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Estudio del poder discriminante en el análisis de fármacos de abuso de

carácter ácido o neutro por cromatografía en capa fina, previa purificación con
minicolumnas de Sep-pak C 18

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Jesús Simal-Lozano
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 cromatografía

Estudio del poder discriminante en el

análisis de fármacos de abuso de
carácter ácido y neutro en plasma por
cromatografía en capa fina, previa
purificación con minicolumnas
SEP PAKC18
(
Cepeda, A., Paseiro, P. y Simal, J. j

Se describe un método de análisis de fármacos de abuso de carácter ácido y neutro en plasma basado
en la purificación de las muestras con las minicolumnas de fase reversa Sep Pak C18. El residuo es
analizado por TLC empleando dos sistemas cromatográficos, seleccionados entre once sistemas
estudiados mediante la aplicación del poder discriminante. Asimismo, se ha intentado la identificación
mediante un sistema de representación cartesiana para los valores de Rf. 1DO de cada componente en
los sistemas escogidos, apoyado con la visualización al UV y reactivos reveladores (Mn04 K ácido, Van
Urk y Hg-DPC).
A method of analysis of drugs of abuse of acidid and neutral character in plasma based in the
purification of the ~amples with the cartidges Sep Pack C18 the phase reverse.
The residue is analysed by TLC employing two chromatographic systems selected amoung eleven
systems, studied by means the application of the discrimining power. Also, identification by means of
a system of the cartesian representation for the Rf. 1DO values of each component in the chosen system
hasving tried, helped by the visualization and the various sequences of spray reagents (Mn04 k
acidified, Van Urk y Hg-DPC).

e
Palabras claves: TLC, fármacos de abuso, Barbitú- Key Words: TLC, drugs abuse, Barbiturates, Allo- S
ricos, Amobarbital, Aprobarbital, Barbital, Buta- barbitone, A/lylbarbitone, Amylobarbitone, Apro- e
barbital, Butalbital, Pentobarbital, Secobarbital, barbitone, Pentobarbitone, Phenobarbitone, Qui- ~
Fenobarbital, Acido Salicílico, Paracetamol, Primi- nalbarbitone, Secbutobarbitone, Salycilic Acid, h
dona, Fenitoína, Cafeína, Teofilina, Meprobamato, Paracetamol, Caffeine, Theophyl/ine, Phenytoin, u
poder discriminante. Primidone and Meprobamate, discrimining power. ti
e
e
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología. n
Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago. r

106 técnicas de LABORATORIO- n. 0 148

 cromatografía

Introducción
La detección y separación de fármacos de abuso
en plasma y otros materiales biológicos han sido estu-
diados por TLC desarrollándose numerosas técnicas
de "screening" para solucionar este problema, siendo to

un factor importante el proceso de extracción y purifi-

cación de la muestra. En este sentido se ha utilizado ..
la extracción líquido-líquido (White y Graves, 1974;
Burke y Thénot, 1985; Widopp, 1986); sin embargo, el
desarrollo de materiales con un fundamento cromato-
gráfico que permiten la purificación de la muestra ha
."'
:,.
hecho que se aconsejen como alternativas ventajo-
sas, así se han empleado en el análisis general toxico- !.
lógico las resinas XAD-2 (Mulé et al., 1971; lbrahim et
al. 1975) tanto en columna como encapsuladas, las
columnas Extrelut (Breiter et al., 1976; Werner et al.,
1979) y últimamente las minicolumnas de fase reversa
C18 (AIIan et al, 1980) señalándose, entre otras venta- 10

jas, los eJevados porcentajes de recuperación así

como su economía en el tiempo de análisis. 10 20 JO .-o so 60 10 10 tO aoo
Una vez purificada la muestra para la realización de .._.
un "screening" del residuo obtenido por TLC, se han

Figura 1. Representación cartesiana de los valores de Rf.

100 con un factor de error de O, 10 (zona sombreada) para
el par de sistemas 8 y 11.
TABLA 1
Valores de los niveles tóxicos en plasma
para los fármacos estudiados (Sien y
colabs., 1972; Stead y Moffat, 1983). Materiales y método

Material y aparatos
COMPONENTES ¡..¡.g/mi
- Minicolumnas de fase reversa Sep Pak C18. Waters
Barbitúricos 40 art. 51910.
Cafeína 15 - Jeringa de vidrio de capacidad 5 mi. y aguja acopla-
Fenitoina 20 da.
Meprobamato 50 - Centrífuga que alcance hasta 4.000 rpm.
Paracetamol 250 - Tubos de centrífuga graduados de 5 mi.
Primidona 25 - Indicadores de pH universal. Merck art. 9535.
Salicylico, Acido 225 - Cámaras cromatográficas de vidrio de 17. 11. 24
Teofilina 20 cm.
- Cromatofolios de Silica Gel GF254 (20.20.0 0,020
cm).
- Microjeringa Hamilton de capacidad 1O ¡..¡.1 y aguja
acoplada.
- Estación de datos Perkin-Eimer mod. 3600 usada
desarrollado y estudiado numerosos líquidos de de- para el cálculo del poder discriminante.
sarrollo atendiendo a las característic~s de los fárma- - Pulverizadores con pera de Richardeson.
cos a separar, sin embargo cuando se trata de un gru-
po particular como es el caso de los Barbitúricos se Reactivos
hace muy difícil separar una mezcla de los mismos
usando un sólo sistema cromatográfico. En este sen- Todos los reactivos utilizados son de grado analíti-
tido Owen et al., 1974 y Stead et al. 1982 utilizan el po- co y todos los fármacos empleados cumplen las nor-
der discriminante para seleccionar aquellos sistemas mas USP XIX/BP.
que tanto individualmente como en combinación per- Acido Salicílico (Analar); Amobarbital, Aprobarbital,
miten obtener una mejor separación de los compo- Butabarbital, Butalbital, Dial, Fenobarbital, Pentobar-
nentes de interés. bital, Paracetamol y Secobarbital (Barcia); Cafeína

técnicas de LABORATORIO- n.• 148 107

 cromatografía

11. Dioxano: Cloroformo: Acetona: Amoníaco

(47,5:45:5:2,5) (Speaker, 1974).
TABLA 11
Visualización a la luz UV254 y reactivos - Reactivos reveladores:
reveladores para los componentes estudiados. 1. Hidróxido amónico concentrado. (Ciarke, 1969).
2. Cloruro de mercurio-Difenilcarbazona en etanol
(Hg-DPC). (Massoud, 1976).
3. P-dimetilaminobenzaldehído al 1 % en etanol: áci-
COMPONENTES UV254 VanUrk Mn04K Hg-DPC do clorhídrico (Reactivo de Van UrK). (López-Riva-
1 Barbttal + + dulla y colabs., 1981 ).
2 Aprobarbttal + + + 4. Permanganato potásico acidificado. (Owen y co-
3 Amobarbttal + + labs., 1978).
4 Butabarbital + +
5 Butalbttal + + + Método
6 Pentobarbital + +
7 Secobarbttal + + + 1. Acondicionamiento de las cámaras cromatográfi-
8 Fenobarbttal + + cas.
9 Dial + + + Se saturan con los respectivos líquidos de desarro-
10 Cafeína + (fugaz)+ llo por agitación. Se espera como mínimo 1 hora antes
11 Teofilina + (ocre)+ de realizar el desarrollo cromatográfico.
12 Acido salicíiico (púrpura)+ (blanco)+ +
13 Paracetamol + (blanco)+ + 2. Activación de los cromatofolios.
Se han activado a 120° C durante 30 min. enfrián-
14 Fenitoína + + dose posteriormente en desecador a temperatura
15 Meprobamato +
16 Primidona (debil) (ocre)+ ambiente.

3. Activación de las minicolumnas Sep Pak C18.

(Merck); Teofilina (Serva); Fenitoína, Primidona y Me-
probamato (lci-Farma).
- Soluciones standard para cada fármaco en etanol.
Se preparan de manera que 1O¡..ti contengan el nivel
tóxico plasmático correspondiente (Tabla-1). Se
aplican 5 ¡..ti por cromatofolio.
- metano!.
- etanol.
- ácido clorhídrico 1N.
- Plasma humano fresco de donante único. Se des-
congela a la temperatura ambiente de laboratorio.
- Líquidos de desarrollo:
1. Cloroformo: Acetona (9: 1) (Stonner y Connie,
1974).
2. Cloroformo: Eter etílico: Metanol: Amoníaco
75:25:5:1) (Massoud, 1976).
3. Acetato de etilo: M etanol: Amoníaco (1 00:18:1,5)
(Vinson y colabs, 1977).
4. Acetato de etilo: n-Hexano: Amoníaco (20:9:10)
(Ahmed y colabs., 1968).
5. Acetato de etilo (Owen y colabs., 1978).
6. Cloroformo: Acetona (4: 1) (Breiter, 1978).
7. Acetato de etilo: Metano!: Amoniaco (80:10:5)
(Biass y colabs., 1974).
8. Cloroformo: lsopropanol: Amoniaco (45:45:10)
(Owen y colabs., 1978).
9. Etanol: Dioxano: Benceno: Amoníaco (5:40:50:5)
(Mulé, 1971).
1o. Acetato de etilo: Diclorometano: Amoniaco
(90:1 0:0,9).
108
Se pasan a través de la minicolumna 5 mi. de meta-
no! seguidos de 1O mi. de agua acidulada con HC1 1 N
apH 3.
4. Modo de operar.
2,5 mi de plasma se diluyen hasta 5 mi con agua y
se acidula con HC1 hasta pH 3. Se centrifuga a 4,000
rpm durante 5 min. El sobrenadante y posteriormente
las aguas procedentes de lavar el precipitado (5 mi
ajustado a pH 3) se hacen pasar a través de una mini-
columna Sep Pak C18 activada. Se elimina de la mini-
columna el agua contenida en su volumen muerto me-
diante una pequeña succión a vacío y se eluye con 2
mi de etanol. Se evapora a sequedad en Baño María
y el residuo obtenido se redisuelve en 25 ¡..ti en el cro-
matofolio.
5. Visualización de los cromatofolios.
Se ha realizado a la luz UV a 254 nm. Para el caso
del Meprobamato se ha puesto de manifiesto con el
reactivo de Van Urk.
6. Elección de los sistemas cromatográficos.
Se han realizado tres ensayos para cada sistema
cromatográfico y obtenidos los valores de Rf. 1OO.
Con estos datos se calcula el poder discriminante
para cada sistema individualmente y combinaciones
de dos y tres sistemas. Para ello, en nuestro caso he-
mos desarrollado un programa en lenguaje Basic to-
mando como base el descrito por Moffat y Smalldon
(197 4), mejorado y adaptado por nosotros para poder
obtener directamente los valores del poder discrimi·
nante. Se utiliza un factor de error de 0,1 O (Anexo 1).
técnicas de LABORATORIO- n. 0 148
 cromatografía
S,STEMA n° Z SISTEHA n° 8
so
10
20
i9
5: o 3 o 5
60
Figura 2. Muestra de plasma sobrecargada con: 1) Secobarbital, 2) Butabarbital, 3) Fenobarbital, 4) Fenitoina, 5) Cafeína,
6) Paracetamol a sus niveles tóxicos correspondientes, y desarrollada.en los sistemas 2, 8, 9 y 11.
Resultados
La Tabla 2 presenta las respuestas de los compo-
nentes a la luz UV254 y reactivos reveladores. El Acido
Salicílico a la luz UV254 color púrpura. Al objeto de
aumentar la sensibilidad de los Barbitúricos a la luz
UV254 se han expuesto a vapores de Hidróxido amó-
nico. El Meprobamato se visualiza con el reactivo de
Van Urk.
La Tabla 3 recoge los valores de Rf. 100 encontra-
dos para cada componente en los 11 sistemas estu-
diados correspondientes a tres experiencias realiza-
das.
En la Tabla 4 se recogen, de entre los sistemas es-
tudiados, aquéllos que presentan los valores más al-
tos del poder discriminante, tanto individualmente
como en combinaciones de dos y tres sistemas, así
como sus valores medios de los ensayos realizados.
La Figura 1 es una representación cartesiana de los
valores medios de Rf. 100, con un factor de error de
0,10, de una de las combinaciones binarias escogi-
das, en este caso, para los sistemas 8 y 11. Represen-
ta una tentativa de identificación de los componentes
estudiados; así, en el caso teórico de que todos los
componentes estén presentes en la muestra queda-
rían perfectamente caracterizados las Primidona, Pa-
racetamol, Acido Salicílico y Teofilina. En el caso de
los Barbitúricos, sólo algunos de ellos serían de difícil
identificación (2, 3, 5, 6, 7) en el caso de muestras en
técnicas de LABORATORIO- n.o 148
SISTEMA n° 9 SISTEMA n° 11
1.2
3
4 D 1,2
3.4
[J
o
o S o
6
6 o
que se encuentren individualmente.
Las Figuras 2 y 3 representan algunos ejemplos de
separaciones cromatográficas desarrolladas en los
sistemas 2, 8, 9, 11 de muestras de plasma sobrecar-
gadas con diferentes fármacos a sus niveles tóxicos
plasmáticos. La Figura 2 recoge la separación llevada
a cabo a partir de una muestra de plasma sobrecarga-
da con Amobarbital, Aprobarbital, Dial, Acido Salicíli-
co y Teofilina. La Figura 3 recoge el mismo hecho para
una muestra sobrecargada con Butabarbital, Cafeína,
Fenitoína, Fenobaarbital, Paracetamol y Secobarbital.
En el primer caso se produce una separación comple-
ta de los componentes en el sistema 8 por lo que es
obvio que las combinaciones entre cualquier sistema
con el sistema 8 producen una separación completa
de los mismos. En el segundo caso los pares Feno-
barbitai-Fenitoína y Fenitoína-Cafeína aparecen con
el mismo Rf. 100 quedan resueltos en el sistema 8.
Los pares que en el sistema 8 no quedan resueltos lo
hacen en cualquiera de los otros sistemas estudiados,
por lo tanto, cualquier combinación binaria o ternaria
con el sistema 8 permite resolver dicha mezcla.
Discusión
Es importante destacar que la purificación de las
muestras de plasma conseguida con las minicolum-
nas Sep Pak C18 es muy satisfactoria como lo de-
109
 cromatografía

Tabla 111
Valores de Rf. 100 obtenidos en las tres experiencias realizadas.

SISTEMA DE DESARROLLO
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

APROBARBITAL 24 43,5 58 9 59,5 38 58,5 61 55,5 56 64

AMOBARBITAL 27 44 59 13 57 41,5 61 62 59 47,6 67,5
BUTABARBITAL 23 44,5 57 15 56,5 38,5 59 64 59 47,5 62
BUTALBITAL 26,5 48 59 8 58,5 42 59 62 59 57,5 69
PENTOBARBITAL 26 46 59,5 13 58 42 62 67 61 58,5 67
SECOBARBITAL 29 49 62,5 13 60 45 63,5 68,5 62 60,5 59
FENOBARBITAL 18 37 61 3 55 33 47 46 40 50 54
DIAL 23 43 63,5 6 57 37 59 54 50 55,7 63
CAFEINA 13 20,5 30 32 9 16 36 74 43 9,5 44
TEOFILINA 4,5 10 21 7 6 12,5 44 8 5,5 12
SALICILICO 11 7 16 2 21 10,5 10 33,5 2 4 3,5
PARACETAMOL 4 10 45 12 29 11 43 66 25 25 29,5
FENITOINA 12,5 30 57 8 53 29 56 71,5 43,5 49,5 54
MEPROBAMATO 5 9 52 25 35 9 54,5 71,5 42,5 32 45
PRIMIDONA 2 8 37 6 48 5,5 61 82,5 22 13,5 21

APROBARBITAL 27 36 62 11 58,5 40 60 61,5 62 50 64

AMOBARBITAL 31 40 62 10 60 42 63 72 62,5 53 66
BUTABARBITAL 27,5 36,5 61 8 58,5 37 62 71,5 62,5 51 58
BUTALBITAL 32 40 61 6 60 42,5 62 68 64,5 53 69
PENTOBAR81TAI 30 1! 82 9,5 60 42 63,5 76,5 65 54 66
SECOBARBITAL 34 44 63 10 61,5 45 65 72 66 55 67
FENOBARBITAL 22 - 25,5 57 2,5 57,5 33 52 76 49 39,5 58
DIAL 26,5 34 61 4 60 39 58,5 63 57 47 64
CAFEINA 13 33 35 ' 23 9 16 33 78 43 42 42
TEOFILINA 4 11 16 1 7 6,5 13 42,5 9 3 14,5
SALICILICO 8 2 19 2 22 12 11 25 2 4 2,5
PARACETAMOL 5 12 48 7 29 11 44 69 26,5 20 31
FENITOINA 14,5 26 58 5 53 25 57 74 44,5 41 55
MEPROBAMATO S 15,5 51,5 16 35 10 54 74 49,5 33 45,5
PRIMIDONA 2 11 42,5 5 49 5,5 58 87 23 12 14

APROBARBITAL 25 41,5 60 6 58,5 40,5 64,5 69 63,5 57 67

AMOBARBITAL 28,5 46,5 61 14 60 43 66 73,5 64 60 67,5
BUTABARBITAL 25 42,5 59 12 59 40,5 65 72 65 60 56
BUTALBITAL 30 45 61 8,5 60 44 65 73 66 61 70,5
PENTOBARBITAL 28 45 61,5 14 61 43,5 66 77 67 53 68,5
SECOBARBITAL 31,5 48 61 13 61,5 46,5 68 76 67 58 70
FENOBARBITAL 20 31 59 3 57,5 35 53 52 53 58 62
DIAL 24 39 59 6 61 40,5 60 65 60 61 67
CAFEINA 11,5 30 24 45 9,5 16 34,5 77 41 10 42,5
TEOFILINA 3,5 10 20 1 7 7 11 41,5 11 5,5 17
SAUCIUCO 8,5 1 16 22 17 10 25 2 4 3
PARACETAMOL 3,5 12 43 13 30 12 44 70 27,5 26 33
FENITOINA 14,5 27,5 60 7 55 26 57 75 45,5 51 58
MEPROBAMATO 6 13,5 51 28 35,5 10 55 75 52,5 32,5 47
PRIMIDONA 2,5 7 42 9 10 6 50,5 93 27 11,5 19

11 o técnicas de LABORATORIO- n.o 148

 cromatografía

SISTEMA no 8 SISTEMA no 9 SISTEMA n° 11

SISTEHA n"2.

1
~
1.2.3
o
1 o 2.3

1 Q 2 o
1.3 o 3 o
4 o 4 o
4
5
o
o
5 o 4
5 [) 5 o
J.l/lluUtnf de plasma sobrecargada con: 1) Amobarbit_al, 2) Aprobarbital, 3) Dial, 4) Teofilina, 5) Acido Salicílico a
...... t6.dcos correspondientes, y desarrollada en los Sistemas 2, 8, 9 Y 11.

Tabla IV
Valores del poder discriminante para los
sistemas elegidos tanto individualmente como
en combinaciones de dos y de tres,
así como, sus valores medios.

SISTEMAS N.0 1 N. 0 2 N. 0 3 X

9 0,69 0,67 0,68 0,680

11 0,61 0,65 0,67 0,643
10 0,62 0,63 0,57 0,606
2 0,62 0,59 0,57 0,593
2.8 0,78 0,82 0,80 0,783
8.9 0,78 0,77 0,79 0,780
8.11 0,75 0,78 0,81 0,780
8.10 0,78 0,78 0,75 0,770
6.8 0,76 0,70 0,78 0,767
2.8.11 0,78 0,84 0,87 0,839
8.10.11 0,82 0,87 0,82 0,823
8.9.10 0,84 0,82 0,79 0,823

en la representación cartesiana de la misma.

Es importante señalar en la localización de,los com-
ponentes el orden de revelado ya que en vanos ensa-

-n. 0 148
 cromatografía
yos realizados se ha podido comprobar que la combi-
nación de los reveladores permanganato potásico
acidificado y el reactivo de Van Urk no es muy reco-
mendable por lo que aconsejamos utilizar primero el
reactivo de Van Urk en la zona probable de aparición
del Meprobamato. Los reactivos Hg-DPC y perman-
ganato potásico acidificado son perfectamente com-
patibles al igual que entre los reveladores Hg-DPC y
Van Urk.
Agradecimientos
Nuestro agradecimiento al Banco de Sangre del
Hospital General de Galicia por habernos falicitado
desinteresadamente el plasma humano para la reali-
zación de este trabajo. Asimismo, a la firma comercial
Sandoz por facilitarnos de forma gratuita el fármaco
Butalbital.
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9. López-Rivadulla, M.L.; Fernández, P.; Carracedo, A., y
ANEXO 1. Programas en lenguaje Basic para la entrada de datos y cálculo directo del
poder discriminante.
10 FOR I = 1 To 24: PRINT: NEXT I
20 PRINT STRING$(80,42): PRINT
30 PRINT " CALCULO DEL PODER DISCR
IMINANTE PARA COMBINACIONES "
40 PRINT " DE 1, 2 y 3 SISTEMAS CR
OMATOGRAFICOS "
50 PRINT: PRINT STRING$(80,42): PRINT:PRINT
R (K) THEN 440 ELSE 460.
440 NEXT K
450 A=A+1
460 NEXT J
470 NEXT I
480 B=N
490 B=B* (B -1)/2
500 DP =1 -A/B: LET DP= INT (DP * 100+0,5)/100
510 PRINT TAB(45); "PODER DISCRIM. = "; DP: PRINT
PODER DISCRIM.=";DP
técnicas de LABORATORIO- n. 0 148
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técnicas de LABORATORIO- n. 0 148
#6, TAB(26);
 cromatografía

60 CLEAR 1000
70 LINPUT " NOMBRE DEL FICHERO A LEER:"; NOM1$
80 LINPUT " NOMBRE DEL FICHERO A GRABAR:";NOM2$
90 FOR I = 1 TO 24: PRINT: NEXT I
100 OPEN "I", #1,NOM1$:0PEN "0", #2, NOM2$:0PEN "O"
,#6, "AUXW:":PRINT #6,CHR$ (17);
110 LET N2=16:LET N1=11
120 DIM DAT (N2,N1), IERR (N1) , IPONT (N1), A$ (N2)
130 FOR I=1 TO N2
140 INPUT #1,A$(I)
150 FOR J=1 TO N1
160 INPUT #1, DAT (I, J)
170 NEXT J
180 NEXT I
190 CLOSE #1
200 FOR I=1 TO 24: PRINT: NEXT I
210 PRINT "FICHERO DE DATOS:"; NOM1$:PRINT #6, "FICHERO DE DATOS:"; NOM1$:
PRINT #6
220 LET N=N2:LET ISYST=N1
230 FOR R=1 TO 3
240 LET IORD=R
250 IF R=1 THEN FOR T=1 TO ll:GOTO 280
260 IF R=2 THEN FOR Q=1 TO 55:GOTO 280
270 IF R=3 THEN FOR D=1 TO 165:GOTO 280
280 REM **** " INTRODUCIR LOS SISTEMAS REQUERIDOS: " *****
290 PRINT "SISTEMAS COMBINADOS:": PRINT #6, "SIST. COMB.";
300 FOR I=1 TO IORD
310 READ IPONT (I)
320 PRINT TAB (20 + I*5) ; IPONT (I);: PRINT #6, TAB (8+I*4);
IPONT ( I);
330 PRINT #2, "S , C. " ; IPONT ( I) ;
340 NEXT I
350 REM ***** "INTRODUCIR LOS FACTORES DE ERROR PARA SER USADOS EN EL
MISMO ORDEN" ******
360 FOR I=1 TO IORD
370 LET IERR (I) 10
380 NEXT I
390 A=O
400 FOR I=1 TO N-1
410 FOR J=I + 1 TO N
420 FOR K=1 TO IORD
430 IF ABS (DAT (I, IPONT(K))-DAT(J, IPONT(K))) < IER
R (K) THEN 440 ELSE 460.
440 NEXT K
450 A=A+1
460 NEXT J
470 NEXT I
480 B=N
490 B=B* (B -1)/2
500 DP =1 -A/B: LET DP= INT (DP * 100+0,5)/100
510 PRINT TAB(45); "PODER DISCRIM. = "; DP: PRINT #6, TAB(26)¡
PODER DISCRIM.=" ;DP

técnicas de LABORATORIO- n. 0 148

--··~--
 A los siguientes puntos prestan
atención los TLER FP81 y FP
automáticos con especial
precisión y reproducibilidad:
puntos de fusión, de ebullición
y de goteo.

German Weber, S.A.; Hermosilla, 102; 28009 MADRID

Tel. (911275 58 99; Tx. 45260 GEWE-E; Fax (91) 402 76 25 M
6685.75.A

cromatografía

520 PRINT #2, "DP"; DP

530 ON R GOTO 580, 560, 540
540 NEXT D
550 GOTO 600
560 NEXT Q
570 GOTO 600
580 NEXT T
590 GOTO 600
600 NEXT R
610 GLOSE #2: GLOSE #6
620 DATA 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,1,2,1,3,1,4,1,5,1,6,1,7,1,8,1,9,1,10,1,11,2,3,
2,4,2,5,2,6,2,7,2,8,2,9,2,10,2,11,3,4,3,5,3,6,3,7,3,8,3,9,3,10,3,11,4,5,4,
6,4,7,4,8,4,9,4,10,4,11,5,6,5,7,5,8,5,9,5,10,5,11
630 DATA 6,7,6,8,6,9,6,10,6,11,7,8,7,9,7,10,7,11,8,9,8,10,8,11,9,10,9,11,10,11
640 DATA 1,2,3,1,2,4,1,2,5,1,2,6,1,2,7,1,2,8,1,2,9,1,2,10,1,2,11,1,3,4,1,3,5,
1,4,6,1,4,7,1,4,8,1,4,9,1,4,10, 1,4,11,1,5,6,1,5,7,1,5,8,1,5,9,1,5,10,
1,5,11,1,6,7,1,6,8,1,6,9,1,6,10,1,6,11,1,7,8,1,7,9,1,7,10,1,7,11
650 DATA 1,8,9,1,8,10,1,8,11,1,9,10,1,9,11,1,10,11,2,3,4,2,3,5,2,3,6,2,3,7,
2,3,8,2,3,9,2,3,10,2,3,11,2,4,5,2,4,6,2,4,7,2,4,8,2,4,9,2,4,10,2,4,11,
2,5,6,2,5,7,2,5,8,2,5,9,2,5,10,2,5,11,2,6,7,2,6,8,2,6,9,2,6,10,2,6,11,
2,7,8,2,7,9,2,7,10,2,7,11,2,8,9,2,8,10
660 DATA 2,8,11,2,9,10,2,9,11,2,10,11,3,4,5,3,4,6,3,4,7,3,4,8,3,4,9,3,4,10,
3,4,11,3,5,6,3,5,7,3,5,8,3,5,9,3,5,10,3,5,11,3,6,7,3,6,8,3,6,9,2,4,11,
2,5,6,2,5,7,2,5,8,2,5,9,2,5,10,2,5,11,2,6,7,2,6,8,2,6,9,2,6,10,2,6,11,
2,7,8,2,7,9,2,7,10,2,7,11,2,8,9,2,8,10
670 DATA 4,5,6,4,5,7,4,5,8,4,5,8,4,5,9,4,5,10,4,5,11,4,6,7,4,6,8,4,6,9,4,6,10,
4,6,11,4,7,8,4,7,9,4,7,10,4,7,11,4,8,9,4,8,10,4,8,11,4,9,10,4,9,11,4,10,11,
5,6,7,5,6,8,5,6,9,5,8,10,5,8,11,5,9,10,5,9,11,5,10,11,6,7,8
680 DATA 6,7,9,6,7,10,6,7,11,6,8,9,6,8,10,6,8,11,6,9,10,6,9,11,6,10,11,7,8,9,
7,8,10,7,8,11,7,9,10,7,9,11,7,10,11,8,9,10,8,9,11,8,10,11,9,10,11
690 END

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