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EXTRACCION DE ADN POR MEDIO DE SOLVENTES ORGANICOS Y

EXTRACCION DE ADN USANDO UN KIT COMERCIAL


Walter A. Morales Acevedo
Genética básica y microbiana
Departamento de Microbiología
Universidad de Pamplona
2018

El genoma es el portador específico de la información, como evolución y forma de expresión


de los genes que brindan una identidad para cada uno de los seres vivos, por lo tanto se hace
de suma importancia su seguimiento. Experimentalmente en los laboratorios donde se
realizan investigaciones relacionadas con la genómica se precisa tener las herramientas
necesarias para realizar la extracción de ADN de cualquier tipo de muestra. En este caso se
aplicaron dos métodos para la extracción, uno mediante el cual se extrajo de manera
rudimentaria con ayuda de solventes orgánicos a partir de una muestra vegetal como la fresa
y otro por medio de un kit comercial de extracción para muestras animales como hígado,
pulmón y sangre.

METODOLOGIA:
Figura 1. Proceso de extracción de ADN de fresa por medio de solventes orgánicos.
Figura 2. Proceso de extracción de ADN usando el kit comercial PureLink Genomic DNA
MiniKit.

RESULTADOS:
Las muestras de ADN extraídas por medio de los dos métodos, extracción por medio de
solventes (ES) y extracción por medio del kit comercial (EK) expuestos fueron almacenadas
y posteriormente preparadas para un análisis electroforético en gel de agarosa, proceso el
cual se muestra en la figura 3 de los anexos. La corrida electroforética se aplicó para un total
de 20 muestras de ADN depositadas en cada pocillo del gel, distribuidas en origen vegetal
como lo es la fresa y de origen animal en estado líquido como las muestras de sangre y solidas
como las de pulmón, hígado y sangre seca trabajadas por los grupos en el laboratorio.
Imagen 1. Fotografía del gel de agarosa de la electroforesis en el transiluminador UV.

1. Fresa G1 ES 11. Pulmón de res G5 EK


2. Fresa G1 ES 12. Fresa G6 ES
3. Sangre humana G1 EK 13. Fresa G6 ES
4. Fresa G2 ES 14. Sangre de ave G6 EK
5. Marcador de peso molecular 15. Marcador de peso molecular
6. Hígado de pollo G2 EK 16. Fresa G3 ES
7. Fresa G4 ES 17. Marcador de peso molecular
8. Sangre seca G4 EK 18. Fresa G3 ES
9. Fresa G5 ES 19. ADN plasmidico RFP
10. Fresa G5 ES 20. ADN plasmidico GFP
ES: Extracción por solventes.
EK: Extracción por kit.
G: Grupo de laboratorio.

DISCUSIÓN:
En los laboratorios donde se realizan investigaciones relacionadas con la genómica se precisa
tener las herramientas necesarias para realizar la extracción de ADN de cualquier tipo de
muestra. En este caso al disponer de una variedad de muestras, un kit de extracción comercial
y optar por un protocolo rudimentario alternativo como la extracción por medio de solventes
orgánicos en función de crear un paralelo entre estos dos analizando el desempeño del
proceso y los resultados obtenidos con una electroforesis en gel de agarosa y así llegar a un
juicio para cada uno de ellos.
1. Extracción de ADN de fresa como muestra vegetal por medio de solventes orgánicos
como método rudimentario.
Este protocolo en general establece 3 etapas, Homogenización para la obtención de una
solución de ADN, un tratamiento con solventes orgánicos a modo de purificación y una
concentración por precipitado. La extracción fue aplicada a la fresa en un estado maduro que
aporta un tejido vegetal y esta posee enormes genomas constituido por aproximadamente
35.000 genes y hasta ocho copias de cada cromosoma siendo así un genoma octoploide.
Previo al inicio de extracción la muestra debió llevarse a congelación con el fin de anular la
actividad enzimática para evitar la degradación del ADN, y como ventaja para el macerado
de la muestra, en el cual no se recurrió a mayor esfuerzo por el alto estado de madurez de la
fruta, ya que uno de los problemas al trabajar con plantas es la composición de la pared
celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extracción de todo su contenido,
incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por acción mecánica, pulverizando el tejido
con hielo seco. Para la homogenización de la muestra se adicionó una solución de NaCl
0,25M y SDS 1% durante el macerado para prevenir contaminación que afectarían la pureza
del ADN actuando como inhibitorio para la actividad de algunas enzimas como polimerasas,
ligasas y endonucleasas de restricción, adicionalmente el NaCl en altas concentraciones es la
base para la separación por precipitación de los polisacáridos de los ácidos nucleicos por su
solubilidad diferencial. La acción complementaria del SDS (sodio dedecil sulfato) asegura
que las membranas celulares se destruyan debido a que este por ser un detergente aniónico,
desintegra lípidos y proteínas presentes en la pared celular, detiene la actividad enzimática
rompiendo los enlaces covalentes y al ser una molécula pequeña presenta propiedades de
interactuar con las proteínas y de este modo puede desnaturalizar a estas, evitando que se
quede atrapado el ADN en los desechos celulares. (Mosquera, 2005). La adición del zumo
de piña a la solución de ADN se hizo con el fin de reemplazar la Proteinasa K empleada en
protocolos más avanzados al proveer Bromelina, una enzima hidrolasa extraída del tallo o
fruto de la piña, que tiene como función degradar proteínas mediante hidrolisis de enlaces
peptídicos. (González, Rodríguez, Torres, & O'Callaghan, 2011). Al adicionar Isopropanol
frio al ser un alcohol precipita los ácidos nucleicos, interaccionando con las moléculas de
agua libres y con las de ADN al tener mayor afinidad por las de agua se observó una
separación de las moléculas de ADN en forma de floculación dejando en evidencia dos fases
en la solución (Rocha, 2002). Al agitar el tubo falcon que contenía esta solución se formó el
particular ovillo siendo posteriormente retirado con un capilar y depositado en un microtubo,
este proceso de formación del ovillo se obtuvo una vez más, cabe resaltar que la coloración
del ovillo fue translucido mientras que el precipitado se tornó rojizo indicando que aparte de
las proteínas también se precipitó otras moléculas que le conferían la pigmentación al fruto.

La purificación del ADN dada con la aplicación de los solventes orgánicos con el fin de
separar materiales contaminantes como proteínas y ARN como adición de Fenol saturado,
Fenol-Cloroformo-isoamilico y Cloroformo-isoamilico proceso que desnaturaliza y precipita
proteínas, la precipitación es acelerada por medio de la microcentrifugacion depositándose
en la fase acuosa (fase superior) el ADN y quedando en la fase inferior las proteínas y
polisacáridos. En esta parte del proceso se tuvo en cuenta las repeticiones de la aplicación
del purificado por cada uno de los solventes y la pérdida de fase acuosa a la hora de
recuperarla, puesto que al estar en contacto con las proteínas pero en distinta fase se hizo
difícil tratar de recuperarla en su totalidad obteniendo un 78% de recuperación.
Teniendo el ADN libre de cualquier molécula acompañante se efectuó el precipitado por
medio de la adición de Acetato de sodio 3M y Etanol absoluto frio, que precipitan y
desnaturalizan proteínas. En este punto se tuvo que recurrir a otro microtubo para dividir la
solución en estos ya que el volumen de los solventes excedía la capacidad de estos mismos.
Mediante centrifugación y eliminación del sobrenadante dejando el “pellet” en el fondo se
realizó un lavado con Etanol 70% en centrifugación para finalmente almacenar la muestra de
ADN en buffer TE.

Todos los pasos anteriormente mencionados se basan en las características fisicoquímicas


del ADN. Además de ser una molécula de alto peso molecular, muy larga y delicada, es un
ácido capaz de formar sales con iones cargados positivamente (cationes). También, es soluble
en soluciones concentradas de sales, pero insoluble en alcoholes como etanol o isopropanol.
Adicionalmente, el ADN es destruido (depurinado) a pH ácido (menor de 4,0), es insoluble
a pH 5.6, pero es soluble a pH 8,0. Por lo tanto, los procesos de extracción, purificación y
almacenamiento del ADN deben mantener el pH óptimo y brindar una alta concentración
iónica (Rocha, 2002).

Teniendo en cuenta la imagen 1 que expone los resultados electroforéticos, expresa en ella
para las muestras de fresa extraídas y analizadas por los diferentes grupos de laboratorio,

correspondiendo a los pocillos 1, 2, 4, 7, 9, 10, 12, 13, 16 y 18

2. Extracción de ADN de muestras animales usando el kit comercial PureLink Genomic


DNA MiniKit.
Imagen 2.

Tabla 1.
Tamaño Log Distancia
(Kpb) (Kpb) (cm)
10 1 0.3
6 0.77 0.7
3 0.47 1.5
1.5 0.17 2.4
1 0 3

Figura 3.
3.5

3
y = -2.7248x + 2.8933
R² = 0.99
2.5
Distancia (cm)

1.5

0.5

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Log (Kpb)

Imagen 3.

CONCLUSIONES:
Con herramientas como estos kits de extracción de ADN, la genómica ha evolucionado
mucho en las últimas décadas y promete continuar en constante evolución. Se ha
revolucionado la forma en que se estudian las secuencias de ADN, que en el pasado era un
proceso complejo y lineal, muentras que en la actualidad se pueden estudiar de manera
paralela las muestras que contienen mezclas de ADN de diferentes tipos. Los kits de
extracción de ADN permiten medir la expresión genética como nunca antes se había logrado,
sin importar el tamaño de la muestra, por lo que se pueden diseñar experimentos más valiosos
para lograr avanzar en una parte tan importante del conocimiento de los sistemas biológicos
como es la expresión de los genes.

BIBLIOGRAFIA:

ANEXOS:

Figura 3. Proceso de corrida electroforética en gel de agarosa.


Adicion de solucion Adicion de
NaCl-SDS a la Isopropanol a una
1. Obtencion de Preparacion de
muestra de fresa porcion del filtrrado
solucion de ADN: solucion de NaCl
macerada y adicion en un tubo Falcon
HOMOGENIZACION 0,25M y SDS 1%.
previa de zumo de con formacion de
naranja y filtrado. precipitado.

Recoleccion del ovillo


Adicion de Fenol
con ayuda de un
Homogenizado y 2. Tratamiento con saturado y
capilar depositandolo
almacenamiento a - Solventes organicos: centrifugacion 13.000
en un microtubo
20ºC por 7 dias. PURIFICACION. rpm con extraccion
adicionando solucion
de fase acuosa.
de buffer TE.

Adicion de Fenol-
Cloroformo- Adicion de
Isoamilico (25:24:1) Cloroformo- Adicion de Acetato
3. Concentracion por
con centrifugacion Isoamilico (24:1) con de Sodio 3M a pH 5,2
PRECIPITACION.
13.000 rpm con centrifugacion 13.000 y Etanol absoluto frio.
extraccion de fase rpm.
acuosa.

Centrifugacion
Lavado del ADN con Eliminacion del
13.000 rpm
Etanol 70% con Etanol y adicion de
eliminando el
agitacion vortex y Buffer TE para
sobrenadante
centrifugacion 13.000 almacenamiento
obteniendo el pellet
rpm. final.
de ADN.

Extracción de ADN por medio de un Kit comercial (PureLink Genomic DNA MiniKit)
Pesado de 25mg de
muestra de Pulmón
Incubacion por 1 Centrifugacion del
1. PREPAACION DE con adicion de
hora a 55ºC con lisado 13.000 rpm y
LISADO Buffer de digestion
vortex ocacional. adicion de RNAsa.
y Proteiasa K
aplicando vortex.

Adicion de Buffer
Adicion del lisado Centrifugacion
lisis/union y
con solucion buffer 13.000 rpm y
mezclado con 2. PURIFICACION y
lisis/union y Etanol cambio de tubo de
vortex y Etanol union al ADN
a una colmna recogida de la
absoluto con
PureLink. columna.
agitacion.

Adicion de Buffer Cambio de tubo de Centrifugacion


de lavado 1 recogida y adicion 13.000 rpm y
3. LAVADO de ADN preparado con de Buffer de lavado transferencia de la
Etanol con 2 preparado con columna a un
centrifugacion. Etanol. nuevo microtubo.

Adicion de Buffer Retiro y desecho de


Adicion de Buffer
de elucion para columna PureLink y
4. ELUCION de de elucion PureLink
una segunda rotulado del
ADN a la columna con
elucion con microtubo con ADN
centrifugacion.
centrifugacion. purificado.

Almacenamiento
final a -20ºC.
Se adicionó la
solucion de agarosa
1. PREPARACION con un previo
2. PREPARACION Adicion 5µl del
DE SOLUCION calentamiento en
GEL DE AGAROSA colorante Safe View
BUFFER TBE funcion de
previo al proceso de
45ml de gel de homogenizar al
450ml de buffer solidificacion del
agarosa al 0,85%. molde del gel con
TBE 1x. gel.
los peines de
formacion de
posillos.

Incubacion de la
Se preparó 30 µl de
solucion de carga a
3. PREPARACION solucion de carga 2x 4. PREPARACION
55ºC por 5 min. con
SOLUCION DE (10µl de buffer de DEL CORRIDO
posterior choque
CARGA carga y 20µl de ELECTROFORETICO
termico en hielo
muestra de ADN).
por 3 min.

Adicion del gel de Cerrado de la


Carga de las
agarosa a la cubeta cubeta y conexion a
muestras de ADN y
de electroforesis y la fuente de energia 5. REVELADO DEL
marcadores de peso
llenado con buffer con un voltaje de 90 GEL
molecular en cada
TBE hasta sumergir voltios para la
uno de los posillos.
el gel. corrida por 30 min.

Se retiró el gel de la
cubeta y se llevó a
un transiluminador
UV para su
observacion.