Aspergillius niger

Medio

Agar papa dextrosa

Agar Sabouraud

Identificacion: Azul de lactofenol

S. cerevisiae

Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YPD) Agar

Agar Sabouraud

Agar Czapek Dox

5.1.4.5. Morfología de las colonias de Aspergillus niger

Colonias de rápido desarrollo sobre ASD o agar Czapek a 25°C y 37°C. El color de las colonias al
principio es blanco a amarillo, luego es negro (ver figura 25). La textura de las colonias es granular.
El reverso de la colonia es incoloro o crema.

5.1.4.6. Características microscópicas de las colonias de Aspergillus niger

Los conidióforos son de pared lisa, hialina o pigmentada y miden de 1,5 a 3 mm de largo y de 15 a
20 mm de diámetro. La vesícula es globosa con 50-100 mm de diámetro y produce fiálides
alrededor de ella. Las fiálides son biseriadas, las ramas primarias miden 30 mm de largo y pueden
estar tabicadas, mientras que las secundarias son cortas y miden 8 mm de longitud, a partir de las
cuales brotan los conidios, los cuales son globosos y rugosos con 4 a 5 mm de diámetro, de color
castaño o marrón a negro (ver figura 26).
The heat-sensitive filamentous molds are easily destroyed under pasteurization conditions (Worobo
and Splittstoesser, 2005). Thus, their presence in heat-processed fruit juice is indicative of possible
postpasteurization contamination or use of highly contaminated raw fruit (Tribst et al., 2009). The
initial microflora of fruits comes from field sources including soil, insects, air, birds, animals, and
fruit exudates.

In fruit, the most common genera include members of Aspergillus, Penicillium, Mucor, Alternaria,
Cladosporium, and Botrytis (Brackett, 1994; ICMSF, 2005; Moss, 2008). In an investigation,
the molds isolated from different fruits were Botrytis cinerea, Rhizopus, Alternaria, Penicillium,
Cladosporium, and Fusarium (Tournas and Katsoudas, 2005). The most frequently found molds in freshly
prepared juices (orange and sweet orange juice) were Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, and Penicillium
islandicum. Moreover, Penicillium digitatum, Colletotrichum, and Curvularia were isolated from orange and
sweet orange juices and Geotrichum was detected in
orange and carrot juice (Aneja et al., 2014).
Apples and apple products, like juice and cider, are excellent substrates for Penicillium expansum
to grow. This mold is the most important causative agent of blue mold rot in this fruit
(Worobo and Splittstoesser, 2005). P. expansum spores can be introduced at the juice-processing
facility by contaminated fruits, since apple storage at low temperature fails to impede fungal growth
(Saloma˜o et al., 2009b), then sanitizer treatments are important measures to reduce mold spores
contamination levels in fruits (Saloma˜o et al., 2008a, 2011). The thermal treatment of apple juice is
effective for reducing P. expansum (Saloma˜o et al., 2009a)

2.3. Análisis microbiológico. El estudio microbiológico de los jugos de frutas se realizó mediante la
técnica de dilución en serie de placa de agar. Se diluyeron 10 ml de muestra de jugo con 90 ml de
agua de peptona estéril al 0,1% (1 g de peptona, 1 l de agua destilada) y se plaquearon en agar
nutriente (pH 5,5) para la enumeración de bacterias y PDA suplementado con antibiótico (pH 5,5)
para la enumeración de hongos en duplicados [4]. Placas sin inocular de PDA y NA se usaron como
control. Los aislados de mohos y levaduras se purificaron en agar de dextrosa de patata, bacterias
en agar nutritivo, y se subcultivaron adicionalmente para su examen e identificación microscópica.

2.4. Identificación de Bacterias.

Para la identificación bacteriana, se observó el cultivo de bacterias durante 24 horas al

microscopio mediante el método de tinción de Gram y varias pruebas bioquímicas para la
identificación de bacterias tales como catalasa, oxidasa, almidón, hidróxido de almidón,
fermentación de azúcar, IMViC y los métodos descritos en "Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology" [14].

Se realizó una identificación adicional de las bacterias sobre la base de los métodos descritos en
"Compendio de métodos para el examen microbiológico de los alimentos" [15, 16].

2.5. Identificación de levaduras

Los métodos adoptados para la identificación de levaduras incluyen características morfológicas,

fermentación de azúcares, prueba de tubo germinal y prueba de resistencia a cicloheximida, y
métodos descritos en "Fungi and Food Spoilage" [17, 18].

2.6. Identificación de Moldes. Los mohos se identificaron sobre la base de las características
morfológicas y culturales, como el color de la colonia, la superficie, el aspecto, la presencia y la
ausencia de paredes transversales y las estructuras reproductivas asexuales y sexuales.

Se realizó una identificación adicional de los moldes de acuerdo con los métodos descritos en
"Fungi and Food Spoilage". Los moldes se cultivaron en agar de extracto de levadura Czapek (pH
6,7), agar extracto de malta (pH 5,6) y agar de nitrato de glicerol (pH 7,0) a 25∘C.
Caja de Petri

Las frutas y los productos que contienen pedazos de frutas se deben mezclar u homogeneizar
antes de proceder al análisis. A una jarra de licuadora estéril tarada, agregue 100 g de fruta o
producto de fruta más 100 ml de agua estéril y mezcle durante 5 minutos o hasta que la mezcla se
vea homogénea.

Después de la mezcla, coloque el frasco en una bolsa de polietileno para evitar fugas a través del
casquillo inferior y coloque el frasco en un baño de agua cerrado de 75 ° C a 80 ° C durante 1,5 h.
Este tiempo de retención asegura que el homogenado estará a 75 ° C durante al menos 30
minutos.

Alternativamente, las muestras (100 g más 100 ml de agua estéril) se pueden homogeneizar con
un stomacher durante 2 a 4 minutos (ver el Capítulo 2). Luego se transfieren dos porciones de 50
ml de homogeneizado a tubos de ensayo estériles de 200 x 30 mm y se colocan en un baño de
agua cerrado a una temperatura de 75 ° C a 80 ° C durante 30 minutos. La superficie de la muestra
en los frascos o tubos debe estar bien debajo de la superficie del agua en el baño durante todo el
tratamiento térmico.

Después del calentamiento, se combinaron muestras duplicadas de 50 ml de homogenato

mezclado a fondo en recipientes de mezcla o todo el contenido (50 ml) de tubos duplicados de
muestra que se habían homogeneizado en un stomacher se combinaron con PDA o MEA en placas
de Petri de 150 mm de diámetro.

Cada muestra de 50 ml se distribuye por igual en cuatro platos y se mezcla a fondo con 10 ml de
agar de 1,5 de fuerza. Las placas de Petri se sellan sin apretar en una bolsa de plástico para evitar
el secado y se incuban a 30 ° C durante hasta 30 días. La mayoría de las ascosporas viables
germinarán y formarán colonias visibles dentro de 7 a 10 días; sin embargo, las ascosporas
debilitadas por el calor y otras debilitadas pueden requerir tiempo adicional para formar colonias.

El tiempo de incubación de 30 días también permite a los moldes madurar y esporular, lo que
ayuda a su identificación. Los jugos de fruta (35 ° Brix o menos) se analizan de una manera idéntica
a la descrita anteriormente. Los productos de zumo de fruta (35 ° Brix o más) y los concentrados
de zumos de frutas se deben diluir (1: 2) con agua estéril y mezclar bien antes de aplicar el
tratamiento térmico para duplicar las muestras de 50 ml.

Inoculacion directa

El método de la placa de Petri está sujeto a error por contaminación aérea (ver Sección 21.51). Un
método alternativo que evita este problema se describe en esta sección. Es adecuado para pulpas
de fruta y homogeneizados.

Las muestras homogeneizadas de 50 ml se calientan en frascos de lados planos, como botes de

medicina de 100 ml. Las botellas se calientan en posición vertical en un baño de agua a 80 ° C
durante 30 min y luego se incuban en sus lados, permitiendo un área de superficie lo más grande
posible, a 30 ° C durante hasta 30 días. Este procedimiento evita el riesgo de contaminación del
aire y minimiza la pérdida de humedad. Las colonias se desarrollan en la superficie del
homogeneizado.

Las muestras más grandes, como cantidades de 100 ml en botellas de 200 ml, también se pueden
manipular con este método. Una desventaja evidente es que las colonias que se desarrollan en las
botellas deben recogerse y cultivarse en medios adecuados para su identificación. Sin embargo, el
cultivo en medios de identificación también se recomienda con el método de la placa de Petri.

De acuerdo con este método, se homogeneizaron muestras de 50 ml con tampón de fosfato del
campo de mantequilla (pH 7,2). Se prepararon diluciones seriadas de jugo transfiriendo 1 ml de
muestra en 9 ml de tampón de fosfato estéril en tubos de ensayo. Después de cada dilución, los
contenidos se mezclaron en un mezclador vortex durante 10 segundos. Se transfirieron volúmenes
de un mililitro de cada dilución a placa de Petri con agar con recuento en placa y se mezcló con
medio por triplicado.

Después de la solidificación, las placas de Petri se incubaron a 35ºC durante 48 h para el recuento
total de placas y se contaron las colonias formadas en la superficie y en los medios. El recuento
total se calculó a partir del recuento medio de triplicado de placas de Petri, teniendo en cuenta las
diluciones.

Para la levadura y el método de la placa de extensión del molde fue utilizado. El crecimiento de
levadura se controló en agar con conteo de placa modificado con 40 ppm de cloranfenicol
(agregado como agente antibacteriano). El agar de papa dextrosa se usó para detectar mohos. Se
colocaron aproximadamente 0,1 ml de inóculo de cada dilución en el centro de agar de dextrosa
de patata solidificado y agar de recuento de placa en una placa de Petri y se usó una varilla de
vidrio doblada estéril para esparcir. El inóculo se extendió en la superficie de los medios e incuba a
25 ° C durante 96 h,

a) Los procesadores comerciales proporcionaron jugos de naranja pasteurizados (envasados en

cartones superiores a dos aguas) que estaban sufriendo deterioro para el aislamiento del molde.
Los micelios fúngicos se eliminaron del jugo mediante un tamiz estéril y se transfirieron
asépticamente a agar dextrosa de patata (PDA; Difco Laboratories, Detroit, MI) y agar de suero de
naranja (OSA; Difco). ) Se examinaron las juntas internas de las cajas de cartón y se sospechó que
el crecimiento del molde se transfirió asépticamente a las placas de PDA y OSA para su
aislamiento.

b) Se tomaron muestras de jugo comercial de naranja no pasteurizado después de 2, 5 y 7 días a 4

° C. El jugo experimental no pasteurizado extraído en la planta piloto del Centro de Investigación y
Educación de Cítricos se mantuvo en matraces estériles a 25 ° C y se tomaron muestras después de
6 y 8 días.

c) Se hidrató cáscara de cítricos granulada seca comercial (6% de humedad) y se mantuvo en un

recipiente abierto térmicamente aislado a temperatura ambiente durante 3 a 4 d. Los
microorganismos que crecen en los gránulos se muestrean asépticamente, se aíslan e identifican.

Aislamiento

Las muestras se retiraron asépticamente de los recipientes y se vertieron en placas o se

extendieron sobre PDA o OSA acidificados. Las placas de PDA se incubaron de 3 a 5 días a 22 a
25ºC. Las placas de OSA se incubaron de 2 a 3 días a 35 ° C. Las colonias representativas de
levaduras y mohos se sembraron en estrías para su aislamiento en PDA, luego se recogieron y
mantuvieron a 4 ° C en inclinaciones de PDA bajo aceite mineral estéril antes de la prueba de
identificación.

Identificaciones

Moldes: se observaron características macroscópicas y microscópicas, después del crecimiento en

PDA, y se compararon con descripciones e ilustraciones de la literatura

Colección de muestras

Se compraron un total de catorce (14) muestras de jugo de fruta procesadas, incluyendo siete
jugos de frutas mixtos y siete jugos de frutas individuales en el mercado principal de Onitsha. Las
muestras se guardaron en el refrigerador antes del análisis.

Procesamiento de muestraDiez mililitros (10 ml) de las muestras se diluyeron con 90 ml de agua
destilada estéril y se mezclaron bien para obtener una dilución de 10-1. Se prepararon diluciones
en serie y se utilizó la técnica de placa de extensión en medios selectivos apropiados.

Análisis microbiológico de muestras

El análisis microbiológico incluyó la enumeración e identificación de contaminantes

microbiológicos en las muestras (FDA, 2001). Las muestras de jugo de fruta se cultivaron
empleando el método de placa distribuida descrito por Uriah (2004) como el mejor para la
enumeración bacteriana de muestras de alimentos. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 24-48
horas antes de la observación del Conteo Viable Total (TVC) en Agar Nutriente y el total se ajusta al
Agar MacConkey.

Las placas de agar de dextrosa de patata para levadura y mohos se incubaron durante 5 días.
Todas las placas inoculadas se mantuvieron en el tiempo y la temperatura requeridos. Los conteos
totales de bacterias se realizaron con el contador de colonia digital Gallenkamp (Harrigan y
McCance, 1990; Pelczar y Chan, 1977). T

El número medio de colonias contadas se expresó como unidades formadoras de colonias (UFC) /
ml. El subcultivo se llevó a cabo para obtener aislados puros y colonias discretas. La identificación
de organismos se hizo sobre la base de características morfológicas, bioquímicas y culturales.
Los aislados bacterianos se analizaron para determinar el carácter de Gram y su motilidad y
diversas pruebas bioquímicas se realizaron inoculando una pequeña porción de colonias bien
aisladas en una serie de medios tales como fermentación de azúcar, prueba de indol, prueba de
rojo de metilo, prueba de Proskauer de Voges, prueba de ureasa, prueba de utilización de citrato y
prueba de catalasa (Cheesbrough, 2000; Uriah, 2004).

Los aislados de hongos se caracterizaron sobre la base de pigmentación, esporulación, disposición

de micelios y microscópicamente (Abbey, 2007; Harrigan y McCance, 1990; Efiuvwevwere, 2000).
Las identidades de los aislados se confirmaron con referencia a manuales bacteriológicos y
micológicos estándar (Buchanan y Gibbon, 1974; Barnett y Hunter, 1987).

Colección de muestras

Se compraron un total de catorce (14) muestras de jugo de fruta procesadas, incluyendo siete
jugos de frutas mixtos y siete jugos de frutas individuales en el mercado principal de Onitsha. Las
muestras

se guardaron en el refrigerador antes del análisis.

Procesamiento de muestra

Diez mililitros (10 ml) de las muestras se diluyeron con 90 ml de agua destilada estéril y se
mezclaron bien para obtener una dilución de 10-1. Se prepararon diluciones en serie y se utilizó la
técnica de placa de extensión en medios selectivos apropiados.

Análisis microbiológico de muestras

El análisis microbiológico incluyó la enumeración e identificación de contaminantes

microbiológicos en las muestras (FDA, 2001). Las muestras de jugo de fruta se cultivaron
empleando el método de placa distribuida descrito por Uriah (2004) como el mejor para la
enumeración bacteriana de muestras de alimentos. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 24-48
horas antes de la observación del Conteo Viable Total (TVC) en Agar Nutriente y el total se ajusta al
Agar MacConkey.
Las placas de agar de dextrosa de patata para levadura y mohos se incubaron durante 5 días.
Todas las placas inoculadas se mantuvieron en el tiempo y la temperatura requeridos. Los conteos
totales de bacterias se realizaron con el contador de colonia digital Gallenkamp (Harrigan y
McCance, 1990; Pelczar y Chan, 1977). T

El número medio de colonias contadas se expresó como unidades formadoras de colonias (UFC) /
ml. El subcultivo se llevó a cabo para obtener aislados puros y colonias discretas. La identificación
de organismos se hizo sobre la base de características morfológicas, bioquímicas y culturales.

Los aislados bacterianos se analizaron para determinar el carácter de Gram y su motilidad y

diversas pruebas bioquímicas se realizaron inoculando una pequeña porción de colonias bien
aisladas en una serie de medios tales como fermentación de azúcar, prueba de indol, prueba de
rojo de metilo, prueba de Proskauer de Voges, prueba de ureasa, prueba de utilización de citrato y
prueba de catalasa (Cheesbrough, 2000; Uriah, 2004).

Los aislados de hongos se caracterizaron sobre la base de pigmentación, esporulación, disposición

de micelios y microscópicamente (Abbey, 2007; Harrigan y McCance, 1990; Efiuvwevwere, 2000).
Las identidades de los aislados se confirmaron con referencia a manuales bacteriológicos y
micológicos estándar (Buchanan y Gibbon, 1974; Barnett y Hunter, 1987).