horas absorbancia

0
2, horas
4 horas
8 horas
16 horas
32 horas
48 horas

Correlación entre unidades de absorvancia y el numero de celulas

De acuerdo con la tabla siguiente se distribuyo los ml correspondientes del caldo de inoculación con
Saccharomyces cerevisiae en tubos de ensayo con caldo estéril.

Número del tubo ml de caldo ml de inóculo

estéril
1 9 1
2 8 2
3 7 3
4 6 4
5 5 5
6 4 6
7 3 7
8 2 8
9 1 9

Posterior mente se calculó el valor de dilución para cada tubo, el valor de absorbancia y el número
de células por ml en cámara Neubauer, se realizó una recta de regresión para relacionar
absorbancia con número de células por ml.
.

Conteo de células
Para el conteo de células se realizó con cámara Neubauer utilizando las siguientes ecuaciones:

CUADRO 1

Área = 1mm x 1 mm = 0 1mm2

Volumen = 1 mm2 x 0,1 mm = 1 x 10-4 mm3

Concentración células = (Total de células contadas/ Número de cuadros) x 10000 x fd.

RESULTADOS Y DISCUSION

Para la obtención de la siguientes tablas se realizó una serie de cálculos para obtener balances de
carbono y balance de grados de reducción, a partir de los rendimientos de biomasa-sustrato
(Yx/s),rendimiento CO2/ sustrato,rendimiento producto – sustrato (Yp/s), cabe resaltar que se
partio de 0,2 moles de azucares.

Tabla 1: datos generales del consumo preferencial de azucares de Saccharomyces

Cerevisiae.
X (g/ml) S(mg/l) CO2(g/100ml)
Peso Peso Absorbancia Peso Peso
Reactor N. Tubo vacío (f) (i) Absorbancia (f) (i) (f)
1.1 1,041 1,04
Fructosa 0,434 0,691
1.2 1,031 1,05 FD1, FD2 FD1 242,3 240,88
2.1 1,032 1,04
Sacarosa 0,892 0,764
2.2 1,049 1,05 FD1, FD2 FD1,FD2 255,48 251,33
4.1 1,046 1,05
Glucosa 0,548 0,584
4.2 1,024 1,04 FD1, FD2 FD1 278,37 275,59

Para la tabla 1. Se multiplicaron los factores de dilución para cada absorbancia en la q fueron
necesarios.

Tabla 2:Datos y cálculos de la biomasa (Saccharomyces Cerevisiae) para consumo preferencial de

azucares.

(peso vacío - peso f) (peso vacío - peso final)

Reactor Xo (g/ml) Xo (g/l) Xf (g/ml) Xf(g/l) (Xf-Xo) (g/l) Xtotal/1-c mol
Fructosa 0,004 4 0,019 19 15 0,581395349
Sacarosa 0,004 4 0,001 1 -3 -0,11627907
Glucosa 0,004 4 0,016 16 12 0,465116279
Tabla 3:Sustrato inicial (Azucar).

Reactor Sustrato inicial (So) (Cmol)

Fructosa 1,2
Sacarosa 2,39
Glucosa 1,2

Tabla 4: Datos y cálculos del sustrato final (Azucar).

Absorbancia Reemplazo abs en y X* FD Sustrato final (Sf)

Reactor (f) (X=(y-0,013/0,02)) (mg/l) (g/l) Sf (Cmol)
Fructosa 0,691 33,9 6,78 0,00678 0,000226
Sacarosa 0,764 37,55 0,751 0,000751 2,62955E-05
Glucosa 0,584 28,55 5,71 0,00571 0,000190333

Tabla 5: Datos y cálculos de CO2 en los reactores.

Peso (i) Peso (f)

Reactor (g/100ml) (g/100ml) CO2(i)-CO2(f) CO2 (g/l) CO2 (Cmol)
Fructosa 242,3 240,88 1,42 14,2 0,322727273
Sacarosa 255,48 251,33 4,15 41,5 0,943181818
Glucosa 278,37 275,59 2,78 27,8 0,631818182

Tabla 6: Cálculos de O2 consumido por medio del valor teórico (3,205 mol O2 en 100g)

Reactor S. consumido (Si-Sf) (g/l) O2 consumido

Fructosa 35,99322 1,153582701
Sacarosa 68,399249 2,19219593
Glucosa 35,99429 1,153616995

Fructosa: Teniendo en cuenta el rendimiento - biomasa sustrato, el sustrato con mayor

rendimiento fue el de fructosa con 0,5g= 50%lo que indica que hubo consumo de 50% de fructosa
para producción de biomasa, Seguido por el rendimiento de CO2/sustrato en el cual uso un 27 %
para la formación de CO2 y un rendimiento de producto/sustrato del 12%; en cuanto al balance de
grado de reducción el rp indica que no hubo algún tipo de fermentación alcohólica con un(-11%).

Sacarosa: su rendimiento biomasa- sustrato fue de 11%, lo que se consumio para la producción de
biomasa, el rendimiento de CO2/sustrato en el cual uso un 39 % para la formación de CO2, un
rendimiento de producto/sustrato del 72%; en cuanto al balance de grado de reducción el rp
indica que hubo algún tipo de fermentación alcohólica con un(4,99%).

Maltosa: hubo errores instrumentales que perjudicaron la terminación del ensayo por ende se
descartó.

Glucosa: su rendimiento biomasa- sustrato fue de 38%, lo que se consumio para la producción de
biomasa, el rendimiento de CO2/sustrato en el cual uso un 52 % para la formación de CO2, un
rendimiento de producto/sustrato del 10%; en cuanto al balance de grado de reducción el rp
indica que hubo algún tipo de fermentación alcohólica con un(20.9%).

Por lo anterior y confirmado en resultados de la tabla 4, el sustrato con mayor consumo y de

mejor preferencia fue el de la sacarosa lo que se corrobora con Carolina p; et al que evaluaron la
producción de etanol, el crecimiento celular y el consumo de sustrato de tres cepas de
Saccharomyces cerevisiae y se encontró que la cepa GG570-CIBII es tolerante a alta concentración
de sacarosa, y además, es capaz de producir una concentración mayor de etanol con respecto a la
cepa control en melaza caña azúcar con 250g/L sacarosa.

CONCLUSIONES

 El sustrato preferencial por Saccharomyces Cerevisiae fue la sacarosa .

 Saccharomyces Cerevisiae es capaz de sobrevivir siguiendo dos rutas metabólicas como lo
mencioado en la introducción, una de ellas es la fermentación en la que la levadura está
fuera de contacto con el oxígeno, obteniendo la energía necesaria para llevar a cabo sus
procesos vitales a partir de metabolizar carbohidratos en este caso la sacarosa con resultdos
notorios a diferencia de los otros sustratos,, produciendo etanol y CO2, que se demostró al
calcular los rendimiendos de CO2 –sustrato y balance de grado de reducción.

BIBLIOGRAFIA

 Pérez, H. Evaluación y selección de cepas de levaduras con características probióticas para

uso como aditivo alimentario. Tesis presentada en opción del Título Académico de
Maestro en Ciencias Microbiológicas Mención en Fermentaciones. La Habana. (2007).
 Peña,C. EVALUATION OF ETHANOL PRODUCTION USING RECOMBINANT STRAINS OF
Saccharomyces cerevisiae FROM SUGAR CANE MOLASSES