Organogénesis indirecta y evaluación de la variación somaclonal en plántulas de Vanilla planifolia

Jacks

Resumen

La baja variabilidad genética de la vainilla (Vanilla planifolia Jacks.) La hace susceptible a plagas y
enfermedades, lo que conduce a una disminución en la producción. La variabilidad genética se
puede ampliar utilizando técnicas de cultivo de tejidos de plantas in vitro. El uso de rutas
morfogénicas indirectas permite aumentar el porcentaje de variación somaclonal en las plántulas
regeneradas. El objetivo de esta investigación fue establecer un protocolo para la organogénesis
indirecta en V. planifolia con el objetivo de ampliar la base genética del cultivo. Se indujo un callo
friable a partir de semillas inmaduras cultivadas en la oscuridad, usando medio MS
complementado con tidiazurón (TDZ) a 2,27 l. Posteriormente, se regeneraron 6.8 brotes por callo
en medio MS suplementado con 8.88 lM de benciladenina (BA). Se logró un 100% de
enraizamiento de brotes regenerados cuando se utilizó medio MS sin reguladores del crecimiento
de las plantas. Finalmente, las plántulas enraizadas se aclimataron en un invernadero. Se observó
una tasa de supervivencia del 91%. Análisis moleculares sobre regenerados. Las plántulas
revelaron la existencia de un 71.66% de polimorfismo genético. Además, la variación morfológica
se confirmó por la presencia de individuos variados en las plántulas regeneradas. El protocolo
propuesto puede ser útil en trabajos posteriores de mejora genética de vainilla.

Introducción

Vanilla (Vanilla planifolia Jacks.) Es una orquídea nativa distribuida en las regiones tropicales y
subtropicales de las Américas (SotoArenas2003). La cultura de la vainilla es económica Importante
por la vainillina, un compuesto orgánico muy apreciado en la industria alimentaria y cosmética,
extraído de frutas (Kalimuthu et al. 2006). En México, esta cultura enfrenta serios problemas
asociados con el desprendimiento prematuro de frutas (Castro-Bobadilla et al. 2011) y la
susceptibilidad al ataque de patógenos fúngicos como el Fusarium oxysporum.

Dado su alto valor económico, el desarrollo de programas de mejoramiento genético en este

cultivo es esencial para obtener genotipos altamente productivos resistentes a las enfermedades
para la comercialización (Retheesh y Bhat 2011). Sin embargo, el éxito de cualquier programa de
mejora genética requiere tener una base genética amplia, que está limitada en vainilla. (Minoo et
al. 2006; Retheesh y Bhat 2011).

Por otra parte, las mutaciones espontáneas ocurren con una frecuencia extremadamente baja en
las poblaciones naturales; por lo tanto, una alternativa prometedora para ampliar la base genética
en V. planifolia es el uso del cultivo in vitro de tejido vegetal (PTC) para producir una variación
somaclonal (Cardone et al. 2010). Esto puede lograr un rápido aumento en la variabilidad genética
de las especies cultivadas (Lestari 2006; Mahlanza et al. 2013). La inducción de procesos
morfogenéticos implica la desdiferenciación y redifferentiation de células somáticas de la planta
(Cardone et al. 2010; Grafi y Barak 2014), que en la variación somaclonal (Larkin y Scowcroft 1981;
Kaeppler et al. 2000). Esta variación puede aumentar en las plantas micropropagadas a través de
rutas morfogénicas indirectas, porque los cultivos de callos involucran la adaptación celular a las
condiciones del cultivo in vitro que causan cambios genéticos y epigenéticos (Kaeppler et al. 2000;
Grafi y Barak 2014). El callo friable obtenido a través de la organogénesis indirecta se puede
utilizar para establecer cultivos celulares para otros fines biotecnológicos.

La variación somaclonal se puede generar a través de la organogénesis indirecta, involucrando

cambios tanto genéticos (Larkin y Scow-croft 1981) como epigenéticos (Kaeppler et al. 2000) en
plantas regeneradas in vitro. Luego, las variantes pueden seleccionarse con rasgos deseables,
como la resistencia a enfermedades (Lebeda y Sva´bova´ 2010) y la tolerancia a varios factores
abióticos (Lestari 2006; Ravikumar et al. 2007).

Una de las técnicas más confiables para evaluar la variación genética producida en la
secuenciación de microsatélites e intransferencias microscópicas a través de ISSR (Inter-Simple
Sequence Repeat) (Pradeep et al. 2002). Las ISSR son un método simple, más rápido y
reproducible para detectar loci polimórficos presentes en el ADN nuclear y el ADN organellar
dentro del número de repeticiones, determinado por la adición o eliminación de unidades
repetidas o por mutación puntual, lo que permite evaluar la variación somaclonal que se produce
en la planta cultivada en tejido a nivel genético (Jarne y Lagoda 1996).

Se ha realizado la micropropagación de V. planifolia tanto directamente (Lee-Espinosa et al. 2008;

Mengesha et al. 2012; Zuraida et al. 2013; Oliveira et al. 2013) como indirectamente (Janarthanam
y Seshadri 2008; Tan et al. 2011, 2013). Sin embargo, ninguno de estos estudios ha evaluado la
variación somaclonal que posiblemente se produjo en las plántulas micropropadas.

Esta investigación tiene como objetivo desarrollar un protocolo para la organogénesis indirecta
que resulte en altos porcentajes de variación somaclonal en las plántulas de V. planifolia, con el fin
de contribuir a los trabajos de mejora genética en este cultivo.

materiales y métodos

Inducción de callo

Cápsulas inmaduras de V. planifolia (morfotipo de Mansa) de aproximadamente 7 meses de

madurez se recolectaron en la región de Papantla, Veracruz, México. Las cápsulas se lavaron con
agua corriente y detergente líquido durante 10 min. Luego, en preparación para la siembra, las
cápsulas se limpiaron con etanol al 75% cuatro veces en la campana de flujo laminar; después, se
cortaron transversalmente y las semillas inmaduras se transfirieron al medio de crecimiento
utilizando escalpelos estériles, siguiendo la metodología propuesta por Shin et al. (2011). El
internodo (0,5–1 cm de longitud) y los segmentos foliares (1 9 1 cm) utilizados como extractos
provienen de plántulas establecidas en el banco de germoplasma in vitro Vanilla spp en el
laboratorio de PTC del Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA) en la
Universidad Veracruzana.

Para el establecimiento in vitro del material vegetal, se utilizó medio de cultivo MS (Murashige y
Skoog 1962) suplementado con 50 mg de hidrocloruro de L-1L-cisteína, 1100 mg de ácido
L1ascórbico y 30 g de L-1 sacarosa; Se usaron 2,2 g de L-1Pitagel como agente gelificante. El pH del
medio se ajustó a 5,8 ± 0,2 y los matraces de cultivo se lavaron a una dosis de 1,5 kg cm-2 y 121 ºC
durante 15 min. El efecto de dos reguladores de crecimiento de plantas diferentes (PGR) se evaluó
por separado a diferentes concentraciones: tidiazurón (TDZ) (0,0.45, 1.13 y 2.27 lM) y ácido 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D) (0 2.26, 4.52 y 6.78 lM).
Los cultivos se incubaron a 25 ± 2 C bajo una irradiación de 50 lmol m-2s-1 provisto por lámparas
fluorescentes (60 W Osram). Se evaluó el efecto del fotoperiodo (16 h de luz / 8 hdark) y la
oscuridad total. Después de 8 semanas de cultivo, se evaluó el porcentaje de explantes que
formaron un callo; también, las apariencias de los callos se evaluaron utilizando la siguiente escala:
callos friables, callos compactos, y ausencia de callos.

Regeneración de disparos

Los callos friables formados durante la inducción se desagregaron en trozos pequeños (0,5 g).
Posteriormente, estos se transfirieron al medio MS para evaluar el efecto de diferentes
concentraciones de benciladenina (BA) (0, 6.66, 8.88 y 11.11 lM). Los cultivos se incubaron en las
condiciones descritas anteriormente. Se evaluó el efecto del fotoperiodo (16/8) y la oscuridad.
Después de 8 semanas de cultivo, se realizaron evaluaciones sobre el porcentaje de callos que
produjeron brotes, la cantidad de brotes por callo y la longitud del brote.

Enraizamiento

Para inducir el enraizamiento, se transfirieron brotes de 2 cm (de longitud) a medio MS a la mitad

de su concentración sin suplementación con PGR, siguiendo la metodología de Zuraidaet al.
(2013). Después de 6 semanas de cultivo, se evaluó el porcentaje de brotes arrancados.

Aclimatación

Los brotes previamente enraizados in vitro y que miden entre 8 y 10 cm de altura se enjuagaron
con agua del grifo; posteriormente, se plantaron en un sustrato estéril hecho de turba y agrolita
(1: 1 v / v) utilizando bandejas de 50 9 30 9 5 cm. Las plántulas se cultivaron en un invernadero en
las siguientes condiciones: 50% de sombra, 80 a 95% de humedad relativa; temperatura entre 28 y
32 C, y se regaron con agua del grifo tres veces a la semana. El fertilizante de hoja Nitrofoska (N: P:
K, 25:10:17) se aplicó una vez por semana. Cuando las plantas alcanzaron los 30 cm de altura, se
transfirieron a una mezcla de musgo de turba, agrolita y compuesto (1: 1: 1 v / v) en macetas
individuales. Fungicida (1 g de L-1Tiabendazol) y fertilizante foliar (Nitofoska ) se aplicó una vez a la
semana de acuerdo con los estándares de cultura técnica (Hernández-Hernández 2011). Después
de 8 semanas en el invernadero, se registró la tasa de supervivencia de las plantas aclimatadas.
Finalmente, se plantaron plántulas en el campo para estudios posteriores de mejoramiento
genético.

Valoración somaclonal.

Extracción de ADN genómico

El ADN total se extrajo por duplicado de 0,2 g de tejido foliar de 28 plantas regeneradas a partir de
callos friables y dos plantas donantes (morfotipo de Mansa), siguiendo el método de Stewart y Via
(1993). La calidad del ADN genómico se examinó mediante electroforesis en gel de agarosa (1%) y
se cuantificó mediante espectrofotometría a una relación de DO de 260/280 usando un
fluorómetro Invitrogen® (Qubit 2.0).
Análisis ISSR

Se probaron 12 cebadores ISSR (UBC, UBC, Biotechnology Laboratory, University of British

Columbia). Las reacciones de amplificación de ISSR por PCR se realizaron en un volumen total de
25 lL que contenía dNTP 0,4 mM, MgCl2,25 pM de cebo 2,5 mM, 0,5 U de polimerasa Taq (Bioline )
y 25 plantillas de ADN ng. La amplificación de ADN se realizó en un termociclador AXIGEN (Applied
Biosystem, CA, EE. UU.). Las condiciones de PCR fueron: una desnaturalización inicial a 94 ºC
durante 1 min, la desnaturalización posterior a 94 ºC durante 30 s, recocido Tm C durante 45 s
extensión a 72 C durante 1 min, 35 ciclos, y la extensión final a 72 C durante 10 min.

Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p / v)

utilizando 19 TAEbuffer (40 mM Tris, 40 mM acetato, 1 mM EDTA y pH 8,4), a 100 V durante 1,5 h.
Posteriormente, los geles se tiñeron con 1 mg mL-1 de bromuro de etidio. Gene Ruler DNA
PlusTM100 bp (Fermenteas®) se utilizó como marcador de ADN. Las bandas se visualizaron en un
sistema de documentación de gel (GelDoc-It Imager, UVP).

Todas las reacciones para cada cebador ISSR se repitieron dos veces, solo se usaron bandas
reproducibles entre réplicas para establecer una base binaria, anotando 1 para presencia y 0,
ausencia. Sobre estas bases, se calculó el número total de bandas, el número medio de bandas por
cebador, el porcentaje de monomorfos y el porcentaje de loci polimórficos.

Análisis estadísticos

Todos los experimentos se realizaron utilizando un diseño aleatorio con 5 réplicas cada uno. Para
la inducción del callo, se realizó un análisis factorial de varianza considerando las siguientes
variables: tipo de PGR, concentración de PGR y condiciones de incubación. Se utilizaron treinta
explantes por tratamiento. Los datos obtenidos fueron procesados estadísticamente con el IBM
SPSS.

Resultados

Inducción de callo

La formación de callos friables se observó a las 12 semanas de cultivo en la oscuridad usando

explantes en medio MS suplementado con TDZ como semillas inmaduras (Fig. 1a). Por el contrario,
no se observó formación de callos en las plantas inmaduras que se cultivaron en condiciones de
luz (Fig. 1b). El porcentaje más alto de formación de callos (100%) se observó utilizando TDZ 2.27
lM, seguido de un 40% con 0.45 y TDZ 1.13 lM (Tabla 1). El callo formado utilizando segmentos
nodales como explantes mostró una apariencia compacta, independientemente del tipo de PGR y
las condiciones de concentración o incubación (Fig. 1c). No se logró la formación de callos cuando
se utilizaron segmentos foliares como explantes (Fig. 1d).
Fig. 1 Efecto de diferentes reguladores del crecimiento, fuentes de explantes y condiciones de
incubación en la formación de callos en V. planifolia. un callo friable obtenido usando semilla en
medios enriquecidos con 2.27 lM de oscuridad insuficiente; b semillas en medios suplementados
con 2.27 lM TDZ y 6.78 lM 2,4-D bajo luz; y 6.78 lM 2,4-D en oscuridad; c callo compacto obtenido
usando segmentos nodales en medios suplementados con 2.27 lM TDZ bajo luz u oscuridad; y en
medios enriquecidos con 6,78 lM 2,4-D bajo fotoperiodo; D segmentos foliares, todos los
tratamientos.

Resumen

El cultivo de Vanilla planifolia es de gran importancia económica porque la vainillina, un químico

valorado en la industria alimentaria y cosmética, se extrae de sus vainas. La propagación
convencional de esta planta está limitada por la baja viabilidad de sus semillas y la muy baja tasa
de germinación. Por esta razón, las técnicas de micropropagación in vitro que utilizan sistemas de
inmersión temporal (TIS) representan un mecanismo de propagación alternativo. Este trabajo
evaluó tres sistemas diferentes de biorreactores en dos fases diferentes de micropropagación
(multiplicación y enraizamiento) de V. planifolia: Biorreactores de inmersión temporal (BIT®),
Biorreactores de inmersión por gravedad (BIG) y Recipiente para inmersión temporal
automatizada (RITA®). Se observó un mayor número de brotes / explante en la fase de
multiplicación en sistemas BIT® (18.06 brotes / explante), seguido de RITA® (12.77) y BIG (6.83). En
la fase de enraizamiento, se obtuvo un mayor número de raíces más largas en BIT® comparado
con BIG y RITA®. Sin embargo, se observó un mayor contenido de clorofila en BIG, seguido de
RITA® y BIT®. Se obtuvo una supervivencia del 100% de las plántulas micropropagadas in vitro en
BIT®, superando la tasa de supervivencia observada en RITA® y BIG. En general, nuestros hallazgos
confirman la utilidad de los sistemas BIT® en la optimización de la micropropagación comercial de
esta especie.Además, este sistema reduce los costos asociados con el uso de los sistemas RITA®.
Aclimatación
Se observaron altas tasas de supervivencia después de 8 semanas de cultivo
de V. Planifolia en condiciones de invernadero. (Fig. 5A, B). La tasa de
supervivencia más alta (100%) fue alcanzado con el sistema BIT®, seguido
de RITA® (90%) y BIG (80%).